CN117264923A - 一种Pfu DNA聚合酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种Pfu DNA聚合酶突变体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117264923A CN117264923A CN202311320456.1A CN202311320456A CN117264923A CN 117264923 A CN117264923 A CN 117264923A CN 202311320456 A CN202311320456 A CN 202311320456A CN 117264923 A CN117264923 A CN 117264923A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna polymerase
- pfu dna
- polymerase mutant
- nucleotide sequence
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 title claims abstract description 84
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 101000927325 Sulfurisphaera tokodaii (strain DSM 16993 / JCM 10545 / NBRC 100140 / 7) DNA-binding protein 7 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 14
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 11
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 21
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 20
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 abstract description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 abstract description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 230000037048 polymerization activity Effects 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010007100 Pulmonary Surfactant-Associated Protein A Proteins 0.000 description 2
- 102100027773 Pulmonary surfactant-associated protein A2 Human genes 0.000 description 2
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3-(3-oxo-1h-2-benzofuran-1-yl)-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C(F)=CNC(=O)N1C1C2=CC=CC=C2C(=O)O1 LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开一种Pfu DNA聚合酶突变体及其制备方法和应用。本发明首先公开了一种Pfu DNA聚合酶突变体，在野生型Pfu DNA聚合酶的羧基端融合一个dsDNA结合蛋白Sto7和引入多个点突变。本发明进一步公开了上述Pfu DNA聚合酶突变体的制备方法和应用。本发明Pfu DNA聚合酶突变体具有快速扩增能力、长片段PCR持续扩增能力、抗抑制能力以及热稳定能力强的优势，可以应用于各类DNA重组技术领域中的PCR扩增、DNA测序、DNA建库以及样本直扩PCR中。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和酶工程领域。更具体地，涉及一种Pfu DNA聚合酶突变体及其制备方法和应用。
背景技术
Pfu DNA聚合酶来自于激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)，其编码基因全长2328bp，蛋白质分子量为90kDa。Pfu DNA聚合酶包含两个功能：一是5’→3’的核酸聚合活性，能以DNA单链为模板，以dNTP为底物合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链；二是具有3’→5’的外切酶活性，能纠正PCR过程中错误掺入的核苷酸，即具有高保真性。Pfu DNA聚合酶主要应用于高保真扩增DNA、长片段PCR扩增以及复杂模板扩增，在分子诊断以及法医学鉴定等领域发挥着重要的作用。但是野生型Pfu DNA聚合酶具有延伸速率慢、延伸能力差、抗抑制能力弱等缺陷。
因此，需要对野生型Pfu DNA聚合酶进行改造得到一种Pfu DNA聚合酶突变体，以解决上述问题。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种能快速扩增、长片段PCR持续扩增、抗抑制能力和热稳定能力强的Pfu DNA聚合酶突变体。
本发明的另一个目的在于提供上述Pfu DNA聚合酶突变体的制备方法和应用。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明首先提供了一种Pfu DNA聚合酶突变体，所述Pfu DNA聚合酶突变体在野生型Pfu DNA聚合酶的羧基端融合一个dsDNA结合蛋白Sto7和引入多个点突变，所述点突变用三联体表示：字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸：M247R、A408S和I478K。
进一步，所述野生型Pfu DNA聚合酶为由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
进一步，所述Pfu DNA聚合酶突变体为由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
编码上述Pfu DNA聚合酶突变体的核苷酸序列也在本发明的保护范围之内。
进一步，所述编码上述Pfu DNA聚合酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
包含上述核苷酸序列的重组表达质粒或重组细胞也在本发明的保护范围之内。
在本发明具体的实施方式中，所述重组表达质粒为pET28a-PfuMut。具体的，所述pET28a-PfuMut是在pET28a的NdeI和BamHI之间插入如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，且保持pET28a其他序列不变获得的。
进一步，所述重组细胞的宿主细胞是改造过的BL21大肠杆菌。在本发明具体的实施方式中，所述宿主细胞为BL21(DE3)感受态细胞。
本发明进一步公开了上述Pfu DNA聚合酶突变体，上述核苷酸序列，或，上述重组表达质粒或重组细胞在如下任一中的应用：
b1)在生物技术领域中的应用；
b2)在DNA重组技术领域中的应用；
b3)在PCR领域中的应用。
进一步，所述应用可以为各类DNA重组技术中的PCR扩增、DNA测序、DNA建库以及样本直扩PCR中。
本发明进一步还公开了上述Pfu DNA聚合酶突变体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
c1)构建包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的重组表达质粒；
c2)将蛋白表达质粒转化进入宿主细胞，诱导表达，获得菌体；
c3)破碎菌体，离心后获得上清，蛋白质沉淀，获得粗蛋白液；
c4)将粗蛋白液纯化、透析后获得Pfu DNA聚合酶突变体。
进一步，所述蛋白质沉淀包括PEI沉淀、硫酸铵沉淀；所述纯化包括Ni柱、Q柱和SP柱纯化。
本发明的有益效果如下：
本发明Pfu DNA聚合酶突变体与野生型的Pfu DNA聚合酶相比，在羧基端融合一个dsDNA结合蛋白Sto7和引入了多个点突变(M247R、A408S和I478K)，该突变体可以在原核宿主进行过表达并通过亲和层析以及离子交换层析纯化获得大量蛋白。本发明Pfu DNA聚合酶突变体具有快速扩增能力、长片段PCR持续扩增能力、抗抑制能力以及热稳定能力强的优势，可以应用于各类DNA重组技术领域中的PCR扩增、DNA测序、DNA建库以及样本直扩PCR中。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明Pfu DNA聚合酶突变体SDS-PAGE胶图。
图2为本发明Pfu DNA聚合酶突变体(Pfu Mut)和野生型Pfu DNA聚合酶(Pfu WT)的快速扩增能力检测电泳图。
图3为本发明Pfu DNA聚合酶突变体(Pfu Mut)和野生型Pfu DNA聚合酶(Pfu WT)的长片段PCR持续扩增能力检测电泳图。
图4为本发明Pfu DNA聚合酶突变体(Pfu Mut)和野生型Pfu DNA聚合酶(Pfu WT)的抗抑制能力检测电泳图。
图5为本发明Pfu DNA聚合酶突变体(Pfu Mut)和野生型Pfu DNA聚合酶(Pfu WT)的热稳定性检测电泳图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1 Pfu DNA聚合酶突变体的设计和构建
1、Pfu DNA聚合酶突变体的设计
为提高野生型Pfu DNA聚合酶的聚合活性，本发明通过在其羧基端融合一个dsDNA结合蛋白Sto7以及引入多个点突变来提高Pfu DNA聚合酶延伸速率、长片段PCR持续扩增、抗抑制能力以及热稳定能力。关于点突变，首先对野生型Pfu DNA聚合酶蛋白结构进行分析，247位氨基酸M与模板/引物3’-OH末端倒数第二个碱基有直接相互作用，因此M247突变为R(即M247R)形成氢键来提高底物结合的稳定性，从而提高聚合酶的聚合活性；进一步对B族DNA聚合酶进行序列比对以及sequence logo分析，将不同于保守序列的A408和I478突变为保守氨基酸S408和K478(即A408S、I478K)。
2、Pfu DNA聚合酶突变体重组表达质粒的构建
全基因合成Pfu DNA聚合酶突变体重组表达质粒pET28a-PfuMut，即在pET28a的NdeI和BamHI之间插入了编码Pfu DNA聚合酶突变体的核苷酸序列，且保持pET28a其他序列不变；所述Pfu DNA聚合酶突变体在野生型Pfu DNA聚合酶(即氨基酸序列SEQ ID NO.3所示)的羧基端融合一个dsDNA结合蛋白Sto7和引入三个点突变M247R、A408S、I478K；具体的，所述Pfu DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，由如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码获得。
实施例2 Pfu DNA聚合酶突变体的诱导表达和纯化
一、将实施例1得到的Pfu DNA聚合酶突变体重组表达质粒转化进入宿主感受态细胞，并诱导表达目的蛋白。
具体步骤如下：
1)取BL21(DE3)感受态细胞冰上融化。
2)取1ul重组表达质粒pET28a-PfuMut加入融化的BL21(DE3)感受态细胞，冰浴30min。
3)冰浴后的感受态细胞放入42℃水浴锅中热激45s，然后冰上放置2min。
4)取500ul LB液体培养基加入到步骤3)得到的细胞中，37℃摇床中220rpm孵育45min。
5)取200ul步骤4)孵育后的细胞涂布在卡那霉素平板上，37℃恒温培养箱静置培养过夜。
6)挑取1个过夜培养卡那霉素平板上的单克隆加入到含有50ug/ml卡那霉素的20ml LB培养基中，放入37℃摇床中220rpm培养7hr。
7)将20ml步骤6)得到的培养物加入到含有50ug/ml卡那霉素的1L LB培养基中，放入37℃摇床中220rpm培养2hr，OD600＝0.6左右时加入200ul 0.5M IPTG，摇床温度和转速调整为25℃，200rpm，过夜诱导表达，时间为15hr左右。
8)将步骤7)诱导表达结束的菌液进行离心收集菌体，8000rpm，15min，4℃，称重菌体重量。
二、通过PEI沉淀、硫酸铵沉淀后，进行Ni柱、Q柱和SP柱等纯化方法，得到纯度较高的Pfu DNA聚合酶突变体。
具体步骤如下：
1、沉淀处理
1)用50ml PBS buffer重悬菌体后离心，12000rpm，10min，4℃，弃上清得到菌体。
2)用80ml lysis buffer重悬菌体，加入终浓度为1mM PMSF。
3)用高压均质机破碎步骤2)加入PMSF的菌体重悬液。
4)将步骤3)破碎液离心，12000rpm，30min，4℃，弃沉淀得上清。
5)上清放入75℃水浴锅中处理30min，之后离心12000rpm，30min，4℃，弃沉淀得上清。
6)上清中加入终浓度为0.3％ PEI进行核酸沉淀，冰浴30min后离心12000rpm，30min，4℃，弃沉淀得上清。
7)上清在搅拌过程中慢慢加入39g硫酸铵粉末，饱和浓度为60％，硫酸铵全部溶解后，4℃冰箱静置2hr进行蛋白沉淀。
8)步骤7)沉淀样品离心，12000rpm，30min，4℃，弃上清得蛋白沉淀。
9)蛋白沉淀用20ml Ni-binding buffer重悬，并用0.45uM滤头过滤，得到过滤后的蛋白样品(粗蛋白液)。
2、Ni柱纯化
1)将5ml Ni预装柱连入AKTA系统，A、B泵分别放入过滤抽气后的Ni-bindingbuffer和Ni-elute buffer，并泵洗AKTA系统。
2)用Ni-binding buffer平衡Ni柱。
3)将过滤后的蛋白样品上样Ni柱。
4)用Ni-elute buffer梯度洗脱目的蛋白(2ml/min流速，30min洗脱时长，0-100％B泵梯度)。
5)收集目标蛋白峰，得到Ni柱洗脱的蛋白样品。
3、Q柱纯化
1)将5ml Q预装柱连入AKTA系统，A、B泵分别放入过滤抽气后的Q-A buffer和Q-Bbuffer，并泵洗AKTA系统。
2)用Q-A buffer平衡Q柱。
3)将Ni柱洗脱的蛋白样品上样Q柱。
4)收集Q柱流穿蛋白峰即为目标蛋白峰，得到Q柱流穿的蛋白样品。
4、SP柱纯化
1)将5ml SP预装柱连入AKTA系统，A、B泵分别放入过滤抽气后的SP-A buffer和SP-B buffer，并泵洗AKTA系统。
2)用SP-A buffer平衡Q柱。
3)将Q柱流穿的蛋白样品上样SP柱。
4)用SP-B buffer梯度洗脱目的蛋白(2ml/min流速，30min洗脱时长，0-100％ B泵梯度)。
5)收集目标蛋白峰，获得蛋白样品。
将蛋白样品透析至Storage Buffer(20mM Tris-HCl(pH 7.5)，100mM KCl，1mMDTT，0.1mM EDTA，50％ Glycerol)，SDS-PAGE胶检测结果如图1所示。从图中可以看出，本实施例得到的蛋白样品的大小为98.7kDa，与预期Pfu DNA聚合酶突变体的大小一致，表明本实施例最终得到的蛋白样品为Pfu DNA聚合酶突变体。进一步，测序验证正确。
实施例3 Pfu DNA聚合酶突变体快速扩增能力
以HeLa gDNA为模板，使用实施例2得到的Pfu DNA聚合酶突变体和野生型Pfu DNA聚合酶蛋白进行PCR扩增，测试其快速扩增能力。设置延伸时间分别为12kb/min和1kb/min，扩增产物为1kb和4.5kb。
其中，PCR扩增的程序如下：
PCR扩增的体系如下：
测试结果如图2所示，与野生型Pfu DNA聚合酶相比，实施例2得到的Pfu DNA聚合酶突变体能以12kb/min的速度扩增1kb和4.5kb的PCR产物，具备了快速扩增能力。
实施例4 Pfu DNA聚合酶突变体长片段PCR持续扩增能力
以质粒为模板，使用实施例2得到的Pfu DNA聚合酶突变体和野生型Pfu DNA聚合酶蛋白进行PCR扩增，测试其长片段PCR持续扩增能力。设置延伸时间分别为12kb/min和1kb/min，扩增产物为10kb和15kb。
其中，PCR扩增的程序如下：
PCR扩增的体系如下：
| 组分 | 体积(ul) |
| 5x Pfu Buffer | 10 |
| 质粒(1ng/ul) | 1 |
| 引物对(10uM) | 2 |
| dNTPs(10mM) | 1 |
| 聚合酶(150ng) | 1 |
| ddH2O | 35 |
测试结果如图3所示，与野生型Pfu DNA聚合酶相比，实施例2得到的Pfu DNA聚合酶突变体能以12kb/min的速度扩增10kb和15kb的PCR产物，具备了持续扩增长片段产物的能力。
实施例5 Pfu DNA聚合酶突变体的抗抑制能力
以人血液为模板，使用实施例2得到的Pfu DNA聚合酶突变体和野生型Pfu DNA聚合酶蛋白进行PCR直扩，测试其抗抑制能力。设置延伸时间分别为12kb/min和1kb/min，扩增产物为408bp和633bp。
其中，PCR直扩的程序如下：
PCR直扩的体系如下：
| 组分 | 体积(ul) |
| 5x Pfu Buffer | 10 |
| 人血液 | 1 |
| 引物对(10uM) | 2 |
| dNTPs(10mM) | 1 |
| 聚合酶(150ng) | 1 |
| ddH2O | 35 |
测试结果如图4所示，与野生型Pfu DNA聚合酶相比，实施例2得到的Pfu DNA聚合酶突变体能以人血液为模板进行直扩，获得408bp和633bp的PCR产物，具备了抗抑制能力。
实施例6 Pfu DNA聚合酶突变体的热稳定性
以HeLa gDNA为模板，使用实施例2得到的Pfu DNA聚合酶突变体和野生型Pfu DNA聚合酶蛋白进行PCR热稳定性测试，延伸时间分别为12kb/min和1kb/min。设置98℃孵育0min，30min和240min三个时间，然后进行PCR扩增，扩增产物为600bp。
其中，PCR扩增的程序如下：
PCR扩增的体系如下：
| 组分 | 体积(ul) |
| 5x Pfu Buffer | 10 |
| HeLa gDNA(10ng/ul) | 1 |
| 引物对(10uM) | 2 |
| dNTPs(10mM) | 1 |
| 聚合酶(150ng) | 1 |
| ddH2O | 35 |
测试结果如图5所示，与野生型Pfu DNA聚合酶相比，实施例2得到的Pfu DNA聚合酶突变体在98℃孵育240min后仍然能够扩增出600bp的PCR产物，具备了更强的热稳定性。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (10)
1.一种Pfu DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述Pfu DNA聚合酶突变体在野生型PfuDNA聚合酶的羧基端融合一个dsDNA结合蛋白Sto7和引入多个点突变，所述点突变用三联体表示：字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸：M247R、A408S和I478K。
2.根据权利要求1所述的Pfu DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述Pfu DNA聚合酶突变体为由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
3.编码权利要求1或2所述的Pfu DNA聚合酶突变体的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于，所述Pfu DNA聚合酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.包含权利要求3或4所述的核苷酸序列的重组表达质粒。
6.包含权利要求3或4所述的核苷酸序列的重组细胞。
7.权利要求1或2所述的Pfu DNA聚合酶突变体，权利要求3或4所述的核苷酸序列，权利要求5所述的重组表达质粒，或，权利要求6所述的重组细胞在生物技术领域中的应用。
8.权利要求1或2所述的Pfu DNA聚合酶突变体，权利要求3或4所述的核苷酸序列，权利要求5所述的重组表达质粒，或，权利要求6所述的重组细胞在DNA重组技术领域或PCR领域中的应用。
9.权利要求1或2所述的Pfu DNA聚合酶突变体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
c1)构建包含SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的重组表达质粒；
c2)将重组表达质粒转化进入宿主细胞，诱导表达，获得菌体；
c3)破碎菌体，离心后获得上清，蛋白质沉淀，获得粗蛋白液；
c4)将粗蛋白液纯化、透析后获得Pfu DNA聚合酶突变体。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白质沉淀包括PEI沉淀、硫酸铵沉淀；优选的，所述纯化包括Ni柱、Q柱和SP柱纯化。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311320456.1A CN117264923A (zh) | 2023-10-12 | 2023-10-12 | 一种Pfu DNA聚合酶突变体及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311320456.1A CN117264923A (zh) | 2023-10-12 | 2023-10-12 | 一种Pfu DNA聚合酶突变体及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117264923A true CN117264923A (zh) | 2023-12-22 |
Family
ID=89200789
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311320456.1A Pending CN117264923A (zh) | 2023-10-12 | 2023-10-12 | 一种Pfu DNA聚合酶突变体及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117264923A (zh) |
-
2023
- 2023-10-12 CN CN202311320456.1A patent/CN117264923A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN117660396A (zh) | Dna聚合酶突变体 | |
| CN114262697B (zh) | 融合Bsu DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶突变体及其基因、质粒、基因工程菌 | |
| CN112175980B (zh) | 通过定点突变提高聚合酶大片段活性的方法及应用 | |
| CN117264923A (zh) | 一种Pfu DNA聚合酶突变体及其制备方法和应用 | |
| CN114921436B (zh) | 末端脱氧核苷酸转移酶突变体、其编码基因、重组表达质粒和基因工程菌 | |
| CN115896063A (zh) | 高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其制备方法及应用 | |
| CN108148852A (zh) | 一种海藻酸裂解酶sha-6基因及应用 | |
| CN106318922A (zh) | 一种Pfu DNA聚合酶的制备方法 | |
| CN113302299A (zh) | 阿洛酮糖差向异构酶变体、其生产方法以及使用其生产阿洛酮糖的方法 | |
| CN117187210B (zh) | 一种突变型Bst DNA聚合酶大片段及其制备方法 | |
| CN114574464B (zh) | 高保真dna聚合酶突变体及其应用 | |
| CN114381442B (zh) | 一种可快速延伸的高保真dna聚合酶及其制备方法和应用 | |
| WO2023098036A1 (zh) | Taq酶突变体、其制备方法和应用 | |
| CN116622744A (zh) | 重组末端脱氧核苷酸转移酶的制备方法和应用 | |
| CN117721094A (zh) | 核酸外切酶i突变体及其制备方法和应用 | |
| CN115975975A (zh) | 一种室温条件下具有扩增活性的dna聚合酶及其应用 | |
| CN117821484A (zh) | 一种HindIII限制性内切酶的制备方法及其应用 | |
| CN117778436A (zh) | 一种高效制备可溶性rna酶抑制剂的工艺 | |
| CN114836448A (zh) | 一种密码子优化的t4多聚核苷酸激酶的核酸分子及其表达方法 | |
| CN113832127A (zh) | 一种限制性内切酶BamHⅠ的突变体及其应用 | |
| CN117587041A (zh) | 重组尿酸酶及其制备方法和应用 | |
| CN116286718A (zh) | 一种突变型Taq酶及其制备方法与应用 | |
| CN116574710A (zh) | 具有链置换功能的dna聚合酶及其应用 | |
| CN116694595A (zh) | 一种新型重组Pfu DNA聚合酶 | |
| CN116064563A (zh) | 白细胞介素-6截短体的制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |