CN115161365A - 一种提高阿卡波糖产量的发酵工艺 - Google Patents

一种提高阿卡波糖产量的发酵工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高阿卡波糖产量的发酵工艺，涉及生物工程技术领域，方法包括以下步骤：将阿卡波糖生产菌接种于基础发酵培养基中；25‑27℃下发酵；向培养基中加入包括刀豆素A和透明质酸的添加物A，调整参数继续发酵；向培养基中加入包括N‑乙酰神经氨酸、2，5‑二巯基‑134‑噻二唑的添加物B，调整参数继续发酵；发酵结束后，所得发酵液进行分离提取，得到阿卡波糖。本发明仅通过在发酵过程中在特定时段加入特定添加物，并调整发酵参数（温度和培养基pH），这样非常简单的手段，即可显著提升阿卡波糖发酵产量，生产和检测成本大大降低。

Description

一种提高阿卡波糖产量的发酵工艺
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及发酵技术中的提高阿卡波糖产量的发酵工艺。
背景技术
阿卡波糖(Acarbose)为一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，是复杂的低聚糖，其结构类似寡糖，这种非寡糖的“假寡糖”可在小肠上部细胞刷状缘处和寡糖竞争而与α-葡萄糖苷酶可逆地结合，抑制各种α-葡萄糖苷酶如麦芽糖酶、异麦芽糖酶、葡萄糖淀粉酶及蔗糖酶的活性，使淀粉分解成寡糖如麦芽糖(双糖)、麦芽三糖及糊精(低聚糖)进而分解成葡萄糖的速度减慢，使蔗糖分解成葡萄糖和果糖的速度减慢，因此造成肠道葡萄糖的吸收减缓，从而缓解餐后高血糖，达到降低血糖的作用。长期服用，可降低空腹血糖和糖化血红蛋白的浓度。
目前糖尿病已经成为一种常见病，阿卡波糖的市场需求量不断增加。
目前国内外阿卡波糖的生产都是利用微生物发酵法制备而得到，其中游动放线菌应用的最为广泛。人们对阿卡波糖产量提升的技术开发，主要集中在诱变选育新菌种以及优化发酵培养基、控制碳源浓度曲线、控制渗透压等，但目前来讲，对发酵培养基现有常见组分的优化已经不能进一步提高产量，控制参数不仅检测控制方面需要专用设备，设备较为昂贵，且对阿卡波糖产量提升的贡献并不显著。
发明内容
未解决上述问题，本发明提供一种通过调整培养基组分，加入新组分及发酵过程中分时段控制培养基组分的方法，以较低的成本，在同等条件下取得了更高的阿卡波糖产量，具体方案如下：
一种提高阿卡波糖产量的发酵工艺，包括以下步骤：
S1、将阿卡波糖生产菌接种于基础发酵培养基中；
S2、25-27℃下发酵；
S3、向培养基中加入包括刀豆素A和透明质酸的添加物A，调整参数继续发酵；
S4、向培养基中加入包括N-乙酰神经氨酸、2，5-二巯基-1，3，4-噻二唑的添加物B，调整参数继续发酵；
S5、发酵结束后，所得发酵液进行分离提取，得到阿卡波糖。
优选地，S1所述阿卡波糖生产菌包括现有公开的可生产阿卡波糖的游动放线菌。
优选地，S1所述基础发酵培养基包括碳源、氮源、微量元素。
优选地，所述碳源包括葡萄糖、乳糖、麦芽糖中的一种或二种以上。
进一步优选地，所述碳源包括葡萄糖和麦芽糖，二者质量比为(0.7-1.3):1。
优选地，所述氮源包括肉汁、酵母膏、蛋白胨中的一种或二种以上。
进一步优选地，所述氮源包括酵母膏和蛋白胨，二者质量比为1:2。
优选地，所述微量元素包括Na盐、K盐、Ca盐、Mg盐、Fe盐、Mn盐、Zn盐、Co盐或Ni盐中的一种或二种以上。
上述碳源、氮源、微量元素均按照本领域常规培养基浓度进行配制。
优选地，S3所述添加物A中，刀豆素A和透明质酸的质量比为(20-35):1。
优选地，S2所述发酵，初始发酵pH为6.4-6.6。
优选地，S3所述添加物A的加入时间为：第一次加入时间为发酵第8-10h，第二次加入时间为发酵第14-20h。
优选地，S3第一次加入添加物A后，培养基中刀豆素A的浓度为2.0-3.3g/L；第二次加入添加物A后，培养基中刀豆素A的浓度为3.5-4.7g/L。
优选地，S3所述调整参数，包括调节培养基pH至6.8-7.0，调节发酵温度至30-32℃。
优选地，S4所述添加物B中，N-乙酰神经氨酸与2，5-二巯基-1，3，4-噻二唑的质量比为(1.7-5.5):1。
优选地，S4所述添加物B的加入时间为发酵第55-70h。
优选地，S4加入添加物B后，培养基中2，5-二巯基-1，3，4-噻二唑的浓度为5.5-9.0g/L。
优选地，S4所述调整参数，包括调节培养基pH至6.5-6.7，调节发酵温度至27-30℃。
优选地，总发酵时间为100-150h。
优选地，S5所述分离提取，采用本领域常规阿卡波糖分离提取工艺。
优选地，在发酵过程中，采用本领域常规手段，可选择地向体系中补充基础培养基。
有益效果
本发明的有益效果在于：
本发明除常规监测（溶氧、温度、OD等）外，无需对反应过程中的其他参数如背景技术中提及的碳源浓度曲线、控制渗透压等进行实时监控，因此无需特殊设备即可进行。本发明仅通过在发酵过程中在特定时段加入特定添加物，并调整发酵参数（温度和培养基pH），这样非常简单的手段，即可显著提升阿卡波糖发酵产量，生产和检测成本大大降低。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
除非特别指出，以下实施例和对比例为平行试验，采用同样的处理步骤和参数。
本发明实施例采用的发酵菌种为游动放线菌Actinoplanessp.ZJB-08196，保藏于中国典型培养物保藏中心,地址:中国武汉,武汉大学,保藏编号CCTCCNO:M209022，为现有文献中公开的菌种，也是可以以公共渠道获取的菌种。
种子液制备：将低温保存的阿卡波糖产生菌接种固体培养基上，28℃活化3天，挑取菌落接种至种子培养基，在温度28℃，震荡下培养60小时，得到种子液。所述种子培养基组成如下：玉米淀粉25.0g/L，黄豆饼粉45.0g/L，磷酸氢二钾0.1g/L，碳酸钙2.0g/L，pH7.0。
实施例1 提高阿卡波糖产量的发酵工艺：
S1、将阿卡波糖生产菌种子液接种于基础发酵培养基中；
S2、25-27℃下发酵；
S3、向培养基中加入包括刀豆素A和透明质酸的添加物A，调整参数继续发酵；
S4、向培养基中加入包括N-乙酰神经氨酸、2，5-二巯基-1，3，4-噻二唑的添加物B，调整参数继续发酵；
S5、发酵结束后，所得发酵液进行分离提取，得到阿卡波糖。
所述基础培养基组成如下：葡萄糖19.0g/L，麦芽糖15.0g/L，酵母膏4.0，
g/L，蛋白胨8.0g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，三氯化铁0.1g/L，氯化钙15.0g/L，碳酸钙27.0g/L，初始pH调节到6.4-6.6。
S3所述添加物A中，刀豆素A和透明质酸的质量比为20:1。
S2所述发酵，初始发酵pH为6.4-6.6。
S3所述添加物A的加入时间为：第一次加入时间为发酵第8h，第二次加入时间为发酵第14h。
S3第一次加入添加物A后，培养基中刀豆素A的浓度为2.0g/L；第二次加入添加物A后，培养基中刀豆素A的浓度为3.5g/L。
S3所述调整参数，包括调节培养基pH至6.8-7.0，调节发酵温度至30-32℃。
S4所述添加物B中，N-乙酰神经氨酸与2，5-二巯基-1，3，4-噻二唑的质量比为1.7:1。
S4所述添加物B的加入时间为发酵第55h。
S4加入添加物B后，培养基中2，5-二巯基-1，3，4-噻二唑的浓度为5.5g/L。
S4所述调整参数，包括调节培养基pH至6.5-6.7，调节发酵温度至27-30℃。
总发酵时间为150h。
S5所述分离提取，采用本领域常规阿卡波糖分离提取工艺。
在发酵过程中，采用本领域常规手段，可选择地向体系中补充基础培养基。
实施例2 提高阿卡波糖产量的发酵工艺：
S1、将阿卡波糖生产菌种子液接种于基础发酵培养基中；
S2、25-27℃下发酵；
S3、向培养基中加入包括刀豆素A和透明质酸的添加物A，调整参数继续发酵；
S4、向培养基中加入包括N-乙酰神经氨酸、2，5-二巯基-1，3，4-噻二唑的添加物B，调整参数继续发酵；
S5、发酵结束后，所得发酵液进行分离提取，得到阿卡波糖。
所述基础培养基组成如下：葡萄糖19.0g/L，麦芽糖15.0g/L，酵母膏4.0，g/L，蛋白胨8.0g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，三氯化铁0.1g/L，氯化钙15.0g/L，碳酸钙27.0g/L，初始pH调节到6.4-6.6。
S3所述添加物A中，刀豆素A和透明质酸的质量比为35:1。
S2所述发酵，初始发酵pH为6.4-6.6。
S3所述添加物A的加入时间为：第一次加入时间为发酵第10h，第二次加入时间为发酵第20h。
S3第一次加入添加物A后，培养基中刀豆素A的浓度为3.3g/L；第二次加入添加物A后，培养基中刀豆素A的浓度为4.7g/L。
S3所述调整参数，包括调节培养基pH至6.8-7.0，调节发酵温度至30-32℃。
S4所述添加物B中，N-乙酰神经氨酸与2，5-二巯基-1，3，4-噻二唑的质量比为5.5:1。
S4所述添加物B的加入时间为发酵第70h。
S4加入添加物B后，培养基中2，5-二巯基-1，3，4-噻二唑的浓度为9.0g/L。
S4所述调整参数，包括调节培养基pH至6.5-6.7，调节发酵温度至27-30℃。
总发酵时间为150h。
S5所述分离提取，采用本领域常规阿卡波糖分离提取工艺。
在发酵过程中，采用本领域常规手段，可选择地向体系中补充基础培养基。
实施例3 提高阿卡波糖产量的发酵工艺：
S1、将阿卡波糖生产菌种子液接种于基础发酵培养基中；
S2、25-27℃下发酵；
S3、向培养基中加入包括刀豆素A和透明质酸的添加物A，调整参数继续发酵；
S4、向培养基中加入包括N-乙酰神经氨酸、2，5-二巯基-1，3，4-噻二唑的添加物B，调整参数继续发酵；
S5、发酵结束后，所得发酵液进行分离提取，得到阿卡波糖。
所述基础培养基组成如下：葡萄糖19.0g/L，麦芽糖15.0g/L，酵母膏4.0，g/L，蛋白胨8.0g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，三氯化铁0.1g/L，氯化钙15.0g/L，碳酸钙27.0g/L，初始pH调节到6.4-6.6。
S3所述添加物A中，刀豆素A和透明质酸的质量比为30:1。
S2所述发酵，初始发酵pH为6.4-6.6。
S3所述添加物A的加入时间为：第一次加入时间为发酵第9h，第二次加入时间为发酵第17h。
S3第一次加入添加物A后，培养基中刀豆素A的浓度为2.6g/L；第二次加入添加物A后，培养基中刀豆素A的浓度为4.1g/L。
S3所述调整参数，包括调节培养基pH至6.8-7.0，调节发酵温度至30-32℃。
S4所述添加物B中，N-乙酰神经氨酸与2，5-二巯基-1，3，4-噻二唑的质量比为3.5:1。
S4所述添加物B的加入时间为发酵第60h。
S4加入添加物B后，培养基中2，5-二巯基-1，3，4-噻二唑的浓度为7.0g/L。
S4所述调整参数，包括调节培养基pH至6.5-6.7，调节发酵温度至27-30℃。
总发酵时间为150h。
S5所述分离提取，采用本领域常规阿卡波糖分离提取工艺。
在发酵过程中，采用本领域常规手段，可选择地向体系中补充基础培养基。
空白试验中，将上述实施例3的添加物A、添加物B分别替换为等质量的无菌水。
对比例1 阿卡波糖产量的发酵工艺：
S1、将阿卡波糖生产菌种子液接种于基础发酵培养基中；
S2、25-27℃下发酵；
S3、向培养基中加入包括刀豆素A和透明质酸的添加物A，调整参数继续发酵；
S4、向培养基中加入无菌水；
S5、发酵结束后，所得发酵液进行分离提取，得到阿卡波糖。
所述基础培养基组成如下：葡萄糖19.0g/L，麦芽糖15.0g/L，酵母膏4.0，g/L，蛋白胨8.0g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，三氯化铁0.1g/L，氯化钙15.0g/L，碳酸钙27.0g/L，初始pH调节到6.4-6.6。
S3所述添加物A中，刀豆素A和透明质酸的质量比为30:1。
S2所述发酵，初始发酵pH为6.4-6.6。
S3所述添加物A的加入时间为：第一次加入时间为发酵第9h，第二次加入时间为发酵第17h。
S3第一次加入添加物A后，培养基中刀豆素A的浓度为2.6g/L；第二次加入添加物A后，培养基中刀豆素A的浓度为4.1g/L。
S3所述调整参数，包括调节培养基pH至6.8-7.0，调节发酵温度至30-32℃。
S4所述无菌水的质量与实施例3中添加物B质量相同。
S4所述无菌水的加入时间为发酵第60h。
S4所述调整参数，包括调节培养基pH至6.5-6.7，调节发酵温度至27-30℃。
总发酵时间为150h。
S5所述分离提取，采用本领域常规阿卡波糖分离提取工艺。
在发酵过程中，采用本领域常规手段，可选择地向体系中补充基础培养基。
对比例2 阿卡波糖产量的发酵工艺：
S1、将阿卡波糖生产菌种子液接种于基础发酵培养基中；
S2、25-27℃下发酵；
S3、向培养基中加入无菌水；
S4、向培养基中加入包括N-乙酰神经氨酸、2，5-二巯基-1，3，4-噻二唑的添加物B，调整参数继续发酵；
S5、发酵结束后，所得发酵液进行分离提取，得到阿卡波糖。
所述基础培养基组成如下：葡萄糖19.0g/L，麦芽糖15.0g/L，酵母膏4.0，g/L，蛋白胨8.0g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，三氯化铁0.1g/L，氯化钙15.0g/L，碳酸钙27.0g/L，初始pH调节到6.4-6.6。
S2所述发酵，初始发酵pH为6.4-6.6。
S3所述无菌水的加入时间为：第一次加入时间为发酵第9h，第二次加入时间为发酵第17h。
S3所述两次加入无菌水的质量与实施例3中两次加入添加物A的质量分别相同。
S3所述调整参数，包括调节培养基pH至6.8-7.0，调节发酵温度至30-32℃。
S4所述添加物B中，N-乙酰神经氨酸与2，5-二巯基-1，3，4-噻二唑的质量比为3.5:1。
S4所述添加物B的加入时间为发酵第60h。
S4加入添加物B后，培养基中2，5-二巯基-1，3，4-噻二唑的浓度为7.0g/L。
S4所述调整参数，包括调节培养基pH至6.5-6.7，调节发酵温度至27-30℃。
总发酵时间为150h。
S5所述分离提取，采用本领域常规阿卡波糖分离提取工艺。
在发酵过程中，采用本领域常规手段，可选择地向体系中补充基础培养基。
对比例3
与对比例1的区别在于：加入添加物A的时间调整为：发酵的第60h、第68h，原加入添加物A的时间加入等量蒸馏水（浓度等其他参数均不变）。
对比例4
与对比例2的区别在于：加入添加物B的时间调整为：发酵的第9h，原加入添加物B的时间加入等量蒸馏水（浓度等其他参数均不变）。
对比例5
与对比例2的区别在于：加入添加物B的时间调整为：发酵的第17h，原加入添加物B的时间加入等量蒸馏水（浓度等其他参数均不变）。
对比例6
与对比例2的区别在于：加入添加物B的时间调整为：发酵的第32h，原加入添加物B的时间加入等量蒸馏水（浓度等其他参数均不变）。
对比例7
与实施例3的区别在于：在第一次加入添加物A时，同时加入添加物B，原加入添加物B的时间加入等量蒸馏水（浓度等其他参数均不变）。
对比例8
与实施例3的区别在于：在第二次加入添加物A时，同时加入添加物B，原加入添加物B的时间加入等量蒸馏水（浓度等其他参数均不变）。
对比例9
与实施例3的区别在于：在加入添加物B时，同时第一次加入添加物A，8h后第二次加入添加物A，原加入添加物A的时间两次加入等量蒸馏水（浓度等其他参数均不变）。
对比例10
与实施例3的区别在于：将加入添加物B的时间改为发酵的第32h，其余不变。
对比例11
与对比例1的区别在于：添加物A中不包括刀豆素A，其他不变。
对比例12
与对比例1的区别在于：添加物A中不包括透明质酸，其他不变。
对比例13
与对比例2的区别在于：添加物B中不包括N-乙酰神经氨酸，其他不变。
对比例14
与对比例2的区别在于：添加物B中不包括2，5-二巯基-1，3，4-噻二唑，其他不变。
蒸馏水均为无菌蒸馏水。
在发酵中单独向培养基中加入添加物A（对比例1），发酵进行到150h时的阿卡波糖产量达到3633μg/mL，较空白试验（不添加添加物A也不添加添加物B，2633μg/mL）提高了38%；在发酵中单独向培养基中加入添加物B（对比例2），发酵进行到150h时的阿卡波糖产量达到2993μg/mL，较空白试验提高了14%；对比例3、4、5、6发酵进行到150h时的阿卡波糖产量分别达到2877μg/mL、3443μg/mL、3170μg/mL、3701μg/mL，较空白试验分别提高9%、31%、20%、41%，可见，添加物A与添加物B的添加时间并非随机设置的，这与他们对微生物代谢的影响机制有关，但在单独添加添加物B时其最佳影响范围的添加时间在第32h（数据记载表明单独添加添加物B时其影响为添加时间在第9-32h均较高，但最佳为第32h）；对比例7、8、9发酵进行到150h时的阿卡波糖产量分别达到3854μg/mL、3991μg/mL、4059μg/mL，可见，调整本发明提供方案中任一添加物的添加时间，都会对结果产生巨大的负面作用；对比例11-14发酵进行到150h时的阿卡波糖产量分别达到2782μg/mL、2817μg/mL、2682μg/mL、2799μg/mL，较空白试验分别提高6%、7%、2%、6%，可见，添加物A中两种物质分别单独添加对最终阿卡波糖产量几乎无影响，同样地，添加物B中两种物质分别单独添加对最终阿卡波糖产量几乎无影响；对比例10发酵进行到150h时的阿卡波糖产量达到3755μg/mL，较空白试验提高了43%，可见，将添加物A与添加物B同时应用到本发明方案时，并非简单叠加（分别按照原方案规定的浓度和时间添加两者）就能达到希望的效果的；按本发明方案在发酵中向培养基中加入添加物A和添加物B（实施例1-3），可以大幅度促进整个发酵过程中阿卡波糖的发酵产量，发酵进行到150h时的阿卡波糖产量可达到4770μg/mL（实施例1-3分别为4582μg/mL、4319μg/mL、4770μg/mL），较空白试验可提高81%，综上可见，添加物A与添加物B对发酵整体的作用，并非简单的叠加作用，二者简单叠加时，反而无法起到提高81%如此高的效果（对比例10），本发明提供的方案使得二者实现了真正的协同作用，有序地对微生物发酵进行影响，最终达到了大幅度提高阿卡波糖产量的目的。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。

Claims (10)

1.一种提高阿卡波糖产量的发酵工艺，其特征在于：包括以下步骤：
S1、将阿卡波糖生产菌接种于基础发酵培养基中；
S2、25-27℃下发酵；
S3、向培养基中加入包括刀豆素A和透明质酸的添加物A，调整参数继续发酵；
S4、向培养基中加入包括N-乙酰神经氨酸、2，5-二巯基-1，3，4-噻二唑的添加物B，调整参数继续发酵；
S5、发酵结束后，所得发酵液进行分离提取，得到阿卡波糖。
2.根据权利要求1所述的提高阿卡波糖产量的发酵工艺，其特征在于：S2所述发酵，初始发酵pH为6.4-6.6。
3.根据权利要求1所述的提高阿卡波糖产量的发酵工艺，其特征在于：S3所述添加物A中，刀豆素A和透明质酸的质量比为(20-35):1。
4.根据权利要求1所述的提高阿卡波糖产量的发酵工艺，其特征在于：S3所述添加物A的加入时间为：第一次加入时间为发酵第8-10h，第二次加入时间为发酵第14-20h。
5.根据权利要求4所述的提高阿卡波糖产量的发酵工艺，其特征在于：S3第一次加入添加物A后，培养基中刀豆素A的浓度为2.0-3.3g/L；第二次加入添加物A后，培养基中刀豆素A的浓度为3.5-4.7g/L。
6.根据权利要求1所述的提高阿卡波糖产量的发酵工艺，其特征在于：S3所述调整参数，包括调节培养基pH至6.8-7.0，调节发酵温度至30-32℃。
7.根据权利要求1所述的提高阿卡波糖产量的发酵工艺，其特征在于：S4所述添加物B中，N-乙酰神经氨酸与2，5-二巯基-1，3，4-噻二唑的质量比为(1.7-5.5):1。
8.根据权利要求1所述的提高阿卡波糖产量的发酵工艺，其特征在于：S4所述添加物B的加入时间为发酵第55-70h。
9.根据权利要求7所述的提高阿卡波糖产量的发酵工艺，其特征在于：S4加入添加物B后，培养基中2，5-二巯基-1，3，4-噻二唑的浓度为5.5-9.0g/L。
10.根据权利要求1所述的提高阿卡波糖产量的发酵工艺，其特征在于：S4所述调整参数，包括调节培养基pH至6.5-6.7，调节发酵温度至27-30℃。
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