JPH06506111A - ボルデテラブロンキセプティカ外膜抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ボルデテラプロンキセプティカ外膜抗原本発明はボルデテラプロンキセプティカ （Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）に対する予防接種へ の使用に適した蛋白質に関する。

Ｂｏｒｄｅｔ、ｅｌｌａ　ｂｒｏｎｃｈｊｓｅ　ｔｔｅａは、動物の呼吸器疾患 、とくにブタの萎縮性鼻炎に関連した細菌性病原体である。この疾患状態は１発 育段階の仔ブタの鼻組織における重篤な変化、肺炎ならびに級長遅滞によって認 識される６本発明者らは。

旦、ｂｒｏｎｃｈｌｓｅ　ｔｌｅａ媒介Ｗ縮性鼻炎に対する防御が、ＳＤＳポリ アクリルアミドゲル電気泳動で測定して分子量６８ｋＤ！　（Ｐ　、　６ｇ）の 外膜蛋白質の存在に相関することを明らかにした（　Ｎｏｖｏｔｎｙら、１９８ Ｓｂ）　、この６８ｋＤａ蛋白質に対する抗体は、防御された仔ブタでは高力価 で検出できるが、一方、防御されていない動物では力価は低いか存在しない（Ｎ ｏｖｏｔｎｙら、１９８Ｓｂ）　、Ｌかも、天然に存在する。　６８ｋＤｘ蛋白 質を欠く変異体のＢ、ｂｒｏｎｅｈｉｓｅ　ｔｌｅｉは、ワクチンとして使用し ても仔ブタを防御できないし、また感染した仔ブタに病的変化を誘導することも ない（Ｎｏｖｏｔｎｙら、１９１＋５ｂ）　。

６８ｋＤａ蛋白質の精製プレパレータ１ンからなるワクチンを妊娠した雌ブタに 投与しておくと、生れた仔ブタには、病原性の強いＢ、　ｂｒ坦吐ｎｕ豆■をチ ャレンジさせても宵意な防御効果が認められる（Ｋｏｂｒｓｃｈ　＆　Ｎｏｖｏ ｌｎｙら、１９９０）　、さらに。

６８ｋＤａ蛋白質に特異的なモノクローナル抗体Ｂ　ＢＯ５（Ｎｏｖｏｔｎｙら 、　１９８Ｓａ）の受動投与は、病原性の強いＢ、　ｂｒ匹肋ｎ肚ｕ９をエアゾ ル感染させたマウスの肺炎による死亡およびＩＥＩ性鼻炎の発症を予防できるこ とが明らかにされたのである。

ネイティブなＰ、６８抗原は、　Ｂ、ｂｒｏｎｅｈｉｓｅ　ｔｉｅｓの培養液か らは、低レベルでしか精製できない１本発明者らは、今回、Ｐ６８を発現する遺 伝子が、実際にはＭｒ９３９Ｈ（Ｐ　、　９４）の蛋白質をコードしていること を発見した。　Ｂ、ｂｒｏｎｃｈｉｓｅ　ｔＩｃｍの表面上でＰ、９４が処理さ れてＰ、６８が形成されるものと推測される５本発明者らはまた。Ｐ、９４をフ ードする全長遺伝子の大ｌ１％ｍでの異種発現によっても、同様のプロセシング て、細菌外膜に向けられたＰ、６８を生じることを発見した。これにより・他の Ｂ、ｂｒｏｎｅｈｉｓｅ　ｔｉｃａ成分が夾雑しないＰ、６ｇを大量に製造する ことが可能になる。

したがって１本発明は、Ｂ、ｂｒ坦殖旦組豆印からの成分が夾雑せず、ネイティ ブなり、ｂｒｏｎｅｈｌｓｅ　ｔｔｅａからのＰ、６８抗原にも結合する抗体に 結合できて、（ａ）次のアミノ酸配列： ＤＷＮＮＱＳ　Ｉ　ＩＫＡＧＥＲＱＨＧＩＨＩＫＱＳＤＧＡＧＶＲＴＡＴＧＴＴ ＩＫＶＳＧＲＱＡＱＧＶＬＬＥＮＰＡＡＥＬＲＦＱＮＧＳＶＴＳ　５ＧＱＬＦＤ ＥＧＶＲＲＦＬＧＴＶＴＶＫＡＧＫＬＶＡＤＨＡＴＬＡＮＶＳＤＴＲＤＤＤＧ　 Ｉ　ＡＬＹＶＡＧＥＱＡＱＡＳ　Ｉ　ＡＤＳＴＬＱＧＡＧＧＶＲＶＥＲＧＡＮＶ ＴＶＱＲＳＴ　ＴＶＤＧＧＬＨＩＧＴＬＱＰＬＱＰＥＤＬＰＰＳＲＶＶＬＧＤＴ ＳＶＴＡＶＰＡＳＧＡＰＡＡＶＳＶＦＧＡＮＥＬＴＶＤＧＧＨＩ　ＴＧＧＲＡＡ ＧＶＡＡＭＤＧＡ　ＩＶＨＬＱＲＡＴＩＲＲＧＤＡＰＡＧＧＡＶＰＧＧＡＶＰＧ ＧＦＧＰＬＬＤＧＷＹＧＶＤＶＳＤＳＴＶＤＬＡＱＳ　ＺＶＥＡＰＱＬＧＡＡ　 ＴＲＡＧＲＧＡＲＶＴＶＳＧＧＳＬＳＡＰＨＧＮＶＴＥＴＧＧＧＡＲＲＦＰＰＰ ＡＳＰＬＳ　ＩＴＬＱＡＧＡＲＡＱＧＲＡＬＬＹＲＶＬＰＥＰＶＫＬＴＬＡＧＧ ＡＱＧＱＧＤ　Ｉ　ＶＡ置ＰＰＩＰＧＡＳＳＧＰＬＤＶＡＬＡＳＱＡＲＷＴＧＡ ＴＲＡＶＤＳＬＳ　ｒＤＮＡＴＷＶＭＴＤＮＳＮＶＧＡＬＲＬＡＳＤＧＳＶＤＦ ＱＱＰＡＥＡＧＲＦＫＣＬＭＶＤＴＬＡＧＳＧＬＦＲＭＮＶＦＡＤＬＧＬＳＤＫ ＬＶＶＭＲＤＡＳＧＱＨＲＬＬＶＲＮＳＧＳＥＰＡＳＧＮＴＭＬＬＶＱＴＰＲＧ ＳＡＡＴＦＴＬＡＮＫＤＧＫＶＤＩＧＴＹＲＹＲＬＡＡＮＧＮＧＱＷＳＬＶＧＡ ＫＡＰＰＡＰＫＰＡＰＱＰＧＰＱＰＧＰＱＰＰＱＰＰＱＰＰＱＰＰＱＲＱＰＥＡ ＰＡＰＱＰＰＡＧＲＥＬＳＡＡＡＮＡＡＶＮＴＧＧＶＧＬＡＳＴＬＷＹＡＥＳＮ を育するか、または（ｂ）上記アミノ酸配列（ａ）と９８％を越えるホモロジー を有する蛋白質を提供する。

この蛋白質は単離され、精製されてもよい、すなわち、純粋な型として提供でき る。純度は９０％もしくはそれ以上、または９５％もしくはそれ以上とすること ができる。アミノ酸配列（ａ）はＰ、６８のアミノ酸配列である。アミノ酸配列 （ｂ）は。

１個または２個以上のアミノ酸挿入、欠失または置換を含有する。したがって。

アミ７酸配列（ａ）および（ｂ）は互いに、１２箇所未満、たとえば８箇所未満 もしくは４Ｍ所未満の位置で異なっている、したがって、配列間のポモロジーは ９８％もしくはそれ以上、たとえば９９％もしくはそれ以上である。

したがって１元の配列の物理化学的性質、たとえば電荷密度、疎水性／親水性。

サイズおよびフンフィギ晶し−ジ璽ンが保持されることを条件に、アミノ酸配列 （鳳）の１個もしくは２個以上のアミノ酸残基が欠失もしくは置換されてもよく 。

また１個もしくは２個以上の付加的アミノ酸残基が挿入されてもよい、改変アミ ノ酸配列から構成される蛋白質はまた。ネイティブなＰ、６８抗原に結合できる 抗体に結合できるものでなければならない、置換の候補は次の通りである。

Ｇに代えてＡおよびその逆 ＶをＡ、　ＬまたはＧに ＫをＲに Ｓ％Ｔにおよびその逆 ＥをＤにおよびその逆、ならびに ＱをＮにおよびその逆 本発明の蛋白質は組換えＤＮＡ技術によって得られる。したがって、その蛋白質 の製造は、蛋白質をコードするＤＮＡ配列の準備に依存する。しかしながら。

本発明者らは、Ｐ、９４と命名された大きな前駆体蛋白質のプロセシング型であ ることを見出した。Ｐ、９４をコードするＤＮＡ配列も０本発明の蛋白質の発現 に使用できる。したがって、さらに他の態様においては１本発明は。

−アミノ酸配列（１）または（ｂ）からなる本発明の蛋白質をコードするＤＮＡ 配列。

−図１に示すヌクレオチド２４フからヌクレオチド２０４０までのヌクレオチド 配列から本質的に構成されるＤＮＡ配列。

−図１に示すヌクレオチド２４フからヌクレオチド２０４０までのヌクレオチド 配列と１２未満の位置で興なるＤＮＡ配列。

−図１に示すアミノ酸配列または図１に示すアミノ酸配列と９８％を越えるホモ ロジーを有するアミノ酸配列の蛋白質。

−前項に定義した蛋白質をコードするＤＮＡ配列。

−図１に示すヌクレオチド１４５からヌクレオチド２８７７までのヌクレオチド 配列から本質的に構成されるＤＮＡ配列。

−図１に示すヌクレオチド１４５からヌクレオチド２８７７までのヌクレオチド 配列と１２未満の位置で興なるＤＮＡ配列。

−図１に示す配列または図１に示す配列と９６％を越えるホモロジーを有する配 列から本質的に構成されるＤＮＡ配列 を提供する。

図１に示すヌクレオチド２４７からヌクレオチド２０４０までのヌクレオチド配 列およびヌクレオチド１４Ｋからヌクレオチド２６７フまでのヌクレオチド配列 は、それぞれ、Ｐ、６ｇおよびＰ、９４をコードする。これらの２つの配列と具 なるＤＮＡ配列は。

１２箇所までたとえば８１１所未満もしくは４箇所未満の位置で異なつていてよ い。

これらの差はコードの変化を生じてもよ（、また生じなくてもよい、コドンが押 入されても省略されても、またヌクレオチドが置換されていてもよい、Ｐ、６１ １およびＰ、９４をコードする図１に示す配列とこれらのＤＮＡ配列の改変バー ジ謬ンの間の差は、９８％もしくはそれ以上たとえば９９％もしくはそれ以上の 程度である。

ＤＮＡ配列は精製され、単離されてもよい、ＤＮＡ配列は最初から、たとえば。

適当な配列のオリゴヌクレオチドの合成およびアニーリングにより９合成するこ とができる。ＤＮＡ配列はクローン化された配列であってもよい。

ＤＮＡ配列のクローニングは本技術分野で既知の標準操作を用いて実施できる。

しかしながら、この操作においては、所望のクローン化ＤＮＡ配列の同定および 単離を容易にするように本明細書に開示された配列データを使用することがとく に有利である。好ましくは、ＤＮＡは、　Ｈｕｌｌら（１９８１）によって記載 されＭａｓｋｅｌｌら、　Ｊ、Ｂａｅｔａｒｉｏｌ、　１フＯ：　２４８７−２ ４７１（１９８ｇ）によって改良された方法によって単離される。ＤＮＡはつい で制限酵素によって消化して短いフラグメントを発生させ。

次にこれをクローニングベクターたとえばコスミドｐＨｃ７９またはその誘導体 に挿入し、得られた組換えＤＮＡ分子を用いて大腸菌をトランスフオームし、か くして所望のライブラリーを発生させる。

ライブラリーは標準的なスクリーニング戦略を用いてスクリーニングできる。

たとえば、ハイブリダイゼーシ璽ンブローブとしては１本明細書に開示されてい るＤＮＡ配列情報を用いて合成された１個もしくは２個以上の標識オリゴヌクレ オチドを採用することができる。１種類または他の種類のさらにｌまたは２回以 上のラウンドのスクリーニングを実施して、陽性クローンの特徴づけおよび確認 を行うことができる。

最初の陽性クローンが確認されたならば、ライブラリーは、この最初のクローン をハイブリダイゼーシッンブローブとして用いて、さらに陽性クローンの再スク リーンニングを行うことができる。別法として、あるいは付加的に、別のライブ ラリーを調製し、ハイブリダイゼーシ冒ンプローブを用いてこれらをスクリーニ ングすることもできる。この方法でさらにＤＮＡ配列を得ることができる。

このようにしてクローン化または合成が行われたならば、所望のＤＮＡ配列を。

既知の標準的技術を用いて１発現ベクターに挿入できる１発現ベクターは通常。

制限酵素を用いて切断され、そのＤＮＡ配列はプラント末端または付着端リゲー シ嘗ンを用いて挿入される。切断は通常１発現ベクターの便利な位置の制限部位 に、そのＤＮＡ配列が挿入されたならばその発現を実行するＤＮＡの要素の制御 下に置かれるように行われる。

これらの要素は宿主によつて変動するが１通常はプロモーター、リポソーム結合 部位、翻訳開始および停止部位、ならびに転写終結部位が包含される。このよう なベクターの例にはプラスミドおよびフスミドがある１本発明の発現ベクターは 染色体外ベクターおよび宿主細胞の染色体に組込まれるベクターの両者を包含す る。

したがって９本発明はまた。

一本明細書で定義されたＤＮＡ配列を含有し、適当な宿主に提供されたとき本発 明のフード蛋白質を発現できる発現ベクター、および−このような発現ベクター でトランスフオームされた宿主を提供する。

本発明に使用される宿主細胞の例には、原核および真核細胞、たとえば細菌。

酵母、哺乳動物および昆虫細胞が包含される。このような細胞の特定の例として は、　Ｅ、ｅｏｌｉ、　Ｓ、ｃｅｒｅｖｌｓ＋ａｅ、　Ｌ■■肛口、チャイニー ズＩ−ムスクー卵胞およびマウス細胞、ならびに江剋肚シコ」工１組虹白および Ｔｒｌｃｏ　１ｕｓｉａ　ｎｌがある。宿主細胞の選択は多くの因子に依存する が、抗原の開訳後修飾が重要であり、したがって原核細胞宿主が好ましいと考え られる。

宿主細胞のトランスホーメータ１ンは標準技術を用いて実施できる０表現型マー カーが通常９発現ベクターの取り込みに成功したトランスホーマントとそうでな いものとの間の識別に使用される。トランスフオームされた宿主細胞の培養およ び抗原の単離も標準技術を用いて実施できる。

したがって２本発明は１本発明の蛋白質を製造するにあたり１本発明の発現ベク ターによって上記蛋白質が発現するような条件下にトランスフオームされた宿主 を維持する方法を提供する。さらに詳しくは、その方法は。

一本明細書で定義された蛋白質をコードするＤＮＡ配列をクローン化または合成 し。

−このＤＮＡ配列を、適当な宿主中での発現が可能なように９発現ベクター中に 挿入し。

一宿主細胞を発現ベクターでトランスフオームし。

−トランスフオームされた宿主細胞を培養し、ついで−蛋白質を単離する ことからなる。

この方法で、Ｐ、６Ｂもしくは本発明によるその修飾バージ１ン、またはＰ、９ ４もしくは本発明によるその修飾バージ１ンの異種発現が達成できる。すなわち 、これらの蛋白質は、　Ｂ、ｂｒｏｎｅｈｉｓｅ　ｔｌｅａではない宿主中で発 現させることができる。

したがって、　Ｂ、ｂｒｏｎｅｈｉｓｅ　ｔｌ印の他の成分を含まない蛋白質を 得ることができる。

Ｐ、９４またはその修飾バージ廖ンは、Ｐ、８８またはその修飾パージ曹ンにプ ロセッシングされることができる。したがって、Ｐ、６ｇまたはその修飾バージ １ンは。

Ｐ、６８もしくはその修飾バージ嘗ンをコードするＤＮＡ配列またはその前駆体 分子Ｐ、９４もしくはその修飾バージ璽ンをフードするＤＮＡ配列を含有する発 現ベクターでトランス７オームされた宿主から得ることができる。

この方法で得られた蛋白質は不溶性で、慣用方法により変性剤としてグアニジニ ウム塩酸塩を使用して再フォールディングする必要のある場合がある。いずれに しても、精製することが好ましい。

本発明はさらに９本発明の蛋白質と、動物薬用として許容される担体または希釈 剤からなる動物薬組成物を提供する。この組成物はワクチンとして使用すること ができる１本発明のワクチンには、さらにＬ扛並吐組肛■９の抗原を任意に含有 させることができる。

本発明のワクチンは通常、Ｍ白質の動物への投与を可能にする動物薬用として許 容されるビヒクルとともに使用される。投与は通常、経口、経鼻または好ましく は非経口経路で行われる。非経口経路の場合、ビヒクルは一般に液体であり。

抗原は一般にそれに溶解または懸濁される。液体ビヒクルの例には生理的食塩溶 液がある。

ワクチンにはまた。免疫応答を刺激して抗原の効力を増大させる補助剤を含有さ せることができる９本発明において使用するのに便利な補助剤には、たとえば。

水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムが包含される。

ワクチンは、蛋白質を最終濃度０．０ｆ〜５−ｇ／閣ｌの範囲、好ましくは０． ０３〜２箇ｄ■１．最も好ましくは０．３６７ｍ１で含有するのが便利である。

処方後、ワクチンを滅菌容器に充填し、ついで密封して低温たとえば４℃に保存 するか、または凍結乾燥する。

本発明はまた。動物にＬ■坦吐組肚■ユに対する免疫を誘導する方法において。

本発明の蛋白質の冑効量を動物に投与することからなる方法を提供する。すなわ ち１本発明の抗原は、ブタ萎縮性鼻炎を誘発するＢ、　ｂｒ坦吐胆肚以９に対す る免疫を誘導するために使用できる。免疫の誘導には、ワクチンを通常、１回ま たは２回以上投与する。ワクチンの１回用量はｌ■ｌ〜５■１．好ましくは２〜 ４ｍｌである。

以下の実施例は本発明を例示するものである。添付の図面中。

図１は、　Ｂ、ｂｒｏｎｃｈｌｓｅ　ｔｉｅｓからのＰ、６８ペルタクチンをコ ードする江遺母子のＤＮＡ配列を示す、下向きの矢印は、成熟ポリペプチドの産 生を生じる２つの蛋白質切断領域と考えられる部位を指示する。蛋白質配列上の 矢印は２つの蛋白質反復モチーフ、（Ｉ）ヌクレオチド９３９〜９８３によって フードされる（ＧＧＸＸＰ）３および（Ｉｆ）ヌクレオチド１８５２〜１９４フ によってコードされる（ＰＱＰ）７を指示する２ヌクレオチド９２２〜９３０お よび２２４５〜２２５３によってコードされる２つのＲＧＤトリペプチド配列は 上線によって示すが、最初の配列のみが成熟蛋白質中に存在する。

Ｔ−残基の連続に先立つ反転反復が残！２８９８〜２９ｏ９の間に示され、　ｒ ｈｏ−独立転写ターミネータ−に類似する。

図２はＰ、６８発現プラスミドｐＢＤｇ８１を発生させるために用いられた戦略 を示す線画である。プラスミドｐＢＤ８７ｓとｐ［１Ｄ８ｓ６はそれぞれＬ■匹 ｆｉ■と１をコードする遺伝子の５°および３°セクシ■ンを含有し、Ｐ、９４ をコードする全長遺伝子の発生に用いられた。ｐＢＤ８７６によって撃留された この全長（非発現）遺伝子はＡｆｌｌｌおよびＨ１ｎｄｌＩ［で消化して切断し 、Ｎｅｏｌ−Ｈ■ｄｍで消化されたｐ　Ｋ　Ｋ　２３３−２とリゲートして、Ｐ 、６８発現プラスミドｐ　Ｂ　Ｄｌ１８１を発生さぜる。

Ｂ、ｂｒｏｎｅｈｉｓｅ　ｔｌｃａ株ＣＮ）５０は、　Ｗｅｌｌｃｏ＋＋ａ　ｃ ｕｌｔｕｒｅ　ｅｏｌｌｅｅｔｌｏｎｆｆｅｌｌｃｏｍｅ　aｉｏ− ｔｅｃｈ、　ＵＩ）から入手した。Ｌ臼且に１２株ＴＧＩおよびＨＢ　１０１は 以前に報告されている通りであるＣＣａｒｔｅｒら、１９ｇ！ＨＢｏｙａｒ　＆ 　Ｒｏｕｌｌａｎｄ　Ｄｕｓｓｏｉｘ、１１６９）　、　：’スミドｐＨｃフ９ 　（Ｈｏｈｎ　＆　Ｃｏ１１１ｎｓ、１９８０）はＡｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅ ｒｎａｔｉｏｎａｌ　（Ｌｉｔｔｌｅ　Ｃｈａ１Sｏｎｔ。

Ｂｕｅｋｌｎｇｈａｗｓｈｉｒｅ、■Ｋ）から入手した。プラスミドｐ　Ｋ　Ｋ 　２３３−２　（Ａｓｍｎｎ　＆　Ｂｒｏｓｉｕｓ。

Ｈ１１５）ならびにＭ１３ｍ　ｐ　１４およびＭ　Ｈｍ　ｐ　１９　（Ｙａｎ４ ｓｅｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５）はＰｈａｒ−ｍａｅｉａ　（Ｍｉｌｔｏｎ 　Ｉｅｙｎｅｉ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒａ、Ｕに）によって供給された 。　Ｅ、ｅｏｌｉ株は。

しｕｒｉａブロス（Ｌ　Ｂ）または１〜６％（Ｗ／Ｖ）アガールで固化したＬＢ 中で増殖させた（Ｍｉｌｌｅｒ、１９７２）　、　Ｂ、ｂｒｏｎｃｈｉｓｅ　ｔ ｉｅａは、既報（Ｎｏｖｏｔｎｙら、　１９８５ａ）のように５ｔａｉｎｅｔ− Ｓｅｈｏｌｔｅ　（Ｓｔａｉｎｅｒ　＆　５ｅｈｏｌｔｅ、　１９１２）ブロス またはメジウム中で増殖させた。

ＤＮＡの単離および操作 Ｂ、ｂｒｏｎｅｈｉｓｅ　ｔｉｅａｃＮ７ｓ３１染色体ＤＮＡは以前に報告され たようにしてｌａ製した（Ｈｕｌｌら、１９８１）　、プラスミドおよびバクテ リオファージＤＮＡは標準方法によって単離し精製した（ｋｌａｎｉａｔｌｓら 、１９８２）　、すべてのＤＮＡ修飾酵素はＧｌｂｃ。

ＢＲＬ　（Ｐａｉｓｌａｙ、５ｅｏｔｌｉｎｄ）から入手した。

Ｂ、ｂｒｏｎｃｈｉｓｅ　ｔｌｅａゲノムライブラリーの構築＝＋Ｘ！　ＦｐＨ Ｃ７９ＤＮＡをＢａｔＨＩＴ消化し、以前ニ報告（Ｃｈａｒｌｅｓう、１９９０ ）されているように４０〜５０ｋｂサイズ範囲で、５ａｕ３Ａ消化Ｂ、ｂｒｏｎ ｅｈｉｓｅ　ｔｉｅａとリゲートした。遺伝子バンクを平板培養し、無作為に選 んだ４８Ｇのコロニーを以前報告されているようにしてマイクロタイタープレー トに移した（Ｃｈ訂１ｅｓら、１９９０）　。

コロニーｉｔ　ｉｔ　母子スクリーンニングブラスハイプリダイゼーシ１７ＩＩ 　（ＤｕＰｏｎｔ。

Ｓｔｅｖｅｎａｇｅ、　［Ｉｅｒｔｆｏｒｄ、Ｕｌ）に移し、　Ｂ、　ａｒｍ　 ｅｒｔｕｓｓｉｓからのＰ、７０をコードする江遺母子の２２ｐ−標識ＣＩ！Ｉ フラグメント（国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１１０２３０２号）と以前に報告され ているようにしてハイブリダイズさせた。

サブクローニングおよびＤＮＡの配列決定組換えファージＤＮＡは、コスミドの 特異的制限工ンドヌクレアーゼフラグメ　１ントのベクターＭ１！ｍｐ１Ｂおよ びＭｕｍ　ｐ　１９へのリ−ディングに、配列を決定した。配列決定はユニバー サルブライマー［”Ｓ］ｄＡＴＰならびに勾配およびくさびゲルの両者を用いて 実施した（Ｂｉｇｇｉｎら、１９８３ＨＳｉｎｇｅｒら、１９７７）　、一部の クローンは、修飾Ｔ７　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｂｏｒ　＆　Ｒｌｃｈａｒｄ ｓｏｎ、１９ｇ？）および７−ジアザ−２−ｄ　Ｇ　Ｔ　Ｐ　（Ｍｌｚｕｓａｖ ａら、　１９１１６）で、　ＰｈａｒｍａｃＩｍから供給されたキットを用いて 配列を決定した。配列内のギャップは、　ＭｉｌｌｉＧｅｎ　７５００　ＤＮＡ シンセサイザー（ＭＮＩＩｐｏｒｅ、　ＩＩＩ）で作成した合成オリゴヌクレオ チドを特異的プライマーとして用いて充填した（Ｃｈａｒｌｅｓら、１９８６） 　。

組えＰ、６８の　的性 組換えＰ、６８蛋白質を撃留するＥ、　ｃｏ旦溶解物を５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳 動に付しくＭａｎｉａＬｉｓら、１９ｇ２）　、　二ｌ−ロセルロースに移した （Ｔｏｗｂｉｎら、１９７９）　、Ｐ、６８の検出には、モノクローナル抗体Ｂ 　ＢＯ５（Ｍｏｎｔａｒａｚら、１９８５；　Ｎｏｖｏｔｎｙら、　１９８５ａ ）を。

西洋ワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗−マウス東二抗体および基質としての４ −クロロ−１−ナフトールとともに使用した（Ｆａｉｒｖｅａｔｈｅｒら、１９ ８６）　、組換えＰ、６８の表面発現についての試験には１国際出願第ＰＣＴ／ ＧＢ９１１０２３０２号に記載されているように、スライド凝集アッセイを行っ た。さらに詳しくは、試験すべきＥ、ｅｏｌｉ株のサンプル（１０６〜１０７） をガラス顕微鏡スライド上で、３０μｌのＩｇＧ精製ポリクローナルウサギ抗− Ｐ、６９抗体と混合し、２分後に、　ｖｉｒ−Ｂ、　ａｒａ　ｅＮｕｓｓｉｓま たはＥ、ｅｏｌｉ　ＴＧＩの陰性対照と比較して、凝集を肉眼で評価した。

２、結果 Ｐ、６８抗原をフードする゛母子の単離Ｂ、ｂｒｏｎｃｈｉｓｅ　ｔ４ｅａゲノ ムライブラリーを、　Ｂ、　ｍｒａ　ｅｒｔｕｓｓｉｓからのＰ、７０抗原をコ ードするＬ遺伝子の放射ｔｆ１ｍｌ、８ｋｂ　Ｃｌａ　Ｉフラグメントとのハイ ブリダイゼーン璽ノによってスクリーニングした、陽性／グナルを返した２つの コスミド中。

ｐＢＤ８４４と命名した一つをその後の分析に使用した。ｐＢＤ８４４について 実施した制限地図作成およびサザンブロ、ティング実験により、Ｂ、ｂｒユｃｈ ｉｓユ旦ヨからのと１遺伝子のＣ１ａｌ−３ｉｌｌハイブリダイゼーシーンパタ ーンは、Ｌと」。□口（Ｃｈａｒｌｅｓら、　１９１１りおよびＢ、　ａｒａ　 ｅｒｔｕｓｓｉｔ　（国際出１１１箪ＰｃＴ／ＧＢ９１１０２！０２）の両者に ついて記載されたパターンと同一であつた。これらのＣ１ｍ　［−８ａｌ　Ｉフ ラグメントは、したがってＰ、６８蛋白質をコードする全ｖ通遺伝子を含有する と考えられ、　Ｂｌｕｅｓｅｒｉｐｔ　ｐ　Ｂ　Ｓ　Ｓ　Ｋ　Ｉ　Ｉ　”にクロ ーン化しテｐ　ＢＤ８７５　（Ｃ１ａｌ）　オヨヒｐＢＤａ５６（□■）を発生 させた。これらはまた、ＤＮＡ配列決定のために。

Ｍ１３ｍｐ１ｇおよびＭ１３ｍｐ１９にクローン化した。

Ｐ、６８をコードするｒｎ　子のヌクレオチド配ＤＮＡ配列は最初１Ｍ１３中に クローン化したＣ１ａｌ−８ａｌｌフラグメントから。

ユニバーサルブライマーを用いて得られ、特異的配列プライマーとして合成オリ ゴヌクレオチドのセットを用いて重複した配列を編集した。ＤＮＡ配列のコンピ ューター分析（図１）から、Ｐ、６８！白質のｐｒｎ遺伝子についてのオープン リーディングフレームはＭ　ｒ９１９９６の蛋白質（Ｐ　、　９４）をコードで きることがあきらかである。　Ｂ、ｂｒｏｎｃｈｉｓｅ　Ｌｉｃａの表面上に見 出される成熟蛋白質の分子量は、しかしながら、５ＤＳ−ＰＡＧＥによる判定で は０．０００で、この分子はより大きな前駆体からプロセッシングを受けたこと を示唆している。このプロセッシングはＮ−末端およびＣ−末端の両者の除去が 包含されるものと思われる。　Ｂ、ｂｒｏｎｅｈ口肚■■からのＰ、６８の精製 プレパレーシ１ンのＮ−末端蛋白質の配列決定では、配列＾５ｐ−Ｔｒｐ／Ｇ１ ｎ−＾ｓｎ−＾５ｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ／５ｅｒ−１１ｅ−Ｘａｉ−Ｌｙｓ−＾１ ２が得られ、シグナルペプチドが切断されることが確認された。それに依存して ＾ＴＧ開始コドンが使用される３２または３４アミノ酸残基間のこのシグナルペ プチドの切断は、　Ｅ、ｃｏｌｉシグナルペプチダーゼによって認識されること が報告されている（　Ｐｅｒ嘗ａｎ　＆　Ｈａｌｖｏｒｓｏｎら、１９ｇり＾１ ｍ−Ｘａｉ−Ａｌａモチーフと一致するＡＹＡ配列の後に存在する。　Ｐ、６１ １蛋白質のＣ−末端に向けて残基６００〜６０２には、アミノ酸の二塩基ベア、 　Ｌｙｓ−＾ｒｇが存在し、同一の残基によって平滑化される。

図１のＤＮＡ配列の最初の＋４０ｂｐの試験は、コンセンサスリボゾーム結合部 位（Ｓｈｉｎｅ　＆　Ｄａｌｇａｒｎｏ）またはＥ、ｅｏｌｉ遺伝子について同 定されたコンセンサスプロモーター要素（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　＆　Ｃｏｕｒｔ 、１９７９）のいずれとも良好なフイｙト１ｔなｌ＋’ことを示している。停止 コドン徒に反転反復があり、それに続いてＴ−残基の連続がある。

Ｐ、６８のＥ、　ｅｏｌ　ｌ中での Ｂ、ｂｒｏｎｃｈｌｇｅ　ｔｌｅａ　ｐｒｎ遺伝子を撃留するコスミドｐＢＤ８ ４４は、Ｐ、６ｇのＥ、　ｃａｌｌ中での発現を指図できなかった。この遺伝子 をＥ、ｃａｌｌ中で発現させるためには。

全構造遺伝子をプラスミドｐ　Ｋ　Ｋ　２３３−２内にクローン化した３図２は ２発現戦略の概略である。プラスミドｐ　Ｂ　Ｄ８７ＳからのＰ　、　６Ｂ出の ５°末端からなるＥｅｏＲＶ−ＥｅｏＲＩフラグメントを、ＥｅｏＲＶ−Ｅｅｏ ＲＩ消化ｐ　Ｂ　Ｄ　８５Ｇ　（Ｐ、６８ｐｒｎの３°末端含有）に、全構造遺 伝子を含むｐＢＤ８７６が発生するようにリゲートした。ブ５Ｘ！）’ｐＢＤ８ ７８をＡｆｌｍ−Ｈｌｎｄｎｌで消化し、　Ｎｅｏ　Ｉ　−Ｈｌｎｄｍ消化ｐ消 化　Ｋ　２３３−２にリゲートした。このリゲーシ璽ン混合物を用いてＥ、ｅｏ ｌｉ　ＴＧＩをトランスフオームし、Ｐ、６８を発現するトランスフォーマント をｍＡＢ　ＢａＯ２と交差反応するその能力により、蛋白賀ド１ドブロットで同 定した。

陽性シグナルを返すコロニーを単離し、プラスミドミニプレブスを行って押入体 の全長がクローン化されたことを証明した。このようなプラスミド中の一つ。

ｐ　Ｂ　Ｄ８ｇ＋ヲ＋ノ後の検討に選択した。ｐａＤｏｔを撃留ｔ　ルＥ、ｃｏ ｌｌ　ＴＧ１１７）　Ｓ　Ｄ　５−ＰＡＧＥゲルのウェスタンプロットでは、驚 くべきことに、検知可能な９４ｋＤｉの高分子量バンドを生じなかったが、その 代わり、約６９ｋＤａおよび６８ｋＤａニ１　対（Ｄ強いバンドを生じた。

Ｐ、６８蛋白質がＥ、　ｃｏｌ　ｉの表面上に発現したが否かを試験するため、 モノクローナル抗体ＢＢＯ５およびポリクローナル抗体−Ｐ、６９抗体の両者を 用い、スライド凝集アッセイを実施した。凝集はｐＢＤ８８１繋留Ｅ、　ｃｏ旦 でもｖｉｒ”Ｂ、ｂｒｏｙＪ上阻■■と全く同様に急速に起こり、異種蛋白質は 表面に位置することが示唆された。

１二！ Ｂ、　ａｒ！ｅｒｔｕｓｓｉｓ染色ＤＮＡのコスミド　ＨＣ）９へのクローニン グならびにＰ、７０をフードする　ｒｎ　母子の０定Ｂ、　ａｒｍ　ｅｒＬｕｓ ｓＩｓ染色体ＤＮＡ　（Ｈｕｌｌら、１９８１の方法のＭａｓｋｅｌｌら、　１ ９８８の改良方法によって調製）を５ａｕ３Ａで部分消化し、　４０〜５０ｋｂ サイズ範囲のフラグメントをコスミドｐ　ＨＣ７９（Ｈｏｈｎ　ｉ　Ｃｏ１１ｉ ｎｓ、　１９８０）のＢａｍＨ１部位にリゲートした。Ｅ。

ｃａｌｌ　ＨＢＩＯＩ中の組換えフスミドを、　Ｃｈａｒｌｅｓら、　１９９０ の方法によって報告された方法に従って平板培養し、マイクロタイタープレート に移し、　ａｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓハイブリダイズ膜（Ｄｕ　Ｐｏｎ ｔ、Ｓｔｅｖｅｎｇｅ、Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ）に移した。ついでコスミ ドを、Ｂ、Ｈ５工Ｖ担からの関連と１遺母子から単離された１、８ｋｂ　ｃエリ 制限フラグメントの放射標識体を用いたＤＮＡ　ｎ　ＤＮＡハイプリダイゼーシ 箇ンによりＰ、７０をコードすると１遺伝子の存在をスクリーニングした。コス ミドｐ１６９の消化後（Ｃｈｉｒｌｅｓ、１９８９）　Ｃ１ａｌフラグメントを ゲル精製した（Ｔｉｕｔｚ　＆　Ｒｅｎｚ、１９ｇり　。

フラグメントをＢＣＬ、　Ｍａｎｈｓｌ曹によって供給されたキットおよび［α ３２Ｐ］−人ＴＰ（Ａ４ｅｒｓｈａ＊）でニアクトランスレートし、以前に報告 された（Ｃｈａｒｌｅｓら、　１９９０）ようにしてＢ、　ａｒａ　ｅｒｔｕｓ ｓＩｓ遺伝子バンクフィルターとハイブリダイズさせた。

３つの陽性クローンが同定され、コスミドｐＢ０８１１を撃留する一つをその後 の分析に選択した。

サブクローニングおよびＤＮＡ配列決 ＝＋スミドｐ　Ｂ　Ｄ８１１の制限７ラグメントを１Ｍ１！ｍｐ１８とＭ　Ｈｍ 　ｐ　１９　（Ｙｉｎｊ＊ｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、１０５）にクローン化し、ユ ニバーサルブライマー、［ａ”Ｓ］ｄＡＴＰ（デオ牛シアデノシン５°−［α３ ５Ｓ］チオトリホスフエート）、ジデオキシヌクレオチドトリホスフェート、な らびに勾配およびウェッジゲル（Ｂｌｇｇｊｎら、　１９８３：５ａｎｚｅｒら 、　１９７７）の両者を用いて配列決定した。圧縮アーチテクトを除くために。

一部のクローンはｐｈ訂■！ｅｌｌｌこよって供給されたキットを用い、修飾Ｔ ？ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｂｏｒ　＆　Ｒｉｅｈａｒｄｓｏｎ、１９８７）お よび７−ジアザ−２°−ｄＧ　Ｔ　Ｐ　（Ｍ！ｚｕｉａｗａ）で配列決定した。

ギャップは特異的プライマーとして合成オリゴヌクレオチドを用いて充填した（ Ｃｈａｒｌｅｓら、１９８６）　。

特異的配列決定プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは、　ＳＡＭＩオ リゴヌクレオチドシンセサイザー（Ｂｉｏｌａｂｓ）で作成した。

ＤＮＡ配列のコンビ１−ター解析により、計算分子量９５．１７７、９２２アミ ノ酸の蛋白質をコードできるオーブンリーディングフレームが明らかにされた。

弘肚Ｘ壓 ＡＭＭＡＮ、Ｅ、　＆　ＢＲＯＳＩＵＳ、Ｊ、　（１９８５）、　’ＡＴＧ’ｖ ｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｒｅｇｕｌｉｔ’ｅｄ　ｈｉｇｈ−１■魔■戟@ｅｘｐｒ ｅｓ− ｓｌｏｎ　ｏｒ　ｃｌｏｎｅｄ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｅｓｅｈｅｒｌｃｈｉａ　 ｃｏｌｉ、Ｇｅｎｅ　４０．１１３−１９０ＢＩＧＧＩＮ、Ｍ、Ｄ、、ＧＩＢＳ ＯＮ、Ｔ、Ｊ、＆　ＨＯＮＧ、Ｇ、Ｆ、　（１９８３）、Ｂｕｆｆｅｒ　ｇｒｉ ｄｌｅｎｔ　ｇｅｌｓ　≠獅п@３ＳＳ ｌａｂｅｌ　ａｓ　ａｎ　ｍｉｄ　ｔｏ　ｒａｐｉｄ　ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃ ｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ、Ｐｒｏｅｅｅｄｉｎｇｓ@ｏｆ　ｔｈｅ ！１ｍｔｌｏｎｉｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ 　Ｕｒ＋Ｉｔａｄ　５ｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａ−ｅｒＩｃｍ　W０．３９６３− ＢＯＹＥＲ，ＨＪ、＆　ＲＯＵＬＬＡＮＤ−ＤＵＳＳＯＩＸ、Ｄ、（１９６９） 、Ａ　ｃｏｍｐｌａｍｅｎｔａｔｌｏｎ　ａｎａｌｙｓ［ｓ@ｏｆ ｔｈｅ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　＠ｎｄ　ｗ＋ｏｄ！ｆｌｃａｔｉｏｎ　ｏｆ 　ＤＮＡ　ｉｎ　Ｅｉｃｈｅｒｉｅｈｉｉ　ｃｏｌｔ、Ｊｏ浮窒獅≠戟@ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｌｏｌｏｇｙ　４１，４５９−４６５゜ＣＡＲＴＥＲ， Ｐ、、ＢＥＤＯＵＥＬＬ、Ｈ，＆　ＷＩＮＴＥＲ，Ｇ、　（１９８５）、Ｉｍｐ ｒｏｖｅｄ　ｏｌｉｇｏｎｕｅｌｅｏｔｌｄ＝@５ｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｕｓｉｎｇ　Ｍ１３　ｖｅｃｔｏ ｒｓ、Ｎｕｃｌａｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１R．４３３− ＣＢＡＲＬＥＳ、　１．Ｇ、　、　ＩＥＹＴＥ、　Ｊ、　、　ＢＲＡＭＭＡＲ， Ｗ、　Ｊ、　、　５ＭｌＴｌ１．　Ｍ　＆　）ＩＡＷＫＩＮr、　Ａ、Ｒ，（１ ９８６）、Ｔｈｅ　１ｓｏ−１ａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ＡＲＯＭ　ｆｏｃｕｓ　ｏｆ 　へ！２r」コＣ二ＬＬ隻！ ｎ１ｄｕｌｉｎｓ、Ｎｕｅｌａｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｅｈ　１４，２ ２０１−２２Ｈ。

ＣＨＡＲＬＥＳ、　１．　Ｇ、　、　ＤＯＵＧＡ　１１．　Ｇ、　、　Ｐ　Ｉｃ ＩＡＲＤ、　Ｄ、　、　ＣＩＩＡＴＦ　ＩＥＬＤ、　Ｓ、　A　ＳＭＩＴＨ，Ｍ 、　、　Ｎ０ＶＯＴＮＹ、　Ｐ、　、　ＭＯＲＲＩ−５ＳＥＹ、Ｐ、　＆　ＦＡ ＩＲＷＥＡＴＨＥＲ，Ｎ、Ｆ、　（１９１１９）、Ｍｏ１ｅｅｕｌａｒ　ａｔｏ ｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃ狽■窒奄嘯≠狽奄盾■ ｏｆ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｏｕｔａｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ 　Ｐ、６９　ｆｒｏｍ　Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌｉ　ｅｒｔｕｓ唐奄刀B Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　 ｏｆ　５ｅｉｅｒ＋ｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Tｔａｔｅｓ　ｏｆ ＾ｍｅｒｌｃａ　Ｈ，！５５４−３５５８ＣＨＡＲＬＥＳ、　１．　Ｇ、　、　 ＬＡＭＢ、　＋１．に、、ＰＩＣに＾ＲＤ、Ｄ、、ＤＯＵＧＡＮ、Ｇ、＆　ＩＩ ＡＷＫＩＮＳ、八Ｒ，i１９９０）、ｌ５ｏｌａ− １ｉＯｎ、ＣｈａｒｌＣｔｅｒｌＺＲｔｉＯｎ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ 　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　Ｏｆ　ｔｈｅ　ａｒｏｅ　ｇｅｎｅ■ ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｃｈｏｒｉｓｗｉｔｅ　１ｙｎｔｈａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｓａ ｌｍｏｎｅｌｌｉ　ｔｙｐｈｉ　ａｎｄ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃ■奄堰@ｃｏｉｌ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｌｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１３６， ３５３−３５８゜ＦＡＩＲＷＥＡＴＩＩＥＲ，Ｎ、Ｆ、、ＬＹＮＥＳＳ、Ｖ、Ａ 、、ＰＩＣＫＡＲＤ、Ｄ、、ＡＬＬＥＮ、Ｇ、　＆　ＴＨＯＭＳＯＮ、Ｒ，ＯC （１９８６）。

ＣＩｏｎｉｎｇ、ｎｕｅｌｅｏＬｉｄａ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｅｔａｎｕｓ　ｔｏｘｉｎ　ｆ窒≠■高■獅■ ＣＩｎ　Ｅｓｅｈｅｒｉｅｈｉｉ　ｃｏｌｉ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌｏｇｙ　１６５　２１−２７゜ＨＯｌｌＮ、Ｂ、＆　Ｃ０ＬＬＩＮＳ 、Ｊ、（１９ｇ０１．＾　ｓｍａｌｌ　ｃｏｓｍｉｄ　ｆｏｒ　ａｆｆｉｃｉｅ ｒ＋ｔ　ｅｌｏｎｉｎ■@ｏｆ　ｌａｒｇｅ ＤＮＡ　ｆｒｉｇｓｅｎＬｃ　Ｇｅｎｅ　１１．２９１−２９８＋１ＬＩＬＬ、 Ｒ，＾、、ＧＩＬＬ、Ｒ，Ｅ、、ＨＳＵ、Ｐ、、ＭＩＮＳＩ！ＥＶ、Ｂ、Ｈ，＆ 　ＦＡＩＪＯｆ、Ｓ、（１９８１）、ＣｏｎTｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｓｂｌｎａｎｔ　ｐｌｓｓｓｉ ｄｓ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｙｐｅ　１　ｏｒ　Ｄ−＊ａｎ獅盾唐■ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｐｉｌｌ　ｆｒｏｍ　ａ　ｕｒｆｎａｒｙ　ｔｒａｃｔ　 Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｉ　ｃｏｌｔ、@Ｉｎｆｅｃｔｉｏ ｎ ａｎｄ　Ｉｎ５ｕｎｉｔｙ　３１　９３３−９３Ｌ［０ＢＩＳＣＨ，Ｍ、　ｌ　 Ｎ０ＶＯＴＮＹ、Ｐ、　（１９９０）、　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ 　ａ　Ｈ−ｋｌｌｏｄａｌｔｏ氏@ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｒ＋＋ｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓ　ｔｈｅ　ｍａｊｏｒ　ｐｒｏｔ ｅｃｔｉｖｅ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｏｆ　Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌ＝@ｂｒｏｎｅｈｌ ！！ｚ１に！　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ−ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒ ｅｅ　ｐｆｇｌａｔｓ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍ高浮獅奄狽■ ５８．３５２（５７゜ ＭＡＩＩＩＡＴＩＳ、Ｔ、、ＰＲＩＴＳＣ［１，Ｅ、Ｅ、　＆　ＳＡＭＢＲＯＯ に、Ｊ、　（１９８２）、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｔｏｎ奄獅■F　Ａ　Ｉａ ｂｏ− ｒａｔｏｒｙ　寵ｕ＋ｕｉ１．ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　［ＩａｒｂｏｒAＮ、Ｙ。

ＭＡＳ［ＥＬＬ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、ＢａｃｔｅｒＩｏ！、１７０．２４８７−２ ４７１．１９０ＭＩＬＬＥＲ，Ｊ、Ｍ、　（１９７２）、Ｅｘｐｅｒｉｓｅｎｔ ｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇａｎｅｔｌｅｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ獅■ @Ｈａｒｂｏｒ Ｎ、Ｙ、　：　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 。

ＭＯＮＴＡＲＡＺ、　Ｊ、＾、、！１ＯＶＯＴＩＩＹ、Ｐ、　＆　ＩＶＡＮＹｌ 、Ｊ、　（１９８５）　Ｉｄｅｎｔｉｆｌｅａｔｉｏｎ　ｏ■@６ｇ−ｋｉｌｏ − ｄｉｌｔｏｎ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｆｒｏｍ　Ｂｏｒｄａ ｔａｌｌａ　ｂｒｏｎｅｈｌｓｅ　ｔｉｅｉ、　Ｉｎｆｅｃ狽奄盾氏@ａｎｄ Ｉｓｍｕｎ口ｙ　４７．　７４４−７５１゜ＭＩＺｔｌＳＡｆ＾、Ｓ、、ＮＩＳ ＨＩＭυＲ＾、Ｓ、　＆　５ＥＥＬ＾、Ｆ、　（１９８６）、　Ｉｍｐｒｏｖｅ ｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｈ■@ｄｌｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍ［ｎａｔｌｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｒ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕ ｅｎｅｎｇ　ｂｙ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｄｅｏｘｙ−７−ｄｅａ嘯≠■浮≠獅潤| ｓｌｎｅ　ｔｒｉｐｈｏｓｐｂａｔｅ　ｉｎ　ｐｌａｃｅ　ｏｆ　ｄＧＴＰ、　 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａ５ｅ婁ｒｅｈ　１４．１R１１−１３２４゜ Ｎ０ＶＯＴＮＹ、　Ｐ、　、　ＣＨＵＢＢ、　Ａ、　Ｐ、　、　Ｃ０ＷＮＬＥＹ 、　Ｋ、　、　ＭＯＮＴＡＲＡＺ、　Ｊ、　Ａ、　＆　ＢＥdＳＬＥＹ、　Ｊ、 　Ｅ、　（１９８５ａ）。

Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｅｌａｓｅ：　Ａ　ｇｅｎｕ ｓ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ａｎｔｉｇ■氏@ａｎｄ ｖｉｒｕｌｅｎｅｅ　ｆａｃｔｏｒ、Ｉｎ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔ ｈｅ　Ｆｏｕｒｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　５ｔａ獅р≠窒р刀@６１ ゜ ２７−４１゜ Ｎ０ＶＯＴＮＹ、Ｐ、、ｌ０ＢＩＳＣＨ，Ｍ、、Ｃ０ＷＮＬＥＹ、に、、ＣＨＵ ＢＢ、Ａ、Ｐ、ｌ　ＭＯＩＩＴＡＲＡＺ、Ｊ、Ａ、（１９８Tｂ）。

Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ　ｂｒａｎｃｈｉｓｅ　ｔ ｉｃｉ　ｖａｃｃｉｎｅｓ　Ｉｎ　ｓｐｅｅｉｆｉｃ−ｐａ狽■盾■■氏| ｆｒｅｅ　ｐｉｇｌｅｔｇ　ｗｉｔｈ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃａｌｌ　５ｕｒ ｆａｅａ　ａｎＨｇｅｎｓ　ｉｎ　ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋ■п@ｉｍｍｕ− ｎｏｉｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｌｍ５ｕｎ ｉｔ７５０．１９０−１９８゜ＰＥＲＬＭＡＮ、Ｄ、　＆　ｆｌＡＲＶＯＲｓＯ ｌｌ、１１．０．　（１９０）、＾ｐｕｔａｔｌｖｅ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔ ｉｄａｓｅ@ｒｅｅｏｇｎｉ− Ｈｏｎ　５ｉｔｅ　ａｎｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｎ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｅ　 ａｎｄ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　Ｊ盾浮窒獅≠■ ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１６７．３９１−４０９゜ＲＯＳ ＥＮＢＥＩＧ、Ｍ、ｋ　Ｃ０ＵＲＴ、ｄ、　（１９７９）、Ｒｅｇｕｌｘｔｉｏ ｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　！ｎｖｏｌｖｅｄ　［ｎ　狽■＝@ｐｒｏｍｏ− ｔｌｏｎ　ａｎｄ　ｔａｒｍｉｎａｔＩｏｎ　ｏｒ　ｆｌｌＡ　ｔｒａｎｓｃｒ ｉｐｔｉｏｎ、Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｇｅｎ■狽奄モ刀@１３゜ ３１９−１５３゜ ５ＡＩＩＧＥＲ，Ｆ、、肩１ｃＩＬＥＮ、ｓ、＆　Ｃ０ＵＬＳＯ１１，＾、Ｒ， （１Ｇ７〕）、ＤＩＩＡ　５ｅｑｕａｎｃｉＢ　ｗｉｔｈ　■■奄奄氏@ｔｅｒ − ｍｉｎａｔｌｏｎ　Ｉｎｈｉｂｌｔｏｒｓ、Ｐｒｏｃｅ＠ｄｉｎｇｓ　ｏｒ　ｔ ｈｅ　ｌ１ａｔｌｏｎａｌ　Ａｅａｄａｍｙ　ｏｆ　５ｃｉ■獅モ■刀@ｏｆ ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔｉｔａｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ　７１．５４０− ５４６７゜５ＩＩＩＮＥ、Ｊ、＆　ＤＡＬＧＡＲにＯ，１，（１９７５）、Ｄｅ ｔｅｒｍｉｎａｎｔ　ｏｆ　ｃｉｓｔｒｏｎ　５ｐｅｅｉｆｌｃｉｔｙ@ｉｎ　 ｂａｅ− ｔａｒｌｘｌ　ｒｉｂｏｓｏｍ＠ｓ、ｌ１ａｔｕｒｅ　２５４．　３４−３ＬＳ ＴＡＩＮＥＲ，Ｄ、Ｗ、ｌ　５ＣＵＯＬＡＴＥ、Ｍ、Ｊ、（１９６２）、＾ｓｉ ｍｐｌｅ　ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｍｅр奄浮■ ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈａｓｅ　ｌ　Ｂｏｒｄｅｔ ｅｌｌａ　ｅｒｔｕｓ＊Ｉｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅ獅■窒≠■ Ｍｌｃｒｏｂｌｏｌｏｇｙ　６３．２１１−２２０゜ＴＡＢＯＲ，Ｓ、ｋ　ＲＩ ＣＢＡＲＤＳＯＮ、Ｃ，Ｃ，（１０７）、ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌ ｙｓｉｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｍｏｄ奄■奄■■ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔフ　ｐｏＩｙｓｅｒａｓｅ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉ ｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ@ｏｆ　５ｅｉ− ｅｎｅｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌ１ｎｉｔａｄ　５ｔｉｔａｓ　ｏｆ　Ａｓｅｒｉ ｅａ　８４．４７６７−４７７１゜ＴＡＵＴＺ　＆　ＲＥＮＺ、＾ｎｉ１．　Ｂ ｉｏｃｈｅｔ　１３２．１４−１９゜ＴＯＶＢＩＮ、　Ｊ、、５ＴＡＥ［ＩＬＩ Ｎ、Ｒ，＆　ＧＯＲＤＯＮ、Ｊ、　（１９７ｇ）、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔ ｌｃ　ｔｒａｎｓ■■秩@ｏｆ　ｐｒｏ− ｔｅｌｎｓ　ｆｒｏｍ　ｐｏｌｙｉｅｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｔｓ　ｔｏ　ｎ１ ｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　５ｈｅｅｔｓ：　ｐｒｏｃｅｄ浮窒■刀@ａｎｄ ｓｏｍｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｒｏｅｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ 　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃ■刀@ｏｆ ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　ｏｒ　Ａｍｅｒｉｃａ　７６．４３５０ −４３５４゜ＹＡＩＩＩＳＣＨ−ＰＥＲＲＯＮ、Ｃ，、ＶＩＥＩＲ＾、Ｊ、　＆ 　ＭＥＳＳＩＮＧ、　Ｊ、　（１９８５１，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＵ　ｐ■≠■ ■@ｖｅｃ− ｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｈｏｓｔ　５ｔｒａｉｎｓ：　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅ ｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍ１３ｍｐ１８　ａｎｄ　ｐtｃ１９　ｖｅｃ− ｔｏｒｓ、Ｇｅｎｅ　３３．＋０３−１１９゜、　ＡＩ＋　ＰＣＴ／ＧＢ　９２ １００５６１フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／３１　 ＺＮＡ ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） Ｉ

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａからの成分が夾雑せず，ネイティブなＢ ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａからのＰ．６８抗原に結合する抗体に結合でき て，（ａ）次のアミノ酸配列：【配列があります】 を有するか，または（ｂ）上記アミノ酸記列（ａ）と９８％を越えるホモロジー を有する蛋白質。
2. ２．「請求項１」に定義された蛋白質をコードするＤＮＡ。
3. ３．図１に示すヌクレオチド２４７からヌクレオチド２０４０までのヌクレオチ ド配列から本質的に構成される「請求項２」に記載のＤＮＡ配列。
4. ４．図１に示すヌクレオチド２４７からヌクレオチド２０４０までのヌクレオチ ド配列と１２未満の位置で異なる「請求項２」に記載のＤＮＡ配列。
5. ５．図１に示すアミノ酸配列を有するか，または図１に示すアミノ酸配列と９８ ％を越えるホモロジーを有するアミノ酸配列。
6. ６．「請求項５」に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列。
7. ７．図１に示すヌクレオチド１４５からヌクレオチド２８７７はでのヌクレオチ ド配列から本質的に構成きれる「請求項６」に記載のＤＮＡ配列。
8. ８．図１に示すヌクレオチド１４５からヌクレオチド２８７７までのヌクレオチ ド配列と１２未満の位置で異なる「請求項６」に記載のＤＮＡ配列。
9. ９．図１に示す配列から本質的に構成されるＤＮＡ配列または図１に示す配列と ９８％を越えるホモロジーを有するＤＮＡ配列。
10. １０．「請求項２〜４および６〜９」のいずれかに定義されたＤＮＡ配列を含有 し，適当な宿主中に堤供された場合，「請求項１〜５」に定義きれる蛋白質を発 現できる発現ベクター。
11. １１．プラスミドである「請求項１０」に記載のベクター。
12. １２．「請求項１０または１１」に定義された発現ベクターでトランスフォーム された宿主。
13. １３．Ｅ．ｃｏｌｉの株である「請求項１２」に記載の宿主。
14. １４．「請求項１」に定義された蛋白質を製造するにあたり，「請求項１２また は１３」記載された宿主を上記蛋白質が発現するような条件下に維持することか らなる方法。
15. １５．「請求項５」に定義きれた蛋白質を製造するにあたり，「請求項６〜９」 のいずれかに定義されたＤＮＡ配列を含有する「請求項１０」に記載の発現ベク ターによってトランスフォームされた「請求項１２または１３」に記載の宿主を 上記蛋白質が発現するような条件下に維持することからなる方法。
16. １６．獣医業として許容される担体または希釈剤と，活性成分としての「請求項 １または５」に記載の蛋白質からなる獣医薬組成物。