CN114836448B

CN114836448B - 一种密码子优化的t4多聚核苷酸激酶的核酸分子及其表达方法

Info

Publication number: CN114836448B
Application number: CN202210546009.7A
Authority: CN
Inventors: 龚晓洁; 赵军; 侯启如; 李志民; 王娟
Original assignee: Annoroad Gene Technology Beijing Co ltd; Beijing Annoroad Medical Laboratory Co ltd; Zhejiang Annoroad Bio Technology Co ltd
Current assignee: Annoroad Gene Technology Beijing Co ltd; Beijing Annoroad Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2022-05-19
Filing date: 2022-05-19
Publication date: 2023-12-05
Anticipated expiration: 2042-05-19
Also published as: CN114836448A

Abstract

本申请公开了一种编码T4多聚核苷酸激酶的核酸分子，所述核酸分子包括如SEQ ID NO：01所示的核苷酸序列，本申请还公开了一种包含上述核苷酸序列的重组载体和宿主细胞，及其表达方法和所生产的T4多聚核苷酸激酶的用途，通过本申请公开的T4多聚核苷酸激酶的核酸分子为T4多聚核苷酸激酶的产量、纯度和活力提供了技术保障。

Description

一种密码子优化的T4多聚核苷酸激酶的核酸分子及其表达方法

技术领域

本申请涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种密码子优化的T4多聚核苷酸激酶的核酸分子及其表达方法。

背景技术

T4 PNK是由T4噬菌体中pseT基因编码的一种磷酸激酶，兼具5’磷酸化活性和3’去磷酸化活性，能够催化ATP的γ-位磷酸基团转移到寡核苷酸链(dsDNA/ssDNA/RNA)的5’-OH末端和3’-单磷酸核苷上，或者将3’-磷酸基团从寡核苷酸链的3’-磷酸末端移除^[1]。因此，T4 PNK的应用场景相当广泛，如催化DNA或RNA末端的磷酸化状态以备下游连接反应，或用于探针、引物标记体系，在测序、分子杂交领域都具有不可或缺的作用。于是，构建稳定、高效的T4 PNK重组表达体系是分子生物学产品市场的必然选择，但在目前普遍适用的pET表达系统中，T4 PNK的重组产物主要以包涵体形式存在，因此严重限制了T4 PNK的生产和应用；并且T4 PNK的高等电点对重组蛋白的分离纯化和体外存储构成了制约因素。在此基础上，攻克T4 PNK在pET系统中的表达困境和提纯工艺成为其质量更新和产品性能提升的有效路径。

发明内容

本申请结合T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)的表达难点，引进SUMO标签和密码子优化技术，构建可在pET系统中高效表达的细胞株，并且复配相应的缓冲体系和纯化策略，为T4PNK的产量、纯度和活力提供了技术保障。

具体的，本申请采用如下技术方案，

1、一种编码T4多聚核苷酸激酶的核酸分子，所述核酸分子包括如SEQ ID NO：01所示的核苷酸序列。

2、一种重组载体，所述重组载体包含如项1所述的核苷酸序列。

3、根据项2所述的重组载体，进一步包含SUMO基因，优选SUMO基因位于SEQ ID NO：01所示的核苷酸序列的5’端。

4、根据项2或3所述的重组载体，所述重组载体为原核细胞重组表达载体。

5、根据项4所述的重组载体，其中质粒骨架为选自pET系列载体中的任意一种，优选的，所述原核细胞重组表达载体为pET28b。

6、一种宿主细胞，所述宿主细胞包含项2～5中任一所述的重组载体。

7、根据项6所述的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌。

8、一种T4多聚核苷酸激酶，其是由SEQ ID NO：01所示的核苷酸序列编码的。

9、根据项8所述的酶，其是利用项2～4中任一项所述的重组载体或项5或6所述的宿主细胞生产的。

10、一种生产T4多聚核苷酸激酶的方法，包括如下步骤：

利用项6或7所述的宿主细胞来生产T4多聚核苷酸激酶。

11、根据项10所述的方法，所述生产过程中，还包括：

通过调节诱导剂的浓度和调节提取液的pH值进行T4多聚核苷酸激酶提取的步骤；

优选，所述诱导剂为IPTG，所述提取液为30mMTris-HCl(pH7.5)，500mMNaCl；

优选，所述诱导剂的浓度为1mM，提取液的pH为7.5。

12、项7或8所述的T4多聚核苷酸激酶在寡核苷酸、DNA或RNA的5’末端标记方面；制备Southern、Northern、EMSA探针方面；凝胶电泳的marker，DNA测序引物，PCR引物方面；使寡核苷酸、DNA或RNA的5’端磷酸化、催化3’磷酸化的单核苷酸的5’磷酸化方面的应用。

发明效果

本申请结合T4多聚核苷酸激酶的表达难点，引进SUMO标签和密码子优化技术，构建可在pET系统中高效表达的细胞株，并且复配相应的缓冲体系和纯化策略，为T4多聚核苷酸激酶的产量、纯度和活力提供了技术保障。

附图说明

附图用于更好地理解本申请，不构成对本申请的不当限定。其中：

图1为野生型WT-PNK和突变型OPT-PNK的核苷酸序列对比；

图2为载体pET28b-WT和载体pET28b-SUMO-OPT的设计示意图；

图3a为载体pET28b-WT(T4 PNK)表达体系在不同pH值的调节液下的可溶性鉴定；

图3b为载体pET28b-WT(T4 PNK)表达体系在不同诱导剂的浓度下的可溶性鉴定；

图4为载体pET28b-SUMO-OPT表达体系在提取液pH为7.5和诱导剂浓度为1mM下的可溶性鉴定；

图5为载体pET28b-SUMO-OPT在二代建库中的功能评价。

具体实施方式

以下对本申请的示范性实施例做出说明，其中包括本申请实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。

如本文所使用的，术语“基因”或“编码序列”是指编码基因产物的体外或体内的核苷酸序列。在一些情况下，基因由或基本上由编码序列组成，即，编码基因产物的序列。在其它情况中，基因包括附加的非编码序列。例如，基因可以或可以不包括编码区之前和之后的区域，例如5’非翻译(5’UTR)或“前导”序列和3’UTR或“非转录尾区(trailer)”序列，以及各个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。

如本文所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链。

如本文所使用的，术语“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。此外，本申请中使用的“基因”也表示相同的含义。

如本文所使用的，术语“载体”用于描述可以被工程化以含有可以在宿主细胞中扩增的克隆的一种多核苷酸或多种多核苷酸的核酸分子。载体包括但不限于：单链，双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个游离末端，没有游离末端(例如环状)的核酸分子；包含DNA，RNA或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多核苷酸种类。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以插入额外DNA片段的环状双链DNA环，例如通过标准分子克隆技术。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的那些基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。重组表达载体可以包含适于在宿主细胞中表达核酸的形式的本发明的核酸，这意味着重组表达载体包括一种或多种调节元件，其可以基于用于表达的、可以与待表达的核酸序列可操作地连接的宿主细胞来选择。

如本文所使用的，密码子优化是指在维持天然氨基酸序列的同时，通过用目的宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子来修饰核酸序列以在该宿主细胞中增强表达的过程。多种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏倚。密码子偏倚(生物体之间密码子选用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而信使RNA(mRNA)的翻译效率继而被认为尤其取决于所翻译密码子的特性和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。所选择tRNA在细胞中的优势通常反映了肽合成中最频繁使用的密码子。因此，可基于密码子优化来定制基因以在给定生物体中进行最佳基因表达。

密码子优化可以例如通过将一种物种的核苷酸序列转化为不同物种的遗传序列来实现。优化的密码子有助于实现更快的翻译速度和更高的准确性。由于这些因素，预计在高表达基因中翻译选择会更强。然而，尽管本文考虑了使用优化的密码子来表达公开的蛋白质，但是本文考虑了用于编码任何公开的蛋白质的核酸的所有可能的密码子。

本申请提供了一种编码T4多聚核苷酸激酶的核酸分子，所述核酸分子包括如SEQID NO：01所示的核苷酸序列。

其中SEQ ID NO：01为：

ATGAAAAAGATAATACTAACAATTGGATGTCCAGGCAGCGGTAAATCCACCTGGGCACGTGAATTTATCGCGAAGAACCCGGGCTTCTATAACATCAACCGCGACGACTACCGCCAGTCGATCATGGCACATGAAGAACGTGACGAATACAAATACACCAAAAAGAAAGAGGGCATCGTGACCGGTATGCAATTTGACACGGCCAAGTCCATTCTGTACGGCGGTGACAGCGTTAAGGGTGTTATCATCTCGGATACCAATCTGAATCCGGAGCGCCGTTTGGCTTGGGAAACCTTTGCAAAGGAGTACGGCTGGAAAGTTGAGCACAAAGTCTTCGACGTCCCGTGGACCGAATTGGTTAAGCGTAATTCCAAGCGCGGTACGAAGGCGGTGCCGATTGATGTCCTGCGTAGCATGTACAAGTCTATGCGTGAATATCTGGGTCTGCCGGTTTATAACGGTACTCCGGGCAAACCGAAAGCGGTTATTTTCGACGTTGATGGTACCCTGGCTAAGATGAACGGCCGTGGTCCGTATGATCTCGAAAAATGTGATACCGATGTGATCAACCCGATGGTTGTCGAGTTAAGCAAAATGTATGCTCTGATGGGTTATCAGATTGTTGTGGTGAGCGGCAGAGAATCTGGTACGAAAGAGGATCCGACTAAGTACTACCGCATGACCCGTAAATGGGTTGAGGACATCGCGGGCGTGCCGTTGGTTATGCAGTGCCAACGCGAGCAGGGTGACACGCGTAAAGATGACGTGGTGAAAGAAGAGATCTTCTGGAAGCACATTGCCCCTCATTTTGACGTGAAGCTGGCGATTGATGATCGTACCCAAGTCGTAGAGATGTGGCGTCGCATTGGTGTGGAGTGCTGGCAGGTGGCGAGCGGCGACTTCTAA

本申请还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含SEQ ID NO：01的核苷酸序列。

在一个优选的实施方式中，所述重组载体进一步包含SUMO基因，所述SUNO基因的序列如SEQ ID NO：02所示，其中SEQ ID NO：02为：

ATGTCCGATTCCGAGGTGAACCAGGAAGCGAAACCGGAAGTGAAACCGGAAGTCAAGCCAGAAACTCACATTAACCTGAAAGTGTCCGACGGCTCTAGCGAAATCTTCTTCAAAATCAAAAAGACTACTCCGCTGCGTCGCCTGATGGAAGCTTTCGCGAAACGTCAGGGTAAAGAAATGGACTCCCTGCGTTTCCTGTACGACGGTATCCGCATCCAGGCGGACCAGACCCCGGAAGATCTGGATATGGAAGACAACGACATTATCGAAGCACACCGCGAACAGATCGGCGGT

在一个优选的实施方式中，SUMO基因位于SEQ ID NO：01所示的核苷酸序列的5’端。

在一个优选的实施方式中，所述重组表达载体为原核细胞重组表达载体，包括但不限于pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-19b、pET-28b、pET-29b、pET-30b、pET-31b、pET-32a、pET-33b、pET-34b、pET-40b、pET-41b，在本申请进一步优选的实施方式中，所述表达载体为pET-28b。

本发明还提供一种宿主细胞，其包含上述的表达载体，即包含SEQ ID NO.01所示的核苷酸序列的表达载体。所述宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌，在一个优选的实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

本申请进一步提供一种T4多聚核苷酸激酶，其是由SEQ ID NO：01所示的核苷酸序列编码的。

在一种优选的实施方式中，所述T4多聚核苷酸激酶由包含SEQ ID NO：01的核苷酸序列的重组载体生产；

在一个优选的实施方式中，所述T4多聚核苷酸激酶由包含SEQ ID NO：01的核苷酸序列的原核细胞重组载体生产；

在一个优选的实施方式中，所述T4多聚核苷酸激酶由包含SEQ ID NO：01的核苷酸序列的pET载体系列中的任意一种载体生产；

在一个优选的实施方式中，所述T4多聚核苷酸激酶由包含SEQ ID NO：01的核苷酸序列的pET28b载体生产；

在一个优选的实施方式中，所述T4多聚核苷酸激酶由包含SEQ ID NO：01的核苷酸序列的宿主细胞生产；

在一个优选的实施方式中，所述T4多聚核苷酸激酶由包含SEQ ID NO：01的核苷酸序列的大肠杆菌生产；

本申请进一步提供了一种生产T4多聚核苷酸激酶的方法，所述生产方法是利用如上所述的任一一种宿主细胞进行生产，优选为使用大肠杆菌进行生产。

在一个优选的生产T4多聚核苷酸激酶的方法中，采用调节诱导剂对T4多聚核苷酸激酶进行提取，进一步优选的方法中，通过调节诱导剂的浓度和调节提取液的pH值达到一个合适的值，然后对T4多聚核苷酸激酶进行提取。

在进一步优选的实施方式中，所述诱导剂为IPTG，所述提取液为30mMTris-HCl(pH7.5)，500mMNaCl。

在进一步优选的实施方式中，所述诱导剂的浓度为1mM，提取液的pH为7.5。

本申请所提供的T4多聚核苷酸激酶，具有多种用途，包括但不限于在寡核苷酸、DNA或RNA的5’末端标记方面；制备Southern、Northern、EMSA探针方面；凝胶电泳的marker，DNA测序引物，PCR引物方面；使寡核苷酸、DNA或RNA的5’端磷酸化、催化3’磷酸化的单核苷酸的5’磷酸化方面的应用。

实施例

实施例1密码子优化

以E.coli表达系统的密码子偏好性为基准，综合评估GC含量、密码子平衡、mRNA二级结构、核酸酶剪切位点、反式作用元件结合和酶切位点规避等因素，对源自于T4噬菌体的T4 PNK基因进行全长核苷酸序列优化，优化后序列命名为OPT-PNK，与未优化序列(WT-PNK)比对结果见图1。

WT-PNK全长906bp，编码301个氨基酸，序列表如下SEQ ID NO：03所示，其中SEQ IDNO：03为：

ATGAAAAAGATTATTTTGACTATTGGCTGTCCTGGTTCTGGTAAGAGTACTTGGGCTCGTGAATTTATTGCTAAGAATCCCGGGTTTTATAATATCAATCGTGATGACTATCGCCAATCTATTATGGCGCATGAAGAACGCGATGAGTACAAGTATACCAAAAAGAAAGAAGGTATCGTAACTGGTATGCAGTTTGATACAGCTAAAAGTATTCTGTACGGTGGCGATTCTGTTAAGGGAGTAATCATTTCAGATACTAACCTGAATCCTGAACGTCGCCTAGCATGGGAAACTTTTGCCAAAGAATACGGCTGGAAAGTTGAACATAAAGTGTTTGATGTTCCTTGGACTGAATTGGTTAAACGTAACTCAAAACGCGGAACTAAAGCAGTACCAATTGATGTTTTACGTTCAATGTATAAAAGCATGCGAGAGTATCTCGGTCTTCCAGTATATAATGGGACTCCTGGTAAACCAAAAGCAGTTATTTTTGATGTTGATGGTACACTAGCTAAAATGAATGGTCGTGGTCCTTATGACCTTGAAAAATGCGATACCGATGTTATCAATCCTATGGTTGTTGAACTGTCTAAGATGTATGCTCTTATGGGTTATCAAATCGTAGTCGTTTCAGGTCGTGAAAGTGGAACTAAAGAAGACCCAACGAAATATTATCGTATGACCCGTAAATGGGTTGAGGACATTGCTGGCGTTCCATTAGTTATGCAATGTCAGCGCGAACAAGGCGATACCCGTAAAGACGATGTAGTTAAAGAAGAAATTTTCTGGAAACACATTGCACCGCATTTTGACGTGAAATTAGCTATTGATGACCGAACTCAAGTAGTTGAAATGTGGCGTCGTATCGGTGTTGAATGCTGGCAAGTCGCTTCGGGAGATTTTTAA

本次优化共涉及对180个氨基酸密码子的调整，与原始序列相似度为78％。优化中除针对大肠杆菌偏好性将部分稀缺密码子改换为嗜好密码子，提高了目的基因在宿主中的适应指数；同时对全序列的序列GC含量进行了调整，由39.85％提高至50.44％，增强了核酸序列的稳定性，有益于正调控mRNA翻译蛋白质的效率。

实施例2表达载体构建

2.1设计引物如表1所示，从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组中克隆不含终止密码子的SUMO全长片段，5’端添加NdeⅠ识别位点，3’端添加NheI识别位点；扩增产物测序正确后用NdeⅠ/NheI进行双酶切消化，回收消化后产物，备用；

表1 SUMO标签克隆引物

2.2同时用NdeⅠ/NheI对pET28b进行双酶切消化，回收消化后载体片段；

2.3将双酶切后的载体和SUMO基因进行连接反应，转化DH5α，挑取阳性克隆，培养，提取质粒，酶切和测序验证；在NdeⅠ和NheI序列区间插入了SUMO基因片段的pET28b为下游要使用的目的载体，命名为pET28b-SUMO，备用。

2.4采用基因合成方式合成优化后的T4 PNK基因OPT-PNK，5’端添加SalⅠ识别位点，3’端添加HindⅢ识别位点，双酶切消化后回收目的产物，备用；

2.5同时用SalⅠ/HindⅢ对pET28b-SUMO进行双酶切消化，回收消化后载体片段；

2.6将双酶切后的载体和OPT-PNK片段进行连接反应，转化DH5α，挑取阳性克隆，培养，提取质粒，酶切和测序验证，最终构建正确的载体命名为pET28b-SUMO-OPT，备用；

2.7以同样的方式将野生型WT-PNK构建至不含SUMO标签的pET28b载体中，命名为pET28b-WT，载体pET28b-WT和载体pET28b-SUMO-OPT示意图如图2所示。

实施例3重组蛋白诱导表达

各取20ng pET28b-WT和pET28b-SUMO-OPT质粒，转化BL21(DE3)感受态细胞，热激，复苏，涂布含50μg/ml卡纳霉素平板，37℃倒置暗培养过夜；

挑取转化子，接种至15ml含50μg/ml卡纳霉素的LB液体培养基，37℃，250rpm振荡培养至OD600≈1.0；

1:200接种至3L SB培养基，37℃，250rpm振荡培养至OD600≈1.0，加入IPTG(终浓度1mM)，12℃，200rpm诱导22hrs，收集菌体，-80℃暂存。

实施例4蛋白质提纯

加入裂解缓冲液悬浮菌体，超声破碎后4℃,10000rpm离心60min，分别收集上清(S)和沉淀(P)，制样，SDS-PAGE检测；

取含有目的蛋白的上清液和His-Ni柱孵育20min，随后进行咪唑浓度梯度去除杂质和洗脱目的蛋白，SDS-PAGE检测；

用紫外吸收法测定蛋白质浓度，取1μl酶样，测定A280读值；

取2μg酶样进行SDS-PAGE电泳，通过条带灰度值计算纯度。

实施例5重组产物可溶性鉴定

T4 PNK的等电点pI＝8.7，偏高的等电点对T4 PNK的重组表达和提纯工艺都构成了一定的阻碍，因此对于野生型重组表达菌株，本申请采取pH梯度递增的方法从重组菌株中提取pET28b-WT的表达产物，期望通过提取液pH值调整获得一定产量的目的蛋白。产物的预期大小约为36KDa，摸索从pH5.8-pH7.5的梯度范围内T4 PNK产物的溶解性能，发现在各个pH浓度条件下产物主要都以包涵体的形式存在，约占总蛋白的70％以上，上清中仅有痕量的目标产物(图3a)。

在此基础上，本申请又摸索了诱导剂IPTG的浓度对产物可溶性的影响，发现IPTG浓度在0.1-1mM范围内时所产生的目的蛋白也主要是包涵体(图3b)。

由此，基本可以确定仅通过调节提取液pH值和诱导剂浓度不能改变pET28b-WT在pET系统中的产物溶解性能。

本申请采用同样的调节方式从重组菌株中提取pET28b-SUMO-OPT的表达产物，将IPTG浓度设定为1mM，提取液pH为7.5，对优化和改造后的表达载体进行诱导和提取时，发现目标产物的水溶性显著改善。SDS-PAGE显示改造后重组蛋白的大小约为48KDa，与预期一致，目标蛋白主要富集在上清液里，沉淀中仅有少量残留；亲和层析发现咪唑浓度在100-250mM区间时，目的蛋白可被大量洗脱下来，如图4所示，本申请的优化后的重组载体解决了T4 PNK在pET表达系统中可溶性表达的问题，因此，改造后的载体实现了T4 PNK在pET表达系统中高效表达的预期目标。

实施例6酶功能测试

以超声打断的小片段DNA为模板，加入末修酶和OPT-PNK，37℃，20min；

加入T4 DNA ligase和接头，20℃，30min，回收连接产物；

测定产物浓度，以市售NEB T4 PNK(#M0201V)为对照标定本法表达纯化的T4 PNK活性。

浓度和纯度分析结果见表2，按本法制备的OPT-PNK重组蛋白纯度可达95％以上，3L SB培养基诱导物约可产酶200mg。

表2纯度和产量分析

纯度	浓度	体积	总产酶量
				(95.5±0.4)％	(4±0.2)μg/μL	50ml	200mg

采用下一代测序建库方案检测T4 PNK重组蛋白的功能，与NEB T4 PNK建库后dsDNA出库浓度相比，本申请表达纯化的OPT-PNK对体系中小片段的磷酸化效率完全满足建库需求，如图5所示，可以替代已商品化的酶用在建库体系中。

