Es ist bekannt, Proteine, insbesondere Enzyme, an feste Trägermaterialien zu binden und dadurch unlösliche Produkte mit vorteilhaften Eigenschaften zu erhalten. Die gebundenen, unlöslichgemachten, aber biologisch aktiven Proteine lassen sich beispielsweise einfacher handhaben als in ihrer nativen löslichen Form. An Träger gebundene Enzyme lassen sich wegen ihrer leichten Rückgewinnung bei stationären Verfahren mehrmals oder, mit besonderem Vorteil, in kontinuierlich arbeitende Verfahren einsetzen.
So ist beispielsweise die Herstellung eines Kondensationsharzes mit einer grossen Bindungskapazität für Proteine durch Umsetzung von 1,3-Phenylendiamin und Formaldehyd sowie Diazotierung des Reaktionsproduktes bekannt.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass man ein in bezug auf die Fixierung bzw. Unlöslichmachung von Proteinen wesentlich aktiveres Produkt erhält, wenn man 1,3-Phenylendiamin mit Glutardialdehyd kondensiert.
Dieses Produkt (PAG-Harz) weist gegenüber dem bereits bekannten vorstehend erwähnten Kondensationsprodukt aus 1,3-Phenylendiamin und Formaldehyd eine Reihe von sehr vorteilhaften Eigenschaften auf, die es als Trägermaterial zur Fixierung von Proteinen verschiedenster Art und Provenienz hervorragend geeignet machen: Es werden grössere Partikel gebildet, die besser filtrierbar sind, schneller sedimentieren und daher allgemein besser zu handhaben sind; die Bindungskapazität für Proteine ist wesentlich grösser; das Kondensationsprodukt stellt bereits einen aktivierten Träger dar, der sofort eingesetzt werden kann und aufgrund der hohen Aktivität kann die Fixierung des Proteins in sehr einfacher Weise erfolgen. Schliesslich ist das Produkt sehr billig.
Die Erfindung betrifft demgemäss ein Verfahren zur Fixierung oder Unlöslichmachung von Proteinen, bzw. Enzymen an das PAG-Harz, also das durch Umsetzung von 1,3-Phenylendiamin mit Glutardialdehyd erhältliche Kondensationsprodukt.
Als Proteine, die an das Kondensationsprodukt chemisch gebunden werden können, kommen Polypeptide, Antigene, Antikörper, Proteininhibitoren und insbesondere Enzyme in Betracht. Die Enzyme können pflanzlichen, tierischen oder mikrobiellen Ursprungs sein. Es kommen in Betracht Hydrolasen (Peptidasen, Proteinasen, Desaminasen, Carbohydrasen, Esterasen), Lyasen bzw. Desmolasen (Hydrolyasen, Decarboxylasen, Aldolasen), Transferasen, Isomerasen, Oxidoreduktasen und Ligasen.
Beispiele von Enzymen, von denen erfindungsgemäss unlösliche Enzympräparate hergestellt werden können, sind Alkoholdehydrogenase, Naringinase, Hesperidinase, ss-Glucosidase, a-Amylase, Invertase, Amylolglucosidase, Urease, Trypsin, Ficin, Papain, Bromelin, Subtilopeptidase, Rennin, Glucoseisomerase, Glucoseoxidase, Peroxidase, Katalase, Acylase, Ribonuclease, Phosphodiesterase, Adenyldeaminase und Cytochrome.
Das molare Verhältnis der beiden Kondensationspartner 1,3-Phenylendiamin und Glutardialdehyd liegt zweckmässigerweise zwischen 1:1 und 1:10, wobei ein Verhältnis von etwa 1:3 bevorzugt ist.
Die Umsetzung kann in an sich bekannter Weise, beispielsweise in wässriger Lösung, vorzugsweise unter Zusatz einer Säure, beispielsweise einer Mineralsäure, wie HCI, durchgeführt werden. In einer besonderen Ausführungsform wird in Gegenwart eines inerten, feinkörnigen, vorzugsweise anorganischen, insbesondere silikathaltigen Hilfsmittels gearbeitet.
Beispiele solcher Hilfsmittel sind Silicagel, Bimsstein, Diatomeenerde, Kieselgur, Bentonit, Wollastonit, poröses Glas, aber auch Metalloxide, wie Aluminiumoxid oder Hydroxylapatit. Bevorzugt wird Silicagel verwendet, beispielsweise mit einer Partikelgrösse von 0,05-0,2 mm, 70-325 mesh. Durch die Anwesenheit eines solchen Hilfsmittels wird eine homogene Partikelbildung bei der Kondensation erreicht, was wiederum eine bessere Sedimentation zur Folge hat. Die Kondensation in Gegenwart eines Hilfsmittels wird zweckmässig so durchgeführt, dass man die Partikel zunächst mit einer der beiden Komponenten in Berührung bringt und dann die zweite Komponente unter gleichzeitigem oder anschliessendem leichten Ansäuern zusetzt.
Die Kondensation kann in homogener Phase oder vorzugsweise in einem Zweiphasensystem unter Zusatz einer Säure, z. B. Schwefelsäure, Phosphorsäure, vorzugsweise aber Salzsäure, oder einer organischen Säure wie einer Carbonsäure, z. B. Essigsäure, unter kräftigem Rühren oder Schütteln vorgenommen werden. Die Verwendung eines Zweiphasensystems fördert die Bildung von sphärischen, weitgehend homogenen, leicht filtrierbaren und gut sedimentierenden Partikeln, die als Trägermaterial besonders gut geeignet sind.
Als zweite Phase eignen sich inerte, mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel, wie Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Benzol, Toluol, Äthylacetat, Dioxan, Schwefelkohlenstoff. Als bevorzugtes organisches Lösungsmittel kann Chloroform verwendet werden.
Die Reaktionstemperatur ist nicht kritisch, sie kann beispielsweise zwischen OoC und 500C liegen. Ein bevorzugter Temperaturbereich ist derjenige zwischen 18-220C.
Nach dem oben beschriebenen Verfahren erhält man ein bereits sehr aktives Trägermaterial, das jedoch durch direkte Diazotierung noch weiter aktiviert werden kann. Die Diazotierung kann in an sich bekannter Weise durch Behandlung des Kondensationsproduktes mit Nitrit und Säure erfolgen. Die genaue Struktur des polymeren Trägermaterials ist nicht bekannt, es wurden aber Chinolin-, 1,7-Phenanthrolin- und 1,6-Diazaphenaleneinheiten nachgewiesen.
Zur erfindungsgemässen Fixierung des Proteins an das Trägermaterial behandelt man dieses mit einer wässrigen, vorzugsweise einer gepufferten Lösung des Proteins (1-50 mg/ ml) bei einer Temperatur von etwa 0-30 C, vorzugsweise 40C bis Zimmertemperatur, was durch Rühren oder Schütteln geschehen kann. Aufgrund der hohen Aktivität des Trägermaterials kann die Fixierung von Proteinen vorteilhaft auch durch einfache Filtration der Proteinlösung durch eine Trägerschicht, vorzugsweise eine mit Träger gefüllte Säule, wie es z. B. in der Säulenchromatographie üblich ist, erfolgen. So kann man beispielsweise Kulturfiltrate von Mikroorganismen, die Proteine bzw. Enzyme enthalten, direkt über eine Trägersäule laufen lassen, wobei die Proteine bzw. Enzyme selektiv fixiert werden.
Man wäscht noch mit etwas Pufferlösung und 1 M KCl-Lösung nach, um nicht fixierte Proteine zu entfernen.
Die an den Träger fixierten Proteine sind im allgemeinen sehr stabil, und es werden bei Enzymen sehr hohe spezifische Aktivitäten (Einheit/g) erreicht. Man erreicht Beladungen von mindestens 1:3-10 Gewichtsteilen Protein/Träger.
Die mittels des erfindungsgemässen Verfahrens trägergebundenen Proteine, insbesondere die Enzyme, können in an sich bekannter Weise verwendet werden, beispielsweise zu analytischen oder präparativen Zwecken oder in der Lebensmitteltechnologie beispielsweise bei der Bildung von Aromastoffen oder bei der Herstellung von Glucose aus Stärke (siehe z. B. Scientific American 224, (No. 3) 26-33 (1971), Angew.
Chemie 84, (8) 319-368 (1972), Chemiker-Zeitung 96, (11), 595-602 (1972), C & EN, (15.2.71), 86-87).
Bei der grosstechnischen Herstellung von Glucose aus Stärke kann Amyloglucosidase auf die neuen Kondensationsprodukte fixiert werden. Die fixierten Enzympräparate können bei der Herstellung von Glucose aus Glucosesirup (vorhydrolysierte Stärke) dienen. Die Kondensationsprodukte können auf Kolonnen gebracht werden (Festbettverfahren).
Eine weitere Anwendung ergibt sich beim enzymatischen Abbau von Lactose in Milchprodukten mittels Lactasen, z. B.
Süssen der Molke.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung. Die Mengenangaben des erhaltenen bzw. eingesetzten Trägers sind auf Trockengewicht bezogen.
Beispiel 1
Zu einer Lösung von 5,0 g 1,3-Phenylendiamin in 50 ml Wasser und 10 ml konz. Salzsäure wurden 50 g Glutardialdehyd (25 %ige wässrige Lösung) unter kräftigem Rühren zugesetzt. Bei beginnender Verfestigung des Reaktionsgemisches wurden 300 ml Wasser zugegeben. Es wurde eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann über einen Büchner-Trichter unter vermindertem Druck abgesaugt. Die feinen polymeren Partikel wurden mit 0,1 N NaOH und Wasser gewaschen und in 0,01 N NaOH aufbewahrt. Ausbeute:
13,8 g.
Beispiel 2
Zu einer Lösung von 5 g 1,3-Phenylendiamin in 300 ml Chloroform wurden unter kräftigem Rühren zunächst 50 g Glutardialdehyd und nach weiteren 5 Minuten 20 ml 7 N Salzsäure zugesetzt. Das Reaktionsgemisch erstarrte sofort. Es wurde mit 100 ml Wasser versetzt und 5 Minuten geschüttelt, bis es wieder fliessfähig wurde. Nach Absaugen des Reaktionsgemisches über einen Büchner-Trichter wurden die polymeren Partikel mit 0,1 N NaOH gewaschen. Restliches Chloroform wurde durch Waschen mit etwas Aceton entfernt. Ausbeute: 14 g. Die so erhaltenen Trägerpartikel sind sphärisch, homogen und gut filtrierbar; sie wurden in Wasser oder in verdünnter Natronlauge aufbewahrt.
Beispiel 3
Zu einer Lösung von 2,0 g 1,3-Phenylendiamin in 50 ml Benzol wurden unter Rühren 30 g Silicagel gegeben. Nach 10minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Silicagel über einen Büchner-Trichter abfiltriert und trocken gesaugt.
Am Silicagel noch haftendes Benzol stört den weiteren Reaktionsverlauf nicht. Die mit 1,3-Phenylendiamin imprägnierten Silicagelpartikel wurden dann schnell unter kräftigem Rühren zu einem Gemisch aus 50 g Glutardialdehyd (25 %ige Lösung in Wasser), 10 ml konz. Salzsäure und 340 ml Wasser gegeben.
Es trat sofort Polymerisation ein. Das orange-rote Polymer wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt, über einen Büchner-Trichter unter vermindertem Druck abfiltriert und mit Wasser neutralgewaschen. Das so erhaltene Trägermaterial wurde dann in einer schwach alkalischen Lösung (0,01 N NaOH) aufbewahrt.
Beispiel 4
Zu 50 g Glutardialdehyd (25 %ige wässrige Lösung) wurden 30 g Silicagel unter kräftigem Rühren zugegeben. Die Masse wurde dann einer Lösung von 5 g 1,3-Phenylendiamin in 300 ml Chloroform unter kräftigem Schütteln zugegeben.
Nach Zusatz von 10 ml 7N Salzsäure und 100 ml Wasser wurde nochmals 10 Minuten geschüttelt. Das Reaktionsprodukt wurde wie in Beispiel 2 beschrieben aufgearbeitet. Man erhielt homogene, sphärische Partikel, die schnell sedimentierten und sich ausgezeichnet filtrieren liessen.
Beispiel 5
Zu in Beispiel 3 und 4 analoger Weise wurde weiteres Trägermaterial hergestellt, wobei anstelle von Kieselgel Diatomeenerde verwendet wurde.
Beispiel 6
Eine Suspension von 1 g des gemäss den Beispielen 1-5 erhaltenen Kondensationsproduktes in 30 ml Wasser wurde mit 1,15 ml konz. Salzsäure bei OoC angesäuert. Zu der eiskal ten Suspension wurde tropfenweise und unter Rühren eine 1 N Natriumnitrit-Lösung zugegeben. Nach beendeter Umsetzung wurde das schwarz-violett gefärbte Trägermaterial abfiltriert, mit kaltem Wasser und einer Pufferlösung (pH 4-8,5, je nach dem pH-Wert der Lösung des Proteins, das anschliessend fixiert werden soll) gewaschen.
Beispiel 7
0,23 g des gemäss Beispiel 2 erhaltenen Trägermaterials wurden in der in Beispiel 6 beschriebenen Weise diazotiert und in eine Chromatographiesäule (1,5 X 15 cm) gefüllt. Eine Lösung von 1 g Amylglucosidase (107 Einheiten/mg) in 100 ml 16 mMol Acetatpuffer (pH 4,8) wurde bei Zimmertemperatur und mit einer Durchflussrate von 20 ml pro Stunde über die Säule gegeben. Das fixierte Enzym wies eine Aktivität von 14 300 Einheiten/g Trägermaterial auf.
Beispiel 8
Eine Suspension von 1 g diazotiertem Trägermaterial (hergestellt nach Beispielen 3 oder 4) in 20 mMol Phosphatpuffer (pH 5,2) wurde in eine Chromatographiesäule (1,5 x 15 cm) gefüllt. Eine Lösung von 500 mg Invertase (150 Einheiten/ mg) in 50 ml 20 m Mol Phosphatpuffer (pH 5,2) wurde bei Raumtemperatur und mit einer Durchflussrate von 20 ml pro Stunde durch die Säule gegeben. Die Säule wurde mit 50 ml 20 mMol Phosphatpuffer (pH 5,2) und 50 ml 1 N Kaliumchloridlösung gewaschen. Fixierte Enzymmenge: 349 mg. Aktivität des fixierten Enzyms: 4280 Einheiten/g Träger. Die Aktivität des gebundenen Enzyms war 8,5% verglichen mit der des löslichen Enzyms. Das Gewichtsverhältnis Enzym zu Trägermaterial war etwa 1:3. Ein aus 20 g diazotiertem Trägermaterial in analoger Weise hergestelltes Invertasepräparat zeigte eine Aktivität von 17,6% verglichen mit der des löslichen Enzyms.
Beispiel 9
1 g diazotiertes Trägermaterial (hergestellt gemäss Beispiel 3 oder 4) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) wurde in eine Chromatographiesäule (1,5 X 15 cm) gefüllt. Eine Lösung von 600 mg Ficin in 60 ml einer Lösung aus 0,1 M Phosphatpuffer, 7 mMol Mercaptoäthanol und 1 mMol EDTA (pH 7,0) wurde bei Zimmertemperatur und mit einer Durchflussrate von 20 ml pro Stunde durch die Säule gegeben. Es wurde mit 50 ml der gleichen Pufferlösung und 50 ml 1 M Kaliumchlorid-Lösung nachgewaschen. Fixiertes Enzym: 459 mg. Die mit Casein als Substrat bestimmte Aktivität des fixierten Enzyms betrug 15 % der Aktivität des löslichen Enzyms.
Beispiel 10
Durch eine Säule mit 2 g diazotiertem, gemäss Beispielen 3 oder 4 erhaltenem Trägermaterial wurde eine Lösung von 4 g Naringinase in 100 ml 0,05 M Citratpuffer (pH 6,5) bei Raumtemperatur mit einer Durchflussrate von 20 ml pro Stunde gegeben. Die trägergebundene Naringinase zeigte eine Aktivität von 32%, verglichen mit dem löslichen Enzym.
Beispiel 11
2 g diazotiertes, gemäss Beispiel 3 oder 4 erhaltenes Trägermaterial wurde 1 Stunde bei 4OC mit einer Lösung von 600 mg Naringinase in 50 ml 0,05 M Citratpuffer (pH 6,5) geschüttelt.
Die Aktivität der fixierten Naringinase betrug 50%, verglichen mit der des löslichen Enzyms.
Beispiel 12
In gleicher Weise wie in Beispiel 11 beschrieben, wurden 40 mg Hesperidinase in 50 ml 0,05 M Citratpuffer (pH 6,5) an das Trägermaterial gebunden. Die Aktivität des fixierten Enzymes betrug 27% derjenigen des löslichen Enzyms.
Beispiel 13
Eine Lösung von ungereinigter Glucoseisomerase, erhalten aus dem teilweise gereinigten Kulturfiltrat eines Mikroorganismus (Streptomyces glaucescens), wurde über eine Säule, enthaltend 50 g diazotiertes, gemäss Beispiel 3 oder 4 hergestelltes Trägermaterial gegeben. Es wurde mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,5) und 1 M Kaliumchlorid-Lösung gewaschen.
Die Aktivität der fixierten Glucoseisomerase betrug 74% der des löslichen Enzyms, bestimmt durch Messung der zu Fructose isomerisierten Glucose einer 10%igen Lösung.
Beispiel 14
Eine Lösung von 100 mg Rinderserumalbumin in 50 ml 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,5) wurde bei Raumtemperatur und einer Durchflussrate von 20 ml pro Stunde über eine Chromatographiesäule (1,5 x 5 cm), enthaltend 0,5 g diazotiertes, gemäss Beispiel 3 oder 4 erhaltenes Trägermaterial gegeben. Es wurden 68,4 mg des Albumins an das Harz gebunden, so dass das Gewichtsverhältnis von gebundenem Protein zu Trägermaterial etwa 1,4:10 betrug.
Unter Verwendung von nicht diazotiertem Trägermaterial wurde etwa dasselbe Kupplungsverhältnis erhalten.
It is known that proteins, in particular enzymes, can be bound to solid carrier materials and thereby insoluble products with advantageous properties can be obtained. For example, the bound, insolubilized, but biologically active proteins are easier to handle than in their native soluble form. Enzymes bound to carriers can be used several times because of their easy recovery in stationary processes or, with particular advantage, in continuously operating processes.
For example, the production of a condensation resin with a large binding capacity for proteins by reacting 1,3-phenylenediamine and formaldehyde and diazotizing the reaction product is known.
It has now been found, surprisingly, that a significantly more active product with regard to the fixation or insolubilization of proteins is obtained if 1,3-phenylenediamine is condensed with glutaraldehyde.
This product (PAG resin) has a number of very advantageous properties compared to the already known above-mentioned condensation product of 1,3-phenylenediamine and formaldehyde, which make it extremely suitable as a carrier material for fixing proteins of various types and origins: They are larger Particles are formed which can be filtered better, sediment more quickly and are therefore generally easier to handle; the binding capacity for proteins is much greater; the condensation product already represents an activated carrier which can be used immediately and, due to the high activity, the protein can be fixed in a very simple manner. After all, the product is very cheap.
The invention accordingly relates to a method for fixing or insolubilizing proteins or enzymes on the PAG resin, that is to say the condensation product obtained by reacting 1,3-phenylenediamine with glutaraldehyde.
Proteins that can be chemically bound to the condensation product are polypeptides, antigens, antibodies, protein inhibitors and, in particular, enzymes. The enzymes can be of vegetable, animal or microbial origin. Hydrolases (peptidases, proteinases, deaminases, carbohydrases, esterases), lyases or desmolases (hydrolyases, decarboxylases, aldolases), transferases, isomerases, oxidoreductases and ligases come into consideration.
Examples of enzymes from which insoluble enzyme preparations can be produced according to the invention are alcohol dehydrogenase, naringinase, hesperidinase, ß-glucosidase, α-amylase, invertase, amylolglucosidase, urease, trypsin, ficine, papain, bromeline, subtilopeptidase, rennin, glucose isomerase, Peroxidase, catalase, acylase, ribonuclease, phosphodiesterase, adenyl deaminase and cytochromes.
The molar ratio of the two condensation partners 1,3-phenylenediamine and glutaraldehyde is expediently between 1: 1 and 1:10, a ratio of about 1: 3 being preferred.
The reaction can be carried out in a manner known per se, for example in aqueous solution, preferably with the addition of an acid, for example a mineral acid such as HCl. In a particular embodiment, the process is carried out in the presence of an inert, fine-grained, preferably inorganic, in particular silicate-containing, auxiliary.
Examples of such auxiliaries are silica gel, pumice stone, diatomaceous earth, kieselguhr, bentonite, wollastonite, porous glass, but also metal oxides such as aluminum oxide or hydroxyapatite. Silica gel is preferably used, for example with a particle size of 0.05-0.2 mm, 70-325 mesh. The presence of such an auxiliary means that homogeneous particle formation is achieved during the condensation, which in turn results in better sedimentation. The condensation in the presence of an auxiliary is expediently carried out by first bringing the particles into contact with one of the two components and then adding the second component with simultaneous or subsequent slight acidification.
The condensation can take place in a homogeneous phase or, preferably, in a two-phase system with the addition of an acid, e.g. B. sulfuric acid, phosphoric acid, but preferably hydrochloric acid, or an organic acid such as a carboxylic acid, e.g. B. acetic acid, with vigorous stirring or shaking. The use of a two-phase system promotes the formation of spherical, largely homogeneous, easily filterable and well-sedimenting particles, which are particularly suitable as carrier material.
Inert, water-immiscible organic solvents, such as dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, benzene, toluene, ethyl acetate, dioxane, carbon disulfide, are suitable as the second phase. Chloroform can be used as the preferred organic solvent.
The reaction temperature is not critical; it can be, for example, between OoC and 500C. A preferred temperature range is between 18-220C.
The process described above gives an already very active carrier material which, however, can be further activated by direct diazotization. The diazotization can be carried out in a manner known per se by treating the condensation product with nitrite and acid. The exact structure of the polymeric carrier material is not known, but quinoline, 1,7-phenanthroline and 1,6-diazaphenalene units have been detected.
To fix the protein to the carrier material according to the invention, it is treated with an aqueous, preferably a buffered, solution of the protein (1-50 mg / ml) at a temperature of about 0-30 ° C., preferably 40 ° C. to room temperature, which is done by stirring or shaking can. Due to the high activity of the carrier material, the fixation of proteins can advantageously also be carried out by simply filtering the protein solution through a carrier layer, preferably a column filled with carrier, as is e.g. B. is common in column chromatography. For example, culture filtrates of microorganisms which contain proteins or enzymes can be run directly over a carrier column, the proteins or enzymes being selectively fixed.
It is washed with a little buffer solution and 1 M KCl solution in order to remove unfixed proteins.
The proteins fixed to the carrier are generally very stable, and very high specific activities (unit / g) are achieved with enzymes. Loads of at least 1: 3-10 parts by weight protein / carrier are achieved.
The proteins, in particular the enzymes, which are carrier-bound by means of the method according to the invention can be used in a manner known per se, for example for analytical or preparative purposes or in food technology, for example in the formation of flavorings or in the production of glucose from starch (see e.g. Scientific American 224, (No. 3) 26-33 (1971), Angew.
Chemie 84, (8) 319-368 (1972), Chemiker-Zeitung 96, (11), 595-602 (1972), C & EN, (15.2.71), 86-87).
In the large-scale production of glucose from starch, amyloglucosidase can be fixed on the new condensation products. The fixed enzyme preparations can be used in the production of glucose from glucose syrup (pre-hydrolyzed starch). The condensation products can be brought to columns (fixed bed process).
Another application results in the enzymatic breakdown of lactose in milk products by means of lactases, e.g. B.
Sweeten the whey.
The following examples illustrate the invention. The amounts of the carrier obtained or used are based on dry weight.
example 1
To a solution of 5.0 g of 1,3-phenylenediamine in 50 ml of water and 10 ml of conc. Hydrochloric acid was added to 50 g of glutaraldehyde (25% strength aqueous solution) with vigorous stirring. When the reaction mixture began to solidify, 300 ml of water were added. The mixture was stirred for a further hour at room temperature and then filtered off with suction through a Buchner funnel under reduced pressure. The fine polymeric particles were washed with 0.1 N NaOH and water and stored in 0.01 N NaOH. Yield:
13.8 g.
Example 2
To a solution of 5 g of 1,3-phenylenediamine in 300 ml of chloroform, initially 50 g of glutaraldehyde and, after a further 5 minutes, 20 ml of 7N hydrochloric acid were added with vigorous stirring. The reaction mixture solidified immediately. 100 ml of water were added and the mixture was shaken for 5 minutes until it became fluid again. After the reaction mixture was filtered off with suction through a Buchner funnel, the polymeric particles were washed with 0.1 N NaOH. Residual chloroform was removed by washing with a little acetone. Yield: 14 g. The carrier particles obtained in this way are spherical, homogeneous and easily filterable; they were stored in water or in dilute sodium hydroxide solution.
Example 3
To a solution of 2.0 g of 1,3-phenylenediamine in 50 ml of benzene, 30 g of silica gel were added with stirring. After stirring for 10 minutes at room temperature, the silica gel was filtered off using a Buchner funnel and sucked dry.
Benzene still adhering to the silica gel does not interfere with the further course of the reaction. The silica gel particles impregnated with 1,3-phenylenediamine were then rapidly mixed with vigorous stirring to a mixture of 50 g of glutaraldehyde (25% solution in water), 10 ml of conc. Hydrochloric acid and 340 ml of water.
Polymerization occurred immediately. The orange-red polymer was stirred for one hour at room temperature, filtered off using a Buchner funnel under reduced pressure and washed neutral with water. The carrier material thus obtained was then stored in a weakly alkaline solution (0.01 N NaOH).
Example 4
30 g of silica gel were added to 50 g of glutaraldehyde (25% strength aqueous solution) with vigorous stirring. The mass was then added to a solution of 5 g of 1,3-phenylenediamine in 300 ml of chloroform with vigorous shaking.
After adding 10 ml of 7N hydrochloric acid and 100 ml of water, the mixture was shaken for another 10 minutes. The reaction product was worked up as described in Example 2. Homogeneous, spherical particles were obtained which sedimented quickly and were extremely easy to filter.
Example 5
In a manner analogous to that in Examples 3 and 4, further support material was produced, with diatomaceous earth being used instead of silica gel.
Example 6
A suspension of 1 g of the condensation product obtained in Examples 1-5 in 30 ml of water was concentrated with 1.15 ml. Hydrochloric acid acidified at OoC. A 1N sodium nitrite solution was added dropwise to the ice-cold suspension with stirring. After the reaction had ended, the black-violet colored carrier material was filtered off, washed with cold water and a buffer solution (pH 4-8.5, depending on the pH of the solution of the protein that is then to be fixed).
Example 7
0.23 g of the support material obtained in Example 2 was diazotized in the manner described in Example 6 and filled into a chromatography column (1.5 × 15 cm). A solution of 1 g of amyl glucosidase (107 units / mg) in 100 ml of 16 mmol acetate buffer (pH 4.8) was passed through the column at room temperature and at a flow rate of 20 ml per hour. The fixed enzyme had an activity of 14,300 units / g of carrier material.
Example 8
A suspension of 1 g of diazotized support material (prepared according to Examples 3 or 4) in 20 mmol of phosphate buffer (pH 5.2) was placed in a chromatography column (1.5 × 15 cm). A solution of 500 mg invertase (150 units / mg) in 50 ml of 20 molar phosphate buffer (pH 5.2) was passed through the column at room temperature and at a flow rate of 20 ml per hour. The column was washed with 50 ml of 20 mmol of phosphate buffer (pH 5.2) and 50 ml of 1 N potassium chloride solution. Fixed amount of enzyme: 349 mg. Fixed enzyme activity: 4280 units / g carrier. The activity of the bound enzyme was 8.5% compared to that of the soluble enzyme. The weight ratio of enzyme to carrier material was about 1: 3. An invertase preparation prepared in an analogous manner from 20 g of diazotized carrier material showed an activity of 17.6% compared with that of the soluble enzyme.
Example 9
1 g of diazotized support material (prepared according to Example 3 or 4) in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) was placed in a chromatography column (1.5 × 15 cm). A solution of 600 mg of ficin in 60 ml of a solution of 0.1 M phosphate buffer, 7 mmol of mercaptoethanol and 1 mmol of EDTA (pH 7.0) was passed through the column at room temperature and at a flow rate of 20 ml per hour. It was washed with 50 ml of the same buffer solution and 50 ml of 1 M potassium chloride solution. Fixed enzyme: 459 mg. The activity of the fixed enzyme determined with casein as a substrate was 15% of the activity of the soluble enzyme.
Example 10
A solution of 4 g naringinase in 100 ml 0.05 M citrate buffer (pH 6.5) was passed through a column with 2 g of diazotized carrier material obtained according to Examples 3 or 4 at room temperature at a flow rate of 20 ml per hour. The carrier-bound naringinase showed an activity of 32% compared to the soluble enzyme.
Example 11
2 g of diazotized carrier material obtained according to Example 3 or 4 was shaken for 1 hour at 40C with a solution of 600 mg of naringinase in 50 ml of 0.05 M citrate buffer (pH 6.5).
The activity of the fixed naringinase was 50% compared with that of the soluble enzyme.
Example 12
In the same way as described in Example 11, 40 mg hesperidinase in 50 ml 0.05 M citrate buffer (pH 6.5) were bound to the carrier material. The activity of the fixed enzyme was 27% that of the soluble enzyme.
Example 13
A solution of unpurified glucose isomerase, obtained from the partially purified culture filtrate of a microorganism (Streptomyces glaucescens), was passed through a column containing 50 g of diazotized carrier material prepared according to Example 3 or 4. It was washed with 0.05 M phosphate buffer (pH 6.5) and 1 M potassium chloride solution.
The activity of the fixed glucose isomerase was 74% that of the soluble enzyme, determined by measuring the glucose isomerized to fructose in a 10% solution.
Example 14
A solution of 100 mg of bovine serum albumin in 50 ml of 0.05 M phosphate buffer (pH 6.5) was at room temperature and a flow rate of 20 ml per hour through a chromatography column (1.5 x 5 cm) containing 0.5 g of diazotized, according to example 3 or 4 obtained carrier material given. 68.4 mg of the albumin was bound to the resin so that the weight ratio of bound protein to carrier material was about 1.4:10.
About the same coupling ratio was obtained using non-diazotized carrier material.