CZ39394A3

CZ39394A3 - Novel plasmid for producing crm protein and diphtheria toxin

Info

Publication number: CZ39394A3
Application number: CZ94393A
Authority: CZ
Inventors: Benjamin J Metcalf
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1993-03-05
Filing date: 1994-02-22
Publication date: 1995-02-15
Also published as: CA2116914A1; ES2231770T3; NO313758B1; EP0616034A3; KR100316004B1; CA2116914C; FI112090B; BR1100634A; HU9400657D0; SK24094A3; HUT71320A; DK0616034T3; AU686126B2; FI941050A; NO940774L; CN1100757A; ZA941548B; EP0616034A2; JPH06292593A; KR940021731A

Description

Oblast techniky ' ' I T 9 0 T 9

I ’ f ’ O v

Předložený vynález se týká nového plasmidu pro produk- \ ci CRM proteinu a difterického toxinu a mikroorganismů, transformovaných tímto fcovým plasmicem.

Dosavadní stav techniky

CRM197 protein je netoxická forma difterického toxinu, ale je imunologicky nerozlišitelný od difterického toxinu.

CRM197 je produkován C.difjhtheriae infikovaným netoxigenním pl γ ~_ fágem ^))197 vytvořeným nitrosoguanidinovou mutagenesí toxigenního korynefágu (Uchida T. a spol. 1971 ,

Nátuře New 3iology 233:8-1l)_r CRM197 protein má stejnou molekulovou hmotnost jako difterický toxin, ale liší se od něj výměnou jedné báze: (guanin na adenin) ve strukturálním genu. lato změna jedné báze působí aminokyselinovou substituci (glutamová kyselina za gl.ycin) ve zralém proteinu a eliminuje toxické vlastnosti difterického toxinu. CRM197 protein je bezpečný a účinný na T-buňkách závislý nosič pro sacharidy a v současnosti je používán v Haemophilus influenzae typ b oligosacharid CRM197 konjugátové vakcině (HibTiter ¹ , Lederle Praxis Biologicals,

Rochester, N.Y.).

Produkce významných množství CRM1 97 proteinu pro použití ve vakcinácn byla ztížena malým množstvím proteini.

Byly vyvíjeny techniky pro podpoření produkce CRM proteinů použitím dvojitých lysogenů (Rappuoli R., 1983, Applied

Env.. iwicrobio. 46:560-564, US patent 4925792 vydaný R.

Rappuolomi a Rappuoli R. 1983, U.Bacteriol. 1 53^:1 202-1210 ) netoxigenního korynefágu /2? 1 9 7 - Parrooli uvádí výtěžky CRM1 97

-2z dvojitých lysogenů až třikrát vyšší než s jednoduchými lysogen.y. Hladiny produkce CRM1 97' jednoduchými lysogeny jsou adekvátní, ale ekonomicky neuspokojivé pro produkci'vakcin, které využívají CRM197 protein.

Zavedení mnohonásobných lysogenů z korynefágu fb do Corynebacterium óiphtheriae je laboratorní screeningový proces pro identifikaci kmenů, které mohou nadměrně produkovat CRM197 protein, difterický toxin nebo jiné CMR proteiny, které jsou zkříženě reaktivní s difterickým toxinem. Dále je tento proces limitován ve své schopnosti ovlivňovat expresi proteinu za použití standardních rekombinantních technik. Bylo by proto výhodné vyvinout proces, který může generovat významná množství difterického toxinu a CRM proteinů zvýšením počtu genových kopií bez použití korynefágu^) , nebo zvýšením produkčních hladin těchto proteinů z kmenů lysogenních pro kor.ynefág/\

Podstata vynálezu

Předložený vynález se týká nového způsobu a plasmidového systému pro manipulaci a zavedení genu, kódujícího CRM197, difterický toxin a jiné CRM proteiny odvozené od genu difterického toxinu, jakož i mikroorganismů, transformovaných: těmiti způsoby. Zvláště preferovaný DNA plasmid, označený pPX 3511, který kombinuje gen pro CRM197 z netoxigenního betafágu a plasmiď pNG2-22 je zde popsán. Nový plasmiaový systém je schopen transformace kmenů Coryímebacterium diphtheriae na kmeny, které jsou schopny exprimovat vysoké hladiny CRM197 proteinu bez použití mnohonásobných lysogenů. Vynález poskytuje elegantní způsoby zvýšení proteinové exprese CRM197, difterického toxinu a jiných CRM proteinů, odvozených od difterického toxinového genu. Exprese genu může být také ovlivněna zvýšením

-3síly promotoru nebo odstraněním promotoru z regulace železem. Ve výhodných provedeních může být plasmidový_vsystém použit pro expresi jiných proteinů jako genetických fúzí s CRM197) difterickým toxinem nebo jinými CRM proteiny odvozenými z difterického toxinového genu. Regulátorová a zpracovávací sekvence CRM197, difterického toxinu nebo jiných CRM proteinů, odvozené z difterického genu, mohou být použity pro expresi cizích.proteinů v Corynebacterium spp.

Popis obrázků na připojených výkresech

C’br. 1 - je rekombinantní DNA plasmid, označený pPX3511, který obsahuje gen CRM197, násobné klonovací místo, odvozené z E.coli klonovacího vektoru pUG 1$, který obsahuje znak chloramfenikolové rezistence (CmR) a počátek replikace odvozený od plasmidu pNG-2-22 (Sewold-Davis T.M. a spol., 1990, FEM MicrobiolvLett. 66:119-124).

Obr. 2 - je 12% SDS-PAGE gel, který ukazuje produkci

CRM1.97 (61 ,8 kijLodalton) z různých kmenů C-diphthel· riae C7. Dráha A: standardy o vysoké molekulové hmotnosti (3RL, 200-14,3 kilodalton), dráha B: jediný lysogen C7(/3197)^°^Χ”, dráha C: dvojitý lysogen C7(/2>197)^tox , dráha D: nelysogenní C7(-)^^oxs pPX 3511, růst bez chloramfenikolu (Cm2) (2 /Ug/ml), dráha E: nelysogenní C7(-)^^ox“ s pPX 3511, růst s chloramfenikolem (2 yug/ml), dráha F: jediný lysogen C7(/3 197)^°^X~ s pPX 3511 růst bez chloramfenikolu...(2. yfUg/ml), dráha G: jediný lysogen C7(Λΐ97)ΐ°^Χ~ růst s chloramfenikolem (2 /ug/ml).

-4Cbr.3 - ukazuje stabilitu plasmidu pPX 351 1 v C.óiphtheriae G7 ( 197)t°^x za použití chloramfenikolové rezistence jako indikátoru plasmidové retence bez antibiotické selekce.

Předložený vynález poskytuje nový způsob a plasmidový systém pro produkci difterického toxinu, CRM197 a jiných CRM proteinů odvozených z difterického toxinového genu v množstvích, která jsou postačující pro použití ve vakcinách nebo jiná použití, vyžadující adekvátně zpracovatelná množství těchto proteinů. Plasmidový systém poskytuje účinné způsoby pro zavedení a zvýšení počtu kopií v genu difterického toxinu nebo CRM genu v Corynebacterium spp. Plasmid má svůj vlastní nezávislý episom se svou vlastní replikačními funkcemi, což umožňuje plasmidu zavedení extra kopií genu difterického toxinu nebo CRM do hostitelských kmenů, které nejsou schopny takové integrace, nebo které předtím nebyly infikovány fágem /2)1 97^^θΧ · Například hladiny CRM197 proteinu produkované Corynebacterium spp, majícím: plasmid podle předloženého vynálezu, jsou srovnatelné, ne-li lepší než výtěžky CRM197 proteinu exprimované vícenásobnými lysogeny C.óiphtheriae, které byly infikovány koryfagem· /2)1 gytox .

Plasmidy, produkující vysoké hladiny podle předloženého vynálezu, obsahují gen, kočující difterický toxm nebo CRM protein, obsahující jeho promotor a regulační signální sekvenci; počátek Corynebacterium replikace takový, že výsledný plasmid může být zaveden do Corynebacterium spp.,_ř a selektovatelný markér, který je popřípadě připojen k násobnému klonovacísu místu. Tento plasmid se používá oro transformaci mikroorganismů rodu Corynebacterium a zejména Corynebacterium óiphtheriae, za podmínek dostačujících k usnadnění exprese difterického toxinu nebo CRM genu. Vhodné kultivační podmínky budou odborníkům v oboru

zřejmé v závislosti na hostitelském organismu. Například pro optimální produkci CRM197, difterického toxinu.nebo jiného CRM proteinu z Corynebacterium spp., je nezbytné udržovat mikroorganismus v mediu s nízkým obsahem železa nebó mediu, zbaveném železa.