尽管以上结合对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护之列。

序列表

<110> 安诺优达基因科技（北京）有限公司

北京安诺优达医学检验实验室有限公司

<120> 一种密码子优化的T4多聚核苷酸激酶的核酸分子及其表达方法

<130> PF02131

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 906

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 1

atgaaaaaga taatactaac aattggatgt ccaggcagcg gtaaatccac ctgggcacgt 60

gaatttatcg cgaagaaccc gggcttctat aacatcaacc gcgacgacta ccgccagtcg 120

atcatggcac atgaagaacg tgacgaatac aaatacacca aaaagaaaga gggcatcgtg 180

accggtatgc aatttgacac ggccaagtcc attctgtacg gcggtgacag cgttaagggt 240

gttatcatct cggataccaa tctgaatccg gagcgccgtt tggcttggga aacctttgca 300

aaggagtacg gctggaaagt tgagcacaaa gtcttcgacg tcccgtggac cgaattggtt 360

aagcgtaatt ccaagcgcgg tacgaaggcg gtgccgattg atgtcctgcg tagcatgtac 420

aagtctatgc gtgaatatct gggtctgccg gtttataacg gtactccggg caaaccgaaa 480

gcggttattt tcgacgttga tggtaccctg gctaagatga acggccgtgg tccgtatgat 540

ctcgaaaaat gtgataccga tgtgatcaac ccgatggttg tcgagttaag caaaatgtat 600

gctctgatgg gttatcagat tgttgtggtg agcggcagag aatctggtac gaaagaggat 660

ccgactaagt actaccgcat gacccgtaaa tgggttgagg acatcgcggg cgtgccgttg 720

gttatgcagt gccaacgcga gcagggtgac acgcgtaaag atgacgtggt gaaagaagag 780

atcttctgga agcacattgc ccctcatttt gacgtgaagc tggcgattga tgatcgtacc 840

caagtcgtag agatgtggcg tcgcattggt gtggagtgct ggcaggtggc gagcggcgac 900

ttctaa 906

<210> 2

<211> 294

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 2

atgtccgatt ccgaggtgaa ccaggaagcg aaaccggaag tgaaaccgga agtcaagcca 60

gaaactcaca ttaacctgaa agtgtccgac ggctctagcg aaatcttctt caaaatcaaa 120

aagactactc cgctgcgtcg cctgatggaa gctttcgcga aacgtcaggg taaagaaatg 180

gactccctgc gtttcctgta cgacggtatc cgcatccagg cggaccagac cccggaagat 240

ctggatatgg aagacaacga cattatcgaa gcacaccgcg aacagatcgg cggt 294

<210> 3

<211> 906

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：人工合成序列

<400> 3

atgaaaaaga ttattttgac tattggctgt cctggttctg gtaagagtac ttgggctcgt 60

gaatttattg ctaagaatcc cgggttttat aatatcaatc gtgatgacta tcgccaatct 120

attatggcgc atgaagaacg cgatgagtac aagtatacca aaaagaaaga aggtatcgta 180

actggtatgc agtttgatac agctaaaagt attctgtacg gtggcgattc tgttaaggga 240

gtaatcattt cagatactaa cctgaatcct gaacgtcgcc tagcatggga aacttttgcc 300

aaagaatacg gctggaaagt tgaacataaa gtgtttgatg ttccttggac tgaattggtt 360

aaacgtaact caaaacgcgg aactaaagca gtaccaattg atgttttacg ttcaatgtat 420

aaaagcatgc gagagtatct cggtcttcca gtatataatg ggactcctgg taaaccaaaa 480

gcagttattt ttgatgttga tggtacacta gctaaaatga atggtcgtgg tccttatgac 540

cttgaaaaat gcgataccga tgttatcaat cctatggttg ttgaactgtc taagatgtat 600

gctcttatgg gttatcaaat cgtagtcgtt tcaggtcgtg aaagtggaac taaagaagac 660

ccaacgaaat attatcgtat gacccgtaaa tgggttgagg acattgctgg cgttccatta 720

gttatgcaat gtcagcgcga acaaggcgat acccgtaaag acgatgtagt taaagaagaa 780

attttctgga aacacattgc accgcatttt gacgtgaaat tagctattga tgaccgaact 840

caagtagttg aaatgtggcg tcgtatcggt gttgaatgct ggcaagtcgc ttcgggagat 900

ttttaa 906

Claims

1.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SUMO基因，所述SUMO基因位于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的5’端，所述重组表达载体为pET28b-SUMO-OPT。

2.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1所述的重组载体。

3.根据权利要求2所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。

4.一种生产T4多聚核苷酸激酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

利用权利要求2或3所述的宿主细胞生产T4多聚核苷酸激酶。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述生产过程中，还包括：

通过调节诱导剂的浓度和调节提取液的pH值进行T4多聚核苷酸激酶提取的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述诱导剂为IPTG，所述提取液是pH为7.5的30mM Tris-HCl，500mM NaCl。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述诱导剂的浓度为1mM。