JP2000515569A

JP2000515569A - 沈降による水溶媒体からのタンパク質の除去

Info

Publication number: JP2000515569A
Application number: JP10505195A
Authority: JP
Inventors: クルペイ，ジョン
Original assignee: リゴケムインコーポレイテッド
Priority date: 1996-07-10
Filing date: 1997-06-09
Publication date: 2000-11-21
Also published as: WO1998001482A1; EP0910589A1; AU3305597A; CA2259615A1; US5976382A

Abstract

(57)【要約】式（Ｉ）で表れる鎖状骨格中に少なくとも２本の鎖部を有する水不溶性架橋ポリカルボン酸が提供される。ここに、各鎖部の少なくとも一つのマレオイル部分のカルボニル基は、-HN.[(H)p(CH)z.(OH)m].NH-部分と共有結合し、式（Ｖ）で表される少なくとも一つの架橋構造を形成し、Ｒは、水素または炭素原子１〜４の低級アルキレンまたは低級アルコキシまたはフェニル、ｘおよびｙは整数、ｚは１〜６の整数、ｐは０またはＺ-１までの整数、ｍは０またはｚまでの整数、およびｗは２〜１２の整数である。また、マトリックス形成し、ポリカルボン酸を含有する水性媒体からタンパク質を除去するポリカルボン酸の利用方法とこの様なポリカルボン酸を得る方法が開示される。これらの方法は、前記マトリックスからそれらを変性することなくタンパク質を回収する方法および、前記マトリックスからポリカルボン酸を回収する方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景発明の技術分野沈降による水溶媒体からのタンパク質の除去従来技術の考察タンパク質は伝統的に試薬または熱の使用によって水溶媒体から除去されてきた。ある溶媒（クロロホルム、尿素）は、タンパク質を変性させその沈澱を生じさせる。同様に、塩の添加により高度に溶媒の電解質レベルを上昇してもタンパク質が沈降する。更に、加熱は変性のみならず一般的にタンパク質を凝集させ、水性溶媒からそれを分離する。タンパク質除去のこれらの方法には大きな３つの欠点がある。まず第一に、媒体から除去される物質は単にタンパク質に限られない。媒体が細胞溶解物（cell ysate）である場合など、媒体が化学物質の複合混合物を含有する場合、これらの方法はタンパク質に添加した他の物質を除去する可能性がある。第二に、これらの方法によって除去されたタンパク質は、透析などの単に時間のかかる処理によって一般に不可逆的に変性されまたは不可逆的に変性されうる。第三に、タンパク質のエーテル単離や精製は、伝統的に幾分有毒な溶媒（フェノールおよび／又はクロロホルム）を使用する。米国特許4,421,653記載の重合物質は、これらの問題を克服しようとした。この物質ジアミンで架槁されたポリエチレン無水マレイン酸誘導体は、血清の単容積をタンパク除去するために溶液中に９容積までを要求する。大過剰の「除蛋白剤」は低い交率を表わすものであり、それを商業的使用に関し不適切に高価なものにする。更に、このマトリックスはアルカリ性域内（すなわちpH10）でタンパク質を沈降し、このようにマイルドなアルカリ状態においてこのマトリックスから要求されるタンパク質の脱離を非常に困難にする。この問題への新しいアプローチは、出願人の先の米国特許5,294,681およびその一部継続出願である米国特許5,453,493において見いだされている。しかしある状況下、粘性の問題がこれらの新しい組成の使用において生ずる。それゆえにこれらの粘性に関する問題を避ける出願人によって、あらかじめ開示された組成の改良を求めることは、望ましいと考えられる。発明の要旨式：ここに、Ｒは水素、炭素数１〜４の低級アルキレンもしくは低級アルコキシまたはフェニルであり、ｘおよびｙは整数である、ｗは２〜１２の整数であるポリマーと、式：Ｈ₂Ｎ［（Ｈ）_P（ＣＨ）_z（ＯＨ）_m］ＮＨ₂ （ＩＩ）ここに、ｚは１〜６の整数であり、ｐは０またはｚ−１までの整数であり、ｍは０またはｚまでの整数である、好ましくは水酸基を含んでいるα，ω−ジアミノアルカンを架橋し、および未反応の無水物基を加水分解して得られる水不溶性架橋ポリカルボン酸組成物の一群が提供される。この架橋ポリカルボン酸またはポリヒドロキシポリカルボン酸組成物は、式の骨格を有する。ここに、式ＩＩＩにおいて、各鎖の少なくとも一つの内部鎖マレオイル部分のカルボニル基は、式ここに、Ｒ、ｘ、ｙ、ｚ、ｐおよびｍは前記と同様である、の少なくとも一つの内部鎖架橋部分を形成するために、 -HN.[(H)p(CH)z.(OH)m].NH- （ＩＶ）部分と共有結合し、化合物（Ｖ）、すなわち式を形成する。架橋ポリカルボン酸組成物の作成方法は、式Ｖの化合物を得るために、式Ｉで表されるポリマーと式ＩＩで表されるα，ω−ジアミノアルカンとの架橋を必要とする。これらの架橋ポリカルボン酸またはポリヒドロキシポリカルボン酸組成物は、タンパク質／ポリカルボン酸組成物マトリックスを形成するために、架橋ポリカルボン酸またはポリヒドロキシポリカルボン酸組成物の有効量をここに添加することを含む当該物質を含有する水性媒体からタンパク質を沈降する方法を提供する。好ましくは、ポリカルボン酸またはポリヒドロキシポリカルボン酸組成物の重量による使用量は、それが含まれる水性媒体中に含まれるタンパク質の推定含有量と少なくとも等しい。更に、ポリカルボン酸組成物は、水性媒体中で使用されることが好ましい。この沈降段階では、これらの各水性媒体におけるタンパク質およびポリカルボン酸組成物の濃度は、重量で約３：１から約１：３の間の割合であり、最も好ましくは、各水性媒体中のタンパク質および架橋ポリカルボキシ酸またはポリヒドロキシポリカルボン酸組成物の濃度は、重量で実質的に等しいことである。実際の沈降過程は、広い範囲内で多少ｐＨに依存する。従って、架橋ポリカルボン酸組成物を含有する媒体のｐＨは、約３から約７．５の間であることが好ましく、成分の混合後は約ｐＨ６．５を越えない。沈降反応の後、そこからペレットとしてマトリックスを回収するために反応混合物を遠心分離することが望ましい。当該タンパク質を変性させることなくマトリックスからタンパク質を分離することは、約ｐＨ８．６〜約９．５において緩衝液を用いて前記マトリックスを処理することによって行ってもよい。マトリックスのペレットの容積当たり、約ｐＨ８．６〜約９．５において、約１〜約５容積の緩衝液を使用することが好ましい。本発明はそれに限定されないが、緩衝液がトリス緩衝液である場合により好ましい結果が得られた。この方法は、また、特にタンパク質および核酸を含む流体からの核酸の分離にも有用である。この場合、核酸またはその混合物の源は、しばしば水性グアニジニウムチオシアナート（aqueous guanidinium thiocyanate）またはドデシル硫酸ナトリウム中に懸濁する細胞溶解物（Ccell lysate）である。代わりに、マトリックスをラウリル硫酸ナトリウムの水溶液で処理し、その後好ましくは反応混合物を遠心分離して残渣ペレットととしてまたはそれからポリヒドキロシポリカルボン酸を回収することにより、マトリックスから架橋ポリヒドロキシポリカルボン酸組成物を回収してもよい。この方法において、タンパク質が変性される場合、マトリックスの残渣ペレットの容積当たり、約０．５〜約２％（ｗ／ｗ）濃度のラウリル硫酸ナトリウムの約１〜約３容積が使用される。その後、回収ポリヒドロキシポリカルボン酸（残渣）を洗浄し、緩衝液中で再懸濁する工程を含むことが好ましく、ここにおいてＲ＝メトキシであり、ｐＨ４〜４．５で脱イオン水を使用する。図面の簡単な説明図は、ポリマーNおよび従来のポリマー、ポリマーＰＡ（米国特許５，４５３，４９３−実施例２の化合物Ｖ、ポリマーはメチルビニルエーテル無水マレイン酸共重合物および１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンから得られる）の水および各種の塩の存在下に膨張する場合において、粘度を時間に対しプロットしたものである。本発明の化合物であるポリマーNは、下記のように、メチルビニルエーテル無水マレイン酸共重合物を１，９−デカジエンを用いて架橋し、その後同様に１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンで架橋することにより得られる。図１は、水中の実験の結果を示し、図２は、塩化リチウム水中の実験の結果を示し、図３は、塩化ナトリウム水中の実験の結果を示し、図４は、塩化カリウム水中の実験の結果を示し、図５は、塩化セシウム水中の実験の結果を示す。好適な実施態様の記述架橋ポリカルボン酸またはポリヒドロキシポリカルボン酸組成物本発明は、式Ｉ：のポリマーをα，ω−ジアミノアルカン、好ましくは式ＩＩ： H₂N.[(H)p(CH)z.(OH)m].NH₂ （ＩＩ）ここに、式中、ｍ，ｐ，ｗおよびｚは上記と同じであり、ｘおよびｙは７〜１０、０００の整数である、のジアミノヒドロキシアルカンで架橋することにより形成される組成物を含んでいる。 Rは、水素、炭素原子数１〜４の低級アルケンもしくは低級アルコキシまたはフェニルである。式ＩのRがメトキシであることが好ましい。１，９−デカジエンで架橋されたメチルビニールエーテル／無水マレイン酸の共重合体は、商品名スタビライズ（Stabileze）０６およびスタブレズ（Stablez e）Q，Mとして販売されている。これらの二つの生成物は粒径だけが違っており、インターナショナルスペシャリティプロダクツ（ISP、Bound Brook，New Jersey）により提供される。これらの生成物は増粘剤であり、それらは特に皮膚ケア、毛髪ケアおよび着色化粧品のために開発された。逆説的にいえば、本発明は、最終的に不均質に結合された生成物が低い粘性であることを要求するものである。本質的に高粘性の出発物質が、非常に低い粘性の生成物に変換された。式ＩＩにおいて、ｚが１〜６の整数であり、ｐは０またはｚ−１までの整数であり、ｍは０またはｚまでの整数である。式ＩＩの各（ＣＨ）基は、そこに付着されるヒドロキシル基を一つ有するかまたは有さないのいずれかである。架橋部分はヒドロキシル基を有しなくてもよく、または架橋結合鎖中に（CH）基につき１つまでのヒドロキシル基、即ち、二つのアミド基の間にｚ個までのヒドロキシル基を有してもよい。式ＩＩのそのようなα，ω−ジアミノアルカン類としては、市販のアルカン類、好ましくは１，３−プロピレンジアミン、１，６−ヘキサメチレンジアミンのようなジアミノアルカンが、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン（Aldr ich Chemical Co.，Milwaukee,Wl）等のジアミノヒドロキシアルカン類が挙げられる。水不溶性架橋ポリカルボン酸またはポリヒドロキシポリカルボン酸中に残っているいかなる無水物基も、アルカリ加水分解によって加水分解される。不溶性架橋ポリカルボン酸またはポリヒドロキシポリカルボン酸組成物において、ジアミノヒドロキシアルカンの初期仕込量のポリ（アルキレンマレイン酸無水物）初期仕込量との割合は、仕込まれたポリマー１ｇに対し、架橋剤約１×１０^-5〜１×１０^-3モルであることが好ましい。化合物Ｖは、すなわちこのように形成される：ここに、ｍ＝０または１、ｐ＝３〜６、ｗ＝６、およびｘとｙは７〜１００００である。架橋ポリカルボン酸組成物の製造方法水不溶性の架橋ポリカルボン酸組成物を製造する方法は、厳格に無水条件下で、式Ｉのポリマーを式ＩＩのα，ω−ジアミノアルカンで架橋させ、その後未反応無水物基を加水分解させる反応が含まれる。式Ｉに相当する所定量のアルキレン架橋ポリ（アルキレン無水マレイン酸）を反応容器に加える。式ＩＩに相当する所定量のα，ω−ジアミノアルカンを、同様に反応容器に加える。ジアミノアルカンの初期仕込量とポリ（アルキレン無水マレイン酸）の初期仕込量の割合は、ポリマー１．０ｇに対し、約１×１０^-5〜１×１０^-3モルの架橋剤であることが好ましい。上記は、式Ｉのポリマーを無水溶媒、好ましくはアセトンに懸濁させ、α，ω −ジアミノまたはジアミノヒドロキシアルカンの溶液をアセトンのような類似の溶媒に１〜５時間で加え、その後、２４〜４８時間撹拌し、その間反応混合物を室温に放置する。反応は常圧、室温で又は加熱下で行ってもよい。ジアミノアルカンは、式Ｉのポリマーの無水物基と架橋してカルボキシル基及びアミド基となる。反応は水を添加して停止し、次に水性アルカリで塩基加水分解することが好ましい。この加水分解ステップの間に、未反応無水物基はカルボキシ塩基に変換され、反応液から除去される。本発明のポリマー類の溶液群がアルカリ金属塩類によって安定化されることが驚くべきことに見いだされた。この安定化は、Ｌｉ⁺＜Ｎａ⁺＜Ｋ⁺＜Ｒｂ⁺＜Ｃｓの順で増大する。市販のものとして容易に入手できるカリウムおよびセシウムが、好ましいものである。任意の可溶性ハロゲン化物、特に塩化物は、これらが市販のものとして容易に入手できるために有用である。アルカリ金属イオンの濃度は安定化に適当であるべきであるが塩析を生じる程は高くないものとされるべきである。これゆえ、０．０５〜０．５Ｍアルカリ金属水溶液中の０．１％〜１０％ｗ／ｗのポリマー溶液を調製することが有用である。最も好ましくは、０．１〜０．３Ｍ塩化カリウムまたは塩化セシウム水溶液中の１％〜３％ｗ／ｗのポリマー溶液、特に０．０Ｍ塩化カリウムまたは塩化セシウム水溶液中の１％ｗ／ｗのポリマー溶液である。水不溶性架橋ポリヒドロキシポリカルボン酸組成物を用いてのタンパク質除去方法本発明のさらなる実施態様は、タンパク質含有水性媒体からの同タンパク質の沈降方法であり、これは、上記架橋ポリヒドロキシポリカルボン酸組成物の有効量を前記水性媒体中へ添加し、これによってタンパク質／ポリカルボン酸ないしポリヒドロキシポリカルボン酸組成物マトリックスを形成することよりなる。前記水性媒体は、除去すべきと欲されるタンパク質を含有する希釈ないしは非希釈の生物学的液体であり得、例えば、全血、血漿、血清、リンパ、胆汁、尿、脊髄液、痰および汗等ならびに便排泄物などが包含される。さらにまた、ヒトまたはその他の動物の組織、例えば、骨格筋、心臓、腎臓、肺、脳などの組織の液状調製物、および細胞培養抽出物または乳汁または微生物学的培養液またはプラント抽出物などに使用することも可能である。好ましい生物学的流体は、ヒト血液および微生物細胞溶解物（bacterial cell lysates）である。前記水不溶性架橋ポリカルボン酸ないしポリヒドロキシポリカルボン酸組成物は、エマルジョン、懸濁液、溶液または乾燥粉末の形態でタンパク質含有水性媒体中へ添加してもよい。架橋ポリカルボン酸ないしポリヒドロキシポリカルボン酸組成物の生物学的流体に対する割合は、所望する除タンパクの度合に応じて変更できる。しかしながら、最適な割合は、タンパク質の濃度、純化すべき物質の状態および濃度、温度、ｐＨ値およびイオン濃度に留意して、それぞれの場合に応じて、好ましく決定されるべきである。温度およびｐＨ値は、原則として臨界的なものではない。しかしながら、温度は通常、０℃〜１００℃の間にあり、好ましくは、４℃以上でかつ６０℃以上でない温度である、というのはこの温度以上では実質的に回復不能なタンパク質変性が生じるからである。架橋ポリカルボン酸ないしポリヒドロキシポリカルボン酸組成物によるタンパク質沈降の効率は、より高い温度で増大するように思われることが留意される。換言すれば、より少ない架橋ポリカルボン酸組成物が６０℃の試料溶液からタンパク質の９０％を除去するために、３０℃の別の同一の溶液から除去する場合よりも、より少ない架橋ポリカルボン酸組成物が必要とされるというものである。該組成物の効率は、鎖間の架橋に水酸基が存在する、すなわち、架橋剤がジアミノヒドロキシアルカンである場合はより大きいものである。タンパク質含有水性媒体のｐＨ値は、水不溶性架橋ポリカルボン酸ないしポリヒドロキシポリカルボン酸組成物の添加後において、約ｐＨ７．５を超えず、好ましくは約ｐＨ６．５を越えない。タンパク質の重量濃度およびポリヒドロキシポリカルボン酸の重量濃度はそれぞれの水性媒体で、好ましくは約３：１〜約１：３の比率である。用いられる架橋ポリカルボン酸ないしポリヒドロキシポリカルボン酸組成物の重量による使用量は、通常、水性媒体中に含有されると見積もられるタンパク質の量と、少なくとも等しい量である。タンパク質含有水性媒体への添加に先立ち、水不溶性架橋ポリカルボン酸ないしポリヒドロキシポリカルボン酸組成物がそれの固有の水性媒体中に懸濁される場合、ＲがＭｅＯで、該ポリカルボン酸ないしポリヒドロキシポリカルボン酸組成物を含有する媒体のｐＨが約３〜約５であり、これによってｐＨ約６．５を超えない当該組成物の混合後の媒体が得られる。該水性媒体の除タンパクの度合は、該架橋ポリカルボン酸組成物試薬における反応性基の濃度に依存する。反応性基の濃度は、その適当な量によって十分な量の結合を保証する本発明の実施可能性に関して臨界的なものではない。代表的には、架橋ポリカルボン酸ないしポリヒドロキシポリカルボン酸組成物試薬は、生物学的流体へ添加され、そして、ある固定時間（fi xed time通常、５〜１５分間）に激しい接触（例えば、撹拌またはその後に静置を伴う反転による）を受ける。この結果得られたタンパク質と結合している架橋ポリカルボン酸組成物とタンパク質とのマトリックスからなる水不溶性相は、除去される。この除去は、相分離（例えば、遠心分離、濾過または沈降）に関して慣習的な任意の周知の方法によって実施できる。水不溶性相の除去は、これによって除タンパクされた上澄液を提供する。水不溶性相の除去が遠心分離による場合、遠心は、約５〜１００，０００×ｇにて、０．２〜１０時間、または単位重力下に設定して行うべきである。超遠心の速度は、得られるペレットが非常に密に充填され、上澄み液がデカンテーションされた際に微細物が失われないために好ましく用いられ得る。タンパク質除去の本方法は、また、該架橋ポリカルボン酸ないしポリヒドロキシポリカルボン酸組成物によって沈降される、または、それと共に適当な処理によって、例えば、特定の緩衝液あるいはその他の抽出薬、例えば界面活性剤の使用によって沈降される、ある物質の抽出にも用いることができる。この物質の除去は、調製的または分析的目的のためのものとなりうる。緩衝液がマトリックスからのタンパク質の分離に用いられる場合は、これは約ｐＨ７．０〜約８．５で１０〜６０分間緩衝液で該マトリックスを撹拌、粉砕および／または振盪することによって行うことができる。該マトリックスのペレットの１容積当たり、緩衝液を約ｐＨ７．０〜約８．５にて、約１〜約５容積用いる。緩衝液は、好ましくはトリス（Tris）緩衝液である。マトリックスが界面活性の抽出薬（好ましくはトウィーン（Tween）またはラウリル硫酸ナトリウム）を用いて処理される場合、マトリックス残存ペレットの１容積当たり、約０．５〜約２％ｗ／ｗの濃度のラウリル硫酸ナトリウム約１〜約３容積が用いられる。上述したステップ群を実行し、そして該水不溶性架橋ポリカルボン酸ないしポリヒドロキシポリカルボン酸組成物を沈降したマトリックスから回収しようとする場合、該不溶性ポリマーは、（ａ）残存する界面活性剤を除去するために水で洗浄し、（ｂ）該マトリックスを約ｐＨ１．５へと酸性化し、（ｃ）該マトリックスを４〜４．５の間のｐＨが得られるまで脱イオン水で洗浄し、そして（ｃ）該ポリマーを蒸留水中に再懸濁する（最終ｐＨ４〜４．５）ことによって回収され得る。タンパク質を沈降するこの方法は、タンパク質が核酸またはその混合物とともに水性媒体中に存在する場合に特に有用である。これは、核酸またはその混合物の源が、水溶性グアニジニウムチオシアナート（guanidinium thiocyanate）中に懸濁された細胞溶解物である場合に頻繁にある。除タンパク化された上澄液（除タンパク後に後ろに残された除タンパク化された流体）は、さらに任意の方法においてさらに処理されることが可能である。調製的目的のため（例えば、ペプチド、グリコプロテイン、ステロイド、リポイド、核酸、酵素、ホルモン、ビタミン、ウィルス、多糖類またはアルカロイドの精製のため）、例えば、更なる精製ステップが実施され得る。この場合、特に、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、セファデックス（Sephadex）、アフィニティーまたは吸着クロマトグラフィー）、濾過（例えば、限外濾過）、電気泳動（例えば、ブロック、ディスク、または無重力電気泳動（carrier-free elect rophoresis））、等電収束および選択的沈降が好ましいものである。本発明の範囲を何ら限定することなく、出願人は、本発明についての当人の理解、すなわち、架橋ポリカルボン酸ないしポリヒドロキシポリカルボン酸組成物が水性媒体からタンパク質を除去することによる機構を述べたい。沈降性は水性媒体における溶解性の一つの機能である。換言すれば、溶解性とは、タンパク質の疎水性の度合いの少なくとも一部における一つの機能である。全てのタンパク質は、水性媒体に曝されたそれらの表面に少なくともいくつかの疎水性部分を有している。出願人は、当人の架橋ポリカルボン酸ないしポリヒドロキシポリカルボン酸組成物が、異なるタンパク質分子の疎水性部分をお互いに近づけ、そしてタンパク質が結果的に沈降するような度合いで凝集させると思っている（これは、より高い温度での、溶液からの架橋ポリカルボン酸ないしポリヒドロキシポリカルボン酸組成物の増大したタンパク質除去効率によって、確証されるであろう。対照的に、他の現象、例えば、会合／脱離、によってタンパク質沈降が引き起こされる場合、タンパク質沈降は、温度上昇に従って減少することが観察される。）。このことが生じ得る前に、該架橋ポリカルボン酸ないしポリヒドロキシポリカルボン酸組成物は、非共有的な相互作用、例えば電荷誘引、によって、１ないしそれ以上のタンパク質分子と結合している（該架橋ポリカルボン酸ないしポリヒドロキシポリカルボン酸組成物は、数多くの陰電荷を有しており、この陰電荷は、全てのタンパク質分子におけるいくつかの部位に存在する、例えば、アルギニン残基での、部分陽電荷と相互作用することができる。）。表面疎水性基によって課された(impose)水の局部配置は、熱力学的に好ましくない。結合水は、無極性のこれらの疎水性基が相互に作用しそして凝集した際に、放出されるであろう。従って、フレキシブルな架橋ポリカルボン酸ないしポリヒドロキシポリカルボン酸組成物と相互作用している２ないしそれ以上のタンパク質が、一本の糸上のビーズ群のようである場合、該組成物−糸は、別々のタンパク質−ビーズ群の無極性部分群が凝集するように、折り畳むことができる。凝集したタンパク質分子群の数ないし大きさが十分に大きな場合、該タンパク質−組成物複合体が沈降する。次の実施例は本発明を説明することを意図するものであって、いかなる点からも発明を制限するものではない。実施例１水不溶性ポリマーV(a)の調製ポリマーの調製３．０ｇの０．０３３モルの１，３−ジアミノ２ヒドロキシプロパンが２．０Ｌ（アセトン）乾燥されたガラス容器内に収容された１．０Ｌのアセトンに溶解された。無水条件は、常時維持された。１，９−デカジエン（Ｓｔａｂｉｌｉｚｅ０６）で架橋された６０ｇの無水マレイン酸メチルビニルエーテルが5L容反応フラスコ内に収容された１Ｌのアセトンに溶解され、４．５撹拌セッティングを用いて３０分間撹拌された。（このポリマーは、アセトンに不溶である。）。架橋剤は、ＦＭＩ定量ポンプ（ポンプセッティング４）を使用して、３７０ｍｌ／ｈｏｕｒの流速で反応フラスコに供給された。反応は室温で、４８時間あるいはそれ以上行われた。この反応時間後、２Ｌの水道水が反応液に攪拌されながら添加された。内容物が４つの１Ｌ遠心管に移され、３０００ｇで１０分間遠心分離された。上清は２０Ｌ容のプラスチック容器に移され、換気フード内に置かれた。ペレットは、ペレットと等容量の水中に分散され、６０のセッティングで３０秒間ジフォードウッド（Gifford wood）ホモジナイザーでホモジナイズされた。ホモジネートの容積は、水で２．５Ｌに調整された。マグネティックスターラで撹拌しながら、２．５Ｌの０．２Ｎ水酸化ナトリウムが添加され、１５分間撹拌されて、３０００×ｇで１０分間遠心分離された。ペレットは４Ｌの水で抽出され、分散されて、再び遠心分離された。この洗浄処置は、さらに２回繰り返された。このペレットは、ペレットと等量の蒸留水中に分散され、マグネティックスターラで撹拌され、ホモジネートのｐＨは４ＮＨＣｌの添加により１．５に調節された。遠心分離後、上清は除去された。このペレットは蒸留水で水洗され、再び遠心分離され、そして上清のｐＨが５．０〜５．５になるまで、洗浄処置が繰り返された。これにより、ｗ＝６でＲがメトキシである式Ｖ（ａ）のポリマーが提供される。二つの炭素原子を有する架橋部分を有するポリカルボン酸またはポリヒドロキシポリカルボン酸組成物を、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンをジアミノ−ヒドロキシエタン（例えば１，２−ジアミノ−１−ヒドロキシエタン）と代える以外は、上記のステップに従って形成され得る。架橋部分が多数のヒドロキシル基を有するポリヒドロキシポリカルボン酸組成物は、１，３−ジアミノ− ２−ヒドロキシプロパンを１，２−ジアミノ−１，２−ジヒドロキシエタンと代えることにより上記のステップに従って形成され得る。多数のヒドロキシル基を持つ三つの炭素原子を有する架橋部分を有するポリカルホン酸またはポリヒドロキシポリカルボン酸組成物は、１，３−ジアミノ−２ −ヒドロキシプロパンを１，３−ジアミノ−ジ−または１，３−ジアミノ−トリ −ヒドロキシプロパン（例えば１，３−ジアミノ−１，２−ジヒロキシプロパンまたは１，３−ジアミノ−１，２，３−ジヒロキシプロパン）と代える以外は、上記のステップに従って形成され得る。四つの炭素原子を有する架橋部分を有するポリカルボン酸またはポリヒドロキシポリカルボン酸組成物は、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンをα，ω−ジアミノ−モノ−ヒドロキシ−ｎ−ブタン（例えば１，４ −ジアミノ−３−ヒドロキシブタンまたは１，４−ジアミノ−１−ヒドロキシ− ブタン）と代える以外は、上記のステップに従って形成され得る。架橋部分が１以上のヒドロキシル基を有するポリヒドロキシポリカルボン酸組成物は、α，ω −ジアミノ−モノ−ヒドロキシ−ｎ−ブタンを１，４−ジアミノ−ジ−、１，４ −ジアミノ−トリ−または１，４−ジアミノ−テトラヒドロキシブタン（例えば１，４−ジアミノ−２，３−ジヒドロキシブタンまたは１，４−ジアミノ−１，２−ジヒドロキシブタン、１，４−ジアミノ−１，２，３−トリヒドロキシブタン、１，４−ジアミノ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン）と代える以外は、上記のステップにより形成され得る。実施例２デオキシ脂肪族ジアミン（すなわち、ｍ＝０）を用いたポリマーＶ（ｂ）の調製３．６６ｇの１，３−プロピレンジアミンは、３Ｌ乾燥ガラス容器で１．０Ｌアセトンと混合された。無水条件は、常時維持された。６０ｇの無水マレイン酸メチルビニルエーテルは、５Ｌの反応フラスコ内に収容された１Ｌアセトン中の１，９−デカジエン(Stabileze 06）で架橋され、４．５の撹拌セッティングを使用して30分間撹拌された。（このポリマーは、アセトンに不溶であった。）。架橋剤は３７０ｍｌ／ｈｏｕｒの流速（ポンプセッティング４）で反応フラスコに供給された。反応は室温で、４８時間あるいはそれ以上進行された。反応後、２Ｌの水道水が反応液に撹拌されながら添加された。反応物は４つの１Ｌ遠心管に移され、３０００×ｇで１０分間遠心分離された。上清は２０Ｌのプラスチック容器に移され、換気フード内に置かれた。このペレットは、ペレットと等容積の水に分散され、６０のセッティングで３０秒間ギフォードホモジナイザーでホモジナイズされた。ホモジネートの容積は、水で２．５Ｌに調整された。マグネティックスターラを用い、２．５Ｌの０．２Ｎ水酸化ナトリウム溶液が添加され、１５分間かき混ぜられて、３０００×ｇで１０分間遠心分離された。ペレットは４Ｌの水で処理され、分散されて、再び遠心分離された。この洗浄処置は、さらに２回繰り返された。このペレットは、ペレットと等容積の蒸留水で分散され、マグネティックスターラで撹拌され、ホモジネートのｐＨは４ＮＨＣｌの添加により１．５に調節された。遠心分離後、上清は除去された。上清は、蒸留水で水洗され、再び遠心分離され、上清のｐＨが５．０〜５．５になるまで、洗浄処置が繰り返された。実施例３実施例１（Ｖ）（ポリマーＮ）により作製された主たるポリヒドロキシポリカルボン酸組成物が、以下の表１に列記された様々な物質を沈降させる能力に関して評価される。表１（ヒト血清アルブミンからプラスミドＤＮＡまで）に記載される全ての物質は、シグマケミカルカンパニー、ミズーリー州セントルイス（Sigma Chem ical Company，St．Louis，Missouri）から粉末または微粒子形状として得られる。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、３３ｍｇ／ｍｌの濃度で、ｐＨ７．３〜７．５の、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝０．９％生理食塩水に溶解される。（残りの化合物であるウシイムノグロブリンから糖タンパク質までは表１に示される濃度で同じリン酸緩衝生理食塩水に同様に溶解される。）ＵＳ５，４５４３，４９３（ポリマーＰＡ）の実施例２のポリマー（Ｖ）と同様に、実施例１において作製されたポリヒドロキシポリカルボン酸組成物（ポリマーＮ）の１％ｗ／ｗ溶液は、リン酸ナトリウム緩衝生理食塩水溶液を用いて作られる。架橋ポリヒドロキシポリカルボン酸組成物溶液（「除蛋白剤」）の１容積は、試料溶液の等容積と組み合わされる。各々の溶液の組合せは反転により混合され、そして１０分間、室温で静置される。各々の溶液は、２，０００×Ｇで１０分間、タンパク質−ポリヒドロキシポリカルボン酸組成物マトリックスを除去するために、遠心分離される。各々の残留する上清のタンパク質除去の百分率は、紫外線吸収（２８０ナノメートル）または比色定量（ピアスカンパニー、イリノイ州ロックビル（Pierce Company，Rockville，IL）からの「ＢＣＡプロティンアッセイリージェント（BCA Protein Assay Reagent）」を使用する）により測定される。タンパク質除去（「除去％」）の百分比は、表１に示される。タンパク質のウシ血清アルブミン、ウシイムノグロブリンおよびヘモグロビンは、架橋ポリヒドロキシポリカルボン酸組成物により、９０％あるいはそれ以上のレベルで除去される。これらのタンパク質は、これらと結合する炭水化物のレベルが一様に低い。反対に、α１酸性糖タンパク質は、炭水化物をたくさん有しているゆえに「除去％」は低い。最後に、表１のＤＮＡ試料については見られるように、非タンパク性の物質は架橋ポリヒドロキシポリカルボン酸組成物によって、ほとんど沈降されない。タンパク質結合データは、ポリマーＮがポリマーＰＡより高いタンパク質結合能を有することを明瞭に証明した。未反応性成分の効果は、ポリマーＰＡのそれと同様であると思われる。実施例４アニオンおよび中性界面活性剤の存在下でのポリマーＮのタンパク質結合能ＢＳＡ溶液は、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．３中に３３ｍｇ／ｍｌの濃度でかつ（ａ）１．０％ｗ／ｖトウィーン８０または１．０％ｗ／ｖラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のいずれか１つを含有させてそれぞれ調製した。水に分散したポリマーＮの１．０％ｗ／ｗ懸濁液を用いた。１容量のポリマー懸濁液及びそれぞれの界面活性剤を含む１容量のタンパク質溶液を本実験に用いた。タンパク質溶液およびポリマー懸濁液の各混合物を撹拌し、１０分間室温で放置し、１０分間２０００×ｇで遠心分離した。上澄みを取出し、２８０ｎｍでのＵＶ吸収を利用してタンパク質を分析した。ＢＳＡ-ＳＤＳ溶液及びＢＳＡ-トウィーン８０溶液からのタンパク質除去率は、９９％より大きかった。実施例５デオキシ脂肪族（Deoxyaliphatic）ジアミンスペーサー（すなわち、mはゼロに等しい）で架橋されたポリマーNのタンパク質結合能化合物（Ｖｂ）、すなわち、プロピレンジアミンで架橋されたポリマーＮ（１．０％ｗ／ｗ）の類似化合物（ポリマーＮＢ）及びポリマーＰＡ（１．０％ｗ／ｗの従来品ポリマー）を、１ｍｌの各々の懸濁液を１ｍｌのＢＳＡ（３３ｍｇ／ｍｌ、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．３）を含む分離した複数の試験管に添加してタンパク質結合能に関して比較された。タンパク質除去率は、ポリマーＮＢ（ｍ＝０）で８３％、従来品（ポリマーＰＡ）で７３．５％であった。デオキシ型のポリマーＮＢ（ｍ＝０）が、脂肪族スペーサにヒドロキシルを一つ有するポリマーＮ（ｍ＝１）より反応性が小さいことは興味のあることである。ポリマーＮ（ｍ＝１）は、ＢＳＡ（初期濃度３３ｍｇ／ｍｌ）の９８％を除くことを示した。実施例６ポリマーＮおよびＰＡの安定度に関するイオン環境と同様に温度の影響を測定するために、実験を水及びグループＩエレメントの塩化物塩を含む溶液の存在下に、４５℃で実施した。これらは水（該ポリマーは、対イオンを構成するＨ⁺を有するそれらの形で存在した）、０．１ＭＬｉＣｌ、０．１ＭＮａＣｌ、０．１ＭＫＣｌ及び０．１ＭＣｓＣｌである。全ての実験は、１．０ｗ／ｗ％のポリマーＮ及びポリマーＰＡをそれぞれ用いて行った。ポリマーの懸濁液を、１０分間３０００×ｇで遠心分離し、その後該ポリマーのゲルと液体の容積比を遊離の液体４容量に対し該ゲル１容量の割合に調節した。試験管の内容物を混合し、４５℃のインキュベータに入れた。該試験管を２４時間間隔でインキュベータから取り出し、遠心分離し、遊離の液体容積に対する該ゲル容積の比率を記録した。当該比率はインキュベーション時間に伴って増加し、増加する粘性の指標となる。いくつかの媒質中でのゲルの容積の増加をグラフに表した（図１〜５）。ゲルの膨張は、存在する対イオンまたはインキュベーション時間に関係なく、ポリマーNの懸濁液よりもポリマーＰＡの懸濁液においてより顕性である。非ピペッタブル(non-pipettable)な粘着性ゲルへのポリマーＰＡの全変換は、純水においては７２時間経過後に；０．１Ｍ塩化リチウムおよび０．１Ｍ塩化ナトリウムにおいてはそれぞれ９６時間後に、そして０．１Ｍ塩化カリウムおよび０．１Ｍ塩化セシウムにおいてはそれぞれ１２０時間後に生じた。対照的に、ポリマーＮの懸濁液は、少ないゲル形成によって証明されたように、ゲル化の傾向がより少なかった。１２０時間のインキュベーションの後、液相の相当な量がポリマーＮの調製液の全てに存在していた。懸濁媒質中の対イオンの性質に関し、その回収容量は、Ｃｓ⁺＞Ｋ⁺＞Ｎａ⁺＞Ｌｉ⁺＞Ｈ⁺の順序に減少した。ポリマーＮの全ての懸濁液は、１２０時間、４５℃でインキュベーション後、ピペッタブル(pipettable)なものであった。これらの条件下において、ポリマーＰＡは、粘着性ゲル状態への全変換を受け、継続して試験を受けることができなかった。インキューベートされたポリマーＮの懸濁液をタンパク質結合能につき試験し、結果を非加熱の対照品と比較した。実施例７ポリマーＮのタンパク質結合能への長期加熱の影響を測定した。水中及びグループＩエレメントの塩化物塩の水性溶液の存在下の１．０％ｗ／ｗの懸濁液を１２０時間、４５℃で加熱した後、このポリマーをタンパク質結合に関して試験した。１ｍｌの各ポリマー懸濁液を、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．３中の３３．０ｍｇ／ｍｌ濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１．０ｍｌに添加した。内容物を撹拌し(vortexed)、１０分間室温で放置し、その後遠心分離した。上澄みを取出し、タンパク質を分析した。結果をポリマーＮについてのみ下記に表した。データは、１２０時間４５℃でのインキュベーションがポリマーＮのタンパク質結合能への検知できる影響がないことを示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．式：ここに、Ｒは水素、炭素数１〜４の低級アルキレンもしくは低級アルコキシまたはフェニルであり、ｘおよびｙは整数であるポリマーと、式：Ｈ₂Ｎ［（Ｈ）_P（ＣＨ）_z（ＯＨ）_m］ＮＨ₂ ここに、ｚは１〜６の整数であり、ｐは０またはｚ−１までの整数であり、ｍは０またはｚまでの整数であり、ｗは２〜１２の整数であるα，ω−ジアミノアルカンを架橋し、未反応の無水物基を加水分解して得られる水不溶性架橋ポリカルボン酸含有物質。２．ｗ＝６、ｚ＝３〜６であり、ポリ（アルキレン無水マレイン酸）の初期仕込量に対するジアミノアルカンの初期仕込量の比率が、ポリマー１．０ｇに対しジアミノアルカン約１×１０^-5〜１×１０^-3モルである請求項１記載の物質。３．ｘおよびｙが７〜１０，０００である請求項１記載の物質。４．請求項１記載の物質をアルカリ水で処理して得られる生成物。５．式：ここに、Ｒは水素、炭素数１〜４の低級アルキレンもしくは低級アルコキシまたはフェニルであり、ｘおよびｙは整数であり、ｚは１〜６の整数であり、ｐは０またはｚ−１までの整数であり、ｍは０またはｚまでの整数であり、ｗは２〜１２の整数である酸から選ばれる水不溶性架橋ポリカルボン酸。６．ｗ＝６、ｚ＝３〜６であり、ポリ（アルキレン無水マレイン酸）の初期仕込量に対するジアミノアルカンの初期仕込量の比率が、ポリマー１．０ｇに対しジアミノアルカン約１×１０^-5〜１×１０^-3モルである請求項５記載の酸。７．ｘおよびｙが、７〜１０，０００である請求項５記載の酸。８．Ｒがメトキシであり、ｍ＝１または０である請求項６記載の酸。９．式：ここに、Ｒは水素、炭素数１〜４の低級アルキレンもしくは低級アルコキシまたはフェニルであり、ｘおよびｙは整数であり、ｗは２〜１２の整数であるポリマーと、式：Ｈ₂Ｎ［（Ｈ）_P（ＣＨ）_z（ＯＨ）_m］ＮＨ₂ ここに、ｚは１〜４の整数であり、ｐは０またはｚ−１までの整数であり、ｍは０またはｚまでの整数であるα，ω−ジアミノアルカンを架橋し、未反応の無水物基を加水分解することからなる請求項５記載の水不溶性架橋ポリヒドロキシポリカルボン酸の製造方法。１０．ｗ＝６、ｚ＝３〜６であり、ポリ（アルキレン無水マレイン酸）の初期仕込量に対するジアミノアルカンの初期仕込量の比率が、ポリマー１．０ｇに対しジアミノアルカン約１×１０^-5〜１×１０^-3モルである請求項９記載の方法。１１．ｘおよびｙが、７〜１０，０００である請求項１０記載の方法。１２．Ｒがメトキシであり、ｍ＝１または０である請求項１０記載の方法。１３．請求項５記載のポリカルボン酸の有効量を加え、タンパク質／ポリカルボン酸マトリックスを形成させることからなる、タンパク質含有水性媒体からタンパク質を沈降させる方法。１４．請求項８記載のポリカルボン酸の有効量を加え、タンパク質／ポリカルボン酸マトリックスを形成させることからなる、タンパク質含有水性媒体からタンパク質を沈降させる方法。１５．ポリカルボン酸の使用量が、水性媒体中の推定タンパク質量と少なくとも同重量である、請求項１３記載の方法。１６．ポリカルボン酸の使用量が、水性媒体中の推定タンパク質量と少なくとも同重量である、請求項１４記載の方法。１７．ポリカルホン酸が水性媒体の形態で使用される、請求項１３記載の方法。１８．ポリカルボン酸が水性媒体の形態で使用される請求項１４記載の方法。１９．各々の水性媒体におけるタンパク質の重量濃度およびポリカルボン酸の重量濃度が約３：１から約１：３の比率である、請求項１５記載の方法。２０．各々の水性媒体におけるタンパク質の重量濃度およびポリカルボン酸の重量濃度が約３：１から約１：３の比率である、請求項１６記載の方法。２１．各々の水性媒体におけるタンパク質の重量濃度およびポリカルボン酸の重量濃度が、実質的に同じである請求項１９記載の方法。２２．各々の水性媒体におけるタンパク質の重量濃度およびポリカルボン酸の重量濃度が、実質的に同じである請求項２０記載の方法。２３．Ｒがメトキシで、ｍ＝０であり、かつポリカルボン酸を含む媒体のｐＨが約３から約６．２で、成分混合後の媒体のｐＨが約６．５以下となるものである、請求項１４記載の方法。２４．Ｒがメトキシで、ｍ＝１であり、かつポリヒドロキシポリカルボン酸を含む媒体のｐＨが約５．５から約７．５で、成分混合後の媒体のｐＨが約７．５以下となるものである、請求項１４記載の方法。２５．反応混合物を遠心分離する工程、およびそれらからマトリツクスをペレットとして回収する工程を含む請求項１３記載の方法。２６．反応混合物を遠心分離する工程、およびそれらからマトリックスをペレットとして回収する工程を含む請求項１４記載の方法。２７．緩衝液を用い、ｐＨが約７．０から約８．５で請求項１３記載のマトリックスを処理することからなる、タンパク質を変性させることなく請求項１３記載のマトリックスからタンパク質を分離する方法。２８．緩衝液でｐＨが約７．０から約８．５で請求項１４記載のマトリックスを処理することからなる、タンパク質を変性させることなく請求項１４記載のマトリックスからタンパク質を分離する方法。２９．マトリックスのペレットの容積に対し約１から約５容量の緩衝液を、ｐＨが約７．０から約８．５で使用するものである、請求項２７記載の方法。３０．マトリックスのペレットの容積に対し約１から約５容量の緩衝液を、ｐＨが約７．０から約８．５で使用するものである、請求項２８記載の方法。３１．緩衝液が、トリス緩衝液である請求項２９記載の方法。３２．緩衝液が、トリス緩衝液である請求項３０記載の方法。３３．請求項１３記載のマトリックスをラウリル硫酸ナトリウム水溶液で処理することからなる、ポリカルボン酸を回収するために請求項１３記載のマトリックスかポリカルボン酸を分離する方法。３４．請求項１４記載のマトリックスをラウリル硫酸ナトリウム水溶液で処理することからなる、ポリカルボン酸を回収するために請求項１４記載のマトリックスからポリカルボン酸を分離する方法。３５．ラウリル硫酸ナトリウムで処理されたマトリックスを遠心分離する工程、およびそれらの残渣ペレットからポリカルボン酸を回収する工程を含む請求項３３記載の方法。３６．ラウリル硫酸ナトリウムで処理されたマトリックスを遠心分離する工程、およびそれらの残渣ペレットからポリカルボン酸を回収する工程を含む請求項３４記載の方法。３７．約０．５から約２％ｗ／ｗの濃度のラウリル硫酸ナトリウムを、マトリックスの残渣ペレットの容積に対し約１から約３容量で使用するものである、請求項３３記載の方法。３８．約０．５から約２％ｗ／ｗの濃度のラウリル硫酸ナトリウムを、マトリックスの残渣ペレットの容積に対し約１から約３容量で使用するものである、請求項３４記載の方法。３９．回収したポリカルボン酸残渣を洗浄する工程、およびそれを脱イオン水に再懸濁させる工程を含む請求項３８記載の方法。４０．ｐＨ４．０〜４．５で脱イオン水を使用するものである、請求項３９記載の方法。４１．タンパク質含有水性媒体が、さらに核酸またはその混合物を含むものである、請求項１３記載の方法。４２．タンパク質含有水性媒体が、さらに核酸またはその混合物を含むものである、請求項１４記載の方法。４３．核酸またはその混合物の起源が、グアニジニウムチオシアナート水溶液中に懸濁した細胞溶解物である請求項４１記載の方法。４４．核酸またはその混合物の起源が、グアニジニウムチオシアナート水溶液中に懸濁した細胞溶解物である、請求項４２記載の方法。４５．核酸またはその混合物の起源が、ドデシル硫酸ナトリウム水溶液中に懸濁した細胞溶解物である請求項４１記載の方法。４６．核酸またはその混合物の起源が、ドデシル硫酸ナトリウム水溶液中に懸濁した細胞溶解物である請求項４２記載の方法。４７．０．０５〜０．５Ｍのアルカリ金属溶液に０．０１〜１０％ｗ／ｗの濃度で請求項５記載の酸を加えてなる請求項５記載の酸の安定化水溶液。４８．０．０５〜０．５Ｍのアルカリ金属溶液に０．０１〜１０％ｗ／ｗの濃度で請求項８記載の酸を加えてなる請求項８記載の酸の安定化水溶液。４９．アルカリ金属が、ＫまたはＣｓであり、ハロゲン化物がＣｌである、請求項４８記載の溶液。５０．０．１〜０．３ＭのＣｓＣｌ水溶液に１〜３％ｗ／ｗの濃度で酸を分散させたものである、請求項４９記載の溶液。