Plasmid. obsahuje gen, kódující difterický toxin nebo CRM protein, který je odvozen od genu difterického toxinu_r Příklady CRM proteinů, např.. Příklady CRM proteinů^ tj. zkříženě reaktivní materiály (Cross-Reacting Materials, které jsou zkříženě reaktivní s difterickým toxinem, které mohou být použity v plasmidových konstruktech podle vynálezu, zahrnují, ale nejsou tak omezeny, CRM197, CRM45,

CRM30, CRM228 a CRM1767 Gen, kódující CRM197 protein je odvozen od difterického toxinu (DT), jehož sekvence byla popsána Greenfieldem· a spol. (Greenfield L. a spol., 1983, Pron.Natl. Acas .Sci.USA, 80:6853-6857'). Rozdíl mezi DT genem a CRM197 genem je v jediné změně báze ve strukturálním genu. Nukleotidové sekvence pro některé CRM geny byly popsány Uchia-ou T. a spol. (J.Biol.Chem., 24843838-3844, 1975). Celý CRM gen, obsahující svoji regulační signální sekvenci, může být produkován polymerásovou řetězovou reakcí (PCR). Pro generaci genu CRM197 nebo jiných CRM genů mohou být použity jiné amplifikační techniky nebo syntéz- ní techniky.

Regulační signální sekvence genu, kódujícího difterický toxin a CRM protein, dovoluje proteinu, aby byl sekretován do media. Sekretovaný protein může být získán z media a čištěn za použití známých technik, jako je vvsrážení solí a sloupcová chromatografie.

Násobné klonovací místo je výhodně odvozeno od pUC 18) ale může rovněž být použita násobné klonovací místa odvozená od jiných zdrojů, např. pBluescript nebo jiní syn- ^:

-6tetické násobné klonovací místo. Alternativně násobné klonovací místo může být eliminováno celé bez interference s operabilitou plasmidu. V jiném případě je selektovatelný markér- inkorporován do plasmidu. Může být použit jakýkoliv markér antibiotické rezistence jako selektující markér, (jako například je, aniž by tak došlo k omezení _rampicilin, erythromycin, chloramfenikol, kanamycin. Vnímavost corynebakterií k antibiotiku'- ' volby je testována jako první. Preferován je chloramfenikol, jsou-li exprimované proteiny zamýšleny pro humánní použití, protože chloramfenikol byl pro tyto účely schválen od Food and Drug Administration. Jako alternativy k markérům antibiotické rezistence mohou být použity jiné metody plasmidové selekce' jako je rezistence k těžkým kovům nebo nutriční požadavky.

Zdroje replikace vhodné pro konstrukci vysoce produkčních plasmidů podle vynálezu jsou ty, které jsou odvozeny od Uorynebacterium spp. Zdroj replikace zvolený pro pPX 351 1 je odvozen od Corynebacterium diphtheriae. Viz příkladová část. Mohou být použity jiné zdroje corvnebacter.

Ve výhodném provedení se vysoké hladiny exprese CRM197 proteinu dosáhne použitím nového rekombinantního DNA plasmidu, označeného pPX 3511, schomného transformace kmenů G. diphtheriae C? do kmenů, které produkují vysoké hladiny CRM197 proteinu. Plasraiď pPX 3511, uvedený na obr. 1, obsahuje CRM197 gen, odvozený od difterického toxinu.(Greenfielď L. a spol., 1983, Proč.Nati.Acad.Sci.USA 80:68536857)· Zbývající část plasmidu je odvozena od rodičovského plasmidu pNG2-22, do kterého byl inzertován CMR197 gen.

Plasmid pPX 3511 je produkován první amplifikaci CRM197 genu z C.diphtheriae polymeráscvcu řetězovou reakcí (PCR).

-7CRM197 gen je pak klonován do C.diphtjeriae plasmidu, obsahujícího selektující markér, jako je pNG2 (Schiller J. a spol., 1980, Antimicrobial Agents and Cgemotherapy 18: 814-821) a pNG2-22 (Serwold-Davis T.M. a spol., 1990'/. FEM Microbiol.Lett. 66:119-124). Oba tyto plasmidy se připojují k širokému rozsahu hostitelů a jsou schopny replikace v malém počtu kopií (5 až 10 kopií/bunka) ve všech dosud testovaných coryneformech.

Rodičovský plasmid pNG2 je přirozeně se vyskytující G.diphtheriae plasmid, který byl izolován z erytromycin rezistentních klinických kmenů. Počátek replikace pNG2 je obsažen na l,6 kb EcoRI-Clal fragmentu. Tento počátek replikace byl použit pro vytvoření vektoru chloramfenikolové rezistence označeného pHG2-22 (Serwold-Lavis a spol. ibíd.) a pCM 2,6 (Schmít, 1991, Infect. Immun. 59: 1899-1904).

Kmem G.diphtheriae G-7 je pak transformován výsledným : pPX 3511 plasmidem elektroporaci, což umožňuje bakterii prd dukovat CRM197 bez přítomnosti fága />197^^ΟΧ . Mohou být. použity jiné transformační techniky jako jsou známé fyzikální a chemické způsoby (Serwold-Lavis a spol.,ibiď.). Tato technika elektrotransformace s pPX 3511 je také provedena za použití G.diphtheriae C7 (/2>l97)^tOX jediného lysogenu pro zvýšení produkce CRM197 proteinu. Hladiny CRM197 proteinu exprimované transformanty jsou srovnávány s expresními hladinami jediného lysogenu C.diphtjeriae C7(/5197)t°^x_ ATCCč. 5328 a dvojitého lysogenu G.diphtheriae G7 (^l97)^tOXM1 , ATCC č. 39255, který; neobsahuje pPX 3511 plasmid. Bylo pozorováno, že je-li plasmid pPX 3511 transfektován do ’C.diphtheriae G7 kmenu, jsou transformanty schopny exprese CRM197 v hladinách, které jsou ekvivalentní C.diphtheriae dvojitě lysogenních kmenů.

-8V jiných provedeních vynálezu je nový plasmidový vektor modifikován pro vytvoření serme plasmidových vektorů s různými schopnostmi. Například místně řízené mutagenese mohou být použity pro provedení změny jedné báze? v CRM197, takže nový plasmid by měl exprimovat difterický toxin. Jiné změny mohou být provedeny na klonované CRM197 genové sekvenci pro expresi jiných známých difterických toxinových CRM proteinů jako je CRM46, CRM30_rCRM228 a CRM 1 76' (Uchida T. a spol., 1973, J.Biol.Chem. 248:3838-3844).

Za použití rekombinantních DNA technik mohou být provedeny změny na regulačních nebo zpracovávacích sekvencích CRM197 nebo jiném podobně klonovaném difterickém toxinu nebo CRM genech pro další zvýšení produkce těchto proteinů. Například tox promotorové oblast může být modifikována na prostou promotoru z regulace železem.

V dalším provedení může být plasmidový vektorový systém modifikován k zavedení klonovacích míst pro restrikčn enzymy do amňnokonce CRM197 genu nebo podobně klonovaného difterického toxinu nebo CRM genu. Klonování DNA sekvencí z jiných proteinů do klonovacích míst by pak mělo umožnit plasmidovému vektoru ko-exprimovat jiné rekombinantní proteiny nebo antigeny jako aminoterminélní fúze^: s CRM197 proteinem nebo podobně klonovaným difterickým toxinem. nebo CRM proteinem, vše za řízení tox promotorem a signální sekvencí. Dále nebo alternativně mohou být klonující místa inzertována do karboxyterminální části CRM197, difterického toxinu' nebo podobně klonovaného CRM pro expresi jiných proteinů jako karboxy terminální ch fú-zí. Díky přítomnosti CRM197 regulační signální sekvence by měl výsledný fuzní protein sekretován do kultivačního media. Alterna-9tivně je nezbytné použít pouze regulátorovou signální sekvencí! CRM197 jako prostředek pro expresi secerno.vaných forem jiných proteinů do kultivačního media.

\

Vhodné proteiny a antigeny použitelné při produkci plasmidu podle vynálezu zahrnují částice antigenů, jako jsou ty„ které jsou odvozeny od bakterií, virů, parazitů nebo hub a mikrokomponent buněk a rozpustných antigenů jako^ jsou proteiny, peptidy, hormony a glykoproteiny. Antigeny které jsou zvláště zajímavé sjou virové, fungální, parazitární nebo bakteriální antigeny, alergeny, , týkající se autoimunity nebo antigeny spojené s tumory. Tyto antigeny mohou být získány z přírodních zdrojů nebo mohou být produkovány rekombinantní DNA technologií nebo jinými prostředky.

Mezi důležité bakteriální antigeny patří ty, které jsou spojeny s lidskými bakteriálními patogeny, které zahrnují, ale nejsou tak omezeny, typické nebo netypické Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Spanhamella catarrhalis, Vibrio cholerae, Neisseria gonorrhoeae’, í Bordetella pertussis, Psedomonas aeruginosa, Staph.yloccccus aureus, Klebsiella pneumoniae a Clostrióium tetani. Některé specifické bakteriální antigeny obsahují bakteriální povrchové proteiny a proteiny vnější membrány (např. z Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae. nebo Branhamella catarrhalis) a bakteriální Povrchové proteiny (např. M protein ze Streptococcus pyogenes nebo 37 kilodalton povrchový protein ze Streptococcus pneumoniae).

Virové antigeny z patogenních virů zahrnují, ale nejsou tak omezeny, virus lidské imunodeficience (typy I a

-10II)^:,viru lidské T-buněčné leukemie (typy 1,11 a III), respiračně synsyciální virus, virus hepatitidy A, hepatitidy B, hepatitidy C, non-A a non-3 hepatitidy, virus herpex simplex (typy I a II) cytomegalovirus, virus influenzae, virus parainfluenzae, poliovirus, rotavirus, coronavirus, virus rubeoly, virus spalniček, zarděnek, virus Epstein-Barro vé, adenovinrus, virus papiloma a virus žluté zimnice.

Některé specifické virové antigeny těchto patogenních virů obsahují F protein (zejména antigeny, obsahující F peptid 283-315\ popsaný wz W089/02935 nazvané ''Respirátory Syncytial Virus: Vaccines and Diagnostic Assays**,

Bradiso P.a spol.) a Ií a ©proteiny respiračně synciáiního viru (RSV), VP4 (dříve znám jako VP3), VP6 a VP7 polypeptidy rotaviru, obalové proteiny viru lidské imunodeficienoe, povrchové a prepovrchové antigeny hepatitidy 3 a herpes glykoproteiny B a D.

Fangální antigeny mohou být ty, které jsou odvozeny od hub, zahrnujících, ale neomezujících se tak, Candida spp. (zejména albicans), Cryptococcus spp. (zejména neoformans), Blastomyces spp. (např. dermatitidis), Histoplasma spp. (zejména capsulatum), Coccidroides spp. (zejména immitis), Paracoccidroides spp. (zejména brasiliensis) a Aspergillus spp. Příklady parazitárních antigenů zahrnují, ale nejsou tak omezeny, Plasmodium spp. Eimeria spp., Schisostosoma spp., Trypanosoma spp., Babesia spp., Leishmania spp., ^cryptosporidia spp., Toxoplasma spp. a Pneumocystis spp.

Vynález bude blíže vysvětlen v následujících příkladech.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 Konstrukty

E.coli DHg <K. (3RL, Gaithersburg, M3) se používá ve všech klonovacích postupech. Kmeny netoxigenní, nelysogenní

-1 1 C.diphtheriae C7(-)^tox-, netoxigenní, jednou lysogenní 0. diphtheriae C?( /?) 197)^t0X” ATCC č. 5328 se používají jak jako plasmidoví hostitelé tak kontroly ve studiích exprese CRM197 proteinu. Netoxigenní, dvojitě lysogenní C.diphtheriae C7( /?)1 97)^tox_'ATCC č. 39255 se použije jako kontrola v pokusech s expresí CRM197 proteinu.

Kultivační media a podmínky

E. coli DH5i\ se rutinně kultivuje na super optimálním půdním (SOB) agarovém mediu a v SOB kapalném při 37' °C (Sambroo'k J. a spol., 1989, Molecular Cloning: A Laborato- ; r,y Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Colď Spring Harbor, NY.). Kmeny C.diphtheriae C? se rutinně' kultivují na SOC: agaru: (Sambrok J. a spol.,ibid.) a kapalině. ET osmotické agarové medium (Best G.R. a M.L.Britz, 1986, Appl.Microbiol.Biotech., 23:288-293) se použije při plotnování elektroporovaných buněk. CY medium zbavené železa (Rappuoli R. a spol., 1983, JL Bacteriol. , 153*1202) se použije pro experimenty, zahrnující expresi CRM197» Chloramfenikol se přidává v množství 34 yug/ml pro E.coli DH5^;(\ a 2 /ug/ml pro C.diphtheriae C7 kmeny, obsahující plasmid pPX 3511·

Klonování CRM197 genu

CRM197 gen se klonuje PCR (polymerázová řetězová reakce) amplifikaci genové sekvence z C.diphtheriae C7 ( ^/3l97)^°^x jednoduše lysogenní DNA za použití oligonukleotidových příměrů na bázi publikované sekvence difterického toxinu (Greenfield L. a spol., 1983, Proč.Nati. Acad.Sci.USA 80:6853-6857). Primery jsou tvarovány tak, že jeden primer by měl v.ytvořet Sall/HincII restrikční místo na počátku funkčního genu a druhý by měl vytvořit Xbal

-12místo po genovém stop kodonu strukturního genu. Tyto nebo podobné primer.y se používají pro amplifikaci a klonování CRM197 genu, difterického toxinového genu a jakéhokoliv CRM genu podobného difterickéhu toxinovému genu kódovanému corynefáfem ft) .

CRM197 PCR produkty se štěpí pomocí HincII a Xbal a ligují do Smal/Xbal štěpeného pNG-22, vektoru chloramfenikolové rezistence v širokém rozsahu hostitelů se schopností replikace? jak v Escherichia coli tak Corynebacterium spp. Pro transformaci E.coli se použije ligace a rekombinantí kolonie jsou screenovány restrikční analýzou na přítomnost CRM197 genu, Jeden izolát, pPX 3511, je sekvenován za použití přesahujících primerů pro ověření jakýchkoliv^- změn v CRM197 genu. Oligoáukleotidové primery použité v PCR a sekvenování jsou syntetizovány na Applieď Biosystems 3803 DNA s.yntetizátoru. PCR se provádí s cyklovačem Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler. Sekvenování se provádí na Applied Biosystems Sequencer 373A. Výsledný plasmidl (pPX 3511) je transferován elektroporací do netoxigenního, nelysogenních kmene C.diphtheriae C7(-)^t0X~ a netoxigenního kmene C.diphtheriae C7 ( f/ ^y , ATCC č.

5328.

Elektrooorace 0.diohtheriae C?

C.diphtheriae C7 se transformuje plasmid^ev^ pPX 351 1 DNA elektroporací za použití protokolu vyvinutého pro transformaci Corynebacterium glutamicum a Brevibacterium lactofermentum (Hayes J.A. a M.L.Britz, 1989, FEMS Microbiol. Lett. 61:329-334), š tím rozdílem, že se použije SOC medium doplněné 0,2 % Tweenu-80. Pro elektroporací se noužije 3TX Transfector 100 s Power Plus a Optimizor Graphic Pluse Analyzer a 1 mm kyvety. Přítomnost plasmióu pPX 3511 v trans

-13formovaných C.diphtheriae C7 kmenech je ověřena plasmidovou záchranou a restrikční analýzou. *

Příklad 2 : Exprese

97

Kvantitativní CRM expresní studie

Porovnání produkce CRM197 se provede kultivací kmenů C.diphtheriae C7 za podobných podmínek a porovnáním množství CRM197'v supernatantu kultivace. Při kvantitativním porovnávání kmenů se 4 ml kultury rostlé přes noc zředí na θύ£θθ=Ο*ί1 ^v CY mediu zbaveném železa (30 ml konečný objem ve 250ml Eplenmeyerově bance) a za třepání se kultivuje 20 hodin při 37 °θ. Kmeny, obsahující pPX 3511 se kultivují jak bez tak s antibiotickou selekcí (2 yUg/ml ; chloramfenikolu). Po inkubaci jsou kultury odstředěny pro odstranění buněk a 20 /ul supernatantů kultur se podrobí zpracování na 12% SEDS-PAGE gelu. C-el se vybarví comassie barvivém a provede se kvantitativní porovnání' za použití zařízerrí Bio-Pad Model 1650 Transmittance/Reflectance Snanhing Densitometer s Hoefer Scientific GS 370 Analysis Package. Porovnání antigenních vlastností rekombinantního CRM197 proteinu a lysogenního ^)197 CRM1 97 proteinu se provede imunoblottingem gelu a sondováním monoklonálními protilátkami k CRM197, CRM197 produkovaný pPX 3511 je antigenicky identický s CRM197 produkovaným lysogenními kmeny.

