CN110672696A - 一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及其应用 - Google Patents

一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及其应用 Download PDF

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Abstract

一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及应用。CoA与Cu(II)作用形成CoA‑Cu(II)配位聚合物，命名为CoA‑Cu(II)CP，其可以催化H2O2的分解。在PPi的存在下，PPi可以与Cu(II)形成Cu(II)‑PPi复合物，致使CoA‑Cu(II)CP无法形成。通过ALP酶促分解反应，致使PPi分解和Cu(II)的释放，CoA‑Cu(II)CP形成，H2O2的催化分解反应发生。基于此，我们构建了铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶电化学传感器，与传统的检测方法相比，基于铜的类核酸配位聚合物构建的电化学生物传感器具有制备简单、高效率和高灵敏度等特点。

Description

一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方 法及其应用
技术领域
本发明涉及一种电化学生物传感器，尤其是涉及一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及应用，属于功能生物材料和生物传感技术领域。
背景技术
了解生物学中具有高度选择性和敏感性的分子或离子，如铜离子(Cu(II))、磷酸根离子(PPi)和碱性磷酸酶(ALP)，对于研究生命系统中发生的生理和病理过程至关重要。Cu(II)是人类和动物必需的微量元素，过量的Cu(II)会引起氧化应激并导致神经退行性疾病，如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和威尔逊氏病。PPi是各种生化过程中的重要代谢产物。并且，许多研究表明，PPi可以用作某些疾病的指示剂，如关节炎和软骨钙化病。ALP，它是磷酸盐代谢中必不可少的水解酶，负责生物有机体中蛋白质，核酸或小分子的去磷酸化过程。此外，ALP异常水平可能与某些疾病有关，如动态骨疾病、肝功能障碍、糖尿病、乳腺癌和前列腺癌。由于它们的生物学重要性，因此开发简单、灵敏、可靠的测定Cu(II)、PPi和ALP的分析方法大有裨益。
巯基-币族金属(如Au，Ag，Cu)配位聚合物已成为目前一类新兴的纳米材料，因其独特的发光性质、催化性质和圆二色性，引起越来越多研究者的关注，已广泛应用于很多科学领域，如催化和药物释放等。本发明基于铜的类核酸配位聚合物开发出一种快速、有效、无标记的Cu(II)、PPi离子传感器和ALP活性检测及其抑制剂筛选的电化学方法。选用辅酶A(CoA)作为底物，CoA可以与Cu(II)作用形成CoA-Cu(II)配位聚合物，命名为CoA-Cu(II)CP，其可以催化H2O2的分解。文献表明，Cu(II)与PPi有着很强的结合力。在PPi的存在下，PPi可以与Cu(II)形成Cu(II)-PPi复合物，致使CoA-Cu(II)CP无法形成。因此，H2O2的催化分解反应不能发生。通过ALP酶促分解反应，致使PