NO313758B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av difteritoksin eller CRM- protein - Google Patents
Fremgangsmåte for fremstilling av difteritoksin eller CRM- protein Download PDFInfo
- Publication number
- NO313758B1 NO313758B1 NO19940774A NO940774A NO313758B1 NO 313758 B1 NO313758 B1 NO 313758B1 NO 19940774 A NO19940774 A NO 19940774A NO 940774 A NO940774 A NO 940774A NO 313758 B1 NO313758 B1 NO 313758B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- plasmid
- crmi97
- diphtheria toxin
- protein
- gene
- Prior art date
Links
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 title claims abstract description 41
- 101150044687 crm gene Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 69
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 54
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 38
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 11
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 8
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 claims description 6
- 101100298079 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) pNG2 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 4
- 108010034055 CRM45 fragment of diphtheria toxin Proteins 0.000 claims description 3
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 claims 1
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 abstract description 29
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 14
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 abstract description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract description 2
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 abstract 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 17
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 15
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 14
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 description 7
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000588655 Moraxella catarrhalis Species 0.000 description 2
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 2
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 2
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 2
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- ITFICYZHWXDVMU-IPTZIORSSA-N (2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-amino-4-carboxybutanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ITFICYZHWXDVMU-IPTZIORSSA-N 0.000 description 1
- WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(N)=NN=O WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000223836 Babesia Species 0.000 description 1
- 241000335423 Blastomyces Species 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 241000595586 Coryne Species 0.000 description 1
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 241000223924 Eimeria Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 241000228402 Histoplasma Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 208000002430 Multiple chemical sensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 241000233870 Pneumocystis Species 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 1
- 241000242678 Schistosoma Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000223996 Toxoplasma Species 0.000 description 1
- 241000223104 Trypanosoma Species 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 201000008680 babesiosis Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 235000019365 chlortetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000317 pneumocystosis Diseases 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000563 toxic property Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte for fremstilling av full-lengde-difteri toksin eller CRM-protein som kryssreagerer med difteri-toksin.
CRMI97-proteinet er en ikke-giftig form av difteri-toksin, men er immunologisk lik difteri-toksinet. CRMI97 fremstilles av C. diphtheriae infisert av den ikke-toksogene fagen fil97<tox>" fremstilt ved nitrosoguanidinmutagenase av den toksogene korynefag li (T. Uchida et al., 1971, Nature New Biology, 233:8-11). CRMI97-proteinet har den samme molekylvekten som difteri-toksinet, men avviker fra dette ved en enkel baseendring (guanin til adenin) i det strukturelle genet. Denne enkeltbaseforandringen fører til en aminosyre-substitusjon (glutaminsyre for glycin) i det ferdige proteinet og fjerner de giftige egenskapene til difteri-toksin. CRMI97-proteinet er en sikker og effektiv T-celleavhengig bærer for sakkarider og benyttes for tiden i Haemophilus influenzae type b-oligosakkarid-CRMI97-konjugatvaksinen (HibTiter™; Lederle Praxis Biologicals, Rochester, N.Y.).
Fremstilling av betydelig mengder av CRMI97-proteinet for anvendelse i vaksiner har vært hindret på grunn av redusert proteintilgjengelighet. Fremstillingsmetoder har vært utviklet for å bedre fremstillingen av CRM-proteiner ved bruk av dobbelt-lysogener (R. Rappuoli, 1983, Applied Env. Microbio., 46:560-564; U.S. patent nr. 4.925.792 utstedt til R. Rappuoli; og R. Rappuoli, 1983, J. Bacteriol., 153:1202-1210) av den ikke-toksogene korynefag 11197. Rappuoli rapporterer utbytte av CRMI97 fra dobbelt-lysogener opp til tre ganger høyere enn enkelt-lysogener. Fremstillingsnivåene av CRMI97 av enkelt-lysogener er tilstrekkelige, men økonomisk ikke tilfredsstillende for fremstillingen av vaksiner som benytter CRMI97-protein.
Innføring av multiple lysogener av korynefagen li i Corynebacterium diphtheriae er en besværlig undersøkelses-prosess for å identifisere stammer som kan overprodusere CRMI97-proteinet, difteri-toksin eller andre CRM-proteiner som kryssreagerer med difteri-toksin. I tillegg, er denne fremstilling begrenset med hensyn til dets evne til å forandre proteinekspresjon ved bruk av standard rekombinant teknikker. Det ville derfor være nyttig å utvikle en prosess som kan fremstille betydelige mengder difteri-toksin og CRM-proteiner ved å øke genkopitallet uten anvendelse av korynefag (i; eller ved å øke produksjonsnivåene av disse proteiner fra stammer som er lysogene for korynefag li.
Oppfinnelsen vedrører en ny fremgangsmåte for fremstilling av et full-lengde difteri-toksin eller CRM-protein som kryssreagerer med difteri-toksin. Et spesielt foretrukket DNA-plasmid, betegnet pPX 3511, som kombinerer genet for CRMI97 fra den ikke-toksogene li-fagen og plasmidet pNG2-22, er beskrevet. Det nye plasmidsystemet er i stand til å transformere stammer av Corynebacterium diphtheriae til stammer som er i stand til å uttrykke høye nivåer av CRMI97-proteinet uten anvendelse av multiple lysogener. Oppfinnelsen omfatter et elegant hjelpemiddel for å øke proteinekspresjonen av CRMI97, difteri-toksin og andre CRM-proteiner som er avledet fra difteri-toksingenet. Genekspresjon kan også utføres ved å øke promotorstyrken eller ved å unndra promotoren fra jernregulering. I foretrukne utførelsesformer kan plasmidsystemer benyttes for å uttrykke andre proteiner som genetiske fusjoner med CRMI97, difteri-toksin eller andre CRM-proteiner avledet fra difteri-toksingenet. Den regulerende og prosesserende sekvensen fra CRMI97, difteri-toksin eller andre CRM-proteiner avledet fra difteri-genet, kan benyttes til å uttrykke fremmede proteiner i Corynebacterium spp.
Kort beskrivelse av figurene
Fig. I er et rekombinant DNA-plasmid, betegnet pPX 3511, som inneholder genet for CRMI97, et multippelt kloningssete avledet fra E. co//-kloningsvektor pUC 18 som inneholder kloramfenikol-resistens- (CmR) markøren og en replikasjons-startfra plasmid pNG2-22 (T.M. Serwold-Davis et al., 1990, FEM Microbiol. Lett., 66:119-124). Fig. 2 er en 12% SDS-PAGE-gel som viser fremstillingen av CRMI97 (61,8 kilodalton) fra ulike stammer C. diphtheriae Cl. Spor A: høymolekylvekt-standarder (BRL, 200-14,3 kilodalton); spor B: enkel lysogen C7(BI97)t0X"; spor C: dobbel lysogen C7(IJI97)tox"; spor D: ikke-lysogen C7(-)tox~ med pPX 3511, dyrket uten kloramfenikol (Cm2) (2//g/ml); spor E: ikke-lysogen C7(-)tox" med pPX 3511, dyrket med kloramfenikol (2 //g/ml); spor F: enkel lysogen C7(lil97)tox" med pPX 3511, dyrket uten kloramfenikol (2 //g/ml); spor G: enkel lysogen C7(fcl97)tox" dyrket med kloramfenikol (2 //g(ml). Fig. 3 viser stabiliteten til plasmid pPX 3511 i C. diphtheriae C7(IJI97)tox" ved bruk av kloramfenikolresistens som en indikator på plasmidbevaring uten antibiotika-seleksjon. Oppfinnelsen vedrører en ny fremgangsmåte for fremstilling av et full-lengde difteri-toksin eller CRM-protein som kryssreagerer med difteri-toksin, kjennetegnet ved transformasjon av en mikroorganisme fra arten Corynebacterium diphteria stamme C7 med et plasmid som inneholder a) et gen som koder for difteri-toksin eller CRM-protein;
b) en Co/ynebacfer/um-replikasjonsstart; og
c) en seleksjonsmarkør, og fremstilling av nevnte toksin eller protein under
betingelser som er egnet for å uttrykke genet ved hjelp av mikroorganismen,
og hvor fremgangsmåte ikke avhenger av multiple lysogensystemer. Oppfinnelsen tilveiebringer således difteri-toksin, CRMI97 og andre CRM-proteiner avledet fra difteri-toksingenet i mengder som er tilstrekkelig for anvendelse i vaksiner eller annen benyttelse som krever tilstrekkelige mengder av disse proteinene. Plasmidsystemet omfatter et effektivt hjelpemiddel for å innføre og øke kopitallet av difteri-toksingenet eller CRM-genet i Corynbacterium spp. Plasmidet har sitt eget uavhengige episom med sine egne replikasjonsfunksjoner, hvilket setter plasmidet i stand til å innføre ekstra kopier av difteri-toksinet eller CRM-genet i vertstammer som ikke er i stand til slik integrering eller som ikke tidligere har vært infisert med fag HI97<t0X>". For eksempel er mengdene av CRMI97-proteinet fremstilt av Corynebacterium spp., som har plasmidet, sammenlignbart med, hvis ikke bedre, de mengder med CRMI97-protein som uttrykkes ved hjelp av multiple lysogener av C. diphteriae som har vært infiserte med korynefag BI97<t0X->.
Høyeffektive produksjonsplasmider som anvendes i oppfinnelsen omfatter et gen som koder for difteri-toksin eller CRM-protein med sin promotor og reguleringssignalsekvens; en Corynebacfer/um-replikasjonsstart slik at det resulterende plasmid kan innføres i Corynebacterium spp.; og en seleksjons-markør som kobles valgfritt til et multippelt kloningssete. Dette plasmid benyttes til å transformere mikroorganismer av arten Corynebacterium, og spesielt Corynebacterium diphtheriae, under betingelser som er tilstrekkelig til å uttrykke difteri-toksinet eller CRM-genet. Passende vekstbetingelser kan lett forstås av én som er erfaren i feltet avhengig av vertsorganismen. For optimal produksjon av CRMI97, difteri-toksin eller andre CRM-proteiner fra Corynebacterium spp., er det for eksempel nødvendig å bevare mikroorganismen i medium som har lavt jern-innhold eller ikke inneholder jern.
Plasmidet inneholder et gen som koder for difteri-toksinet eller CRM-proteinet som er avledet fra difteri-toksingenet. Eksempler på CRM-proteiner, det vil si kryssreagerende forbindelser som er immunologisk kryssreaktive med difteri-toksinet som kan benyttes i plasmidkonstruksjonene som anvendes ifølge oppfinnelsen, omfatter, men er ikke begrenset til, CRMI97, CRM45, CRM30 CRM228 og CRMI76. Genet som koder for CRMI97-proteinet er avledet fra difteri-toksin (DT), sekvensen til denne var omtalt av Greenfield et al., (L. Greenfield et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:6853-6857). Forskjellen mellom DT-genet og CRMI97-genet er en enkel baseforandring i strukturgenet. Nukleotidsekvens-ene for noen av CRM-genene har vært omtalt av T. Uchida et al. (J. Biol. Chem., 248:3838-3844,1975). Hele CRM-genet, deriblant dets regulerende signal-sekvens, kan fremstilles ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR). Andre amplifikasjonsteknikker eller syntetiske teknikker kan benyttes for å lage CRMI97-genet eller andre CRM-gener.
Den regulerende signalsekvensen på genet som koder for difteri-toksinet og CRM-proteinet tillater proteinet å utskilles til mediet. Det utskilte proteinet kan således gjenvinnes fra media og renses ifølge kjente fremgangsmåter, slik som saltfelling og søylekromatografi.
Det multiple kloningssetet stammer fortrinnsvis fra pUC 18, men multiple kloningsseter som stammer fra andre kilder kan benyttes, f.eks. Bluescript eller andre syntetiske multiple kloningsseter. Det multiple kloningssetet kan alternativt fjernes fullstendig uten å påvirke funksjonen til plasmidet. En seleksjonsmarkør blir i begge tilfeller bygget inn i plasmidet. Enhver antibiotisk resistensmarkør kan benyttes som seleksjonsmarkøren, slik som, men ikke begrenset til, ampicillin, erytromycin, kloramfenikol og kanamycin. Corynebakteriens følsomhet overfor antibiotika som velges, undersøkes først. Kloramfenikol foretrekkes hvis de uttrykte proteinene skal benyttes til human bruk, siden kloramfenikol har blitt godkjent for dette formål av mat og legemiddeladministrasjonen. Andre fremgangsmåter for plasmidseleksjon, slik som tungmetallresistens eller næringskrav kan benyttes som alternativer til antibiotika resistensmarkørene.
Replikasjonsstartsteder som er nyttige for å konstruere høyproduksjons-plasmider som anvendes ifølge oppfinnelsen, er de som stammer fra Corynebacterium spp. Replikasjonsstartstedet som velges for pPX 3511 er avledet fra Corynebacterium diphtheriae. Se eksempelseksjonen. Andre corynebakterie-replikasjonstart-steder kan benyttes.
I en foretrukket utførelsesform, blir høy ekspresjon av CRMI97-proteinet oppnådd ved bruk av et nytt rekombinant DNA-plasmid, betegnet pPX 3511, som er i stand til å transformere stammer av C. diphtheriae C7 til stammer som lager store mengder CRMI97-protein. Plasmid pPX 3511, vist i fig. I, inneholder CRMI97-genet avledet fra difteri-toksin. (L. Greenfield et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:6853-6857). Den gjenværende delen av plasmidet avledes fra foreldreplasmid pNG2-22 og inn i denne innsettes CRMI97-genet.
Plasmid pPX 3511 fremstilles ved først å forøke CRMI97-genet fra C.
diphtheriae ved polymeraskjedereaksjon (PCR). CRMI97-genet blir så klonet inn i et C. d/pMfter/ae-plasmid som inneholder en seleksjonsmarkør, slik som pNG2 (J. Schiller et al., 1980, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18:814-821) og pNG2-22 (T.M. Serwold-Davis et al., 1990, FEM Microbiol. Lett., 66:119-124). Begge disse plasmider kan benytte et bredt spektrum av verter og er i stand til å replikere i lavt kopitall (5-10 kopier/celle) i alle coryneformer testet hittil.
Utgangsplasmidet pNG2 er et naturlig forekommende C. diphtheriae-plasmid som opprinnelig ble isolert fra erytromycinresistente kliniske stammer. Replikasjonsstartstedet for pNG2 er inneholdt i et 2,6 kb EcoRI-Clal-fragment. Dette replikasjonsstartsted er blitt benyttet for å lage en kloramfenikolresistens-vektor betegnet pNG2-22 (Serwold-Davis et al., Ibid.) og pCM 2,6 (Schmit, 1991, Infect. Immun., 59:1899-1904).
Stamme C. diphtheriae C7 blir så transformert med det resulterende pPX 3511-plasmidet ved elektroporering, hvilket setter bakterien i stand til å fremstille CRMI97 uten tilstedeværelsen av fag IJI97t0X". Andre transformasjonsfremgangs-måter kan benyttes slik som kjente fysiske og kjemiske hjelpemidler (Serwold-Davis et al., Ibid.). Denne fremgangsmåten for elektrotransformasjon med pPX 3511 blir også benyttet ved bruk av C. diphtheriae C7 (UI97)<tox>'-enkeltlysogen for å øke produksjonsnivået av CRMI97-proteinet. Mengdene CRMI97-protein uttrykt av transformantene, sammenlignes med ekspresjonsnivåene fra det enkle lysogenet C. diphtheriae C7(BI97)tox", ATCC No. 5328 og dobbeltlysogenet C. diphtheriae C7(lil97)<t0X>-MI, ATCC No. 39255 som ikke har pPX 3511-plasmidet. Det observeres at når plasmid pPX 3511 transfekteres inn i en C. diphtheriae Cl-stamme, blir transformantene i stand til å uttrykke CRMI97 i nivåer som er like de i C. d/pMfteirae-dobbeltlysogenstammene.
I andre utførelsesformer av oppfinnelsen, blir den nye plasmidvektoren forandret for å skape en serie plasmidvektorer med ulike egenskaper. For eksempel kan seterettet mutagenese benyttes for å reparere enkeltbaseforandringen i CRMI97, slik at det nye plasmidet kan uttrykke difteri-toksin. Andre forandringer kan gjøres i den klonede CRMI97-gensekvensen for å uttrykke andre kjente difteri-toksin-CRM-proteiner, slik som CRM45, CRM30, CRM228 og CRMI76 (T. Uchida et al., 1973, J. Biol. Chem., 248:3838-3844).
Ved bruk av rekombinant DNA-teknikker, kan forandringer gjøres i difteri-toksinregulerende eller prosesserende sekvenser i CRMI97, eller andre lignende klonede difteri-toksin eller CRM-gener kan benyttes for å øke videre fremstillingen av disse proteiner. For eksempel kan toks-promotor-området modifiseres slik at promotoren unndras jernregulering.
I en annen utførelsesform kan plasmidvektorsystemet forandres for å innføre restriksjonsenzymkloningsseter i amino-terminus i CRMI97-genet eller på lignende måte klonede difteri-toksin eller CRM-gen. Kloning av DNA-sekvensene fra andre proteiner i kloningssetene ville tillate plasmidvektoren å samtidig uttrykke andre rekombinante proteiner eller antigener som aminoterminale fusjoner med CRMI97-proteinet eller lignende klonede difteri-toksin eller CRM-protein, alle sammen under regulering av toks-promotoren og signalsekvensen. Kloningsseter kan i tillegg til eller alternativt, innsettes i det karboksyterminale området av CRMI97, slik at difteri-toksin eller på lignende måte klonet CRM kan uttrykke andre proteiner som karboksyterminale fusjoner. På grunn av tilstedeværelsen av den CRMI97-regulerende signalsekvensen, ville det resulterende fusjons-proteinet bli utskilt i kulturmediet. Alternativt kan kun den regulerende signalsekvensen til CRMI97 bli benyttet som et hjelpemiddel for å uttrykke utskilte former av andre proteiner til kulturmediet.
Passende proteiner og antigener som er anvendbare i produksjonsplasmid-et, omfatter spesielle antigener, slik som de som er avledet fra bakterier, virus, parasitter eller sopp, og mikrokomponenter fra celler og løselige antigener, slik som proteiner, peptider, hormoner og glykoproteiner. Antigener av særskilt interesse er virus, sopp, parasitt eller bakterieantigener, allergener, auto-immunitetsavledede antigener, eller svulst-forbundne antigener. Antigenene kan oppnås fra naturlige kilder eller de kan frmstilles ved rekombinant DNA-teknologi eller på annen kunstig måte.
Blant bakterieantigenene av interesse er de som er forbundet med de humane bakterielle patogener deriblant, men ikke begrensende til, for eksempel typebestemte og ikke-typebestemte Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Branhamella catarrhalis, Vibrio cholerae, Neisseria gonorrhoeae, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae og Clostridium tetani. Noen særskilte bakterieantigener omfatter bakterieoverflate og ytre membranproteiner (f.eks. fra Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae eller Branhamella catarrhalis) og bakterieoverflateproteiner (f.eks. M-proteinet fra Streptococcus pyogenes eller 37 kilo-dalton-overflateproteinet fra Streptococcus pneumoniae).
Virusantigenerfra patogene virus omfatter, men er ikke begrenset til, human immunsviktvirus (typene I og II), human T-celle-leukemivirus (typene 1,11 og III), respiratorisk syncytialvirus, hepatitt A, hepatitt B, hepatitt C, non-A og non-B-hepatittvirus, herpes simplex virus (typene I og II), cytomegalovirus, influensavirus, parainfluensavirus, poliovirus, rotavirus, coronavirus, rubellavirus, meslingvirus, vannkoppevirus, Epstein Barr-virus, adenovirus, papillomavirus og gul febervirus.
Flere spesifikke virusantigener fra disse patogene virus omfatter F-proteinet (særskilte antigener som inneholder F-peptidet 283-315, beskrevet i WO89/02935 med tittel "Respiratory Syncytial Virus: Vaccines and Diagnostic Assays" av P. Paradiso et al.) og N- og G-proteinene fra respiratorisk syncytialvirus (RVS), VP4 (tidligere kjent som VP3), VP6- og VP7-polypeptider fra rotavirus, kapsel-glykoproteiner fra human immunsviktvirus, overflate- og nær overflateantigener fra hepatitt B og herpes glykoproteiner B og D.
Antigener fra sopp kan være de som stammer fra de følgende, men uten å være begrenset til, Candida spp. (særskilt albicans), Cryptococcus spp. (særskilt neoformans), Blastomyces spp. (f.eks. dermatitidis), Histoplasma spp. (særskilt capsulatum), Coccidroides spp. (særskilt immitis), Paracoccidroides spp. (særskilt brasiliensis) og Aspergillus spp. Eksempler på parasittantigener omfatter, men er ikke begrenset til, Plasmodium spp., Eimeria spp., Schistosoma spp., Trypanosoma spp., Babesia spp., Leishmania spp., Cryptosporidia spp., Toxoplasma spp. og Pneumocystis spp.
Oppfinnelsen vil illustreres videre ved de følgende eksempler.
Eksempel I: Konstruksjoner
Bakteriestammer
E. coli DH5a (BRL, Gaithersburg, MD) benyttes for alle kloningsformål. Stammer av ikke-toksogene, ikke-lysogene C. diphtheriae C7(-)tox\ ikke-toksogene, enkeltlysogene C. diphtheriae C7(EI97)<t0X>" ATCC No. 5328 benyttes som både plasmidverter og kontroller i CRMI97-proteinekspresjons-studier. Den ikke-toksogene, dobbeltlysogene C. diphtheriae C7(fcl97)lox" ATCC No. 39255 benyttes som kontroll i CRMI97-proteinekspresjonseksperimentene.
Medium- og dvrkninqsbetingelser
E. coli DH5ct dyrkes vanligvis på superoptimal (SOB) agarmedium og i SOB-medium ved 37°C (J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). C. diphtheriae C7-stammer dyrkes rutinemessig på SOC-agar(J. Sambrook et al., Ibid.) og i væske. ET-osmotisk agarmedium (G.R. Best og M.L. Britz, 1986, Appl. Microbiol. Biotech., 23:288-293) benyttes når elektroporerte celler såes ut. CY-medium der jern er fjernet (R. Rappuoli et al., 1983, J. Bacteriol., 153:1202), benyttes for eksperimenter som omfatter ekspresjon av CRMI97. Kloramfenikol tilsetts ved 34 //g/ml med tanke på E. coli DH5ar og 2 //g/ml for C. diphtheriae C7-stammer som inneholder plasmid pPX 3511.
Kloning av CRMI97- genet
CRMI97-genet klones ved PCR- (polymerasekjedereaksjon) forøkning av gensekvensen fra C. diphtheriae C7((il97)<tox>"-enkeltlysogen-DNA ved bruk av oligonukleotid-"primere" ut i fra den publiserte sekvensen til difteri-toksinet (L. Greenfield et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:6853-6857). "Primerne" lages slik at én "primer" ville lage et Sall/Hincll-restriksjonssete i begynnelsen av det funksjonelle genet og den andre ville lage et Xbal-sete etter stoppkodonet i det strukturelle genet. Disse eller lignende "primere" benyttes for å amplifisere og klone CRMI97-genet, difteri-toksin-genet eller ethvert CRM-gen som ligner på difteri-toksingenet kodet for av corynefag li.
CRMI97-PCR-produktene spaltes med Hincll og Xbal og bindes inn i Smal/Xbal-spaltet pNG2-22, som er en bredspektret vert og kloramfenikol-resistensvektor med evnen til å replikere i både Escherichia coli og Corynebacterium spp. Tilkoblingen benyttes til å transformere E. coli DH5a, og rekombinante kolonier undersøkes ved hjelp av restriksjonsanalyse for tilstedeværelsen av CRMI97-genet. Ett isolat, pPX 3511, sekvenseres ved bruk av overlappende "primere" for å undersøke med tanke på mulige forandringer av CRMI97-genet. Oligonukleotid-"primerne" benyttet i PCR og sekvensering, syntetiseres på en Applied Biosystems 380B DNA-syntesemaskin. PCR utføres med en Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler. Sekvensering utføres ved bruk av Applied Biosystems Sequencer 373A. Det resulterende plasmidet (pPX 3511) overføres ved elektroporering inn i en ikke-toksisk, ikke-lysogen stamme C. diphtheriae C7(-)<tox>" og den ikke-toksogene stamme C. diphtheriae C7(lil97)tox", ATCC No. 5328.
Elektroporering av C. diphtheriae C7
C. diphtheriae C7 transformeres med plasmid pPX 35II-DNA ved elektroporering ved bruk av en protokoll utviklet for transformasjon av Corynebacterium glutamicum og Brevibacterium lactofermentum (J.A. Hayes og M.L. Britz, 1989, FEMS Microbiol. Lett., 61:329-334), bortsett fra at SOC-medium tilsatt 0,2% Tween-80 benyttes. For elektroporering benyttes en BTX-transfektor 100 med "Power Plus" og "Optimizor Graphic puls-analysator" og I mm avstandskuvetter. Tilstedeværelsen av plasmid pPX 3511 i de transformerte C. diphtheriae C7-stammene undesøkes ved hjelp av plasmidisolering og restriksjonsanalyse.
Eksempel 2: Ekspresjon
Kvantitative CRMI97- ekspresionsstudier
Sammenligning av CRMI97-fremstilling gjøres i voksne stammer av C. diphtheriae C7 under lignende betingelser, og mengden CRMI97 sammenlignes i dyrkningssupernatanten. I kvantitativ sammenligning mellom stammene, fortynnes 4 ml over-natten-kultur til en OD6oo=0,l i CY-medium uten jern (30 ml endelig volum i 250 ml Erlenmeyer-flaske) og dyrkes under omrysting i 20 timer ved 37°C. Stammer som inneholder pPX 3511, dyrkes både med og uten antibiotikaseleksjon (2 //g/ml kloramfenikol). Etter inkubasjon blir kulturene sentrifugert for å fjerne cellene, og 20 //I av kultursupernatantene undersøkes med 12% SDS-PAGE-gel. Gelen farges med coomassie, og kvantitativ sammenligning gjøres ved bruk av en Bio-Rad Model 1650 Transmittance/Reflectance Scanning Densitometer med en Hoefer Scientific GS 370 Analysis Package. En sammenligning mellom de antigene egenskapene til det rekombinante CRMI97-proteinet og det lysogene HI97<tox>"-CRMI97-proteinet gjøres ved å immunblotte gelen og undersøke med monoklonale antistoffer mot CRMI97. CRMI97 fremstilt av pPX 3511, er antigent indentisk med CRMI97 fremstilt av lysogene stammer.
