EA023559B1 - Аналоги инсулина человека с пролонгированной терапевтической активностью, стабильные в кислой среде - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к производным инсулина человека, обладающим пролонгированной терапевтической активностью и стабильностью в кислой среде, а также к их фармацевтически приемлемым солям. Заявленные производные инсулина человека могут быть использованы для производства лекарственного препарата для лечения или профилактики сахарного диабета, а также могут быть использованы при лечении пациентов, страдающих сахарным диабетом.

Description

Объектами изобретения являются новые биосинтетические аналоги рекомбинированного инсулина человека пролонгированной терапевтической активности, которые могут найти применение в профилактике и лечении сахарного диабета.

Инсулин и его различные производные используются в больших количествах при лечении сахарного диабета и часто производятся в крупном промышленном масштабе. Несмотря на то что существуют многие различные известные модифицированные производные инсулина и многие фармацевтические препараты с различными профилями активности, все еще существует необходимость в лекарственном препарате, который сможет обеспечить поддержание постоянного уровня глюкозы в организме человека в течение длительного периода времени.

Для достижения эффекта замедленной и/или пролонгированной активности некоторые препараты нормального инсулина человека содержат специфические добавки, например, различные количества протамина, белка, который образует нерастворимый комплекс с инсулином, который образует отложения в подкожных тканях, и из которых постепенно высвобождается инсулин.

Известны различные производные инсулина человека, используемые при лечении диабета, которые содержат дополнительные аминокислоты, или имеют модифицированную последовательность некоторых аминокислот. Изменения первичной структуры инсулина воздействует на его вторичную и третичную структуру, которая влияет на химические и биологические свойства белка, и что, в свою очередь, приводит к фармакокинетическим и фармакодинамическим эффектам. Эти изменения носят различный характер, могут привести к ускоренной или замедленной и пролонгированной активности модифицированного инсулина. Активная форма инсулина представляет собой мономер, который легко проникает в кровь после подкожной инъекции. Известно, что экзогенный инсулин человека в растворах имеет гексамерную форму, которая после употребления диссоциирует на димеры и впоследствии на мономеры до проникновения в кровоток. Одно из производных инсулина, характеризующееся ускоренной активностью, представляет собой лиспро-инсулин (Нита1од®), в котором была инвертирована последовательность пролин (28)-лизин (29) в цепи В. Это делает затруднительным, со стерической точки зрения, образование димеров инсулина в растворе. Второе такое производное представляет собой инсулин, в котором пролин в положении 28 цепи В был замещен аспарагиновой кислотой. Этот введенный отрицательный заряд снижает возможность самоассоциации мономеров инсулина. Оба этих производных инсулина абсорбируются быстрее благодаря их структуре.

Аналоги рекомбинированного инсулина человека пролонгированной активности сконструированы с помощью удлинения цепи В с помощью щелочных аминокислот или ацилирования ε-аминогруппы в лизине в цепи В с помощью алифатической кислоты с около дюжиной атомов углерода.

Введение этих дополнительных щелочных аминокислот изменяет некоторые химические или физические свойства инсулина. Наиболее важное изменение представляет собой сдвиг изоэлектрической точки по отношению к немодифицированному естественному инсулину от 5,4 до диапазона от около 5,5 до около 8,5, что является результатом введения чрезмерных положительных зарядов в молекулу. Вследствие этого, растворимость этих аналогов в нейтральном водном окружении снижается, и, соответственно, необходимость применения слегка кислотного окружения для получения фармацевтических препаратов, содержащих такой модифицированный инсулин.

Тем не менее, кроме очевидных преимуществ, полученных в результате введения дополнительных щелочных аминокислот, также наблюдается неблагоприятное снижение стабильности новых аналогов, которые происходят, в первую очередь, в результате дезаминирования аспарагина в положении А21, происходящем в кислотном окружении.

Данная проблема решается замещением А21Аки другой аминокислотой, такой как аспарагиновая кислота, глицин, аланин, треонин и другие. Один из таких аналогов представляет собой рекомбинантное производное инсулина человека, в котором в цепи А аспарагин(21) был замещен глицином(21) и в Сконце цепи В было прикреплено два аргининовых остатка. Это - так называемое производное инсулина гларгин, производимый под названием Лантус (патент США 5656722).

В ходе нашего исследования было установлено, что производное инсулина человека, где к С-концу цепи В были прикреплены остатки лизина (В31Ьук) и аргинина (В32Аг§), проявляет биологическую активность, которая сходна с производным гларгин, которое уже присутствует на рынке. Предыдущее исследование, проведенное на животных, показывает, что этот препарат, называемый лизаргинсулин, характеризуется пролонгированной активностью и плоским профилем высвобождения, имитируя секрецию естественного инсулина, и с клинической точки зрения - снижением ночных гипогликемии. Благодаря исключительному сходству с инсулином человека, а также с проинсулином, могут ожидаться хорошие результаты исследования, способствующие постепенной разработке потенциального лекарства и его конечной коммерциализации. Важно, что ЬукАгд последовательность на С-конце цепи В инсулина человека обнаружена в проинсулине человека, и это предполагает трансформацию лизаргинсулина в инсулин человека благодаря присутствию карбоксипептидазы С. Это означает, что первым метаболитом лизаргинсулина в организме человека может быть инсулин человека с хорошо известными и приемлемыми характеристиками, даже в случае экзогенного гормона. Было проведено широкое доклиническое иссле- 1 023559 дование на крысах, которое подтвердило пролонгированную активность нового инсулинового аналога. Тем не менее, оказывается, что это производное, помимо его благоприятной биологической активности, характеризуется недостаточной стабильностью в кислотных инъекционных растворах. Основной причиной недостаточной стабильности, которая проявляет себя в первую очередь как дезамидирование, является присутствие остатка аспарагина на С-конце цепи А, где в кислотном водном окружении может происходить дезамидирование, автокатализируемое протоном из карбоксильной группы.

Следовательно, целью данного изобретения является обеспечение новых аналогов инсулина, которые характеризовались бы адекватной стабильностью в кислотных инъекционных растворах (рН 3,5-5), и в то же время могут обладать необходимой биологической активностью. Особенно желательным является, чтобы они проявляли характеристики биологической активности естественного инсулина. Также является особенно важным, чтобы начало активности новых производных было практически немедленным, сразу после введения пациенту, со способностью пролонгированного высвобождения части дозы. Это дало бы возможность обеспечить как ускоренную, так и пролонгированную активность фармацевтического препарата, содержащего инсулиновые аналоги.

Вышеизложенная задача была непредвиденно достигнута в данном изобретении.

Основной аспект данного изобретения представляет собой производное инсулина или его фармацевтически приемлемую соль, содержащую два полипептида, составляющие цепь А и цепь В, где аминокислотная последовательность цепи А была выбрана из 8ЕО ГО N0: 1-5, тогда как аминокислотная последовательность цепи В была выбрана из 8Е0 ГО N0: 6-8.

Предпочтительное производное инсулина или его фармацевтически приемлемая соль согласно данному изобретению характеризуется тем, что является аналогом рекомбинированного инсулина человека с изоэлектрической точкой 5-8,5 и имеет формулу 1

3-3

I I

61у-Не-Уа1-61и-61п-Су8-Су5-Т1н-5ег-Не-Су5-8ег-1-еи-Туг-С1п-1_еи1 2 3 4 5 6 7\^ 8 9 Ю 11 12 13 м 15 16 ³ I 8

С1и-Азп-Туг-Суз-Р I

18 19 20 3

I

РЬе-\/а1-Азп-01п-Н|5-1-еи-Су5-С1у-8ег-Н|3-Ееи-\/а1-С1и-А1а-1-еи-Туг1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Ьеи-\/а1-Суз-е1у-С1и-Агд-О1у-РЬе-РЬе-Т уг-ТЬг-Рго-Ьуз-ТЬг- РР 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

Формула 1 где К обозначает ΝΗ₂ группу или группу согласно формуле Азп-К², где К² обозначает нейтральную Ь-аминокислоту или ΝΗ₂ группу;

К¹ обозначает В31Ьу5-В32Аг§, или В31Аг§-В32Аг§, или В31Аг§, где ВЗЛзп может быть альтернативно замещен другой аминокислотой, преимущественно О1и.

Преимущественно, производное инсулина или его физиологически приемлемая соль согласно данному изобретению характеризуется тем, что

К в формуле 1 обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает О1у, и К¹ обозначает В31Ьу5В32Аг§, или

К в формуле 1 обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает А1а, и К¹ обозначает В31Ьу5В32Аг§, или

К в формуле 1 обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает 8ег, и К¹ обозначает В31Ьу5В32Аг§, или

К в формуле 1 обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает ТЬг, и К¹ обозначает В31Ьу5В32Аг§, или

К в формуле 1 обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает группу ΝΗ₂, и К¹ обозначает В31Ьу5-В32Аг§, или

К в формуле 1 обозначает группу ΝΗ₂ и К¹ обозначает В31Ьу5-В32Аг§, или

К в формуле 1 обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает О1у, а К¹ обозначает В31АгдВ32Аг§, или

К в формуле 1 обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает А1а, а К¹ обозначает В31АгдВ32Аг§, или

К в формуле 1 обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает ТЬг, а К¹ обозначает В31АгдВ32Аг§, или

К в формуле 1 обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает 8ег, а К¹ обозначает В31АгдВ32Аг§, или

- 2 023559

К в формуле 1 обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает группу ΝΗ₂, и К¹ обозначает В31Агд-В32Ат§, или

К в формуле 1 обозначает группу ΝΗ₂, а К¹ обозначает В31Ат§-В32Ат§, или

К в формуле 1 обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает С1у, а К¹ обозначает В31Агд, или или или

К в формуле 1 обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает А1а, а К¹ обозначает В31Агд, К в формуле 1 обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает Тйт, а К¹ обозначает В31Агд, К в формуле 1 обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает §ет, а К¹ обозначает В31Агд, или

К в формуле 1 обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает группу ΝΗ₂, и К¹ обозначает В31Агд, или

К в формуле 1 обозначает группу ΝΗ₂, К¹ обозначает В31Ат§, или

К в формуле 1 обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает С1у, К¹ обозначает В31ЬузВ32Агд и В3Азп был замещен В3С1и.

Как описано ранее, в случае гларгина проблема низкой стабильности решили путем замещения аспарагина в положении А21 глицином. Исследование, которое направлено на получение инсулинового аналога, который проявляет пролонгированную активность и стабильность в кислотных инъекционных растворах, как описано в данном изобретении, шло в другом направлении. Для того чтобы блокировать карбоксильную группу, ответственную за низкую стабильность, были получены новые производные лизаргинсулина с карбоксильной группой в остатке аспарагина, модифицированном различными путями, используя способы генетической инженерии и ферментативной трансформации. В результате проведенного исследования неожиданно выяснилось, что химические и биологические свойства, сходные с таковыми у производного гларгина и лизаргина, проявляются производными инсулина человека формулы 1, где цепь А была удлиненна на С-конце остатком нейтральной аминокислоты (А22), или, где карбоксильная группа аспарагина или цистеина на С-конце цепи А была трансформирована в карбоксиамидную группу, и к С-концу цепи В были прикреплены остатки лизина и аргинина (В31Ьу5-В32Аг§) или два остатка аргинина (В31Ат§-В32Аг§), или один остаток аргинина (В31Агд). Новые аналоги, полученные таким образом, характеризуются надлежащей стабильностью в кислотных инъекционных растворах (рН 3,5-5) и в то же время проявляют необходимую биологическую активность.

Введенная модификация неожиданно привела к получению стабильных фармацевтических композиций производных инсулина, которые в то же время сохраняют биологическую активность и вызывают сдвиг изоэлектрической точки до рН 5-8, тем самым, уменьшая растворимость нового производного инсулина в физиологическом рН в месте инъекции. Это вызывает осаждение микроотложения производного инсулина в подкожной ткани и, затем, медленное высвобождение вещества в кровь, что вызывает поддержание терапевтического уровня в течение пролонгированного времени.

Свойства этих соединений и их композиций были подтверждены исследованием стабильности и исследованием их активности у животных с экспериментальным диабетом. В ходе них был неожиданно обнаружен существенно пролонгированный эффект гипогликемической активности, который также длился в течение длительного времени после прекращения введения медикамента, в отличие от того, что наблюдалось для эталонного коммерчески доступного производного инсулина с пролонгированной активностью. Это позволяет предположить, что свойства производных, которые являются объектами данного изобретения, будут давать возможность значительно уменьшить частое введение медикамента, что будет повышать эффективность, безопасность и комфорт терапии пациента. Также важно, что начало активности новых производных согласно данному изобретению является практически немедленным, что означает, что эти соединения неожиданно проявляют характеристики биологической активности известных инсулиновых аналогов с как ускоренной, так и пролонгированной активностью.

Примеры производных инсулина формулы 1 являются такими как следующие, но не ограничиваются теми, что представлены ниже.

А22О1у

А22А1а

А228ег

А22ТЬг сНА21Азн)А20Суз-НН2

Α21Α811-ΝΗ2

А22О1у

-инсулин человека-инсу^Iинчеποвеκа- инсулин человека -инсулин человека-инсупин чепсвека-инсулин чсловска—инсулин человекаВ31ЬузВ32Агд

В31ЬузВ32Агд

ВЗИузВЗгАгд

В31ЬуаВ32Агё

В31ЬузВ32Аг§

В31Ьу8В32Аг§

В301иВ31ЬувВ32А1В (инсулин ОКК) (инсулин АКК.) (инсулин 5КК) (инсулин ТКК) (инсулин ХКК) (инсулин ΖΚΚ) (инсулин ОЕКК)

А22О1у	—инсулин человека -	В31Аг§В32Аг§	(инсулин ОКК)
А22А1а	-инсулин человека—	В31АгдВ32Аг£	(инсулин АКК)
А228ег	- инсулин человека—	В31Аг§В32Аг£	(инсулин 8КК)
А22ТЬг	-инсулин человека -	В31Аг§В32Аг§	(инсулин ТКК)
сИ,А21Ач1)А20Су^МН2	—инсулин человека -	ВЗ]Аг§В32Аг§	(инсулин ХЕК)
Α21Α8Π-ΝΗ2	-инсулин человека-	В31Аг8В32Аг£	(инсулин ΖΚΚ)
А22О1у	- инсулин человека-	В31Аг§	(инсулин ОК)
А22А1а	- инсулин человека -	В31Аг§	(инсулин АК)
А223ег	-инсулин человека-	В31АГ8	(инсулин 8К)
А22ТЬг	—инсулин человека—	В31Аг§	(инсулин ТК)
Де(А21Ая1)А20С>Ш2	- инсулин человека -	В31Аг§	(инсулин ХК)
Α21Α5Π-ΝΗ,	-инсулин человека-	В31Аг§	(инсулин ΖΚ)

Чтобы упростить названия аналогов рекомбинированного инсулина человека, которые являются объектом данного изобретения, они были обозначены символами, которые состоят из названия инсулин и 2-4 заглавных букв алфавита, которые обозначают аминокислотные остатки, которые были добавлены или которые замещают те, которые присутствуют в материнской частице инсулина человека. В большинстве случаев эти буквы находятся в соответствии с однобуквенным кодом аминокислотных остатков, признанным в литературе. Только для двух остатков, которые не встречаются в природе, использовались дополнительные буквы, а именно Ζ и X. В обоих случаях буква обозначает остаток, помещенный на С-конце цепи А, где вместо терминальной СООН группы находится ΟΟΝΗ₂ группа; буква Ζ обозначает соответствующий амид аспарагина (т.е. Α21Αδη-ΝΗ₂), и буква X - амид цистеина (т.е. άе(Α21Αδη)Α20Суδ-NΗ₂).

Инсулиновые аналоги формулы 1 были получены с помощью серии генетических манипуляций с использованием стандартных способов генной инженерии.

Для этой цели были сконструированы модификации гена, кодирующего рекомбинированный проинсулин человека, с помощью генетических методик, таких как, например, сайт-специфический мутагенез. Реакция сайт-специфического мутагенеза проводилась с использованием набора Бййадепе (номер по каталогу 200518-5), в качестве матрицы была использована плазмидная ДНК ρΙΟΑΕΖυΐΝδ - ρ5/ΖυΐΝδ или ρΙΟΤΕΤΖυΐΝδ - рб/ΖυΐΝδ. Также в качестве матрицы может быть использована любая другая ДНК, содержащая соответствующую последовательность, кодирующую рекомбинированный проинсулин или препроинсулин человека.

Согласно данному изобретению, в свете общепризнанной терминологии, под рекомбинированным проинсулином человека понимается полипептидная цепь, где цепи А и В инсулина человека соединены дипептидом Йлъ-Лгд или Лгд-Лгд. а под рекомбинированным препроинсулином - комбинация проинсулина и дополнительного лидерного полипептида, например, убиквитина, или δΟΌ (супероксиддисмутаза) или их фрагментов.

Реакционную смесь использовали для трансформации компетентных клеток соответствующего штамма ЕхсйепсЫа сой, как например, ΌΗ5α, ΌΗ5 или НВ101, хотя возможно использовать клетки других штаммов Е.сой или клетки других микроорганизмов, или другие известные клеточные линии, которые могут быть использованы для экспрессии рекомбинированных белков. Плазмиду, содержащую данную модификацию гена, кодирующего рекомбинированный проинсулин человека, выделяли и секвенировали для того, чтобы проверить правильность нуклеотидной последовательности. Согласно варианту данного изобретения плазмида с модифицированным геном, кодирующим рекомбинированный проинсулин человека, использовалась для трансформации компетентных клеток ΌΗ5α Е.сой, и бактерии культивировались в средах ЬВ (Лурия-Бертани) с добавлением антибиотика для отбора (0,01 мг/мл) в объеме 500 мл при температуре 37°С, 200 об/мин в течение 18 ч. Бактериальный материал готовили для банка штаммов, образцы в пропорции 1:1 бактериальной культуры и 40% глицерин хранили при -70°С.

Варианты рекомбинированного препроинсулина, полученные путем экспрессии в штаммах Е.сой, выделяли в форме телец включения, после того, как клетки были дезинтегрированы, и далее подвергали стандартным процессам очистки слитых белков. Раствор гибридного белка с инсулиновым аналогом, полученным после ренатурации, подвергли контролируемой обработке трипсином, аналогичным образом, как во многих способах, известных ранее и описанных, например, Кетт1ега с1 а1. в I. Вю1. Сйет., Уо1. 24б, с. 6786-6791 (1971) или патентах США № 6686177 и 6100376. Полученные инсулиновые аналоги подвергались процессу очистки с использованием известных способов, главным образом, хроматографии при низком давлении, ультрафильтрации и/или ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). Продукт осаждали из достаточно очищенного раствора инсулинового аналога.

Для того чтобы получить производные, содержащие на С-конце цепи А остаток Α21Αδη-ΝΗ₂ или

- 4 023559

Ά20Ογ8-ΝΗ₂, использовали α-амидирующие ферменты (α-АЕ), катализирующие превращение прогормонов, встречающихся в природе в живых организмах, которые являются субстратами реакции, превращаемыми в активные формы α-амида.

Фермент РАМ (пептидилглицин α-амидирующая монооксигеназа) представляет собой протеазу с двойной активностью, обозначенной как активность РИМ (пептидилглицин альфа-гидроксилирующая монооксигеназа) и РАЬ (пептидиламидогликолят лиазная активность) (схема 1), которая позволяет получить С терминальный амид. Было обнаружено, что половина пептидных гормонов, таких как окситоцин или вазопрессин, для достижении их оптимальной активности нуждаются в С-терминальной амидной группе. В этой реакции амидная группа происходит от С-терминального остатка глицина, который здесь является предшественником прямой реакции (8а!аш М., ТакайазП К., 8акато1о Η., Нагаба 8., 1Кйба Υ., Νοβίιείιί М.; Ехртеззюп апб сйагас1еп/айоп оГ йишаи Ы£ипсбоиа1 рерббу1д1усше а1рйа-аппбаипд топоохудепазе. Рто1ет Ехрг РштГ. 2003 Арг; 28(2):293-302.; МШет И.А., 8ауаб К.., Ки1аШйа К., Веаибгу О.А., Мегк1ег Ό.Ι, Вейекеп А.Н.; Сйагас1еп/аиоп оГ а ЫГипсбопа1 рерббу1д1усше а1рйа-ат1бабпд еп/уте ехргеззеб ш Сйтезе йатз1ег оуату се11з. Атсй Вюсйет Вюрйуз. 1992 Νωυ 1; 298(2):380-8).

		Схема 1
н		Я	н
Пептид „ту	Си!‘ Аскорбат	Пептид	Пептид К
Ня «к ζ		\ ИО^Нц	Аминированный пептид
РНМ	>· РАЬ	4
		ΗιΟ	сносах
Предшественник, удлиненный на глицин		Промежуточное карбинола	Глиоксилэт
Предшественник с О1у	гидроксильное производное	глиоксилат

Краткое описание α-амидирования пептида активной РАМ протеазой (согласно 8а1аш М., Такайазй! К., 8акатоЮ Н., Нагаба 8., Ка1ба Υ., №дис1и М.; Ехртеззюп апб сйагас1еп/айоп оГ йитап ЫГипсйопа1 рерббу1д1усше а1рйа-аппбаипд топоохудепазе. Рго1еш ЕхртРштГ. 2003 Арг; 28(2):293-302.).

РАМ протеаза представляет собой белок, который обнаруживается среди прочего у эукариотических организмов, с различной длиной аминокислотной цепи. В данном проекте была использована протеаза, которая происходит из организма человека (Ното зар1епз), в которой обнаружены 6 генов, кодирующих белки, проявляющие активность α-амидирующей протеазы.

Основное физико-химическое свойство аналогов рекомбинированного инсулина человека формулы 1, которое отличает их от инсулина человека, представляет собой их значение изоэлектрической точки, которая имеет значения от около 5 до около 8. Это означает хорошую растворимость соединений в растворах с кислотным - слегка кислотным рН. Это свойство обеспечивало получение композиции - растворов новых производных инсулина в кислотном рН.

Аспектом данного изобретения также является фармацевтическая композиция, характеризующаяся тем, что она содержит эффективно действующее количество производного инсулина согласно данному изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, которые определены выше. Предпочтительно, фармацевтическая композиция согласно данному изобретению также содержит от 10 до 50 мкг/мл цинка.

Следующий аспект данного изобретения также представляет собой применение производного инсулина согласно данному изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, которые определены выше, для производства лекарства для лечения или профилактики диабета.

Согласно вышесказанному, фармацевтическая композиция по данному изобретению содержит эффективно действующее количество биосинтетического аналога инсулина человека формулы 1 или его фармакологически приемлемой соли и вспомогательные вещества.

Соль биосинтетического аналога инсулина человека согласно данному изобретению может быть, например, солью щелочного металла или аммонийной солью.

Предназначенную для введения композицию согласно данному изобретению получают в форме раствора, и она содержит эффективно действующее количество биосинтетического аналога инсулина человека формулы 1 или его фармакологически приемлемой соли и вспомогательные вещества, такие как изотонические агенты, консерванты, стабилизаторы, факультативно буферные вещества.

Количество активного вещества, используемого в композиции согласно данному изобретению, составляет около 1-1600, предпочтительно 10-1200, особенно предпочтительно 10-500 ед./мл. В случае каждого аналога инсулина человека, который является объектом данного изобретения, под 1 единицей (1 ед.) подразумевается 1 вспомогательная единица, содержащая такое же число молей аналога, как 1 международная единица инсулина, соответствующая 6 нмоль (т.е. 6х10^-9 моль).

Для фармацевтической композиции согласно данному изобретению значение рН раствора составля- 5 023559 ет от около 3,5 до около 5, предпочтительно 4,0-4,5.

В общем, вспомогательные вещества в композициях согласно данному изобретению представляют собой те же вещества, что используются в препаратах, содержащих известный рекомбинированный инсулин человека.

Изотоническое вещество согласно данному изобретению может быть любым веществом, которое позволяет получить раствор изоосмотический по отношению к плазме крови человека. К типичным изотоническим агентам, используемым в фармацевтике, принадлежат такие вещества, как хлорид натрия, маннитол, глицин, предпочтительно глицерин. Предпочтительным является использование глицерина.

Пригодными консервантами для использования в композиции согласно данному изобретению являются соединения, выбранные из группы, к которой принадлежат т-крезол, фенол или их смеси.

Новые производные, сходные с рекомбинированным нормальным инсулином человека, стабилизируются добавлением ионов цинка, введенными в раствор в форме, среди прочего, хлорида цинка или оксида цинка. Количество цинка может находиться в диапазоне от около 5 до около 150 мкг/мл.

Был разработан следующий пример содержимого композиции, содержащей производные рекомбинированного инсулина человека согласно данному изобретению: 10-500 ед./мл биосинтетического аналога инсулина человека формулы 1 или его фармакологически приемлемой соли, 16 мг/мл глицерина, 2,7-3 мг/мл т-крезола, 10-50 мкг/мл цинка и вода для инъекции до 1 мл.

Для лучшего объяснения сущности данного изобретения данное описание было расширено детальным обсуждением примеров реализации данного изобретения, которое включает также прилагаемые перечни последовательностей и фигуры, из которых показано следующее.

Фиг. 1 представляет структуру плазмиды ρ5/ΖυΐΝδΟ1ν(22Α). содержащей ген, кодирующий СКК белок рекомбинированного инсулина.

Фиг. 2 представляет нуклеотидную и аминокислотную последовательность плазмиды ρ5/ΖυΐΝδΟ^(22Α).

Фиг. 3 представляет структуру плазмиды ρ6/ΖυΐΝ䧀τ(22Α), содержащей ген, кодирующий инсулиновый §КК белок.

Фиг. 4 представляет нуклеотидную и аминокислотную последовательность плазмиды ρ6/ΖυΐΝδδ€Γ(22Α).

Фиг. 5 представляет влияние введения однократной дозы СКК инсулина (в дозе 5 ед./кг массы тела на концентрацию глюкозы в крови нормагликемических крыс, по сравнению с препаратом Генсулин N (Сеи8и1ш Ν)). Средние значения ± §ЕМ (стандартная ошибка среднего). Статистическая значимость ** р<0,01: инсулин СКК по сравнению с начальной концентрацией глюкозы; ## р<0,01, # р<0,05: генсулин N по сравнению с начальной концентрацией глюкозы; ^ЛЛ р<0,01: инсулин СКК по сравнению с генсулином Ν.

Фиг. 6 представляет влияние введения однократной дозы СКК инсулина (в дозе 5 ед./кг массы тела) на концентрацию глюкозы в крови крыс со стрептозотоцин-индуцированным диабетом легкой степени (в сравнении с препаратом Лантус). О - фиксированная гипергликемия; контроль - физиологический солевой раствор 10 мкл/200 г массы тела. Статистическая значимость: ** р<0,01, * р<0,05 СКК по сравнению с Лантусом.

Фиг. 7 представляет влияние введения однократной дозы СКК инсулина (в дозах 2,5, 5 и 7,5 ед./кг массы тела) на концентрацию глюкозы в крови крыс со стрептозотоцин-индуцированным диабетом тяжелой степени. 0 - фиксированная гипергликемия; контроль - физиологический солевой раствор 10 мкл/200 г массы тела. Статистическая значимость: ** р<0,01, * р<0,05 СКК 2,5 ед. по сравнению с контролем; лл р<0,01, л р<0,05 СКК 5 ед. по сравнению с контролем; ## р<0,01, # р<0,05 СКК 7,5 ед. по сравнению с контролем.

Фиг. 8 представляет влияние введения однократной дозы СКК инсулина (в дозе 7,5 ед./кг массы тела) на концентрацию глюкозы в крови крыс со стрептозотоцин-индуцированным диабетом тяжелой степени (в сравнении с препаратом Лантус). 0 - фиксированная гипергликемия; контроль - физиологический солевой раствор 10 мкл/200 г массы тела. Статистическая значимость: ** р<0,01,* р<0,05 СКК по сравнению с Лантусом.

Фиг. 9 представляет концентрацию глюкозы в крови крыс после множественных введений СКК инсулина в дозах 5 ед./кг массы тела в модели стрептозотоцин-индуцированного диабета легкой степени (в сравнении с препаратом Лантус); 0 - фиксированная гипергликемия; контроль - физиологический солевой раствор 10 мкл/200 г массы тела.

Фиг. 10 представляет концентрацию глюкозы в крови крыс в период после прекращения введения СКК инсулина в дозе 5 ед./кг массы тела в модели стрептозотоцин-индуцированного диабета легкой степени (в сравнении с препаратом Лантус).

Фиг. 11 представляет влияние введения однократной дозы СК инсулина (в дозах 10 ед./кг массы тела) на концентрацию глюкозы в крови крыс со стрептозотоцин-индуцированным диабетом умеренной степени в сравнении с препаратом Лантус. 0 - фиксированная гипергликемия; контроль физиологическая соль 10 мкл/200 г массы тела. 0 - фиксированная гипергликемия; контроль - физиологический солевой раствор 10 мкл/200 г массы тела. Статистическая значимость: ** р<0,01, * р<0,05 СК

- 6 023559 по сравнению с Лантусом.

Фиг. 12 представляет влияние введения однократной дозы ОЕКК инсулина (в дозе 10 ед./кг массы тела) на концентрацию глюкозы в крови крыс со стрептозотоцин-индуцированным диабетом умеренной степени в сравнении с препаратом Левемир. 0 - фиксированная гипергликемия.

Пример 1. Конструирование ρ5/ΖυΐΝδΟ1\'(22Λ) плазмиды и получение штамма, трансформированного этой плазмидой.

Для конструирования гена, кодирующего рекомбинированный Ш§О1у(22А) проинсулин, была использована ρ5/ΖυΐΝδ плазмида, в которой фрагмент ДНК, кодирующий предшественник рекомбинированного инсулина, добавляют к модифицированному гену синтетического убиквитина. В гене убиквитина аргининовые кодоны были замещены аланиновыми кодонами, и к С-концу гена убиквитина был добавлен дополнительный аргининовый кодон. Пептид, который составляет часть убиквитина, является переносчиком для предшественника инсулина и является условием высокой эффективности синтеза слитого белка в Е.соП. Участок, кодирующий модифицированный слитый белок убиквитин-инсулин человека, помещается под контроль ртк (\УО 05066344 А2) промотора. Плазмида несет ген устойчивости к ампициллину. Для конструирования вектора ρ5/ΖυΐΝδ была использована плазмида рЮАЫ, чья последовательность, сохраняемая в Банке Генов (Оеие Вапк), имеет номер АУ424310.

Ген рекомбинированного Ш§О1у(22А) проинсулина отличается от модельного гена проинсулина человека таким образом, что он имеет прикрепленный дополнительный СОТ кодон на С-конце цепи А. В результате аминокислотная последовательность цепи А удлиняется в положении 22 на аминокислотный остаток О1у - глицин.

Для того чтобы модифицировать ген, кодирующий последовательность рекомбинированного проинсулина человека, путем добавления ООТ (О1у) кодона на ее С-конце, были разработаны следующие праймеры для реакции точечного мутагенеза:

ОЬУО

5’ ААСТАСТОСААТССТ1ААОТСОАСТСТАОС 3’

С1у 8ТОР

ОЬУО

5’ ОТАОСТАОАОТСОАСТТААССАТТОСАО 3’

С1у

Реакцию точечного мутагенеза проводили с использованием набора 81га1адепе (номер по каталогу 200518-5). В качестве матрицы была использована плазмидная ДНК ρ5/ΖυΐΝδ. Компетентные клетки ΌΗ5 α Ексйепсйа сой были трансформированы реакционной смесью. Плазмиду р5^иШ§О1у(22А) выделили и секвенировали для того, чтобы подтвердить наличие ООТ нуклеотидов, кодирующих глицин, и правильность плазмидной последовательности. Плазмида с модифицированным геном, кодирующим рекомбинированный р5^иШ§О1у(22А) проинсулин, была использована в трансформации компетентных клеток ΌΗ5α Е.сой, которые далее культивировали в течение 18 ч в среде ЬВ с добавлением ампициллина (0,01 мг/мл) в объеме 500 мл при 37°С, 200 об/мин. Бактериальный материал был приготовлен для банка штаммов, образцы, содержащие 1:1 бактериальные культуры и 40% глицерин хранили при -70°С.

Полученный штамм ЕксйепсЫа сой представляет собой начальный биологический материал в способе получения ОКК инсулина посредством биосинтеза, согласно примеру 10.

Генетическое конструирование плазмиды р5^иШ§О1у(22А).

Плазмида р5^иШ§О1у(22А) составляет 4775 пар оснований в длину и построена из следующих регуляторных последовательностей и генов:

от 374 до 1234 п.о. (пар оснований, или Ьр) имеет место ген устойчивости к ампициллину АМР К; от 4158 до 4323 п.о. имеет место участок, кодирующий ртк промотор;

от 4327 до 4554 п.о. имеет место последовательность, кодирующая модифицированный синтетический ген убиквитина ΖυВI;

от 4558 до 4722 п.о. имеет место последовательность, кодирующая ген рекомбинированного Ш§О1у(22А) проинсулина;

от 4729 до 4775 п.о. имеет место участок, кодирующий терминатор транскрипции Тег.

Структура плазмиды р5^иШ§О1у(22А), содержащей ген, кодирующий белок рекомбинированного инсулина человека (ОКК инсулин), показана схематически на фиг. 1, и ее нуклеотидная и аминокислотная последовательность на фиг. 2.

Пример 2. Конструирование плазмиды р5^иШ§О1у(22А)Аг§(31В) и получение штамма, трансформированного ею.

При конструировании гена рекомбинированного Ш§О1у(22А)Агд(31В) проинсулина была использована плазмида р5^иШ§О1у(22А). Рекомбинированный Ш§О1у(22А)Аг§(31В) ген характеризуется замещением ААО (Ьук) кодона СОТ (Агд) кодоном в положении 31 цепи В.

Для того чтобы модифицировать ген, кодирующий последовательность рекомбинированного ΙΝδ- 7 023559

С1у(22Л) проинсулина, были разработаны следующие праймеры для реакции точечного мутагенеза: АКОО

5’ СТААААСАССТСОСООСАТСОТТОААСАО 3’

Аг§

АКСГ)

5’ СОАТОССОСОАССТОТТТТАООАОТОТАО 3’

Аг§

Набор 81га1адеие (номер по каталогу 200518-5) был использован для проведения реакции точечного мутагенеза. Выделение, подтверждение правильности плазмидной нуклеотидной последовательности и получение ΌΗ5α бактерий Е.сой с р5/2и1М§О1у(22А)Аг§(31В) плазмидой были проведены, как в примере 1. Полученный штамм ЕзсйейсЫа сой представляет собой начальный биологический материал в процессе производства ОК. инсулина посредством биосинтеза согласно примеру 11.

Пример 3. Конструирование плазмиды р5^и1М§§ег(22А)Аг§(31В) и получение штамма, трансформированного ею.

Для конструирования гена рекомбинированного 1Ы§§ег(22А)Аг§(31В) проинсулина была использована плазмида ρ5/ΖυΐΝδΟ1\·(22Λ)ΛΓ§(31Β). Различие между геном, кодирующим рекомбинированный 1Ы§§ег(22А)Аг§(31В) проинсулин, и геном, кодирующим рекомбинированный проинсулин ΙΝδО1у(22А)Аг§(31В), состоит в замещении ООТ (О1у) кодона ТСТ ^ег) кодоном в положении 22 цепи А.

Для того чтобы модифицировать ген, кодирующий последовательность рекомбинированного ΙΝδО1у(22А)Аг§(31В) проинсулина, с помощью замещения ООТ (О1у) кодоном ТСТ ^ег) в положении 22 цепи А, были разработаны следующие праймеры для реакции точечного мутагенеза:

5ЕК.О

5’ СААТТСТТААСОАТССТСТАО 3’

8ег 8ТОР

5ЕИЗ

5’ СТТААСААТТОСАОТАОТТСТССАС 3’

5ег

Набор δΙπ·ιΐ3^;ΐ'Κ (номер по каталогу 200518-5) был использован для проведения реакции точечного мутагенеза. Выделение, подтверждение правильности плазмидной нуклеотидной последовательности и получение ΌΗ5α бактерий Е.сой с плазмидой ρ5/ΖυINδδе^(22А)А^§(31В) были проведены, как в примере 1.

Полученный штамм ЕзсйейсЫа сой представляет собой начальный биологический материал в процессе производства δΚ инсулина посредством биосинтеза согласно примеру 12.

Пример 4. Конструирование плазмиды р5^И1№А1а(22А) и получение штамма, трансформированного ею.

Для конструирования гена рекомбинированного 1№А1а(22А) проинсулина была использована плазмида ρ5/ΖυΐΝδ. Различие между геном рекомбинированного 1№А1а(22А) проинсулина и модельным геном проинсулина человека состоит в добавлении ОСТ кодона к С-концу цепи А первого. В результате аминокислотная последовательность цепи А удлиняется в положении 22 на аминокислотный остаток А1а - аланин.

Для того чтобы модифицировать ген, кодирующий последовательность рекомбинированного инсулина человека, добавлением ОСТ (А1а) кодона на ее С-конце, были разработаны следующие праймеры для точечного мутагенеза:

АЬАО

5’ СААТССТТААСОАТССТСТАО 3’

А1а 8ТОР

АЬАП

5’ СТТААССАТТОСАСТАОТТСТССАО 3’

А1а

Набор δΙπ·ιΐ3^;ΐ'Κ (номер по каталогу 200518-5) был использован для проведения реакции точечного мутагенеза. Выделение, подтверждение правильности плазмидной нуклеотидной последовательности и получение ΌΗ5α бактерий Е.сой с плазмидой р5^иГ^А1а(22А) были проведены, как в примере 1.

- 8 023559

Полученный штамм ЕксйепсЫа сой представляет собой начальный биологический материал в процессе производства АКК инсулина посредством биосинтеза согласно примеру 13.

Пример 5. Конструирование плазмиды ρ5/ΖυΐΝ8Ο1γ(22Α)Ο1ιι(3Β) и получение штамма, трансформированного ею.

Для конструирования гена рекомбинированного ρ5/ΖυΐΝ8Ο1γ(22Α)Ο1ιι(3Β) проинсулина была использована ρ5/ΖυΐΝ8Ο1γ(22Α) плазмида. Различие между геном, кодирующим рекомбинированный 1Ы8С1у(22А)С1ц(3В) проинсулин, и геном, кодирующим рекомбинированный Ш8С1у(22А) проинсулин, заключается в замещении кодона ААС (Аки) кодоном САА (С1и) в положении 3 цепи В.

Для того чтобы модифицировать ген, кодирующий последовательность рекомбинированного ΕΝ8С1у(22А) проинсулина, посредством замещения ААС (Акп) кодоном САА (С1и) в положении 3 цепи В, были разработаны следующие праймеры для реакции точечного мутагенеза:

оьио

5’ ОТССААСАОСАССТОТСТООТТС 3’

С1и ото

5’ ОСТОТТСОАСААААСОАООАССТОС 3’

О1и

Набор 81га1адепе (номер по каталогу 200518-5) был использован для проведения реакции точечного мутагенеза. Выделение, подтверждение правильности плазмидной нуклеотидной последовательности и получение ΌΗ5α бактерий Е.сой с плазмидой р5^и1Ы8С1у(22А)С1и(31В) были проведены, как в примере 1.

Полученный штамм ЕксйепсЫа сой представляет собой начальный биологический материал в процессе производства СЕКК инсулина посредством биосинтеза согласно примеру 14.

В примерах 1-5 в качестве хозяинов плазмиды были использованы ΌΗ5α бактерии Е.сой, но в описанной выше модельной реализации данного изобретения могут быть использованы также другие штаммы Е.сой, например, ΌΗ5 или НВ 101.

Пример 6. Конструирование плазмиды р6^иШ88ег(22А) и получение штамма, трансформированного ею.

Для конструирования гена, кодирующего рекомбинированный 1Ы88ег(22А) проинсулин, была использована плазмида р6^иШ8. в которой фрагмент ДНК, кодирующий предшественник рекомбинированного инсулина, был добавлен к модифицированному гену, кодирующему синтетический убиквитин. В убиквитин-кодирующем гене кодоны аргинина были замещены кодонами аланина и к С-концу гена убиквитина был добавлен дополнительный аргининовый кодон. Пептид, составляющий часть убиквитина, является переносчиком для предшественника инсулина, который обуславливает высокую эффективность экспрессии слитого белка у Е.сой. Участок, кодирующий модифицированный слитый белок убиквитининсулин человека помещают под контроль ртк промотора (νθ 05066344 А2). Плазмида несет ген устойчивости к тетрациклину. Для конструирования вектора р6^ЬШ8 была использована плазмида ρ5/ΖυΐΝ8.

Различие между геном, кодирующим рекомбинированный 1Ы88ег(22А) проинсулин, и модельным геном проинсулина человека состоит в том, что к первому был добавлен дополнительный кодон ТСТ на С-конце цепи А. В результате аминокислотная последовательность цепи А удлиняется в положении 22 на аминокислотный остаток 8ег - серин.

Для того чтобы модифицировать ген, кодирующий последовательность рекомбинированного проинсулина, посредством добавления кодона ТСТ (8ег) на ее С-конце, были разработаны следующие праймеры для реакции точечного мутагенеза:

5КК.0

5’ СААСТАСТОСААТТСТТААСТСОА 3’

8ег 8ТОР

8ккл

5’ ТАОАОТССАСТТААСААТТОСАОТАЗ’

8ег

Набор 81га1адепе (номер по каталогу 200518-5) был использован для проведения реакции точечного мутагенеза, в качестве матрицы использовали р6^и1Ы8 плазмидную ДНК. Компетентные клетки ΌΗ5α ЕксйепсЫа сой были трансформированы реакционной смесью. Плазмида р6^иЕ8Г88ег(22А) была выделена и секвенирована для того, чтобы подтвердить присутствие ТСТ нуклеотидов, кодирующих серии, и

- 9 023559 правильность плазмидной последовательности. Плазмида с модифицированным геном, кодирующим ρ6/ΖυΐΝδδθΓ(22Λ) проинсулин, была использована для трансформации ΌΗ5α бактерий Е.еой. Впоследствии бактерии культивировали в течение 18 ч в средах ЬВ с добавлением тетрациклина (0,01 мг/мл) в 500 мл объема при 37°С, 200 об/мин.

Бактериальный материал был приготовлен для банка штаммов, образцы, содержащие 1: 1 бактериальные культуры и 40% глицерин, хранили при -70°С.

Полученный штамм ЕксйепсЫа сой представляет собой начальный биологический материал в процессе производства §КК инсулина посредством биосинтеза согласно примеру 15.

Генетическое конструирование плазмиды ρ6/ΖυΐΝδ^Γ(22Λ).

Плазмида ρ6/ΖυΐΝδ^Γ(22Λ) составляет 4911 пар оснований в длину и составлена из следующих регуляторных последовательностей и генов:

от 146 до 1336 п.о. имеет место ген устойчивости к тетрациклину ТЕТ К; от 4304 до 4469 п.о. имеет место участок, кодирующий ртк промотор;

от 4473 до 4703 п.о. имеет место участок, кодирующий ген, кодирующий модифицированный синтетический убиквитин; существуют следующие модификации: замещение аминокислоты аргинин в положениях 42, 54, 72, 74 в гене убиквитина аланином и добавление аргинина в положении 77, что позволяет удалить убиквитин;

от 4704 до 4868 п.о. имеет место последовательность, кодирующая ген, кодирующий рекомбинированный Ш§§ег(22А) проинсулин;

от 4875 до 4911 п.о. имеет место участок, кодирующий терминатор транскрипции Тег.

Структура плазмиды р6^иШ§§ег(22А), содержащей ген, кодирующий белок рекомбинированного инсулина человека (§КК белок), показана схематически на фиг. 3, а ее нуклеотидная и аминокислотная последовательность на фиг. 4.

Пример 7. Конструирование плазмиды ρ6/ΖυΐΝ8Ο1ν(22Α) и получение штамма, трансформированного ею.

Для конструирования гена, кодирующего рекомбинированный Ш§С1у(22А) проинсулин, была использована плазмида р6^иш§, в которой фрагмент ДНК, кодирующий предшественник рекомбинированного инсулина, добавлен к модифицированному гену, кодирующему синтетический убиквитин.

Различие между геном, кодирующим рекомбинированный Ш§О1у(22А) проинсулин, и модельным геном проинсулина человека, состоит в том, что к первому был добавлен дополнительный кодон СОТ на С-конце цепи А. В результате аминокислотная последовательность цепи А удлиняется в положении 22 на аминокислотный остаток С1у - глицин.

Для того чтобы модифицировать ген, кодирующий последовательность рекомбинированного проинсулина человека, посредством добавления кодона ССТ (С1у) на ее С-конце, были разработаны следующие праймеры для реакции точечного мутагенеза:

ΟΙΎΟ

5’ ААСТАСТОСААТССТТААОТСОАСТСТАОС 3’

С1у 8Т0Р

ΟΙΎΟ

5’ СТАССТАСАОТСОАСТТААССАТТССАОЗ’

С1у

Набор 81га1адеие (номер по каталогу 200518-5) был использован для проведения реакции точечного мутагенеза. Выделение, подтверждение правильности плазмидной нуклеотидной последовательности и получение ΌΗ5 бактерий Е.сой с плазмидой ρ6/ΖυΐΝδΟ1\'(22Λ) были проведены, как в примере 6.

Полученный штамм ЕксйепсЫа сой представляет собой начальный биологический материал в процессе производства СКК инсулина посредством биосинтеза согласно примеру 16.

Пример 8. Конструирование плазмиды р6^иШ§С1у(22А)С1и(3В) и получение штамма, трансформированного ею.

Для конструирования гена рекомбинированного Ш§С1у(22А)С1и(3В) проинсулина была использована плазмида р6^иШ§С1у(22А). Различие между геном рекомбинированного Ш§С1у(22А)С1и(3В) проинсулина и геном рекомбинированного Ш§С1у(22А) проинсулина состоит в замещении ААС (Аки) кодона САА (С1и) кодоном в положении 3 цепи В.

Для того чтобы модифицировать ген, кодирующий последовательность рекомбинированного ΙΝδС1у(22А) проинсулина, посредством замещения ААС (Акп) кодона САА (С1и) кодоном в положении 3 в цепи В, были разработаны следующие праймеры для точечного мутагенеза:

- 10 023559 оьио

5’ СТССААСАОСАССТОТОТООТТС 3’ <,1и оит-2

5’ САСАООТОСТОТТСОАСААААСОАСС 3’

С1и

Набор 8йа1адепе (номер по каталогу 200518-5) был использован для проведения реакции точечного мутагенеза. Выделение, подтверждение правильности плазмидной нуклеотидной последовательности и получение ΌΗ5 бактерий Е.сой с плазмидой ρ6/ΖυΐΝ8Ο1ν(22Α)Ο1υ(31Β) были проведены, как в примере 6.

Полученный штамм ЕксйейсЫа сой представляет собой начальный биологический материал в процессе производства СЕКК инсулина посредством биосинтеза согласно примеру 17.

Пример 9. Конструирование плазмиды р6^ИШ8С1у(22А)Атд(31В) и получение штамма, трансформированного ею.

Для конструирования гена рекомбинированного Ш8С1у(22А)Атд(31В) проинсулина была использована плазмида р6^ИШ8С1у(22А). Ген, кодирующий рекомбинированный Ш8С1у(22А)Атд(31В) проинсулин, характеризуется тем, что в нем замещен ААС (Ьук) кодон ССТ (Агд) кодоном в положении 31 цепи В.

Для того чтобы модифицировать ген, кодирующий последовательность рекомбинированного ΐΝ8С1у(22А) проинсулина, были разработаны следующие праймеры для точечного мутагенеза:

АКСО

5’ СТААААСАССТСОСООСАТСОТТОААСАС 3’

Агд

ΑΚΟϋ

5’ СОАТОССОСОАССТОТТТТАООАОТОТАО 3’

Агд

Набор 8йа1адепе (номер по каталогу 200518-5) был использован для проведения реакции точечного мутагенеза. Выделение, подтверждение правильности плазмидной нуклеотидной последовательности и получение ΌΗ5 бактерий Е.сой с плазмидой р6^ИШ8С1у(22А)Атд(31В) были проведены, как в примере 6.

Полученный штамм ЕксйейсЫа сой представляет собой начальный биологический материал в процессе производства СК инсулина посредством биосинтеза согласно примеру 18.

Пример 10. Производство СКК инсулина.

СКК инсулин был произведен в процессе биосинтеза, осуществляемом классическим путем (инокулят, посевная культура, продуктивная культура) с использованием штамма ЕксйейсЫа сой с фрагментом ДНК, кодирующим предшественник СКК инсулина, полученного согласно примеру 1. Продуктивная культивация была проведена в 150 дм³ ферментационном чане в течение 20 ч при 37°С, контролируя рН, температуру, оптическую плотность, концентрацию глюкозы и аэрацию. В условиях ферментации СКК аналог образовывался внутриклеточно в тельцах включения. После окончания ферментации ферментационный бульон концентрировали и далее обрабатывали лизозимом, и бактериальные клетки подвергали разрушению. Полученную суспензию разводили водой и после инкубации с тритоном центрифугировали. Созданное сырое отложение телец включения вначале очищали, в итоге получая гомогенат телец включения.

Полученный гомогенат растворяли (10-15 мг/см³) в растворе карбоната натрия с добавлением ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), подвергали ренатурации и, для защиты свободных аминогрупп лизина, подвергали обратимому процессу цитраконилирования в реакции с цитраконовым ангидридом. Растворенный белок подвергали расщеплению трипсином для того, чтобы выщепить лидерный белок и расщепить инсулиновые цепи. В результате действия трипсина был получен СКК инсулин. Раствор после расщепления трипсином подвергли очищению жидкостной хроматографией при низком давлении на геле ДЭАЭ (диэтиламиноэтил или ЭЕАЕ) - сефароза ЕЕ (8ерйато§е ЕЕ(ЕаЧ Р1о^)), и после этого диафильтрации и концентрированию - вторая жидкостная хроматография при низком давлении на геле Цсефарозы ЕЕ. Основная фракция подвергалась очистке жидкостной хроматографией при высоком давлении на 10 мкм геле 1<готай1-ВРС8 100А. Основную фракцию концентрировали с использованием диализа до концентрации 30-40 мг/см³ и очищенный СКК инсулин был отделен путем кристаллизации с использованием цитрата натрия, ацетата цинка, лимонной кислоты.

Из одной партии телец включения получили около 5,4 г кристаллизованного СКК инсулина с чистотой ВЭЖХ 97%.

Структура продукта была подтверждена следующими данными:

- 11 023559 молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией, равна 6149 и соответствует теоретическому значению (6149,1);

пептидная карта: соответствует;

последовательность и аминокислотный состав: соответствующий теоретическому.

Изоэлектрическая точка, определенная с помощью капиллярного электрофореза, составляет 7,19.

Пример 11. Производство СК инсулина.

Осуществляя процесс аналогично примеру 10, используя штамм ЕксйепсЫа сой с фрагментом ДНК, кодирующим предшественник СК инсулина, полученный согласно примеру 2, получили из аналогичной партии телец включения 5,2 г СК инсулина с чистотой ВЭЖХ, равной 97,5%.

Структура продукта была подтверждена следующими данными:

молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией, равна 6021 и соответствует теоретическому значению (6020,9);

пептидная карта: соответствует, последовательность и аминокислотный состав: соответствуют теоретическому.

Изоэлектрическая точка: 6,39.

Пример 12. Производство 8К инсулина.

Осуществляя процесс аналогично примеру 10, используя штамм ЕксйепсЫа сой с фрагментом ДНК, кодирующим предшественник 8К инсулина, полученный согласно примеру 3, получили из аналогичной партии телец включения 5,5 г 8К инсулина с чистотой ВЭЖХ, равной 97%.

Структура продукта была подтверждена следующими данными:

молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией, равна 6051 и соответствует теоретическому значению (6050,9);

пептидная карта: соответствует.

Изоэлектрическая точка: 6,55.

Пример 13. Производство АКК инсулина.

Осуществляя процесс аналогично примеру 10, используя штамм ЕксйепсЫа сой с фрагментом ДНК, кодирующим предшественник АКК инсулина, полученный согласно примеру 4, получили из аналогичной партии телец включения 4,7 г АКК инсулина с чистотой ВЭЖХ, равной 96,5%.

Структура продукта была подтверждена следующими данными:

молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией, равна 6163 и соответствует теоретическому значению (6163,1);

пептидная карта: соответствует.

Изоэлектрическая точка: 7,07.

Пример 14. Производство СЕКК инсулина.

Осуществляя процесс аналогично примеру 10, используя штамм ЕксйепсЫа сой с фрагментом ДНК, кодирующим предшественник СЕКК инсулина, полученный согласно примеру 5, получили из аналогичной партии телец включения 5,0 г СЕКК инсулина с чистотой ВЭЖХ, равной 97,5%.

Структура продукта была подтверждена следующими данными:

молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией, равна 6164 и соответствует теоретическому значению (6164,1);

пептидная карта: соответствует.

Изоэлектрическая точка: 6,29.

Пример 15. Производство 8КК инсулина.

Осуществляя процесс аналогично примеру 10, используя штамм ЕксйепсЫа сой с фрагментом ДНК, кодирующим предшественник 8КК инсулина, полученный согласно примеру 6, получили из аналогичной партии телец включения 5,3 г 8КК инсулина с чистотой ВЭЖХ, равной 98%.

Структура продукта была подтверждена следующими результатами:

молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией, равна 6179 и соответствует теоретическому значению (6179,1);

пептидная карта: соответствует.

Изоэлектрическая точка: 7,05.

Пример 16. Производство СКК инсулина.

Осуществляя процесс аналогично примеру 10, используя штамм ЕксйепсЫа сой с фрагментом ДНК, кодирующим предшественник СКК инсулина, полученный согласно примеру 7, получили из аналогичной партии телец включения 6,3 г СКК инсулина с чистотой ВЭЖХ, равной 95,5%.

Остальные свойства продукта (СКК инсулина) такие, как в примере 10.

Пример 17. Производство СЕКК инсулин.

Осуществляя процесс аналогично примеру 10, используя штамм ЕксйепсЫа сой с фрагментом ДНК, кодирующим предшественник СЕКК инсулина, полученный согласно примеру 8, получили из аналогичной партии телец включения 6,0 г СЕКК инсулина с чистотой ВЭЖХ, равной 97%.

Остальные свойства продукта (СЕКК инсулина) такие, как в примере 14.

- 12 023559

Пример 18. Производство ОК инсулина.

Осуществляя процесс аналогично примеру 10, используя штамм ЕзсЬепсЫа сок с фрагментом ДНК, кодирующим предшественник ОК инсулина, полученный согласно примеру 9, получили из аналогичной партии телец включения 5,5 г ОК инсулина с чистотой ВЭЖХ, равной 96,5%.

Остальные свойства продукта (ОК инсулина) такие, как в примере 11.

Пример 19. Производство ΖΚΡ инсулина.

К 1000 мл раствора ОКК инсулина, произведенного согласно примеру 10 или 16 (концентрация 0,1 мг/мл), в 100 мМ МЕ8/КОН буфера рН 5,0-5,5 добавляли 1 мкМ Си8О₄, 100 мкг/мл каталазы, 5 мМ аскорбиновой кислоты и 2 мкМ РАМ фермента (полученного согласно 8а1ат М., ТакаЬазЫ К., 8акато1о Η., Нагайа 8., КаМа Υ., №дисЫ М.; Ехргеззюп апй сЬагас1еп/аОоп οί Ьитап ЬЬипсЬопа1 рерЬйу1д1усте афЬа-апнйаОпд топоохудепазе. Рго1еш Ехрг РипГ. 2003 Арг; 28(2):293-302), и после этого смесь оставляли на 2 ч при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 1 мМ №-ь-ЭДТА.

После фильтрации полученный раствор подвергался очищению с помощью способов ионообменной хроматографии и ВЭЖХ.

Главную фракцию, содержащую ΖΚΡ инсулин, концентрировали и подвергали кристаллизации, используя цитрат натрия, цитрат цинка, лимонную кислоту. Из одной партии реакционной смеси получали около 10 мг кристаллического ΖΚΡ инсулина с чистотой ВЭЖХ, равной 97%.

Структура продукта была подтверждена следующими результатами:

молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией, равна 6091 и соответствует теоретическому значению (6091,1);

пептидная карта: соответствует.

Изоэлектрическая точка: 7,54.

Пример 20. Производство ΖК инсулина.

К 100 мл раствора ОК инсулина, произведенного согласно примеру 11 или 18 (2 мг/мл), в 100 мМ МЕ8/КОН буфера, рН 4,5, добавляли 1 мкМ Си8О₄, 100 мкг/мл каталазы, 5 мМ аскорбиновой кислоты и 2 мкМ РАМ фермента, и после этого раствор слегка перемешивали в течение 1 ч при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 1 мМ №₂-ЭДТА. Раствор после реакции с РАМ подвергали очищению с помощью способов ионообменной хроматографии и ВЭЖХ.

Главную фракцию, содержащую инсулин, концентрировали и подвергали кристаллизации, используя цитрат натрия, цитрат цинка, лимонную кислоту. Из одной партии реакционной смеси получали 22 мг кристаллического ΖК инсулина с чистотой ВЭЖХ, равной 98%.

Структура продукта была подтверждена следующими результатами:

молекулярная масса, определенная масс-спектрометрией, равна 5963 и соответствует теоретическому значению (5962,9);

пептидная карта: соответствует.

Изоэлектрическая точка: 6,97.

Пример 21. Производство фармацевтического препарата ОКК инсулина (100 ед./мл).

Приготовили 100 мл фармацевтического препарата ОКК инсулина (100 ед./мл) следующего состава (значения на 1,0 мл):

ОКК инсулин (Пример 16) 3,69 мг/мл (как 100% вещество, 100 ед/мл) т-крезол 2,7 мг/мл безводный глицерин 16 мг/мл цинк 30 мкг/мл вода для инъекции до 10 мл рН 4,5

Процедура приготовления была следующей.

Готовили два следующих раствора.

Раствор 1.

Оксид цинка в количестве, необходимом для реакции с конечной концентрацией ионов Ζη 30 мкг/мл, растворяли в 40 мл 10 мМ соляной кислоты. После этого, к полученному раствору добавляли инсулин ОКК в количестве, соответствующем 10000 ед. инсулина ОКК, при легком перемешивании до получения прозрачного раствора и затем рН доводили до значения 4,5.

Раствор 2.

Отдельно, 270 мг т-крезола и 1600 мл безводного глицерина разводили в 40 мл воды для инъекции.

Смешивание растворов 1 и 2.

- 13 023559

Раствор 1 добавляли при перемешивании к раствору 2, дополненному водой для инъекции до объема 100 мл и в случае необходимости доведя рН до значения 4,5 с помощью 10 мМ соляной кислоты или 0,2 М раствора гидроксида натрия. Полученную смесь в стерильных условиях фильтровали через 0,22 мкм фильтр и отбирали аликвоты в стеклянные 3 мл флаконы. Определили, что препарат, содержащий ОКК инсулин (100 ед./мл), проявляет стабильность при комнатной температуре в исследуемый период равный 56 дням, в ускоренном испытании на стабильность (пример 24).

Пример 22. Производство фармацевтического препарата ОК инсулина (100 ед./мл).

Приготовили 100 мл фармацевтического препарата ОК инсулина (100 ед./мл) следующего состава (значения на 1,0 мл):

СК инсулин (Пример 11) 3,61 мг/мл (как 100% вещество, 100 ед/мл) т-крезол 2,7 мг/мл безводный глицерин 16 мг/мл цинк 30 мкг/мл вода для инъекции до 1,0 мл рН 4,0

Процедура была идентичной таковой в примере 21, за исключением того, что вместо ОКК инсулина был использован ОК инсулин (в количестве 361 мг, 10000 ед.) и что конечное значение рН было 4,0.

Пример 23. Производство фармацевтического препарата ОЕКК инсулина (100 ед./мл).

Приготовили 100 мл фармацевтического препарата ОЕКК инсулина (100 ед./мл) следующего состава (значения на 1,0 мл):

ОЕКК инсулин (Пример 14) 3,70 мг/мл (как 100% вещество, 100 ед/мл) т-крезол 2,7 мг/мл безводный глицерин 16 мг/мл цинк 30 мкг/мл

Процедура была идентичной таковой в примере 21, за исключением того, что вместо ОКК инсулина был использован ОЕКК инсулин (в количестве 10000 ед.) и что конечное значение рН было 4,0.

Пример 24. Ускоренное испытание стабильности фармацевтического препарата ОКК инсулина (100 ед./мл).

Фармацевтический препарат ОКК инсулина (100 ед./мл), приготовленный согласно примеру 21, подвергался ускоренному испытанию стабильности (25±2°С). В ходе этого испытания проводили анализ чистоты и уровня белковой примеси. Ниже показаны определенная с помощью ВЭЖХ чистота продукта (ОКК инсулина) и пропорциональный вклад: наибольшей отдельной примеси, деамидо-производного и полимеров, в ВЭЖХ испытании, в моменты времени: 0, 28, 42 и 56 дней.

Контроль чистоты с помощью ВЭЖХ	.,0”	28 дней	42 дня	56 дней
Главный пик [%]	95,10	94,33	93,98	93,60
Наибольшая отдельная примесь [%]	1,07	1,70	1,72	1,98
Деамидо [%]	0,28	0,37	0,32	0,36
Полимеры [%]	0,17	0,37	0,44	0,48

Пример 25. Ускоренное испытание стабильности фармацевтического препарата ОЕКК инсулина (100 ед./мл).

Фармацевтический препарат ОЕКК инсулина (100 ед./мл), приготовленный согласно примеру 23, подвергался ускоренному испытанию стабильности (25±2°С). В ходе этого испытания проводили анализ

- 14 023559 чистоты и уровня белковой примеси. Ниже показаны определенная с помощью ВЭЖХ чистота продукта (СЕКК инсулина) и пропорциональный вклад: наибольшей отдельной примеси и полимеров, в ВЭЖХ испытании, в моменты времени: 0, и 14 дней и 1,2 и 3 месяца.

Контроль чистоты с помощью ВЭЖХ	„0”	14 дней	1 месяц	2 месяца	3 месяца
Главный пик [%]	97,33	97,14	96,42	94,55	94,41
Наибольшая отдельная примесь [%]	0,55	0,45	0,67	1,08	1,26
Полимеры[%]	не определял ся	0,09	не определял ся	0,50	не определял ся

Пример 26. Определение активности СКК на животных с нормогликемией.

Аналог рекомбинированного инсулина человека (СКК инсулин), сходный с генсулином N (рекомбинированным изофан инсулином человека) проявляет пролонгированное время действия, и гипогликемия нормогликемических крыс имеет сходное течение. Значительные отличия в гипогликемической активности обоих препаратов наблюдались через 0,5 и 1 час после введения. В это время имеет место наблюдаемое быстрое и глубокое снижение концентрации глюкозы после СКК инсулина. Пиковая активность СКК инсулина и Генсулина N приходится на 2^-й час.

Начальное исследование подтвердило, что СКК инсулин является активным аналогом с пролонгированной гипогликемической активностью. Снижение уровня глюкозы после введения СКК инсулина наблюдалось на протяжении до 12 ч, тогда как уровни глюкозы через 24 ч были сходными с начальным. Результаты реакции нормогликемических крыс на однократное введение препаратов СКК инсулина и генсулина N (принимая во внимание средние значения ± 8ЕМ) показаны на табл. 1 и фиг. 5.

Пример 27. Определение активности СКК инсулина на животных с экспериментальным диабетом.

Исследования на экспериментальной модели диабета крыс (индукция стрептозотоцином) подтвердили неоспоримую гипогликемическую активность СКК инсулина. Эта активность имеет свойства пролонгированной активности.

После введения однократной дозы, снижение концентрации глюкозы в крови исследуемых крыс оставалось статистически значимым до 8^-го-10^-го часа (в зависимости от интенсивности диабета и дозы), в сравнении с контролем. В ходе исследования было продемонстрировано более быстрое начало активности и более быстрое достижение пиковой активности (начало с 30 минут, пик 1-2 часа) при действии СКК инсулина по сравнению с эталонным препаратом - инсулин гларгин (Лантус). Статистическая значимость этого явления была подтверждена для диабета тяжелой и умеренной степени.

Также исследование введения многократных доз СКК инсулина и эталонного препарата инсулина гларгина демонстрировало сходную активность обоих аналогов. Вводимые в течение 21 дня, три раз в день, препараты вызывали улучшение гликемических параметров при диабете легкой степени и, в принципе, статистически не отличались по интенсивности действия. Единственным отличием был значительно более равномерный профиль активности СКК инсулина.

Дополнительно, наблюдалось очень интересное явление продолжительного гипогликемического действия после окончания введения СКК препарата. Это наблюдение было проведено на 9 крысах, которые получали лечение СКК препаратом и 3 из которых получали лечение Лантусом, из группы с диабетом легкой степени, которым вводились аналоги в дозе 5 ед./кг массы тела в течение 21 дня. Полученные результаты могут свидетельствовать о существовании очень сильного связывания СКК инсулина в тканях (возможно подкожной ткани). Они поддерживают тезис о существовании компартмента, в котором инсулин накапливается и медленно перераспределяется. Это явление не наблюдалось для эталонного препарата. Это свойство, после его подтверждения у людей, может быть прорывом в терапии с аналогами инсулина пролонгированной активности, позволяя, например, вводить менее чем одну дозу медикамента в день.

Результаты, описывающие концентрацию глюкозы в крови крыс после введения однократной дозы СКК инсулина в дозе 5 ед./кг массы тела в модели стрептозотоцин-индуцированного диабета легкой степени (в сравнении с препаратом Лантус), показаны в табл. 2 и фиг. 6.

Результаты, описывающие влияние СКК инсулина на концентрацию глюкозы в крови крыс после одноразового введения однократной дозы в дозах 2,5 ед./кг массы тела, 5 ед./кг массы тела и 7,5 ед./кг массы тела в модели стрептозотоцин-индуцированного диабета тяжелой степени (в сравнении с препаратом Лантус и контроль), показаны в табл. 3.

Результаты, представляющие влияние СКК инсулина на концентрацию глюкозы в крови крыс после введения однократной дозы в дозах 2,5 ед./кг массы тела, 5 ед./кг массы тела и 7,5 ед./кг массы тела в модели стрептозотоцин-индуцированного диабета тяжелой степени (в сравнении с контролем), показаны на фиг. 7.

- 15 023559

Результаты, представляющие влияние СКК инсулина на концентрацию глюкозы в крови крыс после введения однократной дозы 7,5 ед./кг массы тела в модели стрептозотоцин-индуцированного диабета тяжелой степени (в сравнении с препаратом Лантус), показаны на фиг. 8.

Результаты, описывающие концентрацию глюкозы в крови крыс после многократных введений 5 ед./кг массы тела СКК инсулина в модели стрептозотоцин-индуцированного диабета легкой степени (в сравнении с препаратом Лантус), показаны в табл. 4 и фиг. 9.

Результаты, описывающие концентрацию глюкозы в крови крыс после окончания введений 5 ед./кг массы тела СКК инсулина в модели стрептозотоцин-индуцированного диабета легкой степени (в сравнении с препаратом Лантус), показаны в табл. 5 и фиг. 10.

Таблица 1

Влияние введения однократной дозы СКК инсулина (в дозе 5 ед./кг массы тела) на концентрацию глюкозы в крови нормогликемических крыс, в сравнении с Генсулином N (изофан рекомбинированный инсулин человека)

Анализиру емый препарат	Доза [ед/кг массы тела]	Концентрация глюкозы в крови [мг/дл ]*	Число животных в группах
До введения	время определения в часах после введения
0,5	1	2	4	6	8	10	12
СКК Инсулин	5	87,5 ±1,0	45,3*3,64»*	32,8±1,3**	26,7±3,5* *	41,2±4,1* ♦	58,2±2,0* *	60,7±2,9* ♦	59,6±1,9* *	65,8± 2,7**
Генсулин N	2	87,6 ±3,7	81,2*4,2	55,6±4,3*	39,1*4,4	33,8*5,1	46,8*5,4	51,3*5,0**	65,3*3,2	70,7± 3,5*	10
контрольн ый 0,9% ЫаС1 раствор	Объем п/к (подкожн о) 3 мл/ 300 г массы тела	91,5±2,0	87,0±2,1	88,7±1,7	88,9±2,0	87,4±3,2	88,7±2,2	93,0±2,0	91,3±2,2	93,0± 2,9	10

Экспериментальные группы п=10; * средние значения ± §ЕМ;

Статистическая значимость ** р<0,01 СКК инсулин по сравнению с начальной концентрацией глюкозы; ## р<0,01, # р<0,05 Генсулин N по сравнению с начальной концентрацией глюкозы; лл р<0,01 СКК инсулин 5 ед./кг массы тела по сравнению с Генсулином N 2 ед./кг массы тела.

*** Зафиксированная смерть одного животного во 2^-й час.

Таблица 2

Влияние введения однократной дозы СКК инсулина в дозе 5 ед./кг массы тела на концентрацию глюкозы в крови крыс с стрептозотоцин-индуцированным диабетом легкой степени, в сравнении с препаратом Лантус (инсулин гларгин)

модель диабета

Анализ ируемы й препара т

доза п/к

число крыс в группе

концентрация глюкозы в крови крыс среднее значение (мг/дл) ± 8ЕМ

нормогли кемия

фиксирован ная гиперглике мня

время забора образцов после однократной дозы препарата

(часы)

0

0,5

1

2

4

6

8

10

12

24

36

стрептозотоцининдуцированный легкой степени 32 мг/кг массы тела., в/м (внутримышечн О»

ОКЕ.

5 ед/кг массы тела

20

82,5 ± 3,0

250,7 ±22,2

115,6 ± 16,1 ΛΛ

84,1 ± 7,8 ΛΛ

93,3 ± 4,8 ΛΛ

106,7 ± 7,2 ΛΛ

117,0± 4>9**АА

130,3 ± 6,9 ΛΛ

142,0 ± 7,9 ΛΛ

173,4 ± 18,6

209,2 ± 20,4

218,2 ± 16,8

Лантус

9

103,6±2,9

229,2 ± 32,5

135,6 ± 27,1

72,6 ± 5,2

69,7 ± 8,4

77,9 ± 6,8

76,8 ± 5,7

106,1 ±6,0

128,2 ± 13,1

199,8 ± 36,6

224,3 ± 28,8

228,7 ± 29,7

контрол ь

10 нл/200г массы тела

9

91,3 ±5,9

236,1 ±7,7

222,2 ± 24,8

205,3 ± 21,5

207,4 ± 21,8

203,4 ± 20,4

205,9 ± 21,3

212,0 ± 24,1

213,6 ± 23,1

213,2 ± 25,6

214,8 ± 23,0

215,7 ± 24,7

Статистическая значимость: ** р<0,01, * р<0,05 СКК по сравнению с Лантусом, лл р<0,01, л р<0,05 СКК по сравнению с контролем.

- 16 023559

Таблица 3

Влияние введения однократной дозы СКК инсулина (в дозе 2,5, 5 и 7,5 ед./кг массы тела) на концентрацию глюкозы в крови крыс со стрептозотоцин-индуцированным диабетом тяжелой степени, по сравнению с препаратом Лантус (инсулин гларгин)

модель диабета

Анали зируем ый препар ат

доза п/к

число крыс в группе

концентрация глюкозы в крови крыс среднее значение (мг/дл) ± 5ЕМ

нормог яикем ИЯ

фикснрова иная гиперглик емия

время забора образцов после однократной дозы препарата

(часы)

0

0,5

1

2

4

6

8

10

12

24

36

стрептозото цин- индуцирова нный тяжелой степени - 45 мг/кг массы тела, в/м)

СКК

2,5 ед/кг массы тела

10

86,3 ± 3,4

570,8 ± 20,1

251,4 ±41,2 ** ΛΛ

170,2 ±28,8 ** ΛΛ

250,0 ±37,8 ** ΛΛ

377,4 ±35,0 ** ΛΛ

426,0 ±36,9

463,1 ±42,1

524,2 ±45,3

560,1 ±33,0

551,0 ±40,2

576,4 ±22,7

Лантус

10

84,4 ± 3,8

596,8 ±3,1

376,5 ±24,3

284,3 ±28,7

134,5 5 ±22,9

209,1 34,4

314,6 ±52,4

415,2 ±40,0

502,6 ±25,5

546,4 ± 17,5

537,6 ±23,2

584,0 ±25,8

СКК

5 ед/кг массы тела

11

84,7 ± 4,0

585,9 ±7,5

235,3 ±32,0 ΛΛ

122,6 ±21,1 ΛΛ

119,6 ± 11,6 ΛΛ

245,2 ±26,7 + + ΛΛ

367,4 ±29,9 + + ΛΛ

421,1 ±33,8 ** Λ

483,5 ±30,6

546,7 ±40,1

594,4 ±3,8

596,0 ±3,3

Лантус

11

81,6 ± 3,2

572,9 ± 12,6

302,3 ±42,7

173,4 ±33,7

123,1 ±21,4

131,3 ±10,9

152,5 ± 14,6

262,2 ±36,7

426,7 ±39,8

502,6 ±26,5

580,2 ± 10,5

594,6 ±3,1

СКК

7,5 ед/кг массы тела

10

89,0 ± 3,4

573,9 ± 18,8

259,1 ± 14,2 * ΛΛ

133,1 ± 19,3

109,2 ±11,8

216,1 ±32,6 ** ΛΛ

280,6 ±42,3 ΛΛ

350,6 ±49,2 ΛΛ

508,7 ±34,0

526,4 ±27,3

571,0 ±20,4

583,0 ± 17,0

Лантус

10

82,4 ± 3,5

594,0 ± 6,0

335,4 ±28,5

198,3 ±36,7

106,1 ±22,4

105,5 ± 16,8

188,7 ±28,7

309,5 ±54,1

402,6 ±49,3

461,6 ±38,4

596,8 ±3,09

599,3 ±0,7

контро ль

10 мкл /200 г массы тела

9

74 ± 3,6

592,1 ±5,4

578,6 ± 10,2

594,2 ± 5,4

579,2 ± 13,0

548,8 ±23,5

526,0 ±25,5

547,3 ±23,7

544,9 ± 14,0

575,3 ± 12,4

593,3 ±6,7

594,3 ±2,6

Статистическая значимость: ** р<0,01, * р<0,05 СКК по сравнению с Лантусом, ^ΛΛ р<0,01, ^Λ р<0,05 СКК по сравнению с контролем.

- 17 023559

Таблица 4

Влияние многократных введений ОКК инсулина в дозе 5 ед./кг массы тела на концентрацию глюкозы в крови крыс со стрептозотоцин-индуцированным диабетом легкой степени по сравнению с препаратом Лантус (инсулин гларгин)

Анализиру емый препарат

число крысе группе

концентрация глюкозы в крови крыс, среднее значение (мг/дл) ± 5ЕМ

нормоглике мия

фиксиров энная гипепгли

последующие дни исследования

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

ОКК 5 ед/кг массы тела

20

82,5 ± 3,0

кемия 198,1 ± 12,1

155,4 ±7,1 ΛΛ

156,8 ±6,2 ΛΛ

157,7 ±7,4 ΛΛ

148,1 ±4,5 ΛΛ

144,1 ±5,3

151,6 ±5,5 ΛΛ

156,6 ±6,0 ΛΛ

152,9 ±5,7 ΛΛ

147,0 ±3,2

152,3 ±3,8

Лантус 5 ед/кг массы тела.

9

103,6 ±2,9

228,9 ± 30,7

136,3 ±8,1

147,0 ± 9,0

173,7 ± 10,4

184,9 ± 12,7

163,7 ± 11,2

171,4 ± 10,4

175,8 ±8,8

168,4 ± 15,7

142,9 ±20,3

160,4 ± 14,4

контроль 10 нл/200 г массы тела

5

88,8 ±9,4

243,4 ± 4,7

229,4 ± 13,3

232,6 ± 10,6

227,0 ± 9,9

254,4 ± 9,1

257,0 ± 8,2

247,0 ± 32,7

258,0 ± 6,7

257,0 ± 7,9

259,8 ± 12,4

252,0 ± 6,7

Анализи руемый препарат

число крыс в группе

концентрация глюкозы в крови крыс, среднее значение (мг/дл) ± 8ЕМ

нормоглнкеми я

фиксированная гипергликемия

последующие дни исследования

υ

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

ОКК 5 ед/кг

20

82,5 ±3,0

198,1 ±12,1

152,6 ±2,3

153,6 ±2,9

149,7 ±3,1

151,5 ±3,3

151,1 ±3,4

149,0 ±5,6

142,7 ±3,2 **

143,0 ±4,9

149,7 ±4,7

149,9 ±4,3

149,2 ±4,2

массы тела,

ΛΛ

ΛΛ

ΛΛ

ΑΛ

ΛΛ

ΛΛ

ΛΛ

ΛΛ

Λ

ΛΛ

* АА

Лантус 5 ед/кг массы тела.

9

103,6 ±2,9

228,9 ± 30,7

164,8 ±13,9

170,6 ± 19,3

161,6 ± 15,6

144,0 ± 18,3

124,9 ± 14,7

156,7 ± 7,5

191,3 ± 19,1

141,0 ± 11,4

172,1 ± 33,1

145,7 ± 15,1

132,2 ± 8,9

контроль 10 нл/200 г массы тела

5

88,8 ± 9,4

243,4 ± 4,7

248,4 ±8,4

255,0 ± 5,5

260,0 ± 11,7

252,0 ± 14,9

249,6 ± 20,4

256,2 ± 8,8

255,0 ± 19,4

259,4 ± 16,7

233,6 ± 11,4

270,2 ± 11,0

268,8 ±3,7

Статистическая значимость: ** р<0,01, * р<0,05 ОКК по сравнению с Лантусом, ^ΛΛ р<0,01, ^Λ р<0,05 ОКК по сравнению с контролем.

Таблица 5

Концентрация глюкозы в период после окончания введения ОКК инсулина в дозе 5 ед./кг массы тела в модели стрептозотоцин-индуцированного диабета легкой степени в сравнении с препаратом Лантус (инсулин гларгин)

Анализируемы й препарат	концентрация глюкозы в крови крыс, среднее значение (мг/дл)
кормогликемия	фиксированная гипергликемия	в последний день введения	дни после окончания введения анализируемых препаратов
1	2	3	5	8	11
ОКК 5 ед/кг массы тела	86,1 ±3,7	214,4 ±24,3	148,3 ± 8,5	146,4 ± 9,4	136,0 ±7,8	137,4 ±6,6	132,8 ±3,1	123,2 ±3,1	126, 4± 3,5
Лантус 5 ед/кг массы тела	103,3 ± 1,2	254,0 ±67,8	141,0 ± 18,2	282,3 ±58,2	277,7 ± 72,6	235,0 ±89,7	158,7 ±40,3	195,3 ±63,1	222, 3 ± 86,4

Пример 28. Определение активности ОК инсулина у животных с экспериментальным диабетом.

Гипогликемическая активность ОК инсулина была подтверждена на стрептозотоцининдуцированном диабете умеренной степени у крыс.

Определили, что активность ОК инсулина после введения однократных доз - 5 или 10 ед./кг массы тела была быстрой и сильной. Начало активности имело место через 30 минут после введения препарата, и оставалась на том же уровне до 2 ч, и после этого слабела до достижения начальных уровней на 24^-й-36^-й час.

Результаты, описывающие влияние препарата ОК инсулина на концентрацию глюкозы в крови крыс после введения однократной дозы 5 и 10 ед./кг массы тела доз в модели стрептозотоцининдуцированного диабета умеренной степени (в сравнении с препаратом Лантус), показаны в табл. 6. График концентрации глюкозы/изменений времени после введения 5 ед./кг массы тела ОК инсулина показан на фиг. 11.

Пример 29. Определение активности ОЕКК инсулина у животных с экспериментальным диабетом.

Гипогликемическая активность аналога ОЕКК инсулина была подтверждена в предварительном ис- 18 023559 следовании стрептозотоцин-индуцированного диабета крыс с умеренным течением.

После однократного введения ОЕКК инсулина в дозе 10 ед./кг массы тела наблюдалась очень быстрая (уже через 0,5 ч), сильная активность, снижающая концентрацию глюкозы в крови животных. Эта активность достигала пика уже через час после введения препарата и медленно снижалась, все еще вызывая значительное снижение уровня глюкозы в сравнении с начальными значениями до 12 ч после введения. Это исследование было проведено в сравнении с препаратом Левемир, аналогом инсулина пролонгированной активности (инсулин детемир).

Результаты, описывающие влияние ОЕКК инсулина на концентрацию глюкозы в крови крыс после введения однократной дозы 10 ед./кг массы тела в модели стрептозотоцин-индуцированного диабета умеренной тяжести, в сравнении с препаратом Левемир, показаны в табл. 7, и график изменения концентрации глюкозы как функция времени после введения 10 ед./кг массы тела ОЕКК инсулина на фиг. 12.

Таблица 6

Влияние введения однократной дозы ОК инсулина (дозы 5 ед./кг массы тела и 10 ед./кг массы тела) на концентрацию глюкозы в крови крыс со стрептозотоцин-индуцированным диабетом умеренной степени в сравнении с препаратом Лантус (инсулин гларгин)

модель диабета

Анали зируем ый препар ат

доза п/к

число крыс В группе

концентрация глюкозы в крови крыс среднее (мг/дл) ± $ЕМ

нормог ликем ИЯ

фиксирова иная гиперглик емия

Время забора образцов после введения однократной дозы препарата

(часы)

0

0,5

1

2

4

6

8

10

12

24

36

стрептозото цин- иядуцирова нный умеренной степени- 40 мг/кг массы тела в/м)

ОК

5,0 ед/кг массы тела

15

80,6 ± 2,4

507,4 ± 22,9

113,9 ± 10,8* *

98,5± 7,6

92,5± 6,7

160,3 ± 18,3

198,1 ±22,6 *

268,7 ± 29,3

294,9 ± 29,4

353,0 ± 28,5

406,9 ± 28,3* +

498,4 ± 26,8

Лантус

5

83,0 ± 4,3

600,0 ±0,0

324,8 ±35,3

136,6 ±27,0

102,2 ±20,4

97,2 ± 11,2

94,8 ±5,3

157,6 ±26,7

266,6 ±60,5

401,4 ±60,4

600,0 ±0,0

594,0 ±5,5

он

10 ед/кг массы тела

15

84,9 ± 3,7

498,7 ± 25,4

96,1 ± 8,1**

85,7 ± 4 4**

77,0 ± 3,5

151,5 ± 14,9

168,3 ± 21,0

200,3 ± 26,2»

248,9 ± 30,6

326,1 ± 27,9

389,3 ± 27,6

431,6 ± 24,4

Лантус

6

77,8 ± 2,3

550,2 ± 33,9

247,8 ± 25,6

134,0 ± 21,8

75,0 ± 8,1

109,3 16,0

94,7 ± 20,0

103,7 ± 20,9

148,8 ± 20,4

223,3 ± 42,2

389,2 ± 17,8

453,7 ± 28,3

контро ль

10 мкл /200 г массы тела

б

80,5 ± 2,9

509,5 ± 40,6

527,2 ±32,5

532,0 ±30,9

495,5 ±26,8

463,5 ±26,9

497,2 ±23,6

452,8 ±31,8

491,7 ±27,8

520,3 ±31,2

503,7 ±35,5

507,7 ±35,3

Таблица 7

Статистическая значимость: ** р<0,01, * р<0,05 ОК по сравнению с Лантусом.

Влияние введения однократной дозы ОЕКК инсулина (в дозе 10 ед./кг массы тела) на концентрацию глюкозы в крови крыс с диабетом умеренной степени в сравнении с препаратом Левемир (инсулин детемир)

модель диабета	Анализиру емый препарат и доза п/к	Концентрация глюкозы, в крови крыс среднее значение (мг/дл) ± 8ЕМ
нормогликемия	фиксированна я гипергликеми я	Время забора образцов после однократной дозы (часы)
0,5	1	4	6	8	12
стрептозотоцининдуцированный умеренной степени —	ОЕКК 10 ед/кг массы тела	90,5 ±6,4	469,5 ±65,8	218,0 ±19,7	109,3±10, 1	143,7 ± 22,4	-	242,3 ±59,2	329,3 ± 155,3
40 мг/кг массы тела, в/м)	Левемир 10 ед/кг массы тела	98,5 ±3,5	502,5 ± 26,2				142,3 ± 22,3		384,0 ± 38,7

- 19 023559

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Институт Биотехнологии и Антибиотикив <120> Новые аналоги инсулина пролонгированной активности <130> 61θ/κνν <160> 25 <170> Ра1епНп νβΓβίοη 3.3 <210> 1 <211> 22 <212> РКТ <213> искусственная <220>

<223 > мутант инсулиновой цепи А <400> 1

Оу Пе Уэ1 Он 61п Суз Суз Тйг Бег Не Суз Бег Ьеи Туг Оп Ьеи 15 10 15

Ои Азп Туг Суз Азп С1у 20 <210> 2 <211> 22 <212> РКТ <213> искусственная <220>

<223> мутант инсулиновой цепи А <400> 2

Оу Не Уа1 6(и Оп Суз Суз Тйг Бег Не Суз Бег Ьеи Туг Оп Ьеи 15 10 15

Ои Азп Туг Суз Азп А1а 20 <210> 3 <211 > 22 <212> РКТ <213> искусственная <220>

<223> мутант инсулиновой цепи А <400> 3

Оу Пе Уа1 Ои Оп Суз Суз Тйг Бег Не Суз Бег Ьеи Туг Оп Ьеи 15 10 15

Ои Азп Туг Суз Азп Бег 20

- 20 023559 <210> 4 <211> 21 <212> РКТ <213> искусственная <220>

<223> мутант инсулиновой цепи А <220>

<221> М15С_РЕАТиКЕ <222> (21)..(21) <223> Хаа = амид Азп <400> 4

С1у Не Уа1 С1и С1п Суз Суз ТКг Бег Пе Суз Бег Беи Туг С1п Беи 15 10 15

С, и Азп Туг Суз Хаа 20

<210>	5
<211>	20
<212>	РКТ
<213>	искусственная
<22О>
<223>	мутант инсулиновой цепи А
<220>
<221>	М15С РЕАТБ1КЕ
<222>	(20)..(20)
<223>	Хаа = амид Суз
г1 400>	5

С1у Пе УаI <31и О1п Суз Суз ТНг Бег Не Суз Бег Беи Туг С1п Беи 15 10 15

С1и Азп Туг Хаа 20 <210> 6 <211> 22 <212> РКТ <213> искусственная последовательность <220>

<223> мутант инсулиновой цепи А <400> 6

- 21 023559

61у Не Уа1 С1и С1п Суэ Суз ТНг Зег Пе Суэ Зег Ьеи Туг С1п Ьеи 15 10 15

С1и Азп Туг Суз Азп ТНг 20 <210> 7 <211 > 32 <212> РКТ <213> искусственная <220>

<223> мутант инсулиновой цепи В <400> 7

РНе Уа1 Азп С1п Н«з Ьеи Суз С1у Зег Нз Ьеи Уа1 61и А1а Ьеи Туг 15 10 15

Ьеи Уа1 Суз <31у С1и Агд С1у РНе РНе Туг ТНг Рго Ьуз ТНг Ьуз Агд 20 25 30 <210> 8 <211> 32 <212> РКТ <213 > искусственная <220>

<223 > мутант инсулиновой цепи В <400> 8

РНе Уа1 Азп С1п ΗΪ3 Ьеи Суз С1у Зег ΗΪ3 Ьеи Уа1 Е1и А1а Ьеи Туг 15 10 15

Ьеи Уа1 Суз С1у 61и Агд С1у РНе РНе Туг ТНг Рго Ьуз ТНг Агд Агд 20 25 30 <210> 9 <211> 32 <212> РКТ <213> искусственная <220>

<223> мутант инсулиновой цепи В <400> 9

РНе Уа1 61и С1п Нз Ьеи Суз С1у Зег ΗΪ3 Ьеи Уа1 61и А1а Ьеи Туг 15 10 15

Ьеи νβΙ Суз 61у С1и Агд 61у РНе РНе Туг ТНг Рго Ьуз ТНг Ьуз Агд 20 25 30 <210> 10

- 22 023559 <211> 31 <212> РКТ <213> искусственная <220>

<223 > мутант инсулиновой цепи В <400> 10

РЬе Уа1 Азп С1п Шз Ьеи Суз С1у Бег ΗΪ5 Ьеи Уа1 С1и А1а Ьеи Туг 15 10 15

Ьеи Уа1 Суз С1у 61и Агд С1у РЬе РЬе Туг ТЬг Рго Ьуз ТЬг Агд 20 25 30 <210> 11 <211> 30 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> праймер СЬУС <400> 11 аасййдса аЬддйаад! сдайсйдс 30 <210> 12 <211> 28 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> праймер СЬУЭ <400> 12 д1адс1адад (гдасКаас сайдсад 28 <210> 13 <211> 29 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> праймер АКСС <400> 13 йаааасасд (сдсддсасс дйдаасад 29 <210> 14 <211> 29 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> праймер АКСО <400> 14 сдаЬдссдсд асдЬдййа ддад1д!ад 29

- 23 023559

<210>	15
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	искусственная
<220>
<223>	праймер 5ЕКС
<400>	15
сааПсйаа ддайййэ д
<210>	16
<211>	25
<212>	ДНК
<213>	искусственная
<220>
<223>	праймер 5ЕРГО
<400>	16
сйаадаай дсадТадйс хссад
<210>	17
<211>	21
<212>	ДНК
<213>	искусственная
<220>
<223>	праймер А1АС
<400>	17
саэЕдсйаэ ддаКДЙа д
<210>	18
<211>	25
<212>	ДНК
<213>	искусственная
<220>
<223>	праймер А1А0
<400>	18
сйаадсай дсад(адйс Хссад
<210>	19
<211>	23
<212>	ДНК
<213>	искусственная
<220>
<223>	праймер СШС
<400>	19
дйдаасадс асйдХдХдд йс
<210>	20
<211>	25
<212> ДНК

- 24 023559 <213> искусственная <220>

<223> праймер СИЮ <400> 20 дскдйсдас аааасдадда сйдс 25 <210> 21 <211> 24 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> праймер 5ККС <400> 21 даайайдс азйсйаад (еда 24 <210> 22 <211> 25 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> праймер 5ККО <400> 22 кададксдас йаадаайд садка 25 <210> 23 <211> 26 <212> ДНК <213> искусственная <220>

<223> праймер 61ЛЮ-2 <400> 23 сасаддкдсС дйсдасааа асдасс 26 <210> 24 <211> 4775 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> плазмида ρ5/ΖυΐΝ50Ιγ(22Α) <400> 24 (здадсдсас даакдадддс сдасаддаад сааадйдаа аддаассааа (йддссдса 60 ддсдкассдС ддасаддаас дкдкдйда сдсйсакса даадддсай ддкдсаасдд 120 ааайдйса ксадйсад! айдсссдй ссасддйка каааайсй даадасдааа 180 дддсйсдкд аСасдсйак ййайддк йакдйакд акаайакдд кйсйадас 240 дксаддкддс асййсддд дааакдкдсд сддаасссй аЮд№1 йййааак 300

- 25 023559 асайсаааЕ аЕдЕаЕссдс ЕсаЕдадаса аЕаасссЕда ЕаааЕдйй ааЕааЕайд 360 аааааддаад адЕаЕдадЕа йсаасаЕй ссдЕдЕсдсс сЕЕайсссЕ ЕЕЕйдсддс 420 аЕЕЙдссЕЕ ссЕдЕЕЕЙд сЕсасссада аасдсЕддЕд ааадЕааазд аЕдсЕдаада 480

ЕсадйдддЕ дсасдадЕдд дйасайда айддаЕйс аасадсддЕа адайсйда 540 дадййсдс сссдаадаас дййссааЕ даЕдадсай Ейааадйс ЕдйаЕдЕдд 600 сдсддЕаЕЕа йссдЬдйд асдссдддса ададсаайс ддЕсдссдса ЕасайаЕЕс 660

ЕсадааЕдас ИддйдадЕ айсассадЕ сасадаааад саййасдд аЕддсаЕдас 720 адЕаададаа ЕЕаЕдсадЕд сЕдссаЕаас саЕдадЕдаЕ аасасЕдсдд ссаасЕЕасЕ 780 Ейдасаасд айддаддас сдааддадй аассдсйй йдсасааса ЕдддддаЕса 840 ГдЕээйсдс сйдаЕсдй дддаассдда дсЕдааЕдаа дссаЕассаэ асдэсдадсд 900

Едасассасд аЕдссЕдсад сааЕддсаас аасдйдсдс ааайайаа сЕддсдазй 960 айЕаййа дсйсссддс аасаайааХ адайддаЕд даддсддаЕа аадйдсадд 1020 ассасййд сдйсддссс йссддйдд йддЕйаЕЕ дйдаЕаааЕ йддадссдд 1080

ЕдадсдЕддд ЕйсдсддЕа Есайдсадс айддддсса даЕддЕаадс сйсссдЕаЕ 1140 сдЕэдЕЕэЕс Еасэсдзсдд ддадкаддс эайаЕддаг дэасдаааЕа дасадэйдс 1200 ЕдадаЕаддЕ дсйсайда йаадсайд дЕаасЕдЕса дассаадЕй айсаЕаЕаЕ 1260 асЕЕЕадай дайЕаааас ЕЕсаЕЕЕЕЕа айЕазаадд аЕсЕаддЕда адаЕсйЕЕЕ 1320 ЕдаЕааЕйс аГдассаааа йссйаасд Едадййсд ЕЕссайдад сдЕсадассс 1380 саЕсдссдй сЕсдаЕасдс ЕдаассдЕдс дсасдйсаЕ сссддасадЕ йадсаадсЕ 1440 дсййддда ссаддсасдс дсаадасдса дсдасйдаа ГйдйддЕа ЕсасЕсаЕй 1500 сйдЕйссд ааЕддаадаЕ ддЕсадсаса садЕдйдас сдсдЕааЕсс Едсдсдасса 1560 сдаЕсЙаас ссдасадЕаа сдЕдасадсд дЕйдасаЕд ссдсайдад дЕййдааа 1620 ссдЕаасйс адаадсаЕдЕ асддЕсадаЕ йаасаЕаад адйсайдс асдсассдй 1680 аааасдсдй садсдсдсй йддсдсааа аассдЕаааа аЕддаЕдЕй ЕсссссдддЕ 1740 ааассддааа ааЕдсдЕсад даасдсЕйс адсдсдйдс эЕдайаЕдс зЕдаззйда 1800 аЕддсдаЕсд дЕйдддсдс дЕйдаЕдсс саЕааддсдЕ аййсддас дЕЕйсадсс 1860 сЕдаЕаадаа дааайадас ЕдЕадйаса дасдадЕсдЕ дадсдайса йасдддадЕ 1920 сдЕсддсдад ЕсаЕссадЕа ЕЕЕйсйсд сдасЕййд дсдасЕсдсс йсЕсЕдаас 1980 ассададсда садЕдЕдйд адЕсаЕсдаЕ аааЕсассда сдасЕсдйд ссдадЕсай 2040 садЕадЕсдс сдасдадссд йЕйдЕаЕа ааЕссдааЕа адаазаЕаЕа ЕЕЕйсааас 2100 саЕаасааса ЕдаЕЕЕаааа адсаааЕсад аааааадйа дЕЕйдсдЕд дддЕдЕдддс 2160 аЕсйдддээ Едадэасада сЕсдсдйй ЕсЕддэддаа йдсддддэЕ ЕЕйдэЕЕаа 2220

- 26 023559 асаа(ад1сэ ссдсададсд дэаййа1д саасдйддс 1д{дсддсас ддддзГОй 2280 ааЬсссссдд сссдйайс аШссасдд дсдасдддда (асаЬааасс сдасадсада 2340 ддасдддгда дсдсдааЬсс сададаТдаТ даааааадад дсададааас дсдсссаддЕ 2400 асдййзЬс йайдйй дд1дйд1сс адддСдйдд ддйд1дссс 1дассадд1д 2460 дса(йд1й дайдсдсд! дсдсддйгд асаааТдсас аййдсссс д1сйд1асд 2520 ьдййСйс ассадаасаа сйсасдаад ЬддсддаЬда асдсйссаа сдйдссддд 2580 аасдсйсдд сдаЕдаСддс айасдддй дайсаддса дйсссддад асддасасад 2640 сйдсйд1д адсдда1дсс дддадссдас аадахдТса дддсдсдгса дсдддййа 2700 дсддд[д1сд дддсдсадсс а1дасссад1 сасдйдсда йдсддад1д 1а1айддй 2760 Саай1дйа ааСсддадЬд дйайсадд даадЬдсйс а(д(:ддсааа ддаааааТдТ 2820 ддйакдьд сдйад1дса асаТдйддЬ аааддЬдааа ЬдасдсДсс 1сдйсайс 2880 дд1сдйасд йсйдссд! дадайдсдд сдддсдйас сддйсэсаэ айасддда! 2940 асдсаддсад 1дйсааа1с аддааддасс ддааааадда Сдсддсдйд «дййЕсс 3000 айддйссд сссссйдас аадсатсасд аааййдасд йсаааЬсад Ьддсддсдаа 3060 асссдасадд зсййаада (сссаддсд! йссссйдд йдйссйс д!дсдййс 3120 йдйсйдс сСйсддЮ: ассддЬдКа Кссдйдй а!ддседсд1 йдсйсай 3180 ссасдсйда сайсадйс сдддйддса дйсдйсса адйддайд й^дсасдаа 3240 сссеесдйс здгссдайа ссасдсссдС Сссддйай айаасйда д!ссаасссд 3300 дааадасасд асааайдсс ад1ддсддй дссайддй айдада!д( дсдададай 3360 й1йддад1 1сйдаад1д ддддсйдад 1дсддйаса йддаэддас адййдд!д 3420 айсдЬйсд сасаадасад йассаддй аадсадйсс ссаайдасс Еаассйсда 3480

Есааассасс ЕссссаддЕд дйййсдЕ йКададса ададайасд сдсадааааа 3540 ааддаЕйса адаадаСсй ййасадда дсдайаЕсд ЕсйсаЕсса Едааддсдй 3600 ЕдаадаЕСаа ассддсйаС йсаЕадаЕс дйаааСсад ддййддда (ддссдаЕда 3660 аассссайа ааасссайа айсайсас йайаасаа Еса(сййд йдйссадд 3720 дй(даааад (йсздддй ссзссссздэ айсдссаК аасаадКй д(сасассдс 3780 сааайасаЕ дсаааааай дсддаЕдасс дйаКсддд дЕдсада(са аЕдайдада 3840 саадйЕаэа сЙсэЕдсаа заадйайа сааЕсадЕсс сааадЕсадс ддЕдЕсссдд 3900 ссйдайаЕ саЕдсссдда (ЕаЕйдааС ййсадсдд дддйдЕдад сдссасаасс 3960

ЕдйЕосаад адсддЕдсй асдадсадк йдссдСсэС сайдЕаадд сйасдссад 4020 саадййдЕ йсадЕдай асасййЕд йссссаЕас ааддаааадЕ аКдддадаа 4080 аааасааасд сссддйдЕс аЕйсссддЕ сайаададс адсаааассд сдЕсдЕадй 4140

- 27 023559 ааааадссад саддагсаад сйсадддй дадагд[д[а (аададасад аййадсса 4200 дСйсеаадЬ адааайаса дйМааас 1деааейй (йаййй дсаасйаа1 4260 йайдайа дйййай ааЕдйаааа саОООО даааОааО аааададдад 4320 дйсаО1дс ааайШд): оаааййа айддйааа ссайассй адаадйдаа 4380 Кйеадао сеайдаОэ 1дйзаэ1й аааайсаэд айаэдаадд ййсйсса 4440 дайаасаад йсйайй (дсаддйаа садйадаад аЬддьдсСас сйдСйда[ 4500 ййасайс адааадазй йссйаса! йдд!сйад ййсдйдд [ддйдйй 4560 дйаассадс асйд1д[дд ййсасйд дйдаадсас СдйсйддЬ аСдЬддсдаа 4620 сд1ддй1й кйсайсс йааасааад сдсддсайд йдаасад1д йдйсйй 4680 айХдйссс [дйееэай ддадаайас [дсаа[ддй задйдайе Одйасадс 4740 йсййсдд аддйдйй ЙаЬйсдад да(гс 4775 <210> 25 <211> 4775 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> плазмида ρ6/ΖυΐΝ3$6Γ(22Α) <400> 25 йдадсдсас даасдадддс сдасаддаад сааадйдаа аддазйааа йСддссдса 60 ддсдйссдС ддасаддаас дСсдСдйда сдсйсаСса даадддсай ддСдсаасдд 120 ааайдйса СсадйсадС айдсссдй ссасддйСа йааайсй даадасдааа 180 дддсйсдСд айсдсйаС ййайддС йаСдСсаСд айайаСдд Сйййдас 240 дСсаддСддс асййсддд даааСдСдсд сддаасссй айСдййС йййаааС 300 асайсаааС аСдйСссдс СсаСдадаса айассйда СэааСдйСс аайаййд 360 аааааддаад адйСдадй йсаасайС ссдСдСсдсс сйайссй Шйдсддс 420 аййдссй сйдййСд йсасесада аасдйддЬд ааадйааад а1дйдаада 480 (садйдддЬ дсасдадЬдд дйасайда айддаййс аасадсддй адайсйда 540 дадййсдс сссдаадаас дййссаа! да(:дадсай Шааадйс 1дйз1д1дд 600 сдсддййа йссдедйд асдссдддса здадсаайс ддкдссдса йсасййс 660 1садаа1дас йддйдад! айсассад! сасадаааад сакйасдд а!ддса[дас 720 адйададаа йаЬдсадЕд йдссаоас саХдадхдаХ аасайдсдд ссаасйай 780 ййдасаасд акддаддас сдааддадй аассдсйй йдсасааса (дддддаЕеа 840 [дйайсдс сйдакдй дддаассдда дйдаа[даа дссайссаа асдасдадсд 900 [дасассасд а!дсйдсад саа!ддсаас аасдйдсдс ааайайаа йддсдаай 960

- 28 023559 асйаййа дсйсссддс аасаайаа! адайддаХд даддсддаХа аадйдсадд 1020 ассасййд сдйсддссс йссддйдд йддййй дйдайааХ йддадседд 1080 Хдадсд1ддд (йсдсддй йэйдсадс айддддсса даХддйадс сйсссдй! 1140 сдйдйагс Осасдасдд ддадхсаддс аайа1дда1 даасдаааО дасадаХсдс 1200 хдадахаддх дейсайда йаадсайд дйайдХса дассаадйХ айсаООХ 1260 аййадай даййааас йсаййСа аййааадд аГйаддХда адайхйй 1320 ХдахааХйс ахдассаааа (ессйаасд Хдадййсд йссайдад сдйэдассс 1380 саЕсдседй йсдаЕасдс ЕдаассдЕдс дсаодйса! сссддасадХ ссадсаадй 1440 дйсйддда ссаддсасдс дсаадасдса дсдасйдаа ЕйдйддЕа ЕсайсайХ 1500 сйдХйссд ааХддзадаХ ддХсэдсасэ сэдХдйдас сдсдхаэХсс Хдсдсдэсса 1560 сдаХсйаас ссдасадХаа сдЕдасадсд дХйдасаХд ссдсайдад дХсйХдааа 1620 ссдХаасйс адаадсаХдЕ асддхсадах ххаасахаад адйсаХЕдХ асдсассдй 1680 аааасдсдй садсдсдсй йддсдсааа аассдЕаааа асддаХдйС ЕсссссдддЕ 1740 ааассддааа аахдсдхсад дааедййс адсдсдйдс аХдайаХдс аХдааайда 1800 ахддсдахсд дШдддсдс дЕйдаХдсс саХааддедх аййсддас дййсадсс 1860 йдаХаадаа даааХсадас ХдХадйаса дасдадХсдХ дадсдаКса йасдддадХ 1920 сдХсддсдад ХсаЕссадХа ЙЕйсйсд сдайййд дсдайсдсс Кййдаас 1980 ассададсда садХдХдйд адХсахсдаг аааХсассда сдайсдйд ссдадЕсаХс 2040 садхадхсдс сдасдадссд сййдХаХа ааХссдааХа адааааХаха ИйХсааас 2100 сахаасааса ХдайХаааа адсаааХсад аааааадйа дЕХйдсдХд дддХдЕдддс 2160 аййдддаа Хдадаасада йсдсдйй Хйддаддаа йдсддддаХ ййдайаа 2220 аеааХадХеа ссдсададсд дааХХЕХаХд саасдйддс ХдХдсддсас ддддаХХХй 2280 ааХсссссдд сссдйайс аХйссасдд дсдасдддда ХасаХааасс сдасадсада 2340 ддасдддЕда дсдсдааХсс сададаЕдаХ даааааадад дсададааас дсдсссаддХ 2400 эсдХХйаХс йайдйй ддЕдХХдЕсе адддЕдХсдд ддйдЕдссс ХдассэддХд 2460 дсайХдХй дайдсдсдХ дсдсддХссд асааахдсас ахсйдсосс дхсйдхасд 2520 ХдХйййс ассадаасаа сйсасдаад ХддсддаХда асдйассаа сдйдссддд 2580 аасдсйсдд сдаХдаХддс аХаасдддй дахасаддса дйсссддад асддасасад 2640 сйдсйдХд адсддаХдсс дддадссдас аадсссдХса дддсдсдХса дсдддХХХХа 2700 дсдддЕдХсд дддсдсадсс аХдасссадХ сасдХадсда ХадсддадЕд ХаХайддй 2760 ХааХаХдСХа ааХсддадХд дХаайсадд даадХдсйс аХдХддсааа ддаааааХд! 2820 ддйайдХд сдЕэадХдса эеаХдХэддХ аааддХдааа хдасдсйсс Есдйсайс 2880

- 29 023559 ддйдйасд йсйдссдХ дадайдсдд сдддсдйас сддйсасаа аХаасдддаХ 2940 асдсаддсад ЬдскаааСс аддааддасс ддааааадда ХдсддсдХад ссдСЙЙсс 3000 аЕаддйссд сссссйдас аадсаХсасд аааХйдасд йсааахсад Хддсддсдаа 3060 асссдасадд айаСааада ХсссаддсдХ йссссйдд йдйссйс дСдсдййс 3120 йдйсйдс ййсддйХ ассддХдХса йссдйдй аХддссдсдХ йдХйсай 3180 ссасдсйда сайсадйс сдддйддса дйсдйсса адйддайд 1а1дсасдаа 3240 ссссссдйс адйсдайа ссасдсссдх ХссддХаай аХсаасйда дХссаасссд 3300 дааадасасд асаааХсдсс адХддсддХа дссайддХа айдадаХдХ дсдададай 3360 йГйддадХ1сйдаад[д ддддсйдад Хдсддйаса йддааддас адййддХд 3420 айсдХйсд сасаадасад йассаддй аадсадйсс ссаайдасс Хаассйсда 3480

Хсааассасс (ссссаддХд дйййсд! Хйсададса ададайасд сдсадааааа 3540 ааддаХйса адаадайй ййасадда дсдайаХсд ХсйсаХсса Хдааддсдй 3600 [даадайаа ассддсйаг йсайдай дХаааассад ддййддда ХддссдаХда 3660 аассссайа ааасссайа айсайсас йайаасаа ХсэХсййд йдйссадд 3720 дй!дааэад [йсадддй ссассссада айсдссай аасаадЬсй дйэсассдс 3780 сааайасах дсаааааай дсддаХдасс дйайсддд дХдсадайа аСдайдада 3840 саадййаа сйса[дсаа ааадйайа саайадХсс сааадйадс ддХдХсссдд 3900 ссйдайаС саХдсссдда ХйХйдааХ ййсадсдд дддйдХдад сдссасаасс 3960 [дййсаад адсддХдсй асдадсадХс йдссдХсаХ сайдйадд сйасдссад 4020 саадййд! йсад[дай асасйй1д йссссайс ааддаааадХ аХсдддадаа 4080 аааасааасд сссддйдй аХйсссддХ сайаададс адсаааассд сдйдйдй 4140 ааэаэдссэд саддайаад сйсадддй дадахдхдй йададасад аййадсса 4200 дХйссаадХ адааайаса дйХйааас Хдсаасйй Хйаййй дсааййаХ 4260 йайдайа дйййай ааХдйаааа сай1айй дааайаай аааададдад 4320 дйсайХдс аааййХдХ йааасйй айддйааа ссайассй адаадйдаа 4380 Хсйсадай ссайдайа ХдйаааХй аааайсаад айаадаадд ййсйсса 4440 дайаасаад ййаайй [дсаддйаа садйадаад аЬддХдйас сйдЬйдаХ 4500 ййасайс адааадааХс йссйаса! йддСйХад ййсдйдд Хддйдйй 4560 дйаассадс асйдХдХдд ййсасйд дйдаадсас [дйсйдд! аХдХддсдаа 4620 сдХддШй (йасайсс Хаааасааад сдсддсаХсд йдаасадХд йдйсйй 4680 аХйдйссс Хдйссаай ддадаайас ХдсааХддй аадХсдайс Хадйасадс 4740 йсййсдд аддйдХХй ХйХйсдад даХсс 4775

- 30 023559

Claims (7)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Производное инсулина человека или его фармацевтически приемлемая соль, обладающие пролонгированной терапевтической активностью и стабильностью в кислой среде, включающие два полипептида, образующие цепь А и цепь В, где аминокислотная последовательность цепи А была выбрана из δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 1-6, тогда как аминокислотная последовательность цепи В была выбрана из δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 710.
2. 2. Производное инсулина человека или его фармацевтически приемлемая соль по п.1, имеющее структуру в соответствии с формулой 1

   5-8

   I )

   О1у-11е-Уа1-С1и-в1п-Су5-Суз-ТЬг-Зег-11е-Су5-Зег-1-еи-Туг-<31п-1-еи1 2 3 4 5 6 в 9 10 11 12 13 и 15 16 ⁵ I δ

   С1и-А5П-Туг-Суе-Н I

   17 18 19 20 3

   РЬе-Уа)-А8П-01п-Н15-1еи-Суз-61у-8ег-Н15-1.еи-Уа1’е1и-А1а-1-еи-Туг1 2 3 4 5 6 7 8 э 10 11 12 13 14 15 16

   Беи-Уа1-Су5-б1у-О1и-Агд-б1у-РИе-Р(1е-Туг-ТПг-Рго-Ьу5-Тйг-А¹ 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 где К обозначает группу ΝΗ₂ или группу формулы Азп-К², где К² обозначает глицин, или аланин, или серин, или треонин, или группу ΝΗ₂;

   К¹ обозначает В31Ьу8-В32Аг§, где В3Азп может быть необязательно замещен другой аминокислотой, предпочтительно О1и, или В31Λ^§-В32Λ^§, или В31Аг§.
3. 3. Производное инсулина или его физиологически приемлемая соль по п.2, характеризующееся тем, что в формуле 1

   К обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает О1у, и К¹ обозначает В3ГОуз-В^ОАгд. или

   К обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает А1а, и К¹ обозначает В31Ьу8-В32Аг§, или

   К обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает δе^, и К¹ обозначает В31^у8-В32Λ^§, или

   К обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает ТЬг, и К¹ обозначает В31Ьу8-В32Аг§, или

   К обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает группу ΝΗ₂, и К¹ обозначает В31ЬузВ32Аг§, или

   К обозначает группу ΝΗ₂ и К¹ обозначает В31Ьу8-В32Аг§, или

   К обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает О1у, и К¹ обозначает В31А^§-В32Λ^§, или

   К обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает А1а, и К¹ обозначает В31А^§-В32Λ^§, или

   К обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает ТЬг, и К¹ обозначает В31А^§-В32Λ^§, или

   К обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает δе^, и К¹ обозначает В31Аг§-В32Аг§, или

   К обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает группу ΝΗ₂, и К¹ обозначает В31Аг§В32Аг§, или

   К обозначает группу ΝΗ₂ и К¹ обозначает В31Λ^§-В32А^§, или

   К обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает О1у, и К¹ обозначает В31Аг§, или

   К обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает А1а, и К¹ обозначает В31Аг§, или

   К обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает ТЬг, и К¹ обозначает В31Аг§, или

   К обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает δе^, и К¹ обозначает В31Аг§, или

   К обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает группу ΝΗ₂, и К¹ обозначает В31Аг§, или

   К обозначает группу ΝΗ₂ и К¹ обозначает В31Аг§, или

   К обозначает группу формулы Азп-К², где К² обозначает О1у, К¹ обозначает В31Ьу8-В32Аг§ и В3Азп был замещен на В3О1и.
4. 4. Фармацевтическая композиция, обладающая активностью снижения концентрации глюкозы в крови, содержащая эффективно действующее количество производного инсулина или его фармацевтически приемлемой соли по какому-либо из пп.1-3.
5. 5. Фармацевтическая композиция по п.4, дополнительно содержащая 10-50 мкг/мл цинка.
6. 6. Применение производного инсулина или его фармацевтически приемлемой соли по какому-либо из пп.1-3 для производства лекарственного препарата для лечения или профилактики сахарного диабета.
7. 7. Способ лечения пациентов, страдающих сахарным диабетом, характеризующийся тем, что пациенту, нуждающемуся в таком лечении, вводят эффективно действующее количество фармацевтической композиции по пп.4 и 5.

   - 31 023559

   Фиг. 1

   1 ТАСА2СССАС СААТ2А0ССС ССАСАССААС САААССТСАА АССААТСААА

   АТСТССС6ТС СТТАСТСССС ССТСТССТТС СТТГССАСТТ ТССТТАСТТТ

   51 ТТТС6ССССА 6СССТАСССТ ССАСАССААС СТССТССТСА СССТТСАТСА

   АААССССССТ ССССАТСССА ССТСТССТТС САССАССАСТ СССААСТАСТ

   101 СААССССАСТ ССТССААСС6 АААТТССТСА ТСАССТСАСТ АТТССССССТ

   СТТССССТСА ССАС6ТТССС ТТТААССАСТ АСТССАСТСА ТААССССССА

   151 ССАСССТТТА ТААААТТСТТ СААСАССААА СССССТССТС АТАССССТАТ

   ССТСССАААТ АТТТТААСАА СТТСТССТТТ СССССАССАС ТАТССССАТА

   201 ТТТТАТАССТ ТААТСТСАТС АТААТАДТСС ТТТСТТАСАС СТСАОСТССС

   ААААТАТССА АТТАСАСТАС ТАТТАТТАСС ААА6ААТСТС САСТССАССС

   251 АСТТТТСССС САААТСТССС СССААССССТ АТТТСТТТАТ ТТТТСТАААТ

   ТСААААСССС СТТТАСАССС СССТТССССА ТАААСАААТА ААААСАТТТА

   301 АСАТТСАААТ АТСТАТСССС ТСАТСАСАСА АТААСССТСА ТАААТССТТС

   ТСТААСТТТА ТАСАТАСССС АСТАСТСТСТ ТАТТСССАСТ АТТТАССААС

   351 ААТААТАТТС АААААССААС АСТАТСАСТА ТТСААСАТТТ СССТСТСССС

   ТТАТТАТААС ТТТТТССТТС ТСАТАСТСАТ ААСТТСТААА СССАСАСССС

   401 СТТАТТСССТ ТТТТТССССС АТТТТСССТТ ССТСТТТТТС СТСАСССАСА

   СААТААСССА АААААССССС ТААААСССАА ССАСАААААС САСТСССТСТ

   451 ААСССТССТС АААСТААААС АТССТСААСА ТСАСТТСССТ ССАССАСТСС

   ТТСССАССАС ТТТСАТГТТС ТАССАСТТСТ АСТСААСССА ССТССТСАСС

   501 СТТАСАТССА АСТССАТСТС ААСАССССТА АСАТССТТСА САСТТТТССС

   СААТСТАССТ ТСАССТАСАС ТТСТССССАТ ТСТАССААСТ СТСААААССС

   551 ССССААСААС СТТТТССААТ САТСАССАСТ ТТТАААСТТС ТССТАТСТСС

   ССССТТСТТС СААААССТТА СТАСТССТСА АААТТТСААС АССАТАСАСС

   601 СССССТАТТА ТССССТСТТС АССССССССА АСАССААСТС ССТССССССА

   СССССАТААТ АССССАСААС ТССССССССТ ТСТССТТСАС ССАССССССТ

   651 ТАСАСТАТТС ТСАСААТСАС ТТССТТСАСТ АСТСАССАСТ САСАОААААС

   АТСТСАТААС АСТСТТАСТС ААССААСТСА ТСАСТССТСА СТСТСТТТТС

   701 САТСТТАССС АТСССАТСАС АСТААСАСАА ТТАТССАСТС СТСССАТААС

   СТАСААТССС ТАСССТАСТС ТСАТТСТСТТ ААТАССТСАС САСССТАТТС

   751 САТСАСТСАТ ААСАСТСССС ССААСТТАСТ ТСТСАСААСС АТСССАССАС

   СТАСТСАСТА ТТСТСАСССС ССТТСААТСА А6АСТСТТСС тассстсстс

   801 ССААССАССТ ААССССТТТТ ТТССАСААСА ТСССССАТСА ТСТААСТССС

   ССТТССТССА ТТССССАААА ААСОТСТТСТ АСССССТАСТ АСАТТСАССС

   851 СТТСАТССТТ 6ССААССССА ССТСААТСАА СССАТАССАА АССАССАССС

   СААСТАССАА СССТТССССТ ССАСТТАСТТ СССТАТССТТ ТССТССТССС

   901 ТСАСАССАСС АТСССТССАС СААТСССААС ААССТТСССС АААСТАТТАА

   АСТСТССТ6С ТАСССАССТС СТТАСССТТС ТТССААСССС ТТТСАТААТТ

   951 стссссааст асттастста ссттсссссс аасааттаат асастссатс

   САССССТТСА ТСААТСАСАТ ССААСССССС ТТСТТААТТА ТСТСАССТАС

   1001 САСССССАТА ААСТТССАСС АССАСТТСТС СССТСССССС ТТСССССТСС

   СТСССССТАТ ТТСААССТСС ТССТ6ААСАС СССАСССССС ААСССССАСС

   1051 СТССТТТАТТ ССТСАТАААТ СТССАССССС ТСАСССТССС ТСТСССССТА

   САССАААТАА ССАСТАТТТА САССТССССС АСТСССАССС АСАСССССАТ

   1101 ТСАТТССАСС АСТССССССА САТССТААСС ССТССССТАТ ССТАСТТАТС

   АСТААССТСС ТСАССССССТ СТАССАТТСС ССАССССАТА ССАТСААТАС

   1151 ТАСАССАССС ССАСТСАССС ААСТАТССАТ СААССАААТА САСАСАТССС атстсстссс сстсастссс ттсатасста сттсстттат стстстассс

   1201 ТСАСАТАССТ СССТСАСТСА ТТААССАТТС СТААСТ6ТСА САССААСТТТ

   АСТСТАТССА СССАСТСАСТ ААТТССТААС САТТСАСАСТ СТССТТСААА

   1251 АСТСАТАТАТ АСТТТАСАТТ САТТТААААС ТТСАТТТТТА АТТТААААСС

   ТСАСТАТАТА ТСАААТСТАА СТАААТТТТС ААСТАААААТ ТАААТТТТСС

   1301 АТСТАССТСА АСАТССТТТТ ТСАТААТСТС АТСАССАААА ТСССТТААСС

   ТАСАТССАСТ ТСТАССАААА АСТАТТАСАС ТАСТССТТТТ АСССААТТ6С

   1351 ТСАСТТТТСС ТТССАСТСАС ССТСАСАССС САТСССССТТ СТССАТАССС

   АСТСААААСС ААССТСАСТС ССАСТСТССС СТАСССССАА САССТАТССС

   1401 ТСААСССТСС ССАСССТСАТ СССССАСАСТ ТСАССААССТ ССТССТСССА

   Фиг. 2

   - 32 023559 асттессасе сетсссаета есесстетсА аетссттсеа ссаееассст

   1451 ССАЕЕСАСЕС ЕСААСАСЕСА СССАССТСАА ТТТЕТТСЕТА ТСАСТСАТТТ

   ЕЕТСССТЕСЕ СЕТТСТЙССТ СССТЕЕАСТТ АААСААССАТ АСТЕАЕТААА

   1501 сстстстссе аатссаасат естсассаса састсттйас сесетаатсс

   ЙЕАСАСАСЕС ТТАССТТСТА ССАЕТСЕТСТ ЕТСАСААСТЕ 6СССАТТАЕЕ

   1551 ТССССЕАССА СЕАТСТТААС СССАСАСТАА СЕТЕАСАЕСЕ ЕТСТСАСАТЕ асссестсст сстасааттс ссстйтсатт йсастстсйс сасастйтас

   1601 ССССАТТЕАЙ ЕТСТТТСААА ССЕТААСТТС АЕААССАТЕТ АСССТСАЕАТ еесстаастс саеааасттт йссагтсаае тсттсйтаса тсссастста

   1651 ТТААСАТААЕ АСТТСАТТСТ АСССАССЕТТ ААААСЕСЕСТ САЕСССССТТ

   ААТТСТАТТС ТСААСТААСА ТСССТЕЕСАА ТТТТССССЕА СТССССССАА

   1701 СТЕЕСЕСААА ААССС1АААА АТЕСАТЙТТТ ТССССССЙЙТ АААССЙЕААА

   САСССССТТТ ТТСССАТТТТ ТАССТАСААА АЙСЕСЕСССА ТТТССССТТТ

   1751 ААТСССТСАС ЕААСССТТТС АСССССТТСС АТЙАСТАТЙС АТСАААСТЕА

   ТТАСССАСТС СТТЕСЕАААЕ ТСЕСЙСААСЕ ТАСТСАТАСС ТАСТТТЕАСТ

   1801 АТЕЕССАТСЕ ЙТТТСССССС ЕТСТЕАТЕСС САТААЕССЕТ АТТТТССЕАС

   ТАССЕСТАЕС САААСССССС САСАСТАСЕС ЙТАТТССССА ТААААСССТС

   1851 ЕТТТТСАССС СТСАТААЕАА 6АААТСА6АС ТЕТАЕТТАСА ЕАСЕАСТСЕТ

   СААААСТССС ЕАСТАТТСТТ СТТТАСТСТС АСАТСААТЕТ СТССТСАССА

   1901 ЕАЙСЕАТТСА СТАСССЕАСТ ССТССЕССАС ТСАТССАСТА ТТТТТССТСЕ

   СТСЕСТААЕТ САТССССТСА ССАЕССЕСТС АЕТАЕСТСАТ АААААСЕАСС

   1951 СЙАСТСТСТС ЕСЕАСТСССС ТТСТСТЙААС АССАСАССЙА САСТСТСТТС

   ССТЕАЕАЕАС СССТСАСССЕ ААЕАЙАСТТЕ ТССТСТСйСТ ЕТСАСАСААС

   2001 АЕТСАТССАТ АААТСАССЙА ССАСТСЙТТС ССйАЕТСАТС САЙТАСТСЙС

   ТСАЕТАССТА ТТТАЕТЕССТ ЕСТСАССААС ЕЕСТСАЕТАЕ ЕТСАТСАССС

   2051 СЙАСЕАСССЕ СТТТТСТАТА ААТСССААТА АЕААААТАГА ТТТТТСАААС

   ЕСТЕСТССЕС ЕААААСАТАТ ТТАЕЕСТТАТ ТСТТТТАТАТ АААААСТТТЕ

   2101 САТААСААСА ТЕАТТТАААА АЕСАААТСАЕ ААААААЕТТА ЕТТТТЕССТЕ

   СТАТТЕТТЕТ АСТАААТТТТ ТССТТТАСТС ТТТТТТСААТ СААААСЕСАС

   2151 ЕЕЕТЕТЕЕЕС АТССТЕСЕАА ТЕАЕААСАЕА СГСЕСЕТТТГ ТСТЕЕАЕСАА

   СССАСАСССС ТАЕЕАСССТТ АСТСТТЕТСТ ЕАЕСЕСАААА АЕАССТССТТ

   2201 СТЙСЙЙССАТ ТТТТСАТТАА АСААТАЕТСА ССЕСАСАЕСС СААТТТТАТЕ

   САСЕССССТА ААААСТААТТ ТСТТАТСАЕТ ЕССЕТСТСЕС СТТААААТАС

   2251 СААС5СТСЕС ТЕТСССЕСАС ЕЕСЕАТТТТТ ААТСССССЙС СССЕТТАТТС

   ЕТТЕССАССЕ АСАСЕССЕТЕ ССССТААААА ТТАЕССЕЕСС СЕССААГААЕ

   2301 АТСТССАССЙ ЕСЕАСЙЕЕЕА ТАСАТАААСС СЙАСАССАЙА ЕЕАССЙСТСА

   ТАЕАССТССС СОСТЙССССТ АТСТАТТТСС ССТСТСЕТСТ ССТССССАСТ

   2351 ЕСЙСЙААТСС САЕАСАТЕАТ ЕААААААСАЕ ЕСАЕА6АААС ЕСЕСССАСЙТ

   СЙСЕСТТАЕЕ ЕТСТСТАСГА СТТТТТТСТС ССТСТСТТТЕ СЕСЕСЕТССА

   2401 АСЙТТТТАТС ГТАТТССТТТ ЕЕТЕТТСТСС АЕЕЕТСТСЙС ЕССТЕТЕССС

   ТЕСААААТАЕ ААТААСЕААА ССАСААСАСЕ ТСССАСАЕСС ССЕАСАСЕЕЕ

   2451 ТСАССАССТС ЕСАТТТЕТСТ САТТЕСЕССТ ЕСЙС6ЕТССС АСАААТССАС

   АСТЕЕТССАС СЕТАААСАЕА СТААСЕСЕСА СЕСЕССАЕЕС ТЕТТТАСЕТЕ

   2501 АТССТЙСССС ЙТССТСТАСС ТСТТТТТТТС АССАЕААСАА СТТСАССААЕ

   ТАЙЙАСЕЕСС САЕСАСАТЕС АСАААААААС ТЙЙТСТТЙГТ ЕААОТЙСТТС

   2551 ТСЕСЙЕАТСА АСССТАССАА СЕТТЕССЕСС ААСЕСТТСЕЕ ССАТСАТЕЕС

   АССЕССТАСТ ТЕСЕАТЕЕТТ ЕСААСССССС ТТЕСЕААЕСС ССТАСТАССЕ

   2601 АТААСЕЕССТ ЕАТАСАЕЕСА ЕСТССССЕАЕ АСЕЕАСАСАЕ СТТЕССТЕТЕ

   ТАГТЕССССА СТАТСТССЕТ ССАЕЕЕССТС ТСССТЕТСТС ЕААСЙЕАСАС

   2651 АЕСЕЕАТССС ЕСЕАЕССЕАС ААССССЕТСА ЕЕЕСЕСЕТСА ССЕССТТТТА

   ТСЕССТАССЕ СССТСЕЕСГЕ ТТСЕЙЕСАСТ СССССЕСАЕТ СЕСССААААТ

   2701 ССЙС6ТСТСЕ ЕЕ6СССАССС АТЕАСССАСТ САССТАЕСЕА ТАЕСЙЕАЕТС

   СЕСССАСАЕС СССССЕТСЙС ТАСТЙЕЕТСА ЕТЕСАТСЕСТ АТСЕССТСАС

   2751 ТАТАСТЕССТ ТААТАТЕТТА ААТСЙСАЕТЕ ЙТААТТСАЕЕ СААСТЕСТТС

   АТАТЕАССЕА АТТАТАСААТ ТТАЕССТСАС САТТААСТСС СТТСАССААЕ

   2801 АТЕГЙ6СААА ЙЕАААААТЕТ ЕЕСТАТСЕТЕ СЕТААСТЕСА АСАТСТАЕСТ

   ТАСАСССТТТ ССТТТТТАСА СССАТАЕСАС ЕСАТТСАСЕТ ТЕТАСАТССА

   2851 АААЕЕТЕААА ТСАСЕССТСС ТСЕСТСАСТС ЙЕТСЕСТАСС СТССТЕССЕТ

   ТТТССАСТТТ АСТЙСССАСЙ АССЕАЗТСАЕ ССАЙСЕАТЙС ЕАЕСАССССА

   Фиг. 2 (продолжение)

   - 33 023559

   2901 САСАСТССЕЕ СССЕССТТАС СЕЕСТСАСАА АТААСЕЕЕАТ АСССАЕЕСАС стстеасесс есссесаатс сссеаететт таттессста тесетссетс

   2951 ТЙСТСАААТС АЕЕААСЕАСС ΞΕΑΑΑΑΑΕΕΑ ТССЕСССТАС ССЕТТТТТСС

   АСЕАСТТТАС ТССТТССТСЕ ССТТТТТССТ АССССЕСАТС СЙСАААААЙЕ

   3001 АТАЕЕСТССЕ ССССССТЕАС ААБСАТСАСС АААТСТСАСС СТСАААТСАЕ

   ТАТССЕАЕЕС СЕЕЕЕЕАСТЕ ТТСЙТАЕТЕС ТТТАСАСТСС ЕАЕТТТАСТС

   3051 ТОЕСЕССЕАА АСССЕАСАСЕ АСТАТАААЕА ТСССАЕСССТ ТТСССССТЕЕ

   АССЕССЕСТТ ХЕЕЕС1СТСС ТСАТАТТТСТ АЕЕЕТССЕСА ААСЕЕЕСАСС

   3101 ТАЕСТСССТС СТЕСБСТСТС СТБТТССТЕС СТТТСЕБТТТ АССЕЕТЕТСА

   АТСЕАСЕЕАС САСЕСЕАЕАЕ САСААСЕАСС САААЕССААА ТЕСССАСАЕТ

   3151 ТТССССГЕТТ АТЕЕССЕСЕТ ТТЕТСГСАТТ ССАССССТСА САСТСАЕТТС

   ААЕЕСЕАСАА ТАССЕССССА ААСАСАСТАА СЕТЕСЕСАСТ ЕТЕАЕТСААЕ

   3201 СЕЕЕТАЕЕСА ЕТТСЕСТССА АЕСТСЕАСТС ТАТЕСАСЕАА ССССССЕТТС

   ССССАТССЕТ СААЙСЕАЕСТ ТСЕАССТЕАС АТАССТЕСТТ СЕ6ЕЕССААЕ

   3251 АЕТСССАСТА ССАСЕСССЕТ ТССССТААСТ АТСААСТТСА СТССААССС6

   ТСАСЕСГЕАТ ЕЕТЕССЕЕСА АЕСССАТТСА ТАЕТТЕААСТ САЕЕТТЕЕЕС

   3301 САААЕАСАСЕ АСАААТСЕСС АЕТСЕСЕЕТА СССАТТЕЕТА АСТЕАЕАТЕТ

   СТТТСТЕТЕС Т6ТТТАЕСЕЕ ТСАСССССАТ СЕЕТААССАТ ТЕАСТСТАСА

   3351 ЕСЕАЕАЕАТТ ТАТСТЕЕАЕТ ТСТТСААЕТЕ ЕЕЕЕССТЕАС ТЕССЕСТАСА

   С6СТСТСТАА АТАСАССТСА АЕААСТТСАС СССССЕАС1С АСССССАТЙТ

   3401 СТЕСААЕЕАС АЕТТТАССТЕ АСТСЕТСТСС САСААСАСАС ТТАССАЕСТТ

   ЕАССТТССТС ТСАААТССАС ТЕАССАСАСС СТСТТСТСТС ААТСЕТССАА

   3451 ААЕСАЕТТСС ССААСТЕАСС ТААССТТСЕА ТСАААССАСС ТССССАССТС

   ТТССТСААСС ЕСТТЕАСТСЕ АТТСЕААССТ АЕТТТЕСТЕЕ АСЕЙЕТССАС

   3501 ЕТТТТТТСЕТ ТТТСАСАЕСА АСАСАТТАСС СЕСАСААААА ААСЙАТСТСА

   СААААААЕСА АААСТСТССТ ТСТСТААТЕС СССТСТТТТТ ТТССТАОАСТ

   3551 АЕААЕАТССТ ТТТТАСАББА ЕСЕАТТАТСЕ ТСТТСАТССА ТЕААЕЕСЕТТ

   ТСТТСТАЕЕА ААААТЕТССТ СЕСТААТАЕС АЕААЕТАЕЕТ АСТТССЕСАА

   3601 ТЕААЕАТТАА АССЕЕССТАТ ТГСАТАЕАТС СТААААТСАС ЕСТТТТСЕЕА

   АСТТСТААТТ ТБЕССЕСА1А ААЕТАТСТАС САТ1ТТАЕТС ССААААСССТ

   3651 ТОЕСССАТСА ААССССАТАА АААСССАТАА АТАСАТАСАС СТАСТААСАА

   АСССЕСТАСТ ТТСЕЕСТАТТ ТТТСЕЕТАТТ ТАТЕТАТЕТЕ ЕАТЕАТТСТТ

   3701 ТСАТСТТТТС СТСТАССАСЕ СГАТЕААААС ТСТСАСЕЕТТ ССАССССАСА

   АЕТАЕААААС ЕАСАТЕЕТСС САТАСТГТТС АЕАЕТСССАА СЕТЕБЕСТСТ

   3751 АТАСЕССАТС ААСААСТССТ ЕТСАСАССОС САААТААСАТ ССААААААТТ

   ТАТЙСЕЕТАС ТТСТТСАЕЕА САЕТЕТЕ6СС СТТТАТТЕТА СЕТТТТТТАА

   3801 ССЕЕАТЕАСС ЕТААТССЕЕС СТЕСАЕАТСА АТЕАСТЕАСА СААСГАТААА

   СЕССТАСТСЕ САТТАССССС САССТСТАЕТ ТАСТЕАСТСТ ЕТТСАТАТТТ

   3851 СТТСАТЕСАА АААЕТААТТА СААТСАЕТСС САААЕТСАСС ССТСТССССС

   СААСТАСЕТТ ТТТСАТТААТ СТТАСТСАСС ЕТТТСАСТСЕ ССАСАБСССС

   3901 СССТЕАТААТ САТЕСССЕЕА ТТАТСТСААТ ТТСТСАЕСЕЕ ССЕСТСТЕАЕ

   ССЕАСТАТТА ЕТАСЕСЕССТ ААТАЕАСТТА ААЕАЕТСССС СССЕАСАСТС

   3951 СЕССАСААСС ТЕТАТССААЕ АЕСССТЕССТ АСЕАЕСАСТС СТЕССЕТСАГ

   ЕСЕЕТЕГТЕС АСАТАЕЕТТС ТССССАСЕЕА ТССТСЕТСАЕ ЕАССЕСАЕТА

   4001 САТТЕТААЕЕ СТТАССССАЕ СААЕТТТТСТ СТСАЕТЕАТА АСАССТТАТС

   ЕГААСАТТСС ЕААТЕССЕТС ЕТТСААААСА ЕАЕТСАСТАТ ТСТСЕААТАС

   4051 СТССССАТАС ААССААААЕТ АТСЕСЕАЕАА ААААСАААСЕ ССССЕТТСТС

   ОАЕЕСЕТАТС ТТССТТТТСА ТАЕСССТСТТ ТТТТСТТТЕС ЕЙССЕААСАЕ

   4101 АТСТСССЕЕТ САТААА6АСС АЕСААААССЕ СЕТСЕТАСТА АААААЕССАС

   ТАЕАСССССА СТАТТТСТСС ТСЕТТТТЕЕС ЕСАССАТСАТ ТТТТГСЕЕТС

   4151 САЕЕАТСААС СТТСАСОЕТТ САСАТ6ТЕТА ТААЕАЕАСАЕ АСТСТАОССА

   СТССТАСТГС СААЕТСССАА СТСТАСАСАТ АТТСТСТСТС ТЕАЕАТССЕТ

   4201 СТТТССААЕТ АЕАААСТАСА СТТТСТАААС ТССААСТТТТ ТСТАСТТТТТ саааееттса тстттеатет саааеаттте асеттеаааа АЕАТЕААААА

   4251 ЕСААСТГААТ СТАТТСАСТА ОТССТТТАТА ААТЕТТАААА САТАТАТАТА

   СЕТТСААТТА САТААСТЕАТ САЕЕАААТАТ ТТАСААТТТТ 6ТАТАТАТАТ

   Мех Е1п11еРЬеУа1ЬузТЬгЬеи

   4301 ΕΑΑΑΤΑΑΑΙΑ ААААЕАЕЕАЕ СТТСАТАТЕС АААТТТТТСТ ГААААСТТТА

   СТТТАТГТАТ ТТТТСТССТС СААЕТАТАСЕ ТТТАААААСА АТТТТ6АААТ

   ТЬгЕ1уЬуз ТЬгИеТЬгЬеи Е1иУз1С1и ЗегЗегАзрТЬг НеАзрАзп*

   4351 АСТЕЕТАААА ССАТТАССТТ АЕААЕТГЕАА ТСТТСАЕАТА ССАТТЕАТАА

   Фиг. 2 (продолжение)

   - 34 023559

   ТЕАССАТТТТ ЕЕТААТВСАА ТСТТСААСТТ АЕААЕТСТАТ ВСТААСТАТТ -АзпУа1Ьуз5ег Ьуз11еЕ1п АерЬузЕХи Е1у11еРгоРго Азр61пЕ1пА1а

   4401 ТЕТТАААТСТ ААААТТСААС АТАААСААЕЕ ТАТТССТССА САТСААСААЕ

   АСААТТТАЕА ТТТТААЕТТС ТАТТТСТТСС АТААЕСАЕЕТ СТАСТТСТТС •А1аЬеи11е РЬеА1аЕ1уЬуз Е1пЬеиЕ1и А$р<31уА1а ТЬгЬеиЭегАзр 4451 СТСТААТАТТ ТЕСАСЕТААА САСТТАСААЕ АТССТССТАС ССТСТСТЕАТ

   САСАТТАТАА АССТССАТТТ ЕТСААТСТТС ТАССАССАТЕ ССАСАЕАСТА

   ТугАзп11еС1п ХузЕ1и5ег ТЬгЬеиШз Ьеи7а1ЬеиА1а ЬеиА1аЕ1у· 4501 ТАТААСАТТС АЕАААСААТС ТАССТТАСАТ СТССТСТТАС СТСТСССТСС

   АТАТТЕТАА6 ТСТТТСТТА6 АТЕСААТСТА ЕАССАЕААТС САСАССЕАСС •С1уЕ1уАгдРЬе Уа1АзпЕ1пШз ЬеиСузЕ1у ЗегЬПзЬеи Уа1Е1иА1аЬеи

   4551 ТССТСЕТТТТ СТСААССАЕС АССТСТСТСС ТТСТСАССТС СТТСААССАС

   АССАЕСАААА САЕТТСЕТСС Т6ЕАСАСАСС ААСАСТЕСАС СААСТТСЕТЕ •ЬеиТугЬеиУа1 СузЕ1уС1и АгдС1уРЬе РАеТугТЬгРго ЬузТЬгЬуз 4601 ТСТАССТССТ АТСТЕСССАА ССТССТТТСТ ТСТАСАСТСС ТААААСАААЕ АСАТЕСАССА ТАСАССЕСТТ ССАССАААСА АЕАТЕТЕАСЕ АТТТТСТТТС

   АгдС1у11е Уа1Е1иС1п СузСузТЬгЗег ИеСузЗег ЬеиТугС1пЪеи4651 СЕСЕЕСАТСС ТТЕААСАЕТС СТЕТАССТСТ АТСТЕТТССС ТЕТАССААСТ

   ССЕСССТАСС ААСТТСТСАС САСАТССАСА ТАСАСААССС АСАТССТТСА •ЬеиЕ1иАзпТуг СузАзпСТу ***

   4701 СЕАЕААСТАС ТЕСААТЕЕТТ ААЕТСЕАСТС ТАССТАСАСС СТССТТТССС

   ССТСТТЕАТЕ АСЕТТАССАА ТТСАЕСТСАЕ АТССАТЕТСС САСЕАААЕСС

   4751 АЕЕСТЕТТТТ ТТАТСТССАС ЕАТСС

   ТССЕАСАААА ААТАЕАЕСТС СТАСЕ

   Фиг. 2 (продолжение)

   Фиг. 3

   - 35 023559

   1 АТТАТСАТЕА САТТААССТА ТАААААТАСЕ СЕТАТСАССА СССССТТТСС

   ТААТАСТАСТ ЕТААТТЕЕАТ АТТТТТАТСС ЕСАТАСТЕСТ СССЕЕАААЕС

   51 ТСТТСААЕАА ТТСТСАТЕТТ ТЕАСАЕСТТА ТСАТССАТАА ССТТТААТЕС

   АЕААЕТТС1Т ААЕАСТАСАА АСТЕТСЕААТ АЕТАЕСТАТТ СЕАААТТАСЕ

   101 ЕЕТАЕТТТАТ САСАЕТТААА ТТССТААССС АЕТСАСЕСАС СЕТЕТАТЕАА

   ССАТСАААТА ЕТЕТСААТТТ ААСЕАТТЕСС ТСАСТССЕТС ССАСАТАСТТ

   151 АТСТААСААТ ССССТСАТСС ТСАТССТССС САСССТСАСС СТССАТССТЕ

   ТАЕАТТЕТТА СССЕАЕТАЕС АЕТАЕЕАЕСС СТСССАСТСЕ ЕАССТАСЕАС

   201 ТАЕЕСАТАЕЕ СТТС6ТТАТС ССЕЕТАСТСС СБЕСССТСТТ ЕССЕСАТАТС

   АТСССТАТСС СААССААТАС ЕЕССАТЕАСЕ СССССЕАЕАА СССССТАТАС

   251 СТССАТТССЕ АСАЕСАТСЕС САЕТСАСТАТ СССЕТЕСТЕС ТАССССТАТА

   САССТААССС ТСТССТАЕСС ЕТСАСТЕАТА ССССАССАСЕ АТССССАТАТ

   301 ТСССТТЕАТЕ СААТТТСТАТ ЕСЕСАСССЕТ ТСТСЕЕАЕСА СТЕТСССАСС

   АСЕСААСТАС ЕТТАААСАТА СЕССТСЕЕСА АЕАЕССТССТ ЕАСАСССТЕЕ

   351 ССТТТЕЕССС ССССССАЕТС СТЕСТСЕСТТ СЕСТАСТТЕЕ АЕССАСТАТС

   СЕАААССЕЕС СЕСБСЕТСАЕ ЕАСЕАЕСЕАА СССАТСААСС ТССЕТЕАТАЕ

   401 САСТАСЕСЕА ТСАТЕЕСЕАС САСАСССЕТС СТЕТЕЕАТСС ТСТАСЕСССЕ

   СТЕАТЕСЕСТ АЕТАССЕСТЕ 6ТЕТЕЕЕСАС САСАССТАЕЕ АЕАТСССЕСС

   451 АСЕСАТССТЕ ЕСССССАТСА ССЕЕСЕССАС АЙЕТССССТТ ССТСССЕССТ

   ТЕСЕТАЕСАС СЕЕСССТАЕТ ЕСССЕСЕЕТС ТССАС6ССАА СЕАССЕСЕЕА

   501 АТАТСЕССЕА САТСАССЕАТ ЕСЕЕААЕАТС ЕЕЕСТСЕССА СТТСЕСССТС

   ТАТАЕСЕЕСТ ЕТАЕТЕЕСТА ССССТТСТАЕ СССЕАЕСОЕТ ЕААЕСССЕАЕ

   551 АТЕАЕСЕСТТ ЕТТТСЕССЕТ ЕЕЕТАТЕЕТЕ ОСАЕЕССССЕ ТОЕССССЕЕЕ

   ТАСТСЕСЕАА САААЕССССА СССАТАССАС СЕТССЕЕОЕС АССЕЕССССС

   601 АСТЕТТЕЕЕС СССАТСТССТ ТЕСАТЕСАСС АТТССТТЕСС ССЕЕСЕСТСС

   ТЕАСААСССЕ СЕЕТАЕАЕЕА АСЕТАСЕТЕЕ ТААЕЕААСЕС СЕССЕССАСЕ

   651 ТСААСЕЕССТ СААССТАСТА СТЕСССТЕСТ ТССТААТОСА ЕЕАЕТСССАТ

   АСТТЕССЕЕА ЕТТЕЕАТЕАТ ЕАСССЕАСЕА АОСАТТАСЕТ ССТСАСССТА

   701 ААСЕЕАЕАЕС СТСЕАССЕАТ ЕСССТТСАЕА СССТТСААСС САСТСАЕСТС

   ТТСССТСТСЕ САССТСЕСТА ССЕЕААСТСТ СССААЕТТСС СТСАСТССАС

   751 СТТССЕЕТЕЕ ЕСЕСЕЕЕЕСА ТЕАСТАТСЕТ СЕССССАСТТ АТЕАСТСТСТ

   ОААЕЕССАСС СЕСЕССССЕТ АСТЕАТАЕСА ЕССЕСЕТЕАА ТАСТЕАСАЕА

   801 ТСТТТАТСАТ ССААСТССТА ЕЕАСАЕЕТЕС ССЕСАЕСЕСТ СТЕСЕТСАТТ

   АЕАААТАСТА ССТТСАЕСАТ ССТЕТССАСС ЕССЕТСССЕА САСССАЕТАА

   851 ТТСЕЕСЕАЕЕ АССЕСТТТСЕ СТЕСАЕСССС АСЕАТЕАТСЕ ЕССТЕТСССТ

   ААСССССТСС ТЕЕСЕАААЕС ЕАССТСЕСЕС ТЕСТАСТАСС СЕОАСАЕСЕА

   901 ТССЕЕТАТТС ЕЕСАТСТТЕС АСЕСССТСЕС ТСААЕССТТС СТСАСТСЕТС

   АСЕССАТААЕ СССТАЕААСЕ ТЕСЕЕЕАЕСЕ АЕТТСССААЕ САОТСАССАЕ

   951 СС6ССАССАА АСЕТТТСЕСС ЕАЕААССАЕС ССАТТАТСЕС СЕЕСАТЕЕСЕ

   СЕСССТЕЕТТ ТЕСАААЕССЕ СТСТТСЕТСС ЕЕТААТАЕСЕ ЕСССТАССЕС

   1001 ЕССЕАСЕСЕС ТЕЕЕСТАСЕТ СТТЕСТЕЕСЕ ТТСЕСЕАССС ЕАЕССТЕЕАТ

   СЕЕСТЕСЕСЕ АСССЕАТЕСА ЕААСЕАССЕС ААЕСЕСТЕСЕ СГССЕАССТА

   1051 ЕЕССТ1СССС АТТАТСАТТС ТТСТСССТТС ССССЕССАТС СССАТССССС

   СССЕААЕЕЕС ТААТАСТААЕ ААЕАССЕААС СССЕССЕТАЕ СССТАСЕСЕС

   1101 ССТТССАЕЕС САТЕСТЕТСС АЕЕСАЕЕТАЕ АТЕАСЕАССА ТСАЕЕЕАСАЕ

   ЕСААСЕТССЕ етассасаее тссетссатс тастестест АЕТСССТЕТС

   1151 СТТСААЕЕАТ СССТСССЕЕС ТСТТАССАЕС СТААСТТСЕА ТСАТТЕЕАСС

   ЕААЕТТССТА ЕСЕАЕСЕССЕ АЕААТЕЕТСЕ ЕАТТЕААЕСТ АЕТААССТЕЕ

   1201 ЕСТЕАТСЕТС АСЕЕСЕАТТТ АТОССЕССТС ЕЕССАЕСАСА ТЕЕААСЕЕЕТ

   ССАСТАССАЕ ТСССССТААА ТАСЕЕСЕЕАЕ ССССТССТСТ АССГГЕСССА

   1251 ТСЕСАТЕЕАТ ТСТАЕЕСЕСС ССССТАТАСС ТТЕТСТЕССТ ССССЕСЕТТЕ

   АССЕТАССГА АСАТССЕСЕЕ СЕЕЕАТАТЕЕ ААСАЕАССЕА СЕЕЕСЕСААС

   1301 СЕТСССЕЕТЕ САТЕЕАСССЕ ЕЕССАССТСЕ АССТЕААТЕЕ ААСССССЕАЕ

   ЕСАЕСЕССАС ЕТАССТСЕЕС ССОЕТЕЕАЕС ТЕЕАСТТАСС ГТЕЕСЕССТС

   1351 АТАЕЕГСССТ САСТЕАТТАА ЕСАТТСЕТАА СТСТСАЕАСС ААЕТТТАСТС

   ТАТССАСЕСА етеастаатт ССТААССАТТ еасаетстее ттсааатеас

   Фиг. 4

   - 36 023559

   1401 АТАТАТАСТТ ТАЕАТТЕАТТ ТААААСТТСА ТТТТТААТТТ ААААЕСАТСТ

   ТАТАТАТЕАА АТСТААСТАА АТТТТСААСТ АААААТТААА ТТТТССТА6А

   1451 АЕЕТСААЕАТ ССТТТТТСАТ ААТСТСАТСА ССААААТССС ТТААСЕТЕАЕ

   ТССАСТТСТА ЕЕАААААСТА ТТАЕАЕТАСТ ЕЕТТТТАЕЕС ААТТЕСАСТС

   1501 ТТТТССТТСС АСТЕА6СЕТС АСАССССАТС ЕССЕТТСТСС АТАСЕСТЕАА

   ААААЕСААЕС ТСАСТСЕСАС ТСТСЕЕЕТАС СЕЕСААЕАЕС ТАТЕССАСТТ

   1551 СССТЕСЕСАС ЕСТСАТСССЕ САСАСТТСАС СААССТЕСТС СТЕЕЕАССАЕ

   ЕССАСССЕТЕ ССАСТАЕСЕС СТСТСААЕТС СТТССАСЕАС ЕАСССТСЕТС

   1601 ЕСАСЕСССАА ЕАСЕСАЕСЕА ССТЕААТТТС ТТСЕТАТСАС ТСАТТТССТЕ

   СЕТЕССССТТ СТЕСЕТСССТ ССАСТТАААС ААССАТАЕТС АЕТАААЕЕАС

   1Й51 ТСТСССААТС ЕААЗАТЕЕТС АССАСАСАЕТ ЕТТСАССССС ТААТССТССЕ

   АЕАСЕСТТАС СТТСТАССАЕ ТСЕТСТЕТСА СААСТЕСС6С АТТАСЕАССС

   1701 СЕАССАСЕАТ СТТААСССЕА САЕТААСЕТС АСАЕСЕЕТСТ ЕАСАТ6СССС

   ЕСТСЕТЕСТА СААТТЕЕССТ СТСАТТЕСАС ТЕТСЕССАЕА СТЕТАСЕЕСО

   1751 АТТЕАЕЕТСТ ТТЕАААССЕТ ААСТТСАЕАА ЕСАТЕТАСЕС ТСАЕАТТТАА

   ТААСТССАСА ААСТТТЕССА ТТЕААСТСТТ ССТАСАТЕСС АСТСТАААТТ

   1801 САТААЕАОТТ САТГЕТАСЕС АСССТТАААА СЕСЕСТСАЕС ССЕСТТСТСЕ

   ЕТАТТСТСАА ЕТААСАТССЕ ТЕССААТТТТ ЕСССЕАСТСЕ СССЕААЕАСС

   1851 СЕСАААААСС ЕТАААААТЕЕ АТСТТТТССС ССССЕТАААС ССЕАААААТЕ

   ССЕТТТТТЕЕ САТТТТТАСС ТАСААААЕСЕ ЕССССАТТТЕ ЕССТТТТТАС

   1901 СЕТСАЕЕААС ЕСТТТСАЕСС СЕТТЕСАТЕА СТАТЕСАТЕА ААСТСААТ6Е

   ОСАСТССТТЕ ССАААЕТС6С ССААСЗТАСТ ЕАТАССТАСТ ТТЕАСТТАСС

   1951 ССАТСЕЕТТТ ЕЕЕСЕСЕТСТ САТЕСССАТА АССССГАТТТ ТСЕЕАСЕТТТ

   ЕСТАСССААА сссесесаса стасссетат ТССССАТААА АСССТССААА

   2001 ТСАЕСССТСА ТААЕААСААА ТСАСАСТЕТА СТТАЕАСАСЕ АЕТССТЕАСС

   АЕТССЕЕАСТ АТТСТТСТТТ АСТСТЕАСАТ СААТЕТСТСС ТСАЕСАСТСЕ

   2051 ЕАТТСАСТАС ЕСЕАЕТССТС СЕССАЕТСАТ ССАЕТАТТТТ ТССТСЕСЕАС

   СТААЕТЕАТЕ СССТСАЕСАС ССЕСТСАЕТА ЕЕТСАТАААА АСЕАЕСЕСТЕ

   2101 ТСТСТЕЕСЕА СТСЕССТТСТ СТЕААСАССА ЕАССЕАСАЕТ ЕТЕТТЕАСТС

   АЕАЕАССССТ ЕАЕСЕЕААЕА ЕАСТГЕТЕСТ СТСЕСТСТСА САСААСТСАЕ

   2151 АТСЕАТАААТ САССЕАССАС ТСЕТТЕСССА ЕТСАТССАЕТ АСТСЕССЕАС

   ТАЕСТАТТТА ЕТЕЕСТЕСТЕ АЕСААСЕЕСТ САЕТАЕЕТСА ТСАЕССЕСТЕ

   2201 ЕАЕССЕСТТТ ТЕТАТАААТС СЕААГААЕАА ААТАТАТТТТ ТСАААССАТА

   СТСЕЕСЕААА АСАТАТТТАЕ ЕСТТАТТСТТ ТТАТАТАААА АСТТТЕЕТАТ

   2251 АСААСАТЕАТ ТТАААААССА ААТСАЕАААА ААЕТТАСТТТ ТЕСЕТСЕЕЕТ

   ТЕТТСТАСТА ААТТТТТСЕТ ТТАЕТСТТТТ ТТСААТСААА АСОСАССССА

   2301 СТЕЕССАТСС ТЕЕЕААТЕАЕ ААСАЕАСТСЕ ССТТТТТСТЕ ЕАЕЕААС1СС

   САСССЕТАСЕ АСССТТАСТС ТТЕТСТЕАСС ЕСАААААЕАС СТССТТЕАСЕ

   2351 СЕЕЕАТТТТТ САТТАААСАА ТАЕТСАССЕС АЕАЕСОЕААТ ТТТАТССААС

   ССССТААААА СТААТТТЕТТ АТСАСТЕССС ТСТСЕССТТА АААТАСЕТТЕ

   2401 ЕСТСССТСТЕ ССЕСАССЕЕС АТТТТТААТС СССССССССС ТТАТТСАТСТ

   СЕАССЕАСАС ЕССЕТССССС ТАААААТТАЕ ЕЕСЕССЕЕЕС ААТААСТАСА

   2451 ССАССЕСССА ССЕСЕАТАСА ТАААССССАС АЕСАЕАСЕАС ССЕТЕАЕССС

   СЕТЕСССЕСТ ЕССССТАТЕТ АТТТ630СТС ТСЕТСТССТЕ СССАСТСЕСС

   2501 ЕААТСССАСА ЕАТСАТЕААА АААЕАЕССАС АЕАААСЕСЕС ССАЕЕТАСЕТ

   СТТАСЕЕТСТ СТАСТАСТТТ ТТТСТССЕТС ТСТТТЕСЕСС ЕСТССАТЕСА

   2551 ТТТАТСТТАТ ТССТТТССТЕ ТТЕТССАЕЕС ТСТСЕСЕССТ ЕТЕСССТЕАС

   АААТАЕААТА АСЕАААССАС ААСАСЕТССС АСАЕССССЕА САСЕЕСАСТС

   2601 САЕЕТЕЕСАТ ТТЕТСТЕАТТ ССЕСЕТЕСЕС ЕЕТССЕАСАА АТ6САСАТСС

   СТССАССЕТА ААСАЕАСТАА СЕСССАСЕСЕ ССАЕЕСТЕТТ ТАСЕТСТАСЕ

   2651 ТЕССССЕТСС ТСТАСЕТСТТ ТТТТТСАССА ЕААСААСТТС АСЕААСТЕОС

   АСЕЕСЕСАСЕ АСАТЕСАСАА АААААЕТЕЕТ СГТСТТСААС ТССТТСАССС

   2701 ЕЕАТЕААСЕС ТАССААС6ТТ СССЕСЕААСС СТТСЕЕСЕАТ ЕАТЕЕСАТАА

   ССТАСТТЕСЕ АТСЕТТ6САА СЕЕСССТТЕС ЕААЕССЕСТА СТАСССТАТТ

   2751 СЕЕЕСТЕАТА САЕЕСАЕСТС ССЕЕАЕАССЕ АСАСАЕСТТС ССТЕТСАЕСЕ

   ЕСССЕАСТАТ ЕТССЕТСЕАЕ СЕССТСТЕСС ТЕТЕТССААС ЕЕАСАСТССС

   2801 ОАТЕССЕЕСА ЕССЕАСААЕС ССЕТСАЕЕЕС ЕСЕТСА6СЕ6 ЕТТТТАЕСЕЕ

   СТАСЕЕСССТ СЗССТЕТТСС ЕЕСА6ТСССЕ СССАЕТСЕСС СААААТСЕСС

   Фиг. 4 (продолжение)

   - 37 023559

   2851 СТСТСССЕЕС ССАЕССАТЕА СССАОТСАСЕ Е АС С САТАЕ С ССАЕТСТАТА

   САСАСССССЕ СЕТСЕЕТАСТ ЕСЕТСАСТСС АТС6СТАТСЕ ССТСАСАТАТ

   2901 СТЕЕСТТААТ АТЕТТАААТС ЕЕАЕТЕЕТАА ТТСАОЕЕААС ТССТТСАТСТ

   ЕАССЕААТТА ТАСААТТТАС ССТСАССАТТ ААСТСССТТС АССААСТАСА

   2951 ЕССАААЕСАА АААТЕТЕССТ АТССТЕСЕТА АСТЕСААСАТ ЕТАССТАААЕ

   ССЕТТТССТТ ТТТАСАССЕА ТАЕСАСССАТ ТСАСЕТТЕТА САТССАТТТС

   3001 ЕТЕАААТЕАС ЕССТССТССС ТСАСТСЕЕТС ССТАСЕСТСС ТЕССОТСАОА

   САСТТТАСТС ССЕАЕЕАССС АЕТЕАСССАС СЕАТСССАЕЕ АССССАСТСТ

   3051 стесеесссе ссттасссес тсасааатаа сеееатасес асссаетест

   ЕАС6ССЕССС ЕСААТСЕСС6 АСТ6ТТТАТТ ССССТАТССС ТСССТСАСЕА

   3101 САААТСАЕЕА АЕЕАССЕСАА АААЕЕАТССС ССЕТАЕССЕТ ТТТТССАТАЕ

   СТТТАСТССТ ТССТЕЕССТТ ТТТССТАССС СССАТСЕЕСА ААААЕЕТАТС

   3151 ЕСТССССССС ССТЕАСААСС АТСАССАААТ СТСАСССТСА ААТСАСТССС

   ССАСССССЕС ССАСТСТТСС ТАСТССТТТА САСТССЕАЕТ ТТАСТСАССС

   3201 ЕЕСЕАААССС ЕАСАЕЕАСТА ТАААСАТССС АССССТТТСС СССТССТАСС сссстттесс СТСТССТСАТ АТТТСТАСЕС ТССССАААЕС сссассатсс

   3251 ТСССТССТСС ССТСТССТСТ ТССТСССТТТ СССТТТАССЕ ЕТЕТСАТТСС

   АСЕСАССАСЕ ССАСАССАСА АСЕАСССААА ЕССАААТССС САСАСТААСС

   3301 ССТСТТАТСС СССССТТТЕТ СТСАТТССАС СССТЕАСАСТ САСТТССЕСЕ

   ССАСААТАСС СССССАААСА САСТААЕСТС СЕЕАСТСТСА ЕТСААЕСССС

   3351 ТАЕЕСАСТТС ЕСТССААССТ ССАСТСТАТС САССААСССС СССТТСАСТС

   АТСССТСААЕ ССАССТТССА ССТСАСАТАС СТЕСТТССЕС СЕСААСТСАС

   3401 СЕАСТАССАС СССССТТССС СТААСТАТСА АСТТЕАЕТСС ААСССЕСААА сстсатеетс сссссаасес саттсатаст тсаастсаес ттсссссттт

   3451 САСАССАСАА АТССССАСТЕ СССЕТАЕССА ТТССТААСТС АСАТЕТСССА

   СТСТЗСТЕТТ ТАССССТСАС СЕССАТСЕЕТ ААССАТТСАС ТСТАСАСЕСТ

   3501 САСАТТТАТС ТССАСТТСТТ СААСТССССС ССТСАСТССС ССТАСАСТСЕ

   СТСТАААТАС АССТСААСАА СТТСАССССС ССАСТСАССС ССАТСТСАСС

   3551 ААССАСАСТТ ТАССТСАСТС СТСТСССАСА АСАСАСТТАС САССТТААСС

   ТТССТСТСАА АТССАСТСАС САСАСССТСТ ТСТСТСААТС СТССААТТСС

   3601 АСТТССССАА СТСАССТААС СТТССАТСАА АССАССТССС САССТЕСТТТ

   ТСААССССТТ састссаттс сааестастт тсстссассс стссассааа

   3651 ТТТССТТТТС АСАССААСАС АТТАСССССА САААААААСС АТСТСААСАА

   АААССААААС ТСТССТТСТС ТААТСССССТ СТТТТТТТСС ТАСАСТТСТТ

   3701 САТССТТТТТ АСАССАСССА ТТАТСЕТСТТ САТССАТСАА ССССТТТСАА

   СТАССААААА ТСТССТСССТ ААТАССАСАА СТАССТАСТТ СС6САААСТГ

   3751 САТТАААССЕ ЕССТАТТТСА ТАЕАТСЕТАА ААТСАЕСЕТТ ТТЕСЕАТЕЕС

   СТААГТТССС СССАТАААСТ АТСТАЕСАТТ ГТАСТСССАА ААСССТАССС

   3801 ССАТСАААСС ССАТАААААС ССАТАААТАС АТАСАССТАС ТААСААТСАТ

   ССТАСТТТСС ССТАТТТТТС сстатттатс татстссате аттеттаста

   3851 СГТТТЕСТСТ АССАСССГАТ СААААСТСТС АЕССТТССАС СССАЕААТАС

   СААААССАСА ТЕЕТСССАТА СТТТТСАСАС ТСССААЕЕТС ЕСЕТСТТАТЕ

   3901 СССАТСААСА АСТССТСТСА САСССССААА ТААСАТССАА ААААТТССЕС

   СССТАСТТСТ ТСАССАСАСТ СТСССССТТТ АТТЕТАСЕТТ ТТТТААСССС

   3951 АТСАСССТАА ТСССССЕТСС АЕАТСААТСА СТСАСАСААЕ ТАТАААСТТС

   ТАСТСССАТТ АССССССАСЕ ТСТАСТТАСТ САСТСТСТТС АТАТТТСААС

   4001 АТССАААААЕ ТААТТАСААТ САСТСССААА СТСАССССТС ТССССССССТ

   ТАССТТТТТС АГТААТЕТТА СТСАЕССТТТ СА6ТСЕССАС АЕСЕССССЕА

   4051 ЕАТААТСАТЕ СССССАТТАТ СТСААТТТСТ САЕСЕССЕЕС ТСТСАССССС

   СТАТТАСТАС ЕЕЕССТААТА САСТТАААСА СТСЕСССССС АСАСТСССЕС

   4101 АСААССТЕТА ТССААЕАЕСС СТСССТАССА ССАЕТССТСС СЕТСАТСАТТ

   ТСТТСЕАСАТ АЕЕТТСТСЕС САСЕЕАТЕСТ СЕТСАССАСС ССАЕТАЕТАА

   4151 СТААСЕСТТА ССССАССААС ТТТТЕТСТСА СТЕАТААСАС СТТАТССТСС

   САТТССЕААТ ССССТССТТС ААААСАЕАЕТ САСТАТТЕТЕ ЕААТАСЕАЕС

   4201 ССАТАСААСС ААААСТАТСС ССАСАААААА САААСЕССС6 СТТСТСАТСТ

   ССТАТЕТТСС ТТТТСАТАЕС ССТСТТТТТТ СТТТССС6СС СААСАСТАСА

   4251 СССЕСТСАТА ААСАССАССА АААСССССТС СТАСТААААА АЕССАССАСС

   СССССАСТАТ ТТСТССТС6Т ТТТЕССССАС САТСАТТТТТ ТСССТССТСС

   Фиг. 4 (продолжение)

   - 38 023559

   4301 АТСААЕСТТС АЕСЕТТЕАЕА ТСТСТАТААС А6АСАСАСТС ТАЕССАОТТТ ТАСТТСЕААЕ ТСССААСТСТ АСАСАТАТТС ТСТЕТСТЕАЕ АТСЕЕТСААА

   4351 ССААЕТАСАА АСТАСА6ТТТ СТАААСТССА АСТТТТТСТА СТТТТТССАА

   ЗСТТСАТСТТ ТСАТЕТСААА ЕАТТТЕАССТ ТСАААААЕАТ САААААССТТ

   4401 СТТААТСТАТ ТСАСТАСТСС ТТТАТАААТС ТТААААСАТА ТАТАТАСААА

   СААТТАСАТА АСТСАТСАСС АААТАТТТАС ААТТТТСТАТ АТАТАТСТТТ

   МеЬС1п11е РкеУа1Ьуз ТкгЬеиТкгС1у

   4451 ТАААТААААА САССАССТТС АТАТССАААТ ТТТТСТТААА АСТТТААСТС

   АТТТАТТТТТ СТССТССААС ТАТАССТТТА ААААСААТТТ ТСАААТТСАС •С1уЬузТкг11е ТЬгЬеиС1и 7а1С1и5ег5ег АзрТЬгИе АзрАзпУа!

   4501 СТААААССАТ ТАССТТАСАА СТТСААТСТТ САСАТАССАТ ТСАТААТСТТ

   САТТТТССТА АТССААТСТТ СААСТТАСАА СТСТАТССТА АСТАТТАСАА

   ЬузЗегЬузИе С1пАзрЬуз С1иС1у11е РгоРгоАзрС1п С1пА1аЬеи4551 АААТСТАААА ТТСААСАТАА АСААССТАТТ ССТССАСАТС ААСААССТСТ

   ТТТАСАТТТТ ААСТТСТАТТ ТСТТССАТАА ССАССТСТАС ТТСТТССАСА •11еРЬеА1а С1уЬузС1пЬеи С1иАзрС1у А1аТкгЬеи ЗегАзрТугАзп·

   4601 ААТАТТТССА ССТАААСАСТ ТАСАА6АТСС ТССТАСССТС ТСТСАТТАТА

   ТТАТАААССТ ССАТТТСТСА АТСТТСТАСС АССАТСССАС АСАСТААТАТ

   -А11еС1пЬуз СХиЗегТкг ЬеиН1зЬеи1/а1 ЬеиА1аЬеи А1аС1уС1у

   4651 АСАТТСАСАА АСААТСТАСС ТТАСАТСТСС ТСТТАССТСТ СССТССТССТ

   ТСТААСТСТТ ТСТТАСАТСС ААТСТАСАСС АСААТС6АСА СССАССАССА

   АгдРЬеУа1Азп Е1пН1зЬеи СузС1уЗег Н1зЬеиА/а1С1и А1аЬеиТуг·

   4701 ССТТТТСТСА АССАССАССТ СТСТССТТСТ САССТССТТС ААССАСТСТА

   ССААААСАСТ ТССТССТССА САСАССААСА СТССАССААС ТТССТСАСАТ •Ьеи\7а1Суз С1уС1иАгдС1у РкеРЬеТуг ТкгРгоЬуз ТкгЬузАгдС1у·

   4751 ССТССТАТСТ ССССААССТС СТТТСТТСТА САСТССТААА АСАААССССС

   ССАССАТАСА ССССТТССАС САААСААСАТ СТСАССАТТТ ТСТТТССССС •С11еУа1С1и С1пСузСуз ТкгЗегИеСуз ЗегЬеиТуг С1пЬеиС1и

   4801 ССАТССТТСА АСАСТССТСТ АССТСТАТСТ СТТСССТСТА ССААСТССАС ССТАССДАСТ ТСТСАССАСА ТССАСАТАСА СААСССАСАТ ССТТЗАССТС

   АзпТугСузАзп Зег***

   4851 ААСТАСТССА АТТСТТААСТ ССАСТСТАСС ТАСАСССТСЕ ТТТСССАСЕС ТТСАТСАССТ ТААСААТТСА ЕСТЕАЕАТСС АТЕТССЕАЕС АААСССТССС

   4901 ТСТТТТТТАТ С АСААААААТА Е

   Фиг. 4 (продолжение)