CN111763679A - 一种胰高血糖素样肽-1类似物的制备方法、编码基因、表达载体及宿主细胞 - Google Patents
一种胰高血糖素样肽-1类似物的制备方法、编码基因、表达载体及宿主细胞 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种胰高血糖素样肽‑1类似物的制备方法以及用于该制备方法的胰高血糖素样肽‑1类似物的编码基因、表达载体和宿主细胞，属于生物医药领域。本发明实施例通过选择使用大肠杆菌碱性磷酸酶启动子调控下游基因转录，同时通过优化改造的利拉鲁肽中间肽或索马鲁肽中间肽的编码基因，突变掉其中的大肠杆菌稀有密码子并尽可能避免形成二级结构，以及通过利用大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽引导利拉鲁肽中间肽或索马鲁肽中间肽的分泌表达。经实验证明，经过优化过密码子的利拉鲁肽中间肽和索马鲁肽中间肽能分泌至培养基中，其表达量较高。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体是一种胰高血糖素样肽-1类似物的制备方法以及用于该制备方法的胰高血糖素样肽-1类似物的编码基因、表达载体和宿主细胞。
背景技术
糖尿病(Diatetes mellitus)是一组以胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用不足引起的血浆葡萄糖(血糖)水平升高为特征的代谢性疾病群。糖尿病因其病因复杂、并发症多、治愈率低，故成为国际一大医学难题，被世界卫生组织认为是不死的癌症。据IDF统计，2017年全球约4.25亿成人患糖尿病，预计到2045年，糖尿病患者可能达到6.29亿。每11个人中就有1人患糖尿病，其中90％以上的糖尿病患者为2型糖尿病。胰高血糖素样肽1(glucagon-likepeptide，GLP-1)及其类似物是近年来治疗2型糖尿病的一类新型药物，其能够促进葡萄糖浓度依赖性的胰岛素分泌，实现胰岛β细胞的保护和α细胞的调节作用，从而达到稳定的降糖效果，不易诱发低血糖。
其中，利拉鲁肽和索马鲁肽是用于治疗2型糖尿病的每日给药一次的人胰高糖素样肽-1(GLP-1)类似物，其是一种通过基因重组技术生产的GLP-1类似物，与人体GLP-1具有97％的序列同源性。它能够根据体内葡萄糖水平高低，按需促进胰岛β细胞分泌胰岛素，发挥降糖作用。由丹麦诺和诺德公司研制开发的利拉鲁肽注射剂和索马鲁肽已被证实在治疗II型糖尿病方面具有良好效果，是较理想的药物。索马鲁肽为长效GLP-1类似物，每周只需注射一次。
然而，在现有的技术中，利拉鲁肽和索马鲁肽的制备方法至少存在收率低、成本高的问题。譬如中国专利CN104745597A、CN106434717A、CN104592381A等公开的制备方法中所采用的大肠杆菌表达都是用融合蛋白表达技术，是通过肠激酶酶切获得的，这些方法的收率低，而且需要引入额外的肠激酶，增加了制备成本。又譬如中国专利CN102875665、CN103275208、CN103304660、CN108203462A等公开了利拉鲁肽的化学制备方法，由于这些化学合成方法需要用到大量的有机溶剂，故会对环境造成较严重的污染，而且在化学合成中副反应较多，收率低；另外，由于这些方法中所使用的原料氨基酸成本较高，故增加了整体的制备成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胰高血糖素样肽-1类似物的制备方法以及用于该制备方法的胰高血糖素样肽-1类似物的编码基因、表达载体和宿主细胞，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
一种胰高血糖素样肽-1类似物的编码基因，其中，所述的胰高血糖素样肽-1类似物为利拉鲁肽中间肽或索马鲁肽中间肽；所述利拉鲁肽中间肽的编码基因的序列如序列表中SEQ ID No：2所示；所述索马鲁肽中间肽的编码基因的序列如序列表中SEQ ID No：7所示。
本发明实施例还提供一种含有上述胰高血糖素样肽-1类似物的编码基因的表达载体。
优选的，所述的表达载体是通过将大肠杆菌碱性磷酸酶启动子(phoA promoter)、大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽(STII signal peptide)与所述胰高血糖素样肽-1类似物的编码基因依次连在一起，并克隆至质粒载体pBR322中得到的。
优选的，所述表达载体的制备方法包括以下步骤：先用限制内切酶PstI与EcoRI将质粒载体pBR322进行酶切，去除800-1000bp的片段；接着，将剩下的大片段与大肠杆菌碱性磷酸酶启动子、大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽和所述胰高血糖素样肽-1类似物的编码基因用T4-DNA连接酶连接成一个完整的环状表达操纵子，得到所述的表达载体。
优选的，所述大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的序列如序列表中SEQ ID No：3所示。
优选的，所述大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽的序列如序列表中SEQ ID No：4所示。
本发明实施例还提供一种包含上述表达载体的宿主细胞。
优选的，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞。
本发明实施例还提供一种胰高血糖素样肽-1类似物的制备方法，其包括以下步骤：将上述的宿主细胞进行表达和分泌，即可得到所述胰高血糖素样肽-1类似物。
与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：
本发明实施例通过选择使用大肠杆菌碱性磷酸酶启动子调控下游基因转录，同时通过优化改造的利拉鲁肽中间肽或索马鲁肽中间肽的编码基因，突变掉其中的大肠杆菌稀有密码子并尽可能避免形成二级结构，以及通过利用大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽引导利拉鲁肽中间肽或索马鲁肽中间肽的分泌表达。经实验证明，经过优化过密码子的利拉鲁肽中间肽和索马鲁肽中间肽能分泌至培养基中，其表达量较高。本发明实施例通过以上述启动子、信号肽组合作为表达调控元件，能够使重组利拉鲁肽中间肽或索马鲁肽中间肽在大肠杆菌中实现高效的分泌表达，其分泌表达量较高。所以，本发明实施例提供的利拉鲁肽中间肽或索马鲁肽中间肽的制备方法具有工艺简单易行，步骤操作简单，周期短，重复性高，收率较高且稳定，制备成本较低廉等优点，适合进行大规模的生产制备。
附图说明
图1是质粒载体pBR322的图谱。
图2是质粒载体pBR322酶切后的图谱。
图3是表达载体pPT-利拉鲁肽酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳结果照片(其中1为DNAmarker；2.为EcoRI和PSTI酶切产物；3为EcoRI酶切产物)。
图4是制备表达载体pPT-利拉鲁肽的过程示意图。
图5是表达载体pPT-利拉鲁肽的图谱。
图6是制备表达载体pPT-索马鲁肽的过程示意图。
图7是表达载体pPT-索马鲁肽的图谱。
图8是pPT-利拉鲁肽工程菌摇瓶实验SDS-PAGE电泳结果照片(其中1为DNAmarker；2-7为利拉鲁肽)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
该实施例提供了一种利拉鲁肽中间肽的编码基因，具体的，该编码基因是以天然的GLP-1编码序列(如序列表中SEQ ID No：1所示)为基础，然后根据大肠杆菌密码子偏爱性，兼顾转录后mRNA的二级结构，AT，GC含量接近且分布均匀的特点进行设计的。其设计的利拉鲁肽中间肽的编码基因的寡核苷酸序列为：5′CACGCTGAAGGTACCTTCACCTCTGACGTTTCTTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCTAAAGAATTCATCGCTTGGCTGGTTCGTGGTCGTGGTTAA3′(如序列表中SEQ ID No：2所示)。
实施例2
该实施例提供了一种索马鲁肽中间肽的编码基因，具体的，该编码基因是以天然的GLP-1编码序列(如序列表中SEQ ID No：1所示)为基础，然后根据大肠杆菌密码子偏爱性，兼顾转录后mRNA的二级结构，AT，GC含量接近且分布均匀的特点进行设计的。其设计的索马鲁肽中间肽的编码基因的寡核苷酸序列为：5′GAAGGTACCTTCACCTCTGACGTTTCTTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCTAAAGAATTCATCGCTTGGCTGGTTCGTGGTCGTGGTTAA3′(如序列表中SEQ IDNo：7所示)。
实施例3
该实施例提供了一种用于制备利拉鲁肽中间肽的表达载体，具体的，该表达载体的制备方法包括如下步骤：
(1)先合成或从其他已知载体上扩增大肠杆菌碱性磷酸酶启动子，其中大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的编码序列如序列表中SEQ ID No：3所示；并在大肠杆菌碱性磷酸酶启动子编码序列的5′端和3′端分别引入PSTI和XbaI限制酶切位点，得到含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的PCR片段或人工合成的基因。
(2)将天然的大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽的编码序列：ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCA(如序列表中SEQ ID No：4所示)与上述实施例1得到的利拉鲁肽中间肽的编码基因序列合并合成大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽加重组利拉鲁肽中间肽的串联编码序列，并在其5′端设计XbaI限制性酶切位点和引入SD序列，在3′端设计引入EcoRI酶切位点，得到大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽和利拉鲁肽中间肽的串联基因(STII-利拉鲁肽)，其具体的序列如下：TCTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCACACGCTGAAGGTACCTTCACCTCTGACGTTTCTTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCTAAAGAATTCATCGCTTGGCTGGTTCGTGGTCGTGGTTAATAAGAATTC3′(如序列表中SEQ ID No：5所示)。
(3)参照附图4，将原始质粒载体pBR322(其图谱如附图1所示)用限制性内切酶PstI与EcoRI进行酶切，去除约900bp的片段，胶回收得到的剩下的大片段(其图谱如附图2所示)，备用；接着，用限制性内切酶PSTI和XbaI处理上述含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的PCR片段或人工合成的基因，胶回收含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的片段；然后，用限制性内切酶XbaI和EcoRI处理上述人工合成的大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽和利拉鲁肽中间肽的串联基因，胶回收含热稳定肠毒素II信号肽和利拉鲁肽中间肽的串联基因片段；再接着，将上述胶回收剩下的大片段、含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的片段以及含热稳定肠毒素II信号肽和利拉鲁肽中间肽的串联基因片段按1∶1∶1的等摩尔比进行混合，并加入T4-DNA连接酶，放置在4℃的温度条件下过夜，得到混合物，混合物中质粒载体pBR322剩下的大片段、含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的片段以及含热稳定肠毒素II信号肽和利拉鲁肽中间肽的串联基因片段便可依次连接形成一个完整的环形表达操纵子，其序列如序列表中SEQID No：6所示。
(4)将上述得到混合物转化DH5α感受态细胞，然后挑选转化子，提质粒，用限制性内切酶EcoRI、PSTI进行酶切鉴定，其结果见附图3。结果表明用EcoRI能切出约600bp的片段，与预计的一致。最后，将测序正确的质粒进行保存，即可得到用于制备利拉鲁肽中间肽的表达载体，该表达载体命名为pPT-利拉鲁肽(其图谱如附图5所示)。
实施例4
该实施例提供了一种用于制备利拉鲁肽中间肽的宿主细胞以及一种利拉鲁肽中间肽的制备方法，具体的，先将上述实施例3得到的表达载体转化大肠杆菌空宿主W3110(W3110为BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心的市售产品)，得到用于制备利拉鲁肽中间肽的宿主细胞；接着，将宿主细胞涂在含有浓度为5μg/ml的四环素抗性基因的LB琼脂平板上，并挑选6个得到的转化子接种于pH为7.2的FA培养基中，得到pPT-利拉鲁肽工程菌，其中FA培养基的成分包括：质量分数为0.1％葡萄糖、质量分数为1.5％酸水解酪蛋白、质量分数为0.1％酵母抽提物、质量分数为0.04％MgSO4、质量分数为0.5％的(NH4)2SO4、质量分数为0.4％的KCl以及摩尔浓度为0.12mol/L的三乙醇胺；然后将pPT-利拉鲁肽工程菌在37℃条件下过夜摇瓶培养24小时后，用SDS-PAGE电泳鉴定其表达结果，结果如附图8所示，利拉鲁肽中间肽可以分泌至培养基中，其表达量约为0.6mg/ml。
实施例5
该实施例提供了一种用于制备索马鲁肽中间肽的表达载体，具体的，该表达载体的制备方法包括如下步骤：
(2)先合成或从其他已知载体上扩增大肠杆菌碱性磷酸酶启动子，其中大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的编码序列如序列表中SEQ ID No：3所示；并在大肠杆菌碱性磷酸酶启动子编码序列的5′端和3′端分别引入PSTI和XbaI限制酶切位点，得到含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的PCR片段或人工合成的基因。
(2)将天然的大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽的编码序列：ATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCA(如序列表中SEQ ID No：4所示)与上述实施例2得到的索马鲁肽中间肽的编码基因序列合并合成大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽加重组索马鲁肽中间肽的串联编码序列，并在其5′端设计XbaI限制性酶切位点和引入SD序列，在3′端设计引入EcoRI酶切位点，得到大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽和索马鲁肽中间肽的串联基因(STII-索马鲁肽)，其具体的序列如下：TCTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAATGCCTATGCAGAAGGTACCTTCACCTCTGACGTTTCTTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCTAAAGAATTCATCGCTTGGCTGGTTCGTGGTCGTGGTTAATAAGAATTC3′(如序列表中SEQ ID No：8所示)。
(3)参照附图6，将原始质粒载体pBR322(其图谱如附图1所示)用限制性内切酶PstI与EcoRI进行酶切，去除约900bp的片段，胶回收得到的剩下的大片段(其图谱如附图2所示)，备用；接着，用限制性内切酶PSTI和XbaI处理上述含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的PCR片段或人工合成的基因，胶回收含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的片段；然后，用限制性内切酶XbaI和EcoRI处理上述人工合成的大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽和索马鲁肽中间肽的串联基因，胶回收含热稳定肠毒素II信号肽和索马鲁肽中间肽的串联基因片段；再接着，将上述胶回收剩下的大片段、含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的片段以及含热稳定肠毒素II信号肽和索马鲁肽中间肽的串联基因片段按1∶1∶1的等摩尔比进行混合，并加入T4-DNA连接酶，放置在4℃的温度条件下过夜，得到混合物，混合物中质粒载体pBR322剩下的大片段、含大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的片段以及含热稳定肠毒素II信号肽和索马鲁肽中间肽的串联基因片段便可依次连接形成一个完整的环形表达操纵子，其序列如序列表中SEQID No：9所示。
(4)将上述得到混合物转化DH5α感受态细胞，然后挑选转化子，提质粒，用限制性内切酶EcoRI、PSTI进行酶切鉴定。结果表明用EcoRI能切出约600bp的片段，与预计的一致。最后，将测序正确的质粒进行保存，即可得到用于制备索马鲁肽中间肽的表达载体，该表达载体命名为pPT-索马鲁肽(其图谱如附图7所示)。
实施例6
该实施例提供了一种用于制备索马鲁肽中间肽的宿主细胞以及一种索马鲁肽中间肽的制备方法，具体的，先将上述实施例5得到的表达载体转化大肠杆菌空宿主W3110(W3110为BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心的市售产品)，得到用于制备索马鲁肽中间肽的宿主细胞；接着，将宿主细胞涂在含有浓度为5μg/ml的四环素抗性基因的LB琼脂平板上，并挑选6个得到的转化子接种于pH为7.2的FA培养基中，得到pPT-索马鲁肽工程菌，其中FA培养基的成分包括：质量分数为0.1％葡萄糖、质量分数为1.5％酸水解酪蛋白、质量分数为0.1％酵母抽提物、质量分数为0.04％MgSO4、质量分数为0.5％的(NH4)2SO4、质量分数为0.4％的KCl以及摩尔浓度为0.12mol/L的三乙醇胺；然后将pPT-索马鲁肽工程菌在37℃条件下过夜摇瓶培养24小时后，用SDS-PAGE电泳鉴定其表达结果，结果表明索马鲁肽中间肽可以分泌至培养基中，其表达量约为0.6mg/ml。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (9)
1.一种胰高血糖素样肽-1类似物的编码基因，所述的胰高血糖素样肽-1类似物为利拉鲁肽中间肽或索马鲁肽中间肽，其特征在于，所述利拉鲁肽中间肽的编码基因的序列如序列表中SEQ ID No：2所示；所述索马鲁肽中间肽的编码基因的序列如序列表中SEQ ID No：7所示。
2.一种含有如权利要求1所述胰高血糖素样肽-1类似物的编码基因的表达载体。
3.根据权利要求2所述的一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体是通过将大肠杆菌碱性磷酸酶启动子、大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽与所述胰高血糖素样肽-1类似物的编码基因依次连在一起，并克隆至质粒载体pBR322中得到的。
4.根据权利要求3所述的一种表达载体，其特征在于，所述表达载体的制备方法包括以下步骤：先用限制内切酶PstI与EcoRI将质粒载体pBR322进行酶切，去除800-1000bp的片段；接着，将剩下的大片段与大肠杆菌碱性磷酸酶启动子、大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽和所述胰高血糖素样肽-1类似物的编码基因用T4-DNA连接酶连接成一个完整的环状表达操纵子，得到所述的表达载体。
5.根据权利要求3或4所述的一种表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌碱性磷酸酶启动子的序列如序列表中SEQ ID No：3所示。
6.根据权利要求3或4所述的一种表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌热稳定肠毒素II信号肽的序列如序列表中SEQ ID No：4所示。
7.一种包含如权利要求2-6中任一项所述的表达载体的宿主细胞。
8.根据权利要求7所述的一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞。
9.一种胰高血糖素样肽-1类似物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将如权利要求7-8任一项所述的宿主细胞进行表达和分泌，得到所述的胰高血糖素样肽-1类似物。
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