Plasmid pPX 3511- stabilitetseksperimenter
Stabiliteten til plasmid pPX 3511 undersøkes ved å benytte vedlikeholdet av klormafenikolmotstandsdyktighet som en indikator på plasmidtilstedeværelse uten antibiotikaseleksjon. Kulturer av C. diphtheriae C7(fil97)<tox>"-pPX 3511 dyrkes i SOC-medium supplert med 0,1% Tween-80 for å hindre celleklumping i 18 timer (14-17 generasjoner) ved 37°C. Kulturene såes så ut på SOC-agarfor kolonitelling og fortynnes 1/10 med tanke på neste generasjon. SOC-agarskålene er replika-utsådd på SOC-agar 2//g/ml kloramfenikol, og prosent kolonier som beholder klormafenikolmotstandsdyktighet, beregnes. Denne fremgangsmåte gjentas opp til 60 generasjoner.
Eksempel 3: Biologiske resultater
Den kvantitative sammenligning når det gjelder fremstilling av CRMI97 fra de ulike C. diphtheriae C7-stammene ved hjelp av densitometriske målinger av coomassie-fargede geler (fig. 2) viser at stammene med pPX 3511 lager omtrent to ganger så meget CRMI97 som det enkelte lysogen, og så meget som det doble lysogen (tabell I). Stabiliteten til plasmid pPX 3511 i løpet av 60 generasjoner er vist i fig. 3.
Deponering av biologisk materiale
Plasmid pPX 3511 ble deponert under betingelsene til Budapest-avtalen hos American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852,12. februar 1993, og har fått ATCC-registreringsnummer 75415. Alle restriksjoner med hensyn til tilgjengelighet for publikum av det deponerte materialet vil for alltid heves når et patent tildeles denne søknad. Deponeringen vil opprettholdes i et offentlig deponeringssted i en periode på minst 30 år fra deponeringsdatoen, eller så lenge som patentet gjelder, eller for en periode på 5 år etter datoen for den siste anmodning for innsendelse av en prøve av biologisk materiale, avhengig av hvilken tidsperiode som blir lengst. Deponeringen vil erstattes hvis den skulle bli ødelagt eller ikke i stand til replikasjon.
Claims (4)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av et full-lengde difteri-toksin eller CRM-protein som kryssreagerer med difteri-toksin, karakterisert ved
transformasjon av en mikroorganisme fra arten Corynebacterium diphteria stamme C7 med et plasmid som inneholder a) et gen som koder for difteri-toksin eller CRM-protein; b) en Corynetoacfer/um-replikasjonsstart; og c) en seleksjonsmarkør, og fremstilling av nevnte toksin eller protein under betingelser som er egnet for å uttrykke genet ved hjelp av mikroorganismen,
og hvor fremgangsmåten ikke avhenger av multiple lysogensystemer.
2. Fremgangsmåte ifølge krav I, karakterisert ved at transformasjonsmetoden er elektroporering.
3. Fremgangsmåte ifølge krav I, karakterisert ved at CRM-genet velges fra gruppen som består av CRMI97, CRM45, CRM30, CRM228 og CRMI76.
4. Fremgangsmåte ifølge krav I, karakterisert ved at replikasjonsstart er avledet fra Co/ynebacfer/um-plasmid pNG2.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US2728393A | 1993-03-05 | 1993-03-05 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO940774D0 NO940774D0 (no) | 1994-03-04 |
| NO940774L NO940774L (no) | 1994-09-06 |
| NO313758B1 true NO313758B1 (no) | 2002-11-25 |
Family
ID=21836767
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19940774A NO313758B1 (no) | 1993-03-05 | 1994-03-04 | Fremgangsmåte for fremstilling av difteritoksin eller CRM- protein |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5614382A (no) |
| EP (1) | EP0616034B1 (no) |
| JP (1) | JP4144813B2 (no) |
| KR (1) | KR100316004B1 (no) |
| CN (1) | CN1100757A (no) |
| AT (1) | ATE280235T1 (no) |
| AU (1) | AU686126B2 (no) |
| BR (1) | BR1100634A (no) |
| CA (1) | CA2116914C (no) |
| CZ (1) | CZ39394A3 (no) |
| DE (1) | DE69434079T2 (no) |
| DK (1) | DK0616034T3 (no) |
| ES (1) | ES2231770T3 (no) |
| FI (1) | FI112090B (no) |
| HU (1) | HUT71320A (no) |
| IL (1) | IL108822A (no) |
| NO (1) | NO313758B1 (no) |
| NZ (1) | NZ260027A (no) |
| PT (1) | PT616034E (no) |
| SK (1) | SK24094A3 (no) |
| ZA (1) | ZA941548B (no) |
Families Citing this family (118)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69638145D1 (de) * | 1995-04-14 | 2010-04-22 | Us Gov Health & Human Serv | Verfahren zur herbeiführung einer immuntoleranz mit hilfe von immuntoxinen |
| US7696338B2 (en) | 1995-10-30 | 2010-04-13 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Immunotoxin fusion proteins and means for expression thereof |
| US7288254B2 (en) | 1995-10-30 | 2007-10-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, Nih | Use of immunotoxins to induce immune tolerance to pancreatic islet transplantation |
| US7517527B2 (en) | 1995-10-30 | 2009-04-14 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Immunotoxin with in vivo T cell suppressant activity and methods of use |
| US7125553B1 (en) | 1996-04-15 | 2006-10-24 | The United States of America as represented by the Department of Health and Human Services c/o Centers for Disease Control and Prevention | Methods of inducing immune tolerance using immunotoxins |
| DE69840913D1 (de) | 1997-03-05 | 2009-07-30 | Us Health | Divalent anti-t-zellen immuntoxinen und deren verwendung |
| EP0968282A2 (en) * | 1997-03-05 | 2000-01-05 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Vectors and methods for expression of mutant proteins |
| US6676943B1 (en) | 1997-04-24 | 2004-01-13 | Regents Of The University Of Minnesota | Human complement C3-degrading protein from Streptococcus pneumoniae |
| CN1086945C (zh) * | 1997-06-03 | 2002-07-03 | 胡章英 | 白喉口服液 |
| GB9923060D0 (en) * | 1999-09-29 | 1999-12-01 | Chiron Spa | Vaccine |
| MX339524B (es) | 2001-10-11 | 2016-05-30 | Wyeth Corp | Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica. |
| GB0211118D0 (en) * | 2002-05-15 | 2002-06-26 | Polonelli Luciano | Vaccines |
| WO2004011027A1 (en) * | 2002-07-30 | 2004-02-05 | Baxter International Inc. | Chimeric multivalent polysaccharide conjugate vaccines |
| US7785608B2 (en) * | 2002-08-30 | 2010-08-31 | Wyeth Holdings Corporation | Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease |
| US7301554B2 (en) * | 2002-09-20 | 2007-11-27 | Ricoh Company, Ltd. | Light scanning device, scanning line adjusting method, scanning line adjusting control method, image forming apparatus, and image forming method |
| EA012984B1 (ru) | 2003-12-17 | 2010-02-26 | Вайет | Конъюгаты иммуногенных пептидных носителей и способы их получения |
| MY144231A (en) | 2003-12-17 | 2011-08-15 | Wyeth Corp | Aß IMMUNOGENIC PEPTIDE CARRIER CONJUGATES AND METHODS OF PRODUCING SAME |
| GB0505996D0 (en) | 2005-03-23 | 2005-04-27 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Fermentation process |
| IL308456A (en) | 2005-04-08 | 2024-01-01 | Wyeth Llc | A multivalent pneumomuroral protein-polysaccharide conjugate preparation |
| US7709001B2 (en) | 2005-04-08 | 2010-05-04 | Wyeth Llc | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| TW200806315A (en) | 2006-04-26 | 2008-02-01 | Wyeth Corp | Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions |
| US8808707B1 (en) | 2006-05-08 | 2014-08-19 | Wyeth Llc | Pneumococcal dosing regimen |
| CN101460180B (zh) * | 2006-05-31 | 2012-06-27 | 西尔维奥·布齐 | 与白喉毒素免疫相关的蛋白质分子的药物应用 |
| AR064642A1 (es) | 2006-12-22 | 2009-04-15 | Wyeth Corp | Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi |
| CN101265288B (zh) * | 2007-03-13 | 2012-03-21 | 齐鲁制药有限公司 | Crm197突变体的纯化方法 |
| BRPI1014494A2 (pt) | 2009-04-30 | 2016-08-02 | Coley Pharm Group Inc | vacina pneumocócica e usos da mesma |
| SG10201406432RA (en) | 2009-06-22 | 2014-11-27 | Wyeth Llc | Compositions and methods for preparing staphylococcus aureus serotype 5 and 8 capsular polysaccharide conjugate immunogenic compositions |
| SI2445522T1 (sl) | 2009-06-22 | 2017-10-30 | Wyeth Llc | Imunogeni sestavki antigenov Staphylococcusa aureusa |
| IT1398927B1 (it) | 2009-06-25 | 2013-03-28 | Consorzio Interuniversitario Per Lo Sviluppo Dei Sistemi A Grande Interfase Csgi | Espressione batterica di un gene artificiale per la produzione di crm197 e derivati. |
| AU2010201410B2 (en) * | 2010-03-30 | 2015-04-30 | Pelican Technology Holdings, Inc. | High level expression of recombinant CRM197 |
| AU2011238711B2 (en) | 2010-03-30 | 2015-06-18 | Pelican Technology Holdings, Inc. | High level expression of recombinant toxin proteins |
| AU2011262346B2 (en) | 2010-06-04 | 2014-12-11 | Wyeth Llc | Streptococcus pneumoniae vaccine formulations |
| EP2575868A1 (en) | 2010-06-07 | 2013-04-10 | Pfizer Vaccines LLC | Ige ch3 peptide vaccine |
| KR101594228B1 (ko) | 2010-08-23 | 2016-02-15 | 와이어쓰 엘엘씨 | 네이세리아 메닌기티디스 ｒＬＰ２０８６ 항원의 안정한 제제 |
| AU2011300409B2 (en) | 2010-09-10 | 2015-03-26 | Wyeth Llc | Non-lipidated variants of Neisseria meningitidis ORF2086 antigens |
| KR101839496B1 (ko) * | 2011-06-01 | 2018-03-19 | 시아먼 유니버시티 | 디프테리아 독소 무독성 돌연변이 씨알엠197 또는 그의 단편을 포함하는 융합 단백질 |
| KR101763625B1 (ko) | 2012-03-09 | 2017-08-01 | 화이자 인코포레이티드 | 수막염균 조성물 및 이의 사용 방법 |
| SA115360586B1 (ar) | 2012-03-09 | 2017-04-12 | فايزر انك | تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها |
| US9169304B2 (en) | 2012-05-01 | 2015-10-27 | Pfenex Inc. | Process for purifying recombinant Plasmodium falciparum circumsporozoite protein |
| KR102057217B1 (ko) | 2012-06-20 | 2020-01-22 | 에스케이바이오사이언스 주식회사 | 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물 |
| WO2014013375A1 (en) | 2012-07-16 | 2014-01-23 | Pfizer Inc. | Saccharides and uses thereof |
| CN102766647A (zh) * | 2012-07-25 | 2012-11-07 | 天津康希诺生物技术有限公司 | 在白喉杆菌中稳定复制的表达载体及含该载体的白喉杆菌 |
| IN2015DN00694A (no) | 2012-08-16 | 2015-06-26 | Pfizer | |
| CN104582718B (zh) | 2012-10-03 | 2017-10-24 | 诺华股份有限公司 | 免疫原性组合物 |
| KR20140075201A (ko) | 2012-12-11 | 2014-06-19 | 에스케이케미칼주식회사 | 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물 |
| KR20140075196A (ko) | 2012-12-11 | 2014-06-19 | 에스케이케미칼주식회사 | 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물 |
| IL274500B2 (en) | 2012-12-20 | 2024-01-01 | Pfizer | glycoconjugation process |
| TWI572356B (zh) | 2013-01-04 | 2017-03-01 | 台灣浩鼎生技股份有限公司 | 具有較高碳水化合物抗原密度之疫苗及新穎皂素佐劑 |
| US9802987B2 (en) | 2013-03-08 | 2017-10-31 | Pfizer Inc. | Immunogenic fusion polypeptides |
| US9707153B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-07-18 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
| CN104140972B (zh) * | 2013-05-07 | 2018-01-23 | 上海惠盾生物技术有限公司 | 白喉毒素突变体crm197的制备方法 |
| US9908805B2 (en) | 2013-08-26 | 2018-03-06 | Corning Incorporated | Method for localized annealing of chemically strengthened glass |
| US9822150B2 (en) | 2013-09-08 | 2017-11-21 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
| US11708411B2 (en) | 2013-12-20 | 2023-07-25 | Wake Forest University Health Sciences | Methods and compositions for increasing protective antibody levels induced by pneumococcal polysaccharide vaccines |
| CN105934251A (zh) | 2014-01-21 | 2016-09-07 | 辉瑞大药厂 | 肺炎链球菌荚膜多糖及其缀合物 |
| US11160855B2 (en) | 2014-01-21 | 2021-11-02 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
| PT3096786T (pt) | 2014-01-21 | 2021-08-24 | Pfizer | Polissacáridos capsulares de streptococcus pneumoniae e conjugados dos mesmos |
| WO2015110941A2 (en) | 2014-01-21 | 2015-07-30 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
| WO2015117093A1 (en) | 2014-01-31 | 2015-08-06 | Fina Biosolutions, Llc | Expression and purification of crm197 and related proteins |
| JP2017505792A (ja) | 2014-02-14 | 2017-02-23 | ファイザー・インク | 免疫原性糖タンパク質コンジュゲート |
| US9107906B1 (en) | 2014-10-28 | 2015-08-18 | Adma Biologics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency |
| CN107109416A (zh) | 2014-11-20 | 2017-08-29 | 生物E有限公司 | 用于crm197的高水平表达的密码子优化多核苷酸 |
| PT3244917T (pt) | 2015-01-15 | 2023-05-31 | Pfizer | Composições imunogénicas para utilização em vacinas pneumocócicas |
| KR20170103009A (ko) | 2015-02-19 | 2017-09-12 | 화이자 인코포레이티드 | 나이세리아 메닌지티디스 조성물 및 그의 방법 |
| EP3292146A1 (en) | 2015-05-04 | 2018-03-14 | Pfizer Inc | Group b streptococcus polysaccharide-protein conjugates, methods for producing conjugates, immunogenic compositions comprising conjugates, and uses thereof |
| DK3313436T3 (da) | 2015-06-23 | 2021-03-08 | Biological E Ltd | Multivalent pneumokok-konjugatvaccine |
| SG10202005253TA (en) | 2015-07-21 | 2020-07-29 | Pfizer | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof |
| EP3377098A1 (en) | 2015-11-20 | 2018-09-26 | Pfizer Inc | Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines |
| CN109790545A (zh) | 2016-03-10 | 2019-05-21 | 约翰·霍普金斯大学 | 产生不含聚集物的单体白喉毒素融合蛋白的方法和治疗用途 |
| US11965009B2 (en) | 2016-03-10 | 2024-04-23 | The Johns Hopkins University | Methods of producing aggregate-free monomeric diphtheria toxin fusion proteins and therapeutic uses |
| US11203626B2 (en) | 2016-03-10 | 2021-12-21 | The Johns Hopkins University | Methods of producing aggregate-free monomeric diphtheria toxin fusion proteins and therapeutic uses |
| EP3269385A1 (en) | 2016-07-12 | 2018-01-17 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| EP3474890A1 (en) | 2016-06-22 | 2019-05-01 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften E. V. | Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition |
| CN109862908B (zh) | 2016-08-05 | 2023-05-02 | 圣诺菲·帕斯图尔公司 | 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物 |
| CN109890415B (zh) | 2016-08-05 | 2023-04-04 | 圣诺菲·帕斯图尔公司 | 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物 |
| CA3037056A1 (en) | 2016-09-30 | 2018-04-05 | Biological E Limited | Multivalent pneumococcal vaccine compositions comprising polysaccharide-protein conjugates |
| US10751402B2 (en) | 2016-11-09 | 2020-08-25 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions and uses thereof |
| US11951165B2 (en) | 2016-12-30 | 2024-04-09 | Vaxcyte, Inc. | Conjugated vaccine carrier proteins |
| KR102459629B1 (ko) | 2017-01-20 | 2022-10-28 | 화이자 인코포레이티드 | 폐렴구균 백신에 사용하기 위한 면역원성 조성물 |
| WO2018144438A1 (en) | 2017-01-31 | 2018-08-09 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Methods for production of capsular polysaccharide protein conjugates from streptococcus pneumoniae serotype 19f |
| PE20191107A1 (es) | 2017-01-31 | 2019-08-26 | Pfizer | Composiciones de neisseria meningitidis y metodos respectivos |
| KR101908590B1 (ko) | 2017-02-01 | 2018-10-16 | (주)포바이오코리아 | Crm197의 용해성 단백질 발현 및 정제 방법 |
| WO2018144799A1 (en) | 2017-02-03 | 2018-08-09 | SCHADECK, Eva, Barbara | Haemophilus influenzae saccharide-carrier conjugate compositions and uses thereof |
| US10259865B2 (en) | 2017-03-15 | 2019-04-16 | Adma Biologics, Inc. | Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection |
| RS63551B1 (sr) | 2017-04-22 | 2022-09-30 | Biological E Ltd | Poboljšani postupak za proizvodnju crm na visokom nivou |
| CN111093650B (zh) | 2017-09-07 | 2024-03-01 | 默沙东有限责任公司 | 肺炎球菌多糖及其在免疫原性多糖-载体蛋白缀合物中的用途 |
| CN117982633A (zh) | 2017-12-06 | 2024-05-07 | 默沙东有限责任公司 | 包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的组合物及其使用方法 |
| KR102475419B1 (ko) * | 2018-07-16 | 2022-12-07 | 주식회사 유바이오로직스 | Crm197을 고농도로 발현하는 코리네박테리움 균주 |
| US11260119B2 (en) | 2018-08-24 | 2022-03-01 | Pfizer Inc. | Escherichia coli compositions and methods thereof |
| CN109100517A (zh) * | 2018-10-08 | 2018-12-28 | 武汉生命科技股份有限公司 | 一种用于检测白喉抗体的抗原蛋白、试剂盒及制备方法 |
| CA3120922A1 (en) | 2018-12-12 | 2020-06-18 | Pfizer Inc. | Immunogenic multiple hetero-antigen polysaccharide-protein conjugates and uses thereof |
| SG11202106541WA (en) | 2018-12-19 | 2021-07-29 | Merck Sharp & Dohme | Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof |
| JP7239509B6 (ja) | 2019-02-22 | 2023-03-28 | ファイザー・インク | 細菌多糖類を精製するための方法 |
| CA3136278A1 (en) | 2019-04-10 | 2020-10-15 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof |
| AU2020323498A1 (en) | 2019-07-31 | 2022-03-03 | Sk Bioscience Co., Ltd. | Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate compositions and methods of using the same |
| IL292494A (en) | 2019-11-01 | 2022-06-01 | Pfizer | Preparations of Escherichia coli and their methods |
| CN115362177A (zh) | 2020-02-21 | 2022-11-18 | 辉瑞公司 | 糖类的纯化 |
| JP2023514697A (ja) | 2020-02-23 | 2023-04-07 | ファイザー・インク | 大腸菌組成物およびその方法 |
| EP3900739A1 (en) | 2020-04-21 | 2021-10-27 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Synthetic streptococcus pneumoniae saccharide conjugates to conserved membrane protein |
| EP3919076A1 (en) | 2020-06-02 | 2021-12-08 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Synthetic oligosaccharide vaccines against streptococcus pneumoniae with microparticle adjuvant formulations |
| EP4203995A1 (en) | 2020-08-26 | 2023-07-05 | Pfizer Inc. | Group b streptococcus polysaccharide-protein conjugates, methods for producing conjugates, immunogenic compositions comprising conjugates, and uses thereof |
| KR20230043157A (ko) | 2020-09-17 | 2023-03-30 | 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 | 다가 백신 조성물 및 이의 용도 |
| CA3199094A1 (en) | 2020-10-22 | 2022-04-28 | Pfizer Inc. | Methods for purifying bacterial polysaccharides |
| AU2021368151A1 (en) | 2020-10-27 | 2023-06-01 | Pfizer Inc. | Escherichia coli compositions and methods thereof |
| US20240000912A1 (en) | 2020-11-04 | 2024-01-04 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines |
| EP4243863A2 (en) | 2020-11-10 | 2023-09-20 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
| US20220202923A1 (en) | 2020-12-23 | 2022-06-30 | Pfizer Inc. | E. coli fimh mutants and uses thereof |
| KR20220102871A (ko) | 2021-01-14 | 2022-07-21 | (주)셀트리온 | 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물 |
| TW202245835A (zh) | 2021-02-04 | 2022-12-01 | 美商默沙東有限責任公司 | 用於肺炎球菌結合物疫苗之奈米乳化液佐劑組合物 |
| CA3218544A1 (en) | 2021-05-03 | 2022-11-10 | Pfizer Inc. | Vaccination against bacterial and betacoronavirus infections |
| WO2022234416A1 (en) | 2021-05-03 | 2022-11-10 | Pfizer Inc. | Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections |
| EP4346893A2 (en) | 2021-05-28 | 2024-04-10 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
| US20220387613A1 (en) | 2021-05-28 | 2022-12-08 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
| WO2023135515A1 (en) | 2022-01-13 | 2023-07-20 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof |
| WO2023161817A1 (en) | 2022-02-25 | 2023-08-31 | Pfizer Inc. | Methods for incorporating azido groups in bacterial capsular polysaccharides |
| WO2023218322A1 (en) | 2022-05-11 | 2023-11-16 | Pfizer Inc. | Process for producing of vaccine formulations with preservatives |
| WO2024084397A1 (en) | 2022-10-19 | 2024-04-25 | Pfizer Inc. | Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections |
| WO2024089001A1 (en) | 2022-10-24 | 2024-05-02 | Idorsia Pharmaceuticals Ltd | Vaccine against klebsiella pneumoniae |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH660375A5 (it) * | 1983-02-08 | 1987-04-15 | Sclavo Spa | Procedimento per la produzione di proteine correlate alla tossina difterica. |
| FR2549855B1 (fr) * | 1983-07-29 | 1987-03-27 | Grp Genie Genetique | Sequence nucleotidique codant pour le peptide signal de la toxine diphterique, vecteur contenant cette sequence nucleotidique, leur application a la transformation de micro-organismes et compositions peptidiques obtenues |
-
1994
- 1994-02-07 DE DE69434079T patent/DE69434079T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-02-07 DK DK94101770T patent/DK0616034T3/da active
- 1994-02-07 ES ES94101770T patent/ES2231770T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-02-07 EP EP94101770A patent/EP0616034B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-02-07 AT AT94101770T patent/ATE280235T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-02-07 PT PT94101770T patent/PT616034E/pt unknown
- 1994-02-22 CZ CZ94393A patent/CZ39394A3/cs unknown
- 1994-02-28 SK SK240-94A patent/SK24094A3/sk unknown
- 1994-03-01 JP JP05442894A patent/JP4144813B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-02 IL IL10882294A patent/IL108822A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-03-03 CA CA002116914A patent/CA2116914C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-04 ZA ZA941548A patent/ZA941548B/xx unknown
- 1994-03-04 HU HU9400657A patent/HUT71320A/hu unknown
- 1994-03-04 NZ NZ260027A patent/NZ260027A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-03-04 NO NO19940774A patent/NO313758B1/no not_active IP Right Cessation
- 1994-03-04 KR KR1019940004356A patent/KR100316004B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-03-04 FI FI941050A patent/FI112090B/fi not_active IP Right Cessation
- 1994-03-04 AU AU57595/94A patent/AU686126B2/en not_active Expired
- 1994-03-04 CN CN94102360A patent/CN1100757A/zh active Pending
-
1995
- 1995-05-25 US US08/450,333 patent/US5614382A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-05-13 BR BR1100634-0A patent/BR1100634A/pt active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2116914A1 (en) | 1994-09-06 |
| ES2231770T3 (es) | 2005-05-16 |
| EP0616034A3 (en) | 1996-10-16 |
| KR100316004B1 (ko) | 2002-02-19 |
| CA2116914C (en) | 2005-02-08 |
| FI112090B (fi) | 2003-10-31 |
| BR1100634A (pt) | 1999-12-07 |
| HU9400657D0 (en) | 1994-05-30 |
| SK24094A3 (en) | 1995-03-08 |
| HUT71320A (en) | 1995-11-28 |
| DK0616034T3 (da) | 2005-02-21 |
| CZ39394A3 (en) | 1995-02-15 |
| AU686126B2 (en) | 1998-02-05 |
| FI941050A (fi) | 1994-09-06 |
| NO940774L (no) | 1994-09-06 |
| CN1100757A (zh) | 1995-03-29 |
| ZA941548B (en) | 1994-10-03 |
| EP0616034A2 (en) | 1994-09-21 |
| JPH06292593A (ja) | 1994-10-21 |
| KR940021731A (ko) | 1994-10-19 |
| ATE280235T1 (de) | 2004-11-15 |
| JP4144813B2 (ja) | 2008-09-03 |
| IL108822A0 (en) | 1994-06-24 |
| PT616034E (pt) | 2005-02-28 |
| FI941050A0 (fi) | 1994-03-04 |
| NO940774D0 (no) | 1994-03-04 |
| US5614382A (en) | 1997-03-25 |
| EP0616034B1 (en) | 2004-10-20 |
| DE69434079D1 (de) | 2004-11-25 |
| IL108822A (en) | 2004-09-27 |
| NZ260027A (en) | 1996-03-26 |
| DE69434079T2 (de) | 2005-02-24 |
| AU5759594A (en) | 1994-09-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO313758B1 (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av difteritoksin eller CRM- protein | |
| US7355016B2 (en) | Methods for detection of mycobacteria | |
| EP0712442B1 (en) | Vaccine compositions | |
| EP0544685A1 (en) | Mycobacterial expression vector | |
| NO325016B1 (no) | Fremgangsmate for fremstilling av en proteinanalog til Bordetella-eksotoksin, polypeptidanalog av S1-subenhet fra Bordetella pertussis-toksin og vaksine mot pertussis. | |
| US20100303849A1 (en) | Lipidated Vaccine against Dengue Virus Infection | |
| JP2023154063A (ja) | 肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）の発現 | |
| US8147841B2 (en) | Clostridium toxin, and process for the preparation of immunogenic composition | |
| AU743165B2 (en) | Live attenuated bacteria of the species Actinobacillus pleuropneumoniae | |
| EP0742829B1 (en) | Expression of heterologous proteins in attenuated bacteria using the htra-promoters | |
| US6033877A (en) | Peptide expression and delivery system | |
| AU2002301780B2 (en) | Clostridium toxin and method for preparing immunogenic compositions | |
| AU2007201975B2 (en) | Clostridium Toxin and Method for Preparing Immunogenic Compositions | |
| CN111808202A (zh) | 产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用 | |
| EA045199B1 (ru) | ЭКСПРЕССИЯ ПНЕВМОКОККОВОГО ПОВЕРХНОСТНОГО БЕЛКА А (PspA) | |
| NO304188B1 (no) | Nukleotidsekvens som koder for et ytre membranprotein fra Neisseria meningitt |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |