JP4144813B2 - Crm蛋白質およびジフテリアトキシンを産生させるための新規なプラスミド - Google Patents
Crm蛋白質およびジフテリアトキシンを産生させるための新規なプラスミド Download PDFInfo
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Description
【背景】
CRM197蛋白質は無毒な形態のジフテリアトキシンであるが、これをジフテリアトキシンから免疫学的に区別することは不可能である。毒素産生性を示すコリネファージβのニトロソグアニジン変異誘発で作り出される毒素産生性を示さないファージβ197tox-に感染させたジフテリア菌(Corynebacterium diphteriae)が、CRM197を産生する(Uchida, T.他、 1971、 Nature New Biology 233:8-11)。このCRM197蛋白質の分子量は該ジフテリアトキシンと同じであるが、構造遺伝子内の1つの塩基が変化していることで(グアニンからアデニンへ)それとは異なっている。このように1つの塩基が変化していることが、成熟蛋白質内のアミノ酸置換(グリシンがグルタミン酸に置き換わっている)の原因になっており、それによってジフテリアトキシンの毒性がなくなっている。このCRM197蛋白質は、糖類のための安全で有効なT細胞依存担体であり、現在これは、インフルエンザ菌型bオリゴ糖CRM197接合体ワクチン内で用いられている(HibTiter商標;Lederle Praxis Biologicals、 Rochester、 N.Y.)。
【0002】
ワクチンで用いるに適した有意量でCRM197蛋白質を製造することは、蛋白質量が低いことが原因で妨げられてきた。毒素産生性を示さないコリネファージβ197の二重溶原菌(Rappuoli, R.、 1983、 Applied Env. Microbio. 46:560-564;R. Rappuoliに発行された米国特許第4,925,792号、およびRappuoli, R.、1983、 J. Bacteriol. 153:1202-1210)を用いてCRM蛋白質の産生を助長する技術が開発された。Rappuoliは、二重溶原菌(double lysogen)を用いることによって、単溶原菌(single lysogen)よりも3倍高い収率に及ぶCRM197収率を報告している。単溶原菌によるCRM197の産生レベルは適当であるが、CRM197蛋白質が用いらているワクチン類の製造にとっては経済的に満足されるものではない。
【0003】
コリネファージβの多重溶原菌(multiple lysogen)をジフテリア菌に導入するのは、CRM197蛋白質、ジフテリアトキシン、またはジフテリアトキシンと交差反応性を示す他のCRM蛋白質を過剰生産し得る株を同定するにとって労力を必要とするスクリーニング方法である。加うるに、この方法の能力は、標準的組換え技術が用いられている蛋白質発現操作に限定されている。従って、コリネファージβを用いることなく遺伝子のコピー数を増大させるか、或はコリネファージβに溶原性を示す株からの上記蛋白質産生レベルを増大させることにより、ジフテリアトキシンおよびCRM蛋白質を有意量で生じさせ得る方法を開発することは有益である。
【0004】
【発明の要約】
本発明は、CRM197、ジフテリアトキシン、およびジフテリアトキシン遺伝子から誘導される他のCRM蛋白質、をコード化する遺伝子を操作して導入するための新規な方法およびプラスミド系、並びにこれらの手段で形質転換された微生物に関する。毒素産生性を示さないベータファージ由来CRM197のための遺伝子とプラスミドpNG2−22を結合させる、pPX3511と表示する特に好適なDNAプラスミドを記述する。この新規なプラスミド系は、多重溶原菌を用いることなくCRM197蛋白質を高レベルで発現し得る株に、ジフテリア菌株を形質転換させ得る。本発明は、CRM197、ジフテリアトキシン、およびこのジフテリアトキシン遺伝子から誘導される他のCRM蛋白質の、蛋白質発現を増大させる精密な手段を提供するものである。プロモーターの力を増大させるか、或は鉄調節由来プロモーターを除去することにより、遺伝子発現を操作することも可能である。好適な態様において、このプラスミド系を用いることで、CRM197、ジフテリアトキシン、またはこのジフテリアトキシン遺伝子から誘導される他のCRM蛋白質、との遺伝的融合として、他の蛋白質を発現させることができる。CRM197、ジフテリアトキシン、またはこのジフテリア遺伝子から誘導される他のCRM蛋白質由来の、調節およびプロセシング配列を用いて、コリネバクテリウム種内で外来蛋白質を発現させることができる。
【0005】
【発明の詳細な記述】
本発明は、ジフテリアトキシン、CRM197、およびジフテリアトキシン遺伝子から誘導される他のCRM蛋白質を、ワクチン類内で用いるか或は運用できるに適当な量でこれらの蛋白質を必要としている他の用途で用いるに充分な量で産生させる新規な方法およびプラスミド系に関する。このプラスミド系は、ジフテリアトキシン遺伝子もしくはCRM遺伝子をコリネバクテリウム種の中に導入してそれらのコピー数を増大させるに有効性を示す手段を提供する。このプラスミドは、それ自身の複製機能と共にそれ自身の独立したエピソームを有しており、従って、このプラスミドは、ジフテリアトキシンもしくはCRM遺伝子の余分なコピーを宿主菌株(これらは、このような組み込みの能力を有していないか、或は以前にはファージβ197tox-に感染しなかった)の中に導入することができる。例えば、本発明のプラスミドを有するコリネバクテリウム種が産生するCRM197蛋白質レベルは、コリネファージβ197tox-に感染させたジフテリア菌の多重溶原菌が発現するCRM197蛋白質収率より良好でないにしても匹敵している。
【0006】
本発明の高レベル産生プラスミドは、ジフテリアトキシンもしくはCRM蛋白質をコード化する遺伝子(それのプロモーターおよび調節シグナル配列を含む);コリネバクテリウム属の複製開始点(その結果として得られるプラスミドがコリネバクテリウム種の中に導入され得るように);並びに任意に多重クローニング部位に連結していてもよい、選択性マーカー;を含んでいる。このプラスミドを用い、ジフテリアトキシンもしくはCRM遺伝子の発現を容易にするに充分な条件下で、コリネバクテリウム種の微生物、特にジフテリア菌の形質転換を行う。適切な増殖条件は、その宿主有機体に応じて本分野の技術者に容易に明らかであろう。例えば、コリネバクテリウム種を用いてCRM197、ジフテリアトキシンまたは他のCRM蛋白質を最適に産生させるには、この微生物を、低鉄もしくは脱鉄(deferated)媒体の中に維持する必要がある。
【0007】
このプラスミドは、ジフテリアトキシンか或はこのジフテリアトキシン遺伝子から誘導されるCRM蛋白質、をコード化する遺伝子を含んでいる。CRM蛋白質、即ち本発明のプラスミド構築物内で用いられ得る、ジフテリアトキシンと免疫学的交差反応を示す交差反応材料(Cross-Reacting Materials)の例には、これに限定されるものではないが、CRM197、CRM45、CRM30、CRM228およびCRM176が含まれる。このCRM197蛋白質をコード化する遺伝子はジフテリアトキシン(DT)から誘導され、この後者の配列は、Greenfield他によって報告された(Greenfield, L.他、 1983、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 80:6853-6857)。このDT遺伝子とCRM197遺伝子との間の違いは、構造遺伝子内の塩基の1つが変化している点である。これらのCRM遺伝子のいくつかに関するヌクレオチド配列が、Uchida, T.他(J. Biol. Chem.、 248:3838-3844、 1975)によって報告されている。このCRM遺伝子全体(それの調節シグナル配列を含む)は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で製造され得る。他の増幅技術もしくは合成技術を用いても、このCRM197遺伝子もしくは他のCRM遺伝子を生じさせ得る。
【0008】
ジフテリアトキシンもしくはCRM蛋白質をコード化する遺伝子上の調節シグナル遺伝子は、この蛋白質がその培地内に分泌されることを可能にしている。従って、この分泌された蛋白質は、その培地から回収された後、通常技術、例えば塩沈澱およびカラムクロマトグラフィーなどで精製され得る。
【0009】
該多重クローニング部位は、好適にはpUC18から誘導されるが、他の給源から誘導される多重クローニング部位、例えばpBluescriptもしくは他の合成多重クローニング部位も用いられ得る。また、この多重クローニング部位は、このプラスミドの作用性を干渉しないで全て除去され得る。どちらの場合も、このプラスミドの中に選択性マーカーを組み込む。この選択性マーカーとしては如何なる抗生物質耐性マーカーも用いられ、例えばこれに限定されるものではないが、アンピシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、カナマイシン耐性マーカーなどが用いられ得る。このコリネバクター(corynebacter)がその選択抗生物質に対して示す感受性を最初に試験する。これらの発現させた蛋白質をヒト用途で用いることを意図している場合クロラムフェニコールが好適である、と言うのは、クロラムフェニコールは上記目的に関してFDA(the Food and Drug Administration)に認可されているからである。プラスミド選択に関する他の方法、例えば重金属耐性もしくは栄養要求なども、抗生物質耐性マーカーに対する代替として用いられ得る。
【0010】
本発明の高産生プラスミド類の構築で有効な複製開始点は、コリネバクテリウム種から誘導されるものである。pPX3511に関して選択した複製開始点はジフテリア菌から誘導される。実施例セクションを参照のこと。他のコリネバクター複製開始点も用いられ得る。
【0011】
好適な態様において、ジフテリア菌株C7を形質転換してCRM197蛋白質を高レベルで産生する菌株を生じさせ得る、pPX3511と表示する新規な組換え型DNAプラスミドを用いることで、CRM197蛋白質の高レベル発現を達成する。図1に示すプラスミドpPX3511には、ジフテリアトキシンから誘導されるCRM197遺伝子が含まれている。(Greenfield, L.他、 1983、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 80:6853-6857)。このプラスミドの残りの部分は親プラスミドpNG2−22から誘導され、この中に該CRM197遺伝子を挿入する。
【0012】
プラスミドpPX3511は、最初にポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いてジフテリア菌由来CRM197遺伝子を増幅させることを経由して作り出される。次に、このCRM197遺伝子を、選択性マーカーを含んでいるジフテリア菌プラスミド、例えばpNG2(Schiller, J.他、 1980、 Antimicrobial Agents and Chemotherapy 18:814-821)およびpNG2−22(Serwold-Davis, T.M.他、 1990、 FEM Microbiol. Lett. 66:119-124)にクローン化する。これらのプラスミドの両方共、幅広い宿主域を有しており、今まで試験した全てのコリネフォーム(coryneforms)において低コピー数(5−10コピー/細胞)で複製し得る。
【0013】
親プラスミドpNG2は天然に存在しているジフテリア菌プラスミドであり、これは最初エリスロマイシン耐性臨床菌株から単離されたものであった。pNG2に関する複製開始点は、2.6kbのEcoRI−ClaIフラグメント上に含まれている。この複製開始点を用いて、pNG2−22(Serwold-Davis, T.M.他、上記)およびpCM2.6(Schmit、 1991、 Infect. Immun. 59:1899-1904)と表示するクロラムフェニコール耐性ベクターを作り出した。
【0014】
次に、エレクトロポレーションにより、その得られるpPX3511プラスミドを用いてジフテリア菌株C7の形質転換を行うことで、この細菌は、ファージβ197tox-存在なしでもCRM197を産生し得るようになる。他の形質転換技術、例えば公知の物理的および化学的手段も用いられ得る(Serwold-Davis他、上記)。このpPX3511を用いたエレクトロ形質転換技術を、また、ジフテリア菌C7(β197)tox-単溶原菌を用いて実施することによって、このCRM197蛋白質の産生レベルを上昇させる。この形質転換体が発現するCRM197蛋白質レベルは、単溶原菌であるジフテリア菌C7(β197)tox-(ATCC番号5328)および二重溶原菌であるジフテリア菌C7(β197)tox-M1(ATCC番号39255)[これはpPX3511プラスミドを有していない]による発現レベルに匹敵している。プラスミドpPX3511をジフテリア菌株C7に移入すると、その形質転換体は、ジフテリア菌の二重溶原菌株に匹敵するレベルでCRM197を発現し得ることが観察される。
【0015】
本発明の他の態様において、この新規なプラスミドベクターを修飾して、種々の能力を有する1組のプラスミドベクターを作り出す。例えば部位特異的変異誘発を用いて、CRM197内の単一塩基変化を修復することができ、その結果として、この新規なプラスミドはジフテリアトキシンを発現するようになる。このクローン化したCRM197遺伝子配列に他の変化を生じさせて、他の公知ジフテリアトキシンCRM蛋白質、例えばCRM45、CRM30、CRM228およびCRM176などを発現させるようにすることができる(Uchida, T.他、1973、J. Biol. Chem.、 248:3838-3844)。
【0016】
組換えDNA技術を用い、CRM197または他の同様にクローン化したジフテリアトキシンもしくはCRMの遺伝子が有するジフテリアトキシン調節配列もしくはプロセシング配列に変化を生じさせることにより、更にこれらの蛋白質の産生量を上昇させ得る。例えば、toxプロモーター領域を修飾して、そのプロモーターから鉄調節を取り除くことができる。
【0017】
別の態様において、このプラスミドベクター系を修飾して、該CRM197遺伝子または同様にクローン化したジフテリアトキシンもしくはCRM遺伝子が有するアミノ末端に制限酵素クローニング部位を導入することができる。次に、これらのクローニング部位に他の蛋白質由来DNA配列をクローン化することにより、該CRM197蛋白質または同様にクローン化したジフテリアトキシンもしくはCRM蛋白質とのアミノ末端融合物として他の組換え型蛋白質もしくは抗原を、このプラスミドベクターが共発現するようにすることができ、ここで、これらの全てはそのtoxプロモーターおよびシグナル配列の支配下にある。加うるにか或は別法として、該CRM197、ジフテリアトキシンまたは同様にクローン化されたCRM、が有するカルボキシ末端部分にクローニング部位を挿入することによって、カルボキシ末端融合物として他の蛋白質を発現させることも可能である。このCRM197調節シグナル配列が存在していることにより、その得られる融合蛋白質はその培養培地内に分泌される。また、他の蛋白質を分泌形態として培養培地内に発現させる手段として用いるに必要とされているのは、そのCRM197の調節シグナル配列のみである。
【0018】
本発明の産生プラスミドで有効性を示す適切な蛋白質および抗原には、粒子状抗原、例えば細菌、ウイルス、寄生虫または菌・カビから誘導されるもの、並びに細胞および可溶抗原の微細成分、例えば蛋白質、ペプチド類、ホルモン類および糖蛋白質などが含まれる。特に興味の持たれる抗原はウイルス、菌・カビ、寄生虫もしくは細菌の抗原、アレルゲン、自己免疫関連抗原もしくは腫瘍関連抗原である。これらの抗原は天然源から入手可能であるか、或はこれらは組換えDNA技術または他の人工手段で製造され得る。
【0019】
興味の持たれる細菌抗原の中には、ヒトの細菌病原体に関連している抗原があり、これらには、これに限定されるものではないが、例えば分類分け可能(typable)および分類分け不可能な(nontypable)インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、大腸菌(Escherichia coli)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、カタル球菌(Branhamella catarrhalis)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎かん菌(Klebsiella pneumoniae)および破傷風菌(Clostridium tetani)が含まれる。いくつかの特定的細菌抗原には、細菌の表面および外側膜蛋白質(例えば、インフルエンザ菌、髄膜炎菌、淋菌またはカタル球菌由来)および細菌の表面蛋白質(例えば、化膿連鎖球菌由来M蛋白質または肺炎連鎖球菌由来の37キロダルトン表面蛋白質)が含まれる。
【0020】
病原性ウイルス由来のウイルス抗原には、これに限定されるものではないが、ヒト免疫不全ウイルス(I型およびII型)、ヒトT細胞白血病ウイルス(I型、II型およびIII型)、RSウイルス、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、非Aおよび非B肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(I型およびII型)、シトメガロウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、コロナウイルス、風疹ウイルス、はしかウイルス、水痘ウイルス、エプスタイン・バールウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルスおよび黄熱病ウイルスが含まれる。
【0021】
これらの病原性ウイルスのいくつかの特定ウイルス抗原には、RSウイルス(RSV)のF蛋白質(特に、表題が「RSウイルス:ワクチンおよび診断アッセイ」であるParadiso, P.他の国際公開第89/02935号明細書の中に記述されているFペプチド283-315を含んでいる抗原)およびNおよびG蛋白質、ロタウイルスのVP4(以前はVP3として知られていた)、VP6およびVP7、ヒト免疫不全ウイルスのエンベロープ糖蛋白質、B型肝炎の表面およびプレサーフェス(presurface)抗原、並びにヘルペス糖蛋白質BおよびDが含まれる。
【0022】
菌・カビの抗原は、これに限定されるものではないが、カンジダ(Candida)種[特にアルビカンス(albicans)]、クリプトコックス(Cryptococcus)種[特にネオフォルマンス(neoformans)]、ブラストミセス(Blastomyces)種[例えばデルマティティディス(dermatitidis)]、ヒストプラスマ(Histoplasma)種[特にカプスラーツム(capsulatum)]、コクシジオイデス(Coccidioides)種[特にイミティス(immitis)]、パラコクシジオイデス(Paracoccidioides)種[特にブラジルパラコクシジオイデス(brasiliensis)]およびアスペルギルス(Aspergillus)種を含む菌・カビから誘導される抗原であってもよい。寄生虫抗原の例には、これに限定されるものではないが、プラスモディム(Plasmodium)種、アイメリア(Eimeria)種、住血吸虫(Schistosoma)種、トリパノソーマ(Trypanosoma)種、バベシア(Babesia)種、リーシュマニア(Leishmania)種、クリプトスポリジア(Cryptosporidia)種、トキソプラスマ(Toxoplasma)種およびニューモシスティス(Pneumocystis)種から誘導されるものが含まれる。
【0023】
以下に示す非制限的実施例を用いて本発明のさらなる説明を行う。
【0024】
【実施例】
実施例1:構築物
細菌株
全てのクローニング操作において大腸菌DH5α(BRL、Gaithersburg、 MD)を用いる。CRM197蛋白質発現研究におけるプラスミドの宿主および対照の両方として、毒素産生性を示さず溶原性を示さないジフテリア菌C7(−)tox-株、毒素産生性を示さない単溶原ジフテリア菌C7(β197)tox-株(ATCC番号5328)を用いる。CRM197蛋白質発現実験における対照として、毒素産生性を示さない二重溶原ジフテリア菌C7(β197)tox-株(ATCC番号39255)を用いる。
【0025】
培養培地および条件
大腸菌株DH5αを37℃の超最適ブロス(SOB)寒天培地上およびSOB液内で常規通り増殖させる(Sambrook, J.他著「分子クローニング:実験室マニュアル」(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、 1989、Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor、 NY)。ジフテリア菌C7株をSOC寒天培地(Sambrook, J.上記)および液内で常規通り培養する。エレクトロポレーションを行った細胞を平面培養する場合、ET浸透寒天培地(Best, G.R.およびM.L. Britz、 1986、 Appl. Microbiol. Biotech.、 23:288-293)を用いる。CRM197の発現を伴う実験では、脱鉄CY培地(Rappuoli, R.他、 1983、 J. Bacteriol.、 153:1202)を用いる。クロラムフェニコールを、大腸菌DH5αでは34μg/mL添加しそしてプラスミドpPX3511を含んでいるジフテリア菌C7株では2μg/mL添加する。
【0026】
CRM197遺伝子のクローニング
公開されているジフテリアトキシン配列(Greenfield, L.他、 1983、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6853-6857)を基準にしたオリゴヌクレオチドプライマーを用いた、ジフテリア菌C7(β197)tox-単溶原菌DNA由来の遺伝子配列をPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)増幅させることによって、CRM197遺伝子のクローニングを行う。1つのプライマーがその機能遺伝子の開始点にSalI/HincII制限部位を作り出しそしてもう1つのプライマーがその構造遺伝子の遺伝子終止コドンの後ろにXbaI部位を作り出すように、上記プライマーの設計を行う。これらのもしくは同様なプライマーを用いて、このCRM197遺伝子か、ジフテリアトキシン遺伝子か、或はコリネファージβがコード化するジフテリアトキシン遺伝子に類似した何らかのCRM遺伝子の、増幅およびクローニングを行う。
【0027】
このCRM197のPCR産物をHincIIおよびXbaIで消化させた後、SmaI/XbaIで消化させたpNG2−22(大腸菌およびコリネバクテリウム種の両方の中で複製する能力を有する幅広い宿主域のクロラムフェニコール耐性ベクター)に結合させる。この連結反応を用いて大腸菌DH5αの形質転換を行い、そしてこのCRM197遺伝子の存在に関する制限分析により、組換え型コロニーのスクリーニングを行う。このCRM197遺伝子に対する何らかの変化を検査するための重なりプライマーを用いて、1つの単離物であるpPX3511の配列決定を行う。Applied Biosystems 380BDNAシンセサイザーを用いて、PCRおよび配列決定で用いるオリゴヌクレオチドプライマー類の合成を行う。Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cyclerを用いてPCRを行う。Applied Biosystems Sequencer 373Aを用いて配列決定を行う。その得られるプラスミド(pPX3511)を、エレクトロポレーションにより、その毒素産生性を示さず溶原性を示さないジフテリア菌C7(−)tox-株および毒素産生性を示さないジフテリア菌C7(β197)tox-株(ATCC番号5328)に転移させる。
【0028】
ジフテリア菌C7のエレクトロポレーション
Tween-80を0.2%補ったSOC培地を用いる以外は、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)およびブレビバクテリウ・ラクトフェルメンツム(Brevibacterium lactofermentum)の形質転換を行う目的で開発されたプロトコル(Hayes, J.A.およびM.L. Britz、 1989、 FEMS Microbiol. Lett. 61:329-334)を用いたエレクトロポレーションにより、プラスミドpPX3511のDNAを用いてジフテリア菌C7の形質転換を行う。エレクトロポレーションでは、Power PlusおよびOptimizor Graphic Pulse Analyzerが備わっているBTX Transfector 100、および間隙が1mmのキュベットを用いる。プラスミドレスキューおよび制限分析により、その形質転換したジフテリア菌C7株内にプラスミドpPX3511が存在していることを確かめる。
【0029】
実施例2:発現
定量的CRM 197 発現研究
同様な条件下でジフテリア菌C7株を増殖させた後、その培養上澄み液内のCRM197量を比較することにより、CRM197産生の比較を行う。これらの菌株の定量的比較では、4mLの一晩培養物を脱鉄CY培地で希釈してOD600=0.1になるようにし(250mLの三角フラスコ内の最終体積30mL)、そして37℃で20時間振とうして増殖させる。pPX3511を含んでいる菌株を、抗生物質選択の有り無し両方で増殖させる(2μg/mLのクロラムフェニコール)。インキュベートした後、これらの培養物を遠心分離にかけることで細胞を除去し、そしてこの培養物の上澄み液20μLを12%SDS−PAGEゲルの上で泳動させる。このゲルをクーマシー染色した後、Hoefer Scientific GS 370 Analysis Packageが備わっているBio-Rad Model 1650透過率/反射率走査濃度計(Transmittance/Reflectance Scanning Densitometer)を用いて定量比較を行う。このゲルのイムノブロッティングを行いそしてCRM197に対するモノクローナルを用いて検査することにより、組換え型CRM197蛋白質と溶原性β197tox-のCRM197蛋白質が示す抗原特性の比較を行う。pPX3511が産生するCRM197は、溶原性菌株が産生するCRM197と抗原的に同じである。
【0030】
プラスミドpPX3511の安定性実験
抗生物質選択無しプラスミド保持の指示としてクロラムフェニコール耐性の持続を用いることにより、プラスミドpPX3511が示す安定性を試験する。細胞凝集を防止する目的でTween-80を0.1%補ったSOCブロス内で18時間(14−17世代)、37℃で、ジフテリア菌C7(β197)tox-pPX3511の培養物を増殖させる。次に、コロニーの数を数える目的で、これらの培養物をSOC寒天上で平面培養した後、次世代のために1/10希釈する。これらのSOC寒天プレートを、クロラムフェニコールが2μg/mL入っているSOC寒天上でレプリカ平板培養した後、クロラムフェニコール耐性を維持しているコロニーのパーセントを計算する。60世代に及んでこの方法を繰り返す。
【0031】
実施例3:生物学的結果
クーマシー染色したゲルの濃度測定を用いた、異なるジフテリア菌C7株によるCRM197産生の定量的比較(図2)により、pPX3511はその単溶原菌よりも約2倍多い量でCRM197を産生し、そしてその二重溶原菌と同様に多量産生することが示された(表1)。このプラスミドpPX3511が60世代に渡って安定であることは、図3に示されている。
【0032】
生物学的寄託
ブタペスト条約の規定の下で、プラスミドpPX3511を1993年2月12日付けでthe American Type Culture Collection(ATCC)、 12301 Parklawn Drive、 Rockville、 Maryland 20852に寄託し、ATCC取得番号75415と指定された。この寄託材料の公共利用に対する全ての制限は、本出願に対して特許が与えられた時点で最終的に取り除かれる。この寄託は、この寄託日から少なくとも30年間か或はこの特許の有効期間か或はこの生物材料のサンプル提供に関する最も新しい要求日から5年間のいずれか長い方の期間に渡って、公共寄託所に維持される。この寄託物の活力がなくなるか或は複製能力がなくなる場合それを交換するものとする。
【0033】
本分野の技術者は、常規実験を用いるのみで、本明細書で特定的に記述した本発明の特定態様に対する数多くの相当物を認識するか或は確かめることができるであろう。上記相当物を請求の範囲内に包含させることを意図している。
【0034】
本発明の特徴および態様は以下のとうりである。
【0035】
1.ジフテリアトキシンと交差反応性を示すジフテリアトキシンもしくはCRM蛋白質の製造方法において、a)ジフテリアトキシンもしくはCRM蛋白質をコード化する遺伝子、b)コリネバクテリウム属の複製開始点、およびc)選択性マーカー、を含んでいるプラスミドを用いて、コリネバクテリウム種微生物の形質転換を行い、そして該微生物による該遺伝子の発現に充分な条件下で上記トキシンもしくは蛋白質を発現させる、ことを含む方法。
【0036】
2.該形質転換方法がエレクトロポレーションによるものである第1項の方法。
【0037】
3.該微生物がジフテリア菌である第1項の方法。
【0038】
4.該ジフテリア菌株が株C7である第3項の方法。
【0039】
5.該CRM遺伝子がCRM197、CRM45、CRM30、CRM228およびCRM176から成る群から選択される第1項の方法。
【0040】
6.該複製開始点がコリネバクテリウム属プラスミドpNG2から誘導される第1項の方法。
【0041】
7.a)ジフテリアトキシンもしくはCRM蛋白質をコード化する遺伝子、
b)コリネバクテリウム属の複製開始点、および
c)任意に多重クローニング部位に連結している、選択性マーカー、
を含んでいる、宿主内でジフテリアトキシンと交差反応性を示すジフテリアトキシンもしくはCRM蛋白質を発現させるためのプラスミド。
【0042】
8.該蛋白質をコード化する遺伝子が、作用を示す様式で、1種以上の蛋白質、ペプチド類またはそれらのエピトープ類をコード化するヌクレオチド配列に連結している第7項のプラスミド。
【0043】
9.プラスミドpPX3511、ATCC取得番号75415。
【0044】
10.第7項のプラスミドで形質転換されているコリネバクテリウム種の微生物。
【図面の簡単な説明】
【図1】CRM197のための遺伝子、クロラムフェニコール耐性(CmR)マーカーを含んでいる大腸菌クローニングベクターpUC18から誘導される多重クローニング部位、およびプラスミドpNG2−22(Serwold-Davis, T.M.他、 1990、 FEM Microbiol. Lett. 66:119-124)から誘導される複製開始点、を含んでいる、pPX3511と表示する組換え型DNAプラスミドの略図である。
【図2】異なるジフテリア菌株C7からのCRM197(61.8キロダルトン)産生を示す12%SDS−PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)の結果を示す図に代わる写真である。レーンA:高分子量の標準(BRL、200−14.3キロダルトン);レーンB:単溶原菌C7(β197)tox-;レーンC:二重溶原菌C7(β197)tox-;レーンD:クロラムフェニコール(Cm2)(2μg/mL)なしで増殖させたpPX3511を有する非溶原性C7(−)tox-;レーンE:クロラムフェニコール(2μg/mL)有りで増殖させたpPX3511を有する非溶原性C7(−)tox-;レーンF:クロラムフェニコール(2μg/mL)なしで増殖させたpPX3511を有する単溶原菌C7(β197)tox-;レーンG:クロラムフェニコール(2μg/mL)有りで増殖させた単溶原菌C7(β197)tox-。
【図3】抗生物質選択なしで、プラスミド保持の指示としてクロラムフェニコール耐性を用いた、ジフテリア菌C7(β197)tox-内におけるプラスミドpPX3511の安定性を示すグラフである。
Claims (3)
- ジフテリアトキシンもしくはジフテリアトキシンと交差反応性を示すCRM蛋白質の製造方法において、
プラスミドpNG2中に存在する複製開始点および選択性マーカーを含んでなるプラスミドpNG2−22にジフテリアトキシンもしくはCRM蛋白質をコードする遺伝子を挿入したプラスミドを用いて、ジフテリアC7株(Corynebacterium diphtheria C7)の微生物の形質転換を行い、そして
該微生物による該遺伝子の発現に十分な条件下で上記トキシンもしくは蛋白質を発現させる、ことを特徴とする方法。 - プラスミドpNG2中に存在する複製開始点および多重クローニング部位に連結している選択性マーカーを含んでなるプラスミドpNG2−22にジフテリアトキシンもしくはCRM蛋白質をコードする遺伝子が挿入されたプラスミド。
- 請求項2のプラスミドで形質転換されているジフテリア菌C7株(Corynebacterium diphtheria C7)の微生物。
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