CN115058445A - 一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母及其构建方法与应用，其中，构建方法包括步骤：获取米曲霉酮酯酰辅酶A硫解酶基因的克隆片段，所述米曲霉酮酯酰辅酶A硫解酶基因记为AoErg10D基因，所述AoErg10D基因的核苷酸序列为SEQ NO.1；将所述克隆片段连接到载体pYes2.0上，得到AoErg10D表达载体；将所述AoErg10D表达载体转化至酿酒酵母ScPot1基因突变体Y02319中，构建转基因菌株AoErg10D‑Y02319，即得到所述可降解油酸的基因改造酿酒酵母。本发明构建得到的基因改造酿酒酵母AoErg10D‑Y02319能够在以油酸为唯一碳源的培养基生长良好，且油酸利用率高，因此可将该因改造酿酒酵母AoErg10D‑Y02319用来降解油酸。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母及其构建方法与应用。
背景技术
硫解酶普遍存在于原核生物和真核生物中。硫解酶在脂质代谢中发挥着重要作用，根据酶催化反应的方向可分为两类：3-酮脂酰基辅酶A硫解酶(ACAA；EC 2.3.1.16)和乙酰辅酶A乙酰基转移酶(ACAT；EC 2.3.1.9)。前者也称为硫解酶I，可以催化β-酮脂酰基辅酶A去除乙酰基产生乙酰辅酶A和少两个碳的酮酯酰辅酶A，该催化反应主要发生在脂肪酸β-氧化的每个循环的最后一步。后者又称为硫解酶II，可以催化两分子的乙酰辅酶A缩合产生乙酰乙酰辅酶A，该催化反应普遍存在于许多合成代谢过程的第一步，例如原核生物中甾醇和酮体的生物合成或聚(3-羟基丁酸)(许多细菌中的主要能量和碳储存分子)的合成。虽然这两种硫解酶催化可逆反应，但硫解酶I只参与催化分解代谢过程，这在热力学上是有利的，而硫解酶II通常催化合成代谢反应，且有时会参与分解代谢作用。
酿酒酵母，又称面包酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，用于制作面包和馒头等食品及酿酒。酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5-10μm。其繁殖的方法为出芽生殖。酿酒酵母具有生长周期短、发酵能力强、容易进行大规模培养以及含有多种蛋白质、氨基酸、维生素、生物活性物质等丰富的营养成分等优点，一直是基础及应用研究的主要对象，在食品、医药等领域应用广泛，被认为是最具潜力的大规模生产菌种。
野生型酿酒酵母对油酸的利用率较少，在酿酒酵母中有一个3-酮酯酰辅酶A硫解酶(由ScPot1基因编码合成)，该酶催化脂肪酸β-氧化最后一步酮酯酰辅酶A分解产生乙酰辅酶A和少两个碳的酮酯酰辅酶A，根据研究发现，酿酒酵母缺失ScPot1蛋白的突变体表型表现为在以油酸为唯一碳源的培养基中无法生长，而野生型酵母可以利用油酸为唯一碳源进行生长。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母及其构建方法与应用，旨在解决现有酿酒酵母对油酸的降解效率较低的问题。
本发明的技术方案如下：
一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母的构建方法，其中，包括步骤：
获取米曲霉酮酯酰辅酶A硫解酶基因的克隆片段，所述米曲霉酮酯酰辅酶A硫解酶基因记为AoErg10D基因，所述AoErg10D基因的核苷酸序列为SEQ NO.4；
将所述克隆片段连接到载体pYes2.0上，得到AoErg10D表达载体；
将所述AoErg10D表达载体转化至酿酒酵母ScPot1基因突变体Y02319中，构建转基因菌株AoErg10D-Y02319，即得到所述可降解油酸的基因改造酿酒酵母。
所述可降解油酸的基因改造酿酒酵母的构建方法，其中，获取米曲霉酮酯酰辅酶A硫解酶基因的克隆片段的步骤包括：
根据所述AoErg10D基因的核苷酸序列设计对应引物序列，所述引物序列为SEQNO.13-14；
提取米曲霉总RNA进行反转录，得到米曲霉cDNA；
以所述米曲霉cDNA为模板，所述引物序列SEQ NO.2作为引物，将AoErg10D基因扩增出来，得到米曲霉酮酯酰辅酶A硫解酶基因的克隆片段。
所述可降解油酸的基因改造酿酒酵母的构建方法，其中，将所述克隆片段连接到载体pYes2.0上，得到AoErg10D表达载体的步骤包括：
将载体pYes2.0用限制性内切酶HindIII和EcoRI进行线性化，得到线性化载体；
将所述克隆片段与线性化载体进行重组转化，得到AoErg10D表达载体。
一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母，其中，采用本发明所述可降解油酸的基因改造酿酒酵母的构建方法制得。
一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母的应用，其中，将本发明构建方法制得的基因改造酿酒酵母用于降解油酸。
有益效果：本发明将AoErg10D表达载体转化至酿酒酵母ScPot1基因突变体Y02319中，构建得到可降解油酸的基因改造酿酒酵母。通过实验研究发现，该基因改造酿酒酵母在以油酸为唯一碳源的培养基上生长状况较佳，且培养基中的油酸被利用完全，因此，可将本发明构建的基因改造酿酒酵母用于降解油酸。
附图说明
图1为为本发明一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母的构建方法流程图。
图2为载体pYes2.0示意图。
图3为目标基因表达载体示意图。
图4为为上述转基因菌株在以油酸为唯一碳源的培养基中的生长情况图。
图5为上述转基因菌株在以油酸为唯一碳源的培养基中的菌体浓度结果图。
图6为上述转基因菌株在以油酸为唯一碳源的培养基中的油酸利用情况结果图。
图7上述转基因菌株为以油酸为唯一碳源的固体培养基点板实验结果图。
具体实施方式
本发明提供一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母及其构建方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1，图1为本发明提供的一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母的构建方法流程图，如图所示，其包括步骤：
S10、获取米曲霉酮酯酰辅酶A硫解酶基因的克隆片段，所述米曲霉酮酯酰辅酶A硫解酶基因记为AoErg10D基因，所述AoErg10D基因的核苷酸序列为SEQ NO.4；
S20、将所述克隆片段连接到载体pYes2.0上，得到AoErg10D表达载体；
S30、将所述AoErg10D表达载体转化至酿酒酵母ScPot1基因突变体Y02319中，构建转基因菌株AoErg10D-Y02319，即得到所述可降解油酸的基因改造酿酒酵母。
具体来讲，首先根据所述AoErg10D基因的核苷酸序列设计对应引物序列，所述引物序列为SEQ NO.13-14；提取米曲霉总RNA进行反转录，得到米曲霉cDNA；以所述米曲霉cDNA为模板，所述引物序列SEQ NO.13-14作为引物，将AoErg10D基因扩增出来，得到米曲霉酮酯酰辅酶A硫解酶基因的克隆片段。然后将载体pYes2.0用限制性内切酶HindIII和EcoRI进行线性化，得到线性化载体，将所述克隆片段与线性化载体进行重组转化，得到AoErg10D表达载体；最后利用PEG介导酿酒酵母转化法将所述AoErg10D表达载体转化至酿酒酵母ScPot1基因突变体Y02319中，制得本发明所述可降解油酸的基因改造酿酒酵母，即转基因菌株AoErg10D-Y02319。
本发明将AoErg10D表达载体转化至酿酒酵母ScPot1基因突变体Y02319中，构建得到可降解油酸的基因改造酿酒酵母。通过实验研究发现，该基因改造酿酒酵母在以油酸为唯一碳源的培养基上生长状况较佳，且培养基中的油酸被利用完全，因此，可将本发明构建的基因改造酿酒酵母用于降解油酸。本发明中，所述米曲霉购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，所述酿酒酵母ScPot1基因突变体Y02319体购自Euroscarf。
在一些实施方式中，还提供一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母，其中，采用本发明所述可降解油酸的基因改造酿酒酵母的构建方法制得。
一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母的应用，其中，将本发明构建方法制得的基因改造酿酒酵母用于降解油酸。
下面通过具体实施例对本发明做进一步的解释说明：
本研究探索了酿酒酵母ScPot1基因突变体Y02319在以油酸为唯一碳源的培养基中无法生长，而野生型酿酒酵母Y0000则可以在以油酸为唯一碳源的培养基中生长且可以少量分解油酸，这为提高酿酒酵母对油脂利用情况提供参考依据，为本申请对酿酒酵母进行基因工程改造来提高其油脂的利用提供实验背景。基于此，本申请做了以下实验设计：
步骤1)、本发明利用PCR技术克隆、扩增并获得米曲霉AoErg10s基因全长，其由六个硫解酶基因AoErg10A、AoErg10B、AoErg10C、AoErg10D、AoErg10E和AoErg10F组成，均为具有特定序列的DNA分子，对应序列长度分别为1200bp、1299bp、1242bp、1266bp、1251bp和1260bp，对应核苷酸序列如SEQ NO.1-6所示。
步骤2)、根据所述六个硫解酶基因AoErg10A、AoErg10B、AoErg10C、AoErg10D、AoErg10E和AoErg10F的核苷酸序列设计对应六对引物序列，其中AoErg10A基因对应的引物序列为SEQ NO.7-8，AoErg10B基因对应的引物序列为SEQ NO.9-10，AoErg10C基因对应的引物序列为SEQ NO.11-12，AoErg10D基因对应的引物序列为SEQ NO.13-14，AoErg10E基因对应的引物序列为SEQ NO.15-16，AoErg10F基因对应的引物序列为SEQ NO.17-18；提取米曲霉总RNA进行反转录，得到米曲霉cDNA；以所述米曲霉cDNA为模板，分别以上述引物序列作为引物进行扩增，可得到对应的AoErg10s基因克隆片段。作为举例，以所述米曲霉cDNA为模板，以所述引物序列SEQ NO.15-16作为引物，可将AoErg10D基因扩增出来，得到米曲霉酮酯酰辅酶A硫解酶基因的克隆片段。
步骤3)、将步骤2)中扩增出来的克隆片段通过限制性酶切位点HindIII和EcoRI可插入连接到载体pYes2.0上得到目标基因表达载体，其中，pYes2.0载体示意图和目标基因表达载体示意图分别如图2和图3所示。
步骤4)、将载体pYes2.0转化至野生型酿酒酵母Y0000中，并将载体pYes2.0和步骤3)中构建好的目标基因表达载体均转化至酿酒酵母ScPot1基因突变体Y02319中，分别得到转基因菌株pYes2.0-Y0000、pYes2.0-Y02319、AoErg10A-Y02319、AoErg10B-Y02319、AoErg10C-Y02319、AoErg10D-Y02319、AoErg10E-Y02319和AoErg10F-Y02319。
5)、将步骤4)得到的转基因菌株pYes2.0-Y0000、pYes2.0-Y02319、AoErg10A-Y02319、AoErg10B-Y02319、AoErg10C-Y02319、AoErg10D-Y02319、AoErg10E-Y02319和AoErg10F-Y02319进行摇瓶培养以及固体点板实验，培养基中均只加了油酸作为唯一碳源。结果如图4-图7所示，图4为上述转基因菌株在以油酸为唯一碳源的培养基中的生长情况图。图5为上述转基因菌株在以油酸为唯一碳源的培养基中的菌体浓度结果图。图6为上述转基因菌株在以油酸为唯一碳源的培养基中的油酸利用情况结果图。图7上述转基因菌株为以油酸为唯一碳源的固体培养基点板实验结果图。
从上述结果图中可以看出，在以油酸为唯一碳源的培养基中，pYes2.0-Y0000可以生长，且能够少量利用油酸；pYes2.0-Y02319、AoErg10A-Y02319、AoErg10B-Y02319和AoErg10C-Y02319完全不可以生长；AoErg10E-Y02319和AoErg10F-Y02319可以生长，但它们的生长较差，油酸也几乎没被利用；而AoErg10D-Y02319生长的非常好，且培养基中的油酸几乎被利用完全。因此，本发明将AoErg10D表达载体转化至酿酒酵母ScPot1基因突变体Y02319中，构建得到基因改造酿酒酵母AoErg10D-Y02319，并将该AoErg10D-Y02319用于降解油酸。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 深圳技术大学
<120> 一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母及其构建方法与应用
<160> 18
<210> 1
<211> 1200
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 1
atgtcttctc ttccgccggt ctatattgtt tcctctgccc gcaccccagt cggctctttc 60
ttggggtcgc tctcaagtct cactgccccg cagttaggct ctcatgctat taaagctgcg 120
ctcagcaaag cggatggaat caagccgtct gatatccagg aggtcttctt tggcaatgtc 180
atctccgcaa acgttggaca aaatcctgct agacagtgtg ctctcggcgc tggtctcaat 240
gaatcaactg tctgtactac ggttaataag gtgtgcgcgt ctggcttgaa agcggttatt 300
ctcggtgcac agaccatcat gactggcaat gcggatattg tcgtagcagg cggtgctgaa 360
tccatgtcta acgcccctca ttaccttcca aaccttcgcg tcggtgcgaa atacggcaac 420
cagagtctgg tggacggtat tatgaaggat ggcttgacag acgcaggaaa gcaggaactc 480
atgggcttgc aagccgagga gtgtgctcag gatcatggct ttagcaggga acaacaggat 540
gattatgcca ttcgcactta cgaaaaagca caggcggctc aaaaggctgg cctttttgac 600
gaagaaattg cgcctattga acttcctggc tttaggggca agccaggtgt gactgtgtca 660
caagacgaag aaccaaagaa tcttaacccg gataagcttc gagctatcaa gcctgcattt 720
atccccggat ccggcacggt cacagccccg aattcctcac ctcttaacga cggtgctgct 780
gctgttatcc tcgtctcaga agctaaactg aaagagctta acctaaagcc tgttgcaaag 840
attcttggct ggggagatgc cgcccagcag ccaagcaaat tcacaactgc cccagctcta 900
gcaattccca aggccctcag ccatgcaggt gtggctcagg atgctgttga tgcgttcgag 960
attaacgaag cgttcagcgt agttgctctg gccaatatga aactcctggg gttggctgaa 1020
gataaagtca acatccatgg tggtgcagtg gctatcggtc atcctatcgg cgccagcggt 1080
gctcgtatct tgactacatt gctcggtgta ttgaaagcga gaaagggtaa gattggttgt 1140
gccgggattt gtaatggagg aggtggtgct agcgctattg ttgtcgaatc tctcgtctga 1200
<210> 2
<211> 1299
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 2
atggcgatcc aagcttcggc tacgcgtctc ttcaagaggg cggctatccc cgcatctcgc 60
cagtggcagc gacagttcag cgctgcagcc ccagcactca aggagatcca ggatgcctat 120