Experimenty stability plasmidu pPX 3511

Stabilita plasmidu pPX 3511 je studována za použití udržení chloramfenikolové rezistence jako indikátoru^ plas-; midové retence bez antibiotické selekce. Kultury C.diphtheriae C7 ( fo 197)^^OX_ pPX 3511 se kultivují c SOC půd% ; doplněné 0,1 % Tweenu-80 pro zabránění shlukování buněk po;

-1418 hodin (14-17 generací) při 37 °C. Kultury se pak umístí na SOC agar pro spočítání kolonií a zředí 1/10 pro další generaci. SOC agarové plotny jsou opakovaně umístěny na SOC agar 2 yug/ml chloramfenikolu a spočtou se procenta kolonií,udržujících rezistenci k chloramfenikolu. Proces se opakuje 60krát.

Příklad 3 : Biologické výsledky

Kvantitativní porovnání CRM197 produkce z různých C. diphtheriae C7 kmenů densitometrií coomassie vybarvených gelffi (obr. 2) ukazuje, že kmeny s pPX 3541 produkují asi dvakrát více CRM197 než jednoduchý lysogen a stejně jako dvojitý lysogen (tabulka 1). Stabilita plasmidu pRX 3511 během šedesáti generací je uvedena na obr. 3.

Tabulka 1

Produkce CRM197 kmeny C.diphtheriae,vyjádřená jako násobky produkce s jedním lysogenaím ( Al97)^°^X násobky produkce sjedním lysogenním (^ 197)t⁰*^-

dvojitý	lysogen. (/7l9?)^t0X	2,2
pPX 351 1	(-)^tox ne, CM2	2,8
pPX 3511	(-)^tox:~, Cm2	1 ,9
pPX 3511	(ft 1 97)^t0X'’^_ ne, CM2	2,0
pPX 3511	(/^197)^tox~, CM2	23

Biologické uložení

Plasmiď pPX 351 1 byl uložen podle pravidel Budapeštské smlouvy v American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, ryland' 20852 12.února 1993 a

-15a byl označen ATCC přírůstkovým 75415· Všechna omezení dostupnosti publikování' uloženého materiálu budou odstraněna po udělení patentu na tuto přihlášku:. Uložení _vbude udr žováno v přístupném depozitáři po dobu nejméně 30 leť od data uložení nebo dobu životnosti patentu nebo po Soba pěti let po datu nejčetnějrších požadavků na vydání vzorku; biologického materiálu. Uložení bude obnoveno, nebude-li životaschopný nebo replikovatelný.

Odborníci v oboru; budou schopni za použití pouze rutinních pokusů, stanovit mnoho ekvivalentů ke zde popsaným specifickým provedením. Takové ekvivalenty spadají do rozsahu následujících nároků.

Claims

1 . Způsob produkce difterického toxinu nebo CRM pr-o---teinu, který je zkříženě reaktivní s difterickým toxinem, vyznačující se tím, že zahrnuje transformaci mikroorganismu druhu Corynebacterium plasmidem, obsahujícím a) gen, kódující difterický toxin nebo CRM protein, b) Corynebacterium počátek replikace a c) selektující markér a expresi uvedeného toxinu nebo proteinu za podmínek umožňujících expresi genu mikroorganismem.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že transformace se provádí elektroporací.

3. Způsob podle nároku 1, v yznačující se t í m, že mikroorganismem je Corynebacterium óiphtheriae.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se t í m, že kmene® Corynebacterium diphtheriae je kmen':

C7.

5>. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tr í m, že CRM gen je vybrán ze skupiny, zahrnující CRM197, CRM45, CRM30, CRM228 a CRM176.

6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m, že počátek replikace je odvozen od Corynebacterium plasmidů pNG2.

-17*

7. Plasmiď pro expresi difteric^ého toxinu nebo ‘ $

CRM proteinu, který je zkříženě reaktivní s difterickým . _; í toxinem v hostiteli, obsahující

a) gen, kódující difterický toxin nebo CRM protein,

a) Corynebacterium počátek replikace a ''

e) selektující markér popřípadě připojený k násobnému klonovacímu místu.

8. Plasmiď podle nároku 7, kde gen, kódující protein je operativně připojen k nukleotidové sekvenci, kódující jeden nebo více proteinů, peptidů nebo jejich epitopů.

9. Plasmid pPX 3511, ATCC přírůstkové čislo Č.7541ÍŽ*

10. Mikroorganismus rodu Corynebacterium, který je transformován plasmidem podle nároku 7.