CN114235697A

CN114235697A - 一种基于蛋白酶控制释放比色检测藻类碱性磷酸酶的纸基器件与应用

Info

Publication number: CN114235697A
Application number: CN202111565236.6A
Authority: CN
Inventors: 常洋洋; 张茜; 刘猛
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2021-12-20
Filing date: 2021-12-20
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2041-12-20
Also published as: CN114235697B

Abstract

本发明公开了一种基于蛋白酶控制释放比色检测藻类碱性磷酸酶的纸基器件与应用，属于分析检测领域。本发明通过RCA反应制备三维功能核酸，三维功能核酸结构中包含焦磷酸镁，利用碱性磷酸酶可以将焦磷酸镁水解为可溶性磷酸镁的作用特点，在数分钟内，三维功能核酸结构坍塌，释放被控的蛋白酶，在比色纸芯片加入TMB/H₂O₂显色底物后发生反应，产生颜色变化，显色深浅与待测物的含量成正比，整个检测过程约25min，检测成本低廉；本发明可应用于铜绿微囊藻藻液ALP活性检测，将藻液过膜处理后滴加于反应区，可通过显色深浅反映铜绿微囊藻藻液中ALP活性。本发明步骤简单、耗时短，不需大型分析仪器，可实现对待测物的快速现场定量检测。

Description

一种基于蛋白酶控制释放比色检测藻类碱性磷酸酶的纸基器件与应用

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种基于蛋白酶控制释放比色检测藻类碱性磷酸酶的纸基器件与应用，尤其涉及所述纸基器件在铜绿微囊藻藻液ALP检测中的应用。

背景技术

三维功能核酸是一类在生物技术领域极具应用潜力的材料，其具有较大的负载能力，其可以负载信号蛋白分子作为一种控释材料，基于三维功能核酸的响应型控释材料是一类新型的纳米材料，在生物传感器方面受到了特别的关注，当目标物存在时释放货物分子，产生检测信号，蛋白酶作为高效催化剂具有信号放大的作用，可以实现快速、灵敏的检测。这种材料同时还具有良好的生物相容性以及较高的稳定性，在生物传感器及药物递送方面都受到了特别的关注。

生物酶可以对检测信号进行放大，但是将纳米控释材料与生物酶结合时，由于蛋白质与材料的相互作用力较强，释放速度慢，将其用于分子的即时检测较困难。据知，目前关于蛋白质快速释放的控释材料的研究较少。

DNA纳米结构由于可编程性强使得其在多个领域显示了巨大的应用前景。近年来，由于三维功能核酸(3D DNA)具有高度有序和灵活的多孔结构，已被用于蛋白质包覆；但是其释放的应用和研究较少。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于蛋白酶控制释放的比色检测藻类碱性磷酸酶的纸基器件及其制备方法与在铜绿微囊藻藻液ALP检测中的应用。用于负载蛋白酶的3D DNA结构(protein@3D DNA)中包含了可被待测物质水解的焦磷酸镁，利用待测物质将焦磷酸镁水解为可溶性磷酸镁盐的变化，在数分钟内，释放负载的蛋白酶，实现碱性磷酸酶的快速传感及信号放大检测。

本发明的技术方案为：

一种基于蛋白酶控制释放比色检测藻类碱性磷酸酶的纸基器件，所述纸基器件由包括反应区Z1区和检测区Z2区的两层纸芯片构成，所述反应区Z1区封闭处理后，负载了由焦磷酸镁与DNA骨架组成的三维功能脱氧核糖核酸，所述三维功能核酸包裹蛋白酶，所述检测区Z2区负载了3,3',5,5'-四甲基联苯胺。

进一步地，上述技术方案中，所述纸基器件包括反应区器件和检测区器件，所述反应区器件上设有反应区Z1区，所述检测区器件上设有检测区Z2区，将反应区器件和检测区器件在竖直方向上重叠后，所述反应区Z1区与检测区Z2区在竖直方向上相对应，所述反应区Z1区和检测区Z2区均为亲水区，所述反应区器件上除了反应区Z1区以外的部分以及检测区器件上除了检测区Z2区以外的部分均为疏水区。

进一步地，上述技术方案中，所述反应区Z1区的材质包括NC；检测区Z2区的材质包括FF120HP；所述反应区Z1区的面积≤检测区Z2区的面积。

进一步地，上述技术方案中，所述蛋白酶包括辣根过氧化物酶HRP。

进一步地，上述技术方案中，包裹了蛋白酶的三维功能脱氧核糖核酸的制备方法，包括以下步骤：

a)SEQ ID NO.1所示的线性DNA模板环状化，得到环状DNA模板，纯化环状DNA模板，并将纯化的环状DNA模板溶于无酶无菌水中；

b)、向反应容器中添加环状DNA模板、SEQ ID NO.2所示的环状DNA模板引物、Phi29DNA聚合酶缓冲液、蛋白酶、dNTP Mixture、水，于室温下进行涡旋和离心混合均匀，最后向体系中加入Phi 29DNA聚合酶并吸打混匀，25-30℃反应25-45min，65-70℃反应5-10min终止滚环扩增反应，室温放置10-13h，离心，使用无酶无菌水重悬沉淀，所得沉淀物即为包裹了蛋白酶的三维功能脱氧核糖核酸。

本发明还提供了一种基于蛋白酶控制释放比色检测藻类碱性磷酸酶的纸基器件在制备生物传感器中的应用。

进一步地，上述技术方案中，利用纸基器件的反应区Z1区上碱性磷酸酶水解三维功能脱氧核糖核酸上焦磷酸镁为可溶性磷酸盐的变化，以释放被包裹的蛋白酶，蛋白酶在毛细作用力以及重力的双重作用下进入检测区Z2区，并在检测区Z2区上进行催化显色反应，进而实现碱性磷酸酶的检测。

进一步地，上述技术方案中，所述应用包括如下步骤：

(1)设计形状为两个圆形区域上下重叠在一起的纸基器件，两个圆形区域分别为反应区Z1区和检测区Z2区；圆形周围区域使用固体蜡打印机打印，得到微流控纸基器件；

(2)将打印好的反应区器件浸泡于封闭缓冲液中，封闭一段时间后室温烘干，将包裹了蛋白酶的三维功能脱氧核糖核酸打印到封闭后的反应区Z1区上，制成生物活性纸；将3,3',5,5'-四甲基联苯胺滴加到检测区Z2区，室温干燥，储存于室温；

(3)将反应区Z1区和检测区Z2区重叠在一起，反应区Z1区位于上层，并将含待测物质的缓冲液滴加于反应区Z1区，孵育后，反应区Z1区的溶液经纸基器件的毛细作用力和重力的双重作用下，逐渐向检测区Z2区下渗，下渗完全后将上层反应区Z1区去掉，再将底物显色液A、底物显色液B和HOAc-NaOAc缓冲液的混合溶液滴加于下层检测区Z2区的中心，一段时间后拍照，使用ImageJ软件进行分析。

进一步地，上述技术方案中，步骤(1)中使用固体蜡打印机打印，得到纸芯片器件后，于115-120℃加热2-3min。

进一步地，上述技术方案中，所述步骤(2)中封闭缓冲液为含质量分数为2％-4％BSA的PBS缓冲溶液，封闭时间为10～20min；添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺的浓度为15～20μM；所述步骤(3)中底物显色液A为3,3',5,5'-四甲基联苯胺的二甲基亚砜溶液；底物显色液B为H₂O₂；HOAc-NaOAc缓冲液为NaOAc和HOAc的混合溶液，将底物显色液A、底物显色液B和HOAc-NaOAc缓冲液的混合溶液滴加于检测区Z2区后，1-2min后拍照。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明方法的材料合成只需通过一步反应以及离心操作，步骤简单、易于执行。

2、本发明方法中对蛋白酶的负载提高了蛋白酶的长期稳定性，易于保存。

3、本发明方法可以很容易地扩展到其他检测目标，方法简单、可靠。

4、本发明方法与纸基传感器件结合，制备得到的生物传感器检测速度快，灵敏度高，与现有检测方法相比成本较低且不需大型分析仪器。

附图说明

图1为本发明实施例1中HRP@3D DNA门控材料合成及控释策略图。

图2为本发明方法中纸芯片器件工作原理图。

图3为HRP@3D DNA三维功能核酸超分子SEM图。

图4为HRP释放与反应时间关系图(插图为选择性)。

图5为灵敏度和选择性分析图。

图6为不同稀释倍数铜绿微囊藻藻液ALP检测灵敏度。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，通过实施例对本发明进行说明。本发明所列的这些具体实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

表1寡核苷酸序列汇总表

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的封闭缓冲液：25mM PBS，3wt％BSA，0.02wt％Tween-20，pH 7.5。

下述实施例中的洗涤缓冲液：8mM Na₂HPO₄,2mM KH₂PO₄,0.136mM NaCl,2.6mMKCl,pH 7.4。

下述实施例中的底物显色液A：20mM TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，称取4.8mg溶于1mL无水乙醇中，用超声将TMB粉末溶解，避光保存。

下述实施例中的底物显色液B：100mM H₂O₂，移取10μL 30％H₂O₂，用超纯水定容到1mL，现用现配，避光保存至4℃下。

下述实施例中的HOAc-NaOAc缓冲液：0.1M NaOAc，0.1M HOAc，pH 4.5。

下述实施例中的T4 PNK缓冲液(1×)：50mM Tris-HCl,10mM MgCl₂,5mM DTT,0.1mM spermidine(亚精胺),pH 7.6。

下述实施例中的T4 DNA连接酶缓冲液(1×)：40mM Tris-HCl，0mM MgCl₂，10mMDTT，0.5mM ATP，pH 7.8。

下述实施例中的Phi 29DNA聚合酶缓冲溶液(1×)：50mM Tris-HCl，10mM(NH₄)₂SO₄，4mM DTT，10mM MgCl₂，pH 7.5。

下述实施例中的ALP反应缓冲液(1×)：50mM Tris-HCl，0.11mM EDTA，pH8.5。

实施例1 HRP@3D DNA的制备及碱性磷酸酶的检测

HRP@3D DNA的制备及碱性磷酸酶的检测，如图1所示，具体操作如下：

a)、在含有10U T4 PNK(T4多聚核苷酸激酶)，2mM ATP的1×T4 PNK缓冲溶液中(总体积：50μL)，线性模板1(PW-17)(300pmol)于37℃孵育40min，对线性模板磷酸化。

b)、将步骤a)处理后的样品与引物1(PW-17primer，300pmol)、1×T4 DNA连接酶缓冲溶液混合，90℃加热2min，冰上降温2min，再室温放置5min，加入20U T4 DNA连接酶(总体积:100μL)，室温孵育2h或4℃12h进行连接反应。

c)、将步骤b)中的反应产物进行标准乙醇沉淀法浓缩处理，添加250μL无水乙醇、10μL 3M乙酸钠以及2μL糖原，充分震荡，于-20℃冰箱放置30min；将沉淀后的反应体系于14000rpm/min离心20min去掉上清液，并使用真空离心机进行干燥，最后通过dPAGE电泳分离得到环状DNA模板——环状模板1(PW-17)。

d)、经过提胶、沉淀、离心、干燥步骤之后，将环状模板1(PW-17)溶于无酶无菌水中，使用nanodrop仪器进行DNA浓度的定量并使用无酶无菌水将最终浓度标定为5μM；所得环状模板1(PW-17)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

e)、在1×Phi 29DNA聚合酶缓冲液中(总体积：50μL)，将2μL环状模板1：PW-17(5μM)、8μL dNTP Mixture(2.5mM)、10μL HRP(辣根过氧化物酶，50μM)和1μL Phi 29DNA聚合酶(10U/μL)混合，于30℃反应30min完成RCA反应，再65℃放置10min将Phi 29DNA聚合酶灭活，将体系在4℃下静置10-13h，将得到的HRP@3D DNA于8000rpm/min离心10min，用无酶无菌水洗涤三次，最后分散于无酶无菌水中。HRP@3D DNA三维功能核酸的超分子SEM图如图3所示。

f)、使用Microsoft PowerPoint软件设计硝化纤维素膜纸芯片器件，使用XeroxColorQube 8570N固体蜡打印机打印，于120℃加热2-3min，如图2所示，得到一个带有反应区(Z1，NC 0.45μM，直径0.4厘米)，和检测区(Z2，FF120HP，直径0.6厘米)的纸芯片器件(中间圆形部分为反应区，周围为蜡)。

g)、为减少Z1区对蛋白的非特异性吸附，先将其浸入封闭缓冲液，静置30min使其表面被封闭缓冲液封闭完全，之后用洗涤缓冲液清洗两次后干燥。将10μL含焦磷酸镁的HRP@3D DNA溶液滴加于Z1区，室温干燥。将5μL 20mM TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)滴加到Z2区，室温干燥并储存于室温。将含有Z1区和Z2区的两层纸重叠放置，将10μL含碱性磷酸酶(0.1-2Unit)的ALP反应缓冲液滴加于Z1区，孵育20min后，Z1区的HRP@3D DNA中的焦磷酸镁被水解，纳米球结构坍塌，释放HRP，经纸芯片的毛细作用力以及重力的双重作用，控释的HRP会逐渐向Z2区下渗，向Z1区滴加10μL洗涤缓冲液辅助下渗。最后，将上层纸去掉，使用排枪同时向Z2区加入预先混合好的2μL底物显色液A、5μL底物显色液B和8μL HOAc-NaOAc缓冲液，此时HRP催化底物显蓝色，一分钟后用手机拍照。使用Image J软件对最终颜色变化进行定量分析，对平行样取平均值。空白对照设置为不含有碱性磷酸酶的反应缓冲液。

如图4所示，对释放反应动力学进行分析，加入的ALP在30min内可以实现对被控的蛋白酶的完全释放，检测反应响应较快，可以实现快速检测。对脲酶、葡糖氧化酶、乙酰胆碱酯酶、纤维素酶进行选择性分析，有明显的信号差异，三维功能核酸对ALP具有较高选择性。

如图5所示，对在纸芯片器件上的检测结果进行分析，颜色强度与所包含碱性磷酸酶的活性成正比。检测限(LOD，定义为3σ，σ＝空白样品的标准差)达到0.1U，检测时间25min。对脲酶、葡糖氧化酶、乙酰胆碱酯酶、纤维素酶检测时，未观察到明显信号，仅对碱性磷酸酶具有较高选择性。

实施例2负载HRP@3D DNA的纸芯片用于铜绿微囊藻藻液ALP的检测

负载HRP@3D DNA的纸芯片制备过程同实施例1，纸芯片用于铜绿微囊藻藻液ALP检测的应用：

a)、随机选取恒温光照培养箱中培养的铜绿微囊藻藻液，利用紫外分光光度计测量其680nm处吸光度，将藻液通过0.22μm水性滤膜，作为检测样品，并将获得的藻液进行梯度稀释备用，样品放置于4℃中暂时保存，。

b)、使用封闭缓冲液将纸芯片Z1区进行封闭处理并使用洗涤缓冲液进行洗涤，室温干燥，将10μL含焦磷酸镁的HRP@3D DNA溶液滴加于Z1区，室温干燥。将5μL20mM TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)滴加到Z2区，室温干燥并储存于室温。将含有Z1区和Z2区的两层纸重叠放置，将10μL含处理后藻液的ALP反应缓冲液滴加于Z1区，孵育20min后，Z1区的HRP@3DDNA中的焦磷酸镁被水解，纳米球结构坍塌，释放HRP，经纸芯片的毛细作用力以及重力的双重作用，控释的HRP会逐渐向Z2区下渗，向Z1区滴加10μL洗涤缓冲液辅助下渗。最后，将上层纸去掉，使用排枪同时向Z2区加入预先混合好的2μL底物显色液A、5μL底物显色液B和8μLHOAc-NaOAc缓冲液，此时HRP催化底物显蓝色，一分钟后用手机拍照。使用Image J软件对最终颜色变化进行定量分析，对平行样取平均值。空白对照设置为不含有藻液的反应缓冲液。

用于检测铜绿微囊藻藻液ALP的纸芯片分析结果如图6所示，颜色强度与藻液中ALP含量成正比。与纸芯片用于碱性磷酸酶检测的灵敏度分析对应，可分析得到在680nm处不同吸光度下藻液所产生分泌的碱性磷酸酶的活性间关系，检测时间30min。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连理工大学

<120> 一种基于蛋白酶控制释放比色检测藻类碱性磷酸酶的纸基器件与应用

<130> 2021

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

attcgtgtga gaaaacccaa cccgccctac ccaaaagata tcgtcagatg a 51

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

ctcacacgaa ttcatctgac 20

Claims

1.一种基于蛋白酶控制释放比色检测藻类碱性磷酸酶的纸基器件，其特征在于：所述纸基器件由包括反应区Z1区和检测区Z2区的两层纸芯片构成，所述反应区Z1区封闭处理后，负载了由焦磷酸镁与DNA骨架组成的三维功能脱氧核糖核酸，所述三维功能核酸包裹蛋白酶，所述检测区Z2区负载了3,3',5,5'-四甲基联苯胺。

2.根据权利要求1所述的纸基器件，其特征在于：所述纸基器件包括反应区器件和检测区器件，所述反应区器件上设有反应区Z1区，所述检测区器件上设有检测区Z2区，将反应区器件和检测区器件在竖直方向上重叠后，所述反应区Z1区与检测区Z2区在竖直方向上相对应，所述反应区Z1区和检测区Z2区均为亲水区，所述反应区器件上除了反应区Z1区以外的部分以及检测区器件上除了检测区Z2区以外的部分均为疏水区。

3.根据权利要求2所述的纸基器件，其特征在于：所述反应区Z1区的材质包括NC；检测区Z2区的材质包括FF120HP；所述反应区Z1区的面积≤检测区Z2区的面积。

4.根据权利要求1所述的纸基器件，其特征在于：所述蛋白酶包括辣根过氧化物酶HRP。

5.根据权利要求1所述的纸基器件，其特征在于：包裹了蛋白酶的三维功能脱氧核糖核酸的制备方法，包括以下步骤：

b)、向反应容器中添加环状DNA模板、SEQ ID NO.2所示的环状DNA模板引物、Phi 29DNA聚合酶缓冲液、蛋白酶、dNTP Mixture、水，于室温下进行涡旋和离心混合均匀，最后向体系中加入Phi 29DNA聚合酶并吸打混匀，25-30℃反应25-45min，65-70℃反应5-10min终止滚环扩增反应，室温放置10-13h，离心，使用无酶无菌水重悬沉淀，所得沉淀物即为包裹了蛋白酶的三维功能脱氧核糖核酸。

6.一种基于蛋白酶控制释放比色检测藻类碱性磷酸酶的纸基器件在制备生物传感器中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：利用纸基器件的反应区Z1区上碱性磷酸酶水解三维功能脱氧核糖核酸上焦磷酸镁为可溶性磷酸盐的变化，以释放被包裹的蛋白酶，蛋白酶在毛细作用力以及重力的双重作用下进入检测区Z2区，并在检测区Z2区上进行催化显色反应，进而实现碱性磷酸酶的检测。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述应用包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：步骤(1)中使用固体蜡打印机打印，得到纸芯片器件后，于115-120℃加热2-3min。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述步骤(2)中封闭缓冲液为含质量分数为2％-4％BSA的PBS缓冲溶液，封闭时间为10～20min；添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺的浓度为15～20μM；所述步骤(3)中底物显色液A为3,3',5,5'-四甲基联苯胺的二甲基亚砜溶液；底物显色液B为H₂O₂；HOAc-NaOAc缓冲液为NaOAc和HOAc的混合溶液，将底物显色液A、底物显色液B和HOAc-NaOAc缓冲液的混合溶液滴加于检测区Z2区后，1-2min后拍照。