atcctcagtg cttcacgaac tccgactgct aagtttaatg gatcgttcgc ctccgtctct 180
gcccccgagc tgggcgccgt tgccatcaag tctgctgtga ccaagtctgg actccctgtc 240
gagaagatca ccgatgtata catgggaaat gtcctccaag gatcggtcgg ccaggcacca 300
gctcgccagg cttctatctt cgctggtttg tcgccaacag tggaatccat gacagtaaac 360
aaagtgtgcg cctcgggtct caaggctgta gcacttgctg cacagaatat ccagcttggc 420
ctggcagacg cccaagttgc tggaggaatg gagaatatgt ctcgtgtccc ttactacctc 480
ccacgttcca gccagcttcc accgttcgga gagatcaaac tggaagatgg tttaatcaag 540
gatggtctgt gggatgtcta taacaagttt catatgggta tctgtgccga aaccacagcc 600
aagaagtatg agatctcgag ggaagatcag gatgaatatg cgattcagtc gtaccagcgg 660
gctcagaagg cctggaacga gaataagttc gccgatgaga ttgcccccgt cactgtcaag 720
ggtaagaagg gtgagaccgt tgtcgaacgt gacgaaggct atgagaatct gcgggttgat 780
aagatgaaga ccttgaagcc cgcattctta agggacggca caggcactgt cactgccggt 840
aatgcttcca ccatgaatga tggggcatca gctctggttc tggctagcaa ggacttggct 900
cgcgagtttg gccagggcaa ccgggctctt gcgcgtatcg tgtcctccgc ggatgcagct 960
attgaccccg tggacttccc tgtcgcccca gctaaggcgg ttcccattgc cctcgagcga 1020
gctggtatca ccaaggatca ggttgccgtc tgggagttta atgaggcatt tgctgccgtt 1080
atcaaagcaa acgagaagat tcttggattg cagaacgccc gtgtcaaccc tctgggagga 1140
gctatctctc tgggacatgc actcggaagc tcaggctccc gtatcctggt cactcttctc 1200
caccagttgc agcctggtga atatggtgtg gccgcgattt gcaatggtgg tggcgccgct 1260
agtgccatgg ttgtccagaa gttggaccgg gttgattag 1299
<210> 3
<211> 1242
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 3
atggcatctc caattccccg gggcctccgc caggtcctcc agaagtcccc caatgacatt 60
gtcatccttt cctcactgcg tacccccgtc actcgtgcga agaaaggcgg tttcaaagat 120
gcctaccccg aagaactcct cgccaatgtc ctcaaggcga cccttgaagc gaaccccaaa 180
ctcgacccag ccctgattga ggaagtcgct atcggctccg ttctccaaga gctcggcggt 240
gcaaaggctg gccgtatggc tcagattcac gcaggcttcc cccacacggt tcccttccac 300
acaatcaaca gacaatgttc gtccggtcta gctgctatta ccgcgatcgg caacggaatc 360
cgggcaggcg ctctcaacat tggtgtcggt ggaggaatgg agtccatgac ccggaattac 420
ggatctcgcg ctatccccac cgtgctgtgg cccgagctca aggagtcgcc gtcgaaggac 480
tctcgggact gcatcatgcc tatgggtatt acctccgaaa acgttgcttc tcgttacggt 540
atctcgaggg aggaccagga cgtatttgcc gccgagtcgc acaagaaggc tactgctgcg 600
cagaacgctg gtctgttcga ctccgaaatc gtgcccgtga agaccctctc ctttgaccct 660
gaaaaccccg atgcgccccc gaaggaaatc accgtcacaa aggatgatgg tgtccgcccc 720
aacatctccg tcgagaagat ggccagtctg aagccagcct tctccccgac tggtgctagc 780
accgccggaa acagctcgca ggtcagcgac ggtgctgccg ctgcactgct catgcgtcgt 840
tccaccgcga ccgaactcgg actgacatcc tccatcaagg gccgctgggt cggcaccgct 900
gttgctggtt gtgctcccga tgagatgggt gttggacctg ctgttgctat tcccaagctt 960
cttcagcagc tcgacatgag cgtctccgat gttaacatct gggagatcaa cgaggctttt 1020
gcctcccagg cgctctactc tatccgcaag ttgggtattg acgaggccaa ggtcaaccct 1080
aagggtggtg ctattgccat cggtcacccg ctcggtgcca ctggagctag acagctcgcc 1140
actctcctgc ccgagatgga gcgtaccggc caggaagtcg gtgttgtcag catgtgcatt 1200
ggaaccggta tgggaatggc tggtatgttt gttcgggagt aa 1242
<210> 4
<211> 1266
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 4
atgtcttcgc ctcaacaacg actatcttct atcgcaaacc agcttacgag ccctggtgct 60
gtgtccgcaa agtcaaagct cttggcgaag aaccctgacg atgtggtgat tactctcgcc 120
ctgcggactc ctcttacaaa agccaggaag ggtggcttga aggatactac tttggatgag 180
cttctcatct cactgctgac ggatgtgcgc gagcggtcga aactcgatcc aaaccttgtc 240
gaagatgtct gtgtcggaaa tgtccttgcc cctggtcaag cttacatcgc ccgttccgct 300
gttttggcag ctggtttccc cgtcaccgcc gcagcatcag ttgccaaccg attctgttct 360
tctggattgc tggcgatcca gaacattgcc aaccagatca ttgccggttc aattgatgtt 420
ggtatcgcag ttggagcaga gagcatgagc accaaccccg acaacggtgc tccagagcta 480
tctgacaaaa tcacatcaca cccaatcgcc tcgcagaaca agcaacccat gggtcagacc 540
tccgaaaatg tcgcatctca atttggaatc actcgcgaaa tgcacgacca gttcgctgcc 600
aagagctacc agaaagcaga gcatgcccag aaggctggct ggttcaatga cgagattgtt 660
cccgttcaca ccaaggttaa ggatcctaag actggagaag tgaagaatgt tgtggtcgat 720
cgtgatgatg gtattcgtta tggcacgact gccgaatcgc tcggcaagat tcgttcagcc 780
tttcctcagt ggaagcccag tgctacaacg ggtggcaatg ctagccaaat taccgacggc 840
gccgcagcac tcgtcctcat gaaacgatcc cgcgcacaag agctgggcca accaattctg 900
gccaagttcg gcggggccac tattgccggc ttagagcccc gaatcatggg aattggtccc 960
tctatcgcca ttcctaagct cctctccaag gtcggcttga ccaaggatga cattgatatc 1020
tttgagatca acgaggcgtt tgcatccatg ggtacttact gtgttcaaaa actcggtctt 1080
gacgaatcta aggtgaaccc tcggggtggt gcaattgctt tcggccaccc gttgggatgc 1140
acaggagcac gacaggttgt tactgccctc tccgaattgc ggcgacagaa caagaaagtg 1200
gcagtcacct ccatgtgtgt tggaactggt atgggcatgg ctggtatttt catctccgag 1260
gcttga 1266
<210> 5
<211> 1251
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 5
atggccacag atcgtttgaa ctctattctc agccacctca agggaggaaa cactggcctt 60
gccgccatca cccagaagaa cccagacgat gtagtcatta cgctcgctct gcgtactcct 120
ctggccaagg ccgtcaaggg tggattcaag gacacacagt tggattacat cgtatactcc 180
ttgttgaagg aggttatcga caagtccaag attgaccctg ctttggtcga ggatgtctgc 240
ttgggtaatg tcaacgacgg caaggccccc tatctcctcc gtgccgcctc ccttgcggcc 300
ggcatcccca acacatccgg cgcatcgtcc gtcaaccgat tctgctcctc cggtctcaag 360
gctgttcagg acatcgccaa ccagattaca ttgggtcaga tcgatgttgg tatcgccctt 420
ggtgctgagt tgatgtcggc cggcggtgat gcagtccaac ctttcagcga ggaagtcctg 480
aagaaccaag agtctgccga ctgcctgcag cccatgggtc agacatccga gaatgtcgga 540
tcggacttca acatcagccg tgaggttcag gacaagtatg ccgccgagtc gtaccgccgc 600
gctgaggagg cccagaaagc tgggtggttc gatgatgaga tcgtccccat caccaccaag 660
gtgaaggacc ccaagaccgg cgaggtcaag caggttactt tgaccaagga tgagggtatc 720
cgttatggaa cgacggccga gtctctcggc aagatccgac cggctttccc taagttcggt 780
aaccggagca ctggtggcaa ctccagccag gtgactgacg gcgctgccgc tgtcctcctc 840
atgcgtcgct ctagggctat tgaacttaac cagcctatcc tggctaagtt ctgtggtgcc 900
accgttgctg gcgttccccc tcgcatcatg ggtatcggcc ctaccgctgc catccccaag 960
ctcctctcca agttcaactt gaacaaggat gacatcgata tctacgagat caacgaggcc 1020
ttcgcttcca tggccgtcta ctgtttgcag aaccttggct tggaccatgc caaggtcaac 1080
ccccgcggcg gtgccattgc actcggccat cccttgggcg ccacgggtgc tcgccagatc 1140
tgcacaattc tgagcgaggc aagacggacg aagaagaagg tgctggtcac gagtatgtgc 1200
attggtaccg gacagggcat ggcgggattg ttcgtcaacg aacaggtgta a 1251
<210> 6
<211>
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 6
atgtcttctg ctcagcagcg tcttacccag gtggcttctc acttcacccc tggtggcaag 60
aagggcgtcg ccgccatcac cgagaagcac cccgatgaca ttgtcgtgac ttgtgccctt 120
cgttctgccc tcaccaaggg tggaaagggt ggcttcaagg ataccgcggc tgctgatatc 180
ctggctggcg ttttcaaggg tgttattgag aagagtggca tcgaccccaa cgtcatcgag 240
gatgttgccg tcggctccgt ccttgcccct ggtggcggtg ccaccgagtt ccgtgctgct 300
gctctggttg ctggtttccc cgagactact gctgtcaaga gcttgaaccg tcagtgctcc 360
agtggtctcc aggccatcgt tgacattgcc aatgctatca agtccggcat gattgaagtt 420
ggtattggtg ctggtgtgga gagcatgtcc tctcagtatg gtcctggtgc tgtcaccgaa 480
ttctcagacc tcctcgagaa ccaccaagag tctgccaact gcaaggttcc catgggtgtt 540
ctgtcggaga acatggctaa ggaccgtggc atttctcgtg ctgtccaaga tgctttcgcc 600
gcctcatcct accagaaggc ggttaaggct cagaaggctg gtctctttaa cgaggagatc 660
tatcctcttc aggtgaagtg gactgacccc aagtctggcg aggagaagac cattaccgtg 720
aaggccgatg atggtatccg tgacggtatc accgctgaat ccctgggcaa gattcgccct 780
gctttcgcca aggatggctc cattcatgct ggcaatgcct cccagatctc cgacggtgcc 840
gctgctgttt tgttaatgaa gcgttccact gctgagcgcc tcggtcagaa gatcatcggc 900
aagtacgtcg ccgctagcgt tgtgggtgtt aagcccctgc tcatgggcat cggcccctgg 960
aaggccatcc ccgtggccct tgagaaggct ggcatcacca aggatgacgt tgatatctac 1020
gagatcaatg aggcctttgc ctctcagtgc gtgtggtgtg tcaatgaact tggactacct 1080
caagagaaga tcaaccctaa gggaggtgcc attgcattcg gacaccctct tggctgcacc 1140
ggttctcgtc agatcagcac cctgctgaca gagctgaagc gcactgacaa gaagatcggt 1200
gtcactagca tgtgtgttgg cactggtatg ggtatggctg ccgtttgggt tcgcgaataa 1260
<210>7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 7
ctatagggaa tattaagctt atgtcttctc ttccgccggt 40
<210>8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400>8
gatggatatc tgcagaattc gacgagagat tcgacaacaa tagc 44
<210>9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 9
ctatagggaa tattaagctt atggcgatcc aagcttcgg 39
<210>10
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 10
gatggatatc tgcagaattc atcaacccgg tccaacttct g 41
<210>11
<211>40
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 11
ctatagggaa tattaagctt atggcatctc caattccccg 40
<210>12
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400>1 2
gatggatatc tgcagaattc agctcccgaa caaacatacc agcc 44
<210>13
<211>41
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 13
ctatagggaa tattaagctt atgtcttcgc ctcaacaacg a 41
<210>14
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 14
gatggatat ctgcagaatt cagcctcgga gatgaaaata cca 43
<210>15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 15
ctatagggaa tattaagctt atggccacag atcgtttgaa ct 42
<210>16
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 16
gatggatatc tgcagaattc cacctgttcg ttgacgaacaa t 41
<210>17
<211>41
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 2
ctatagggaa tattaagctt atgtcttctg ctcagcagcg t 41
<210>18
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 18
gatggatatc tgcagaattc ttcgcgaacc caaacggc 38
Claims (5)
1.一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母的构建方法，其特征在于，包括步骤：
获取米曲霉酮酯酰辅酶A硫解酶基因的克隆片段，所述米曲霉酮酯酰辅酶A硫解酶基因记为AoErg10D基因，所述AoErg10D基因的核苷酸序列为SEQ NO.1；
将所述克隆片段连接到载体pYes2.0上，得到AoErg10D表达载体；
将所述AoErg10D表达载体转化至酿酒酵母ScPot1基因突变体Y02319中，构建转基因菌株AoErg10D-Y02319，即得到所述可降解油酸的基因改造酿酒酵母。
2.根据权利要求1所述可降解油酸的基因改造酿酒酵母的构建方法，其特征在于，获取米曲霉酮酯酰辅酶A硫解酶基因的克隆片段的步骤包括：
根据所述AoErg10D基因的核苷酸序列设计对应引物序列，所述引物序列为SEQ NO.13-14；
提取米曲霉总RNA进行反转录，得到米曲霉cDNA；
以所述米曲霉cDNA为模板，所述引物序列SEQ NO.2作为引物，将AoErg10D基因扩增出来，得到米曲霉酮酯酰辅酶A硫解酶基因的克隆片段。
3.根据权利要求1所述可降解油酸的基因改造酿酒酵母的构建方法，其特征在于，将所述克隆片段连接到载体pYes2.0上，得到AoErg10D表达载体的步骤包括：
将载体pYes2.0用限制性内切酶HindIII和EcoRI进行线性化，得到线性化载体；
将所述克隆片段与线性化载体进行重组转化，得到AoErg10D表达载体。
4.一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母，其特征在于，采用权利要求1-3任一所述可降解油酸的基因改造酿酒酵母的构建方法制得。
5.一种可降解油酸的基因改造酿酒酵母的应用，其特征在于，将权利要求1-3任一构建方法制得的基因改造酿酒酵母用于降解油酸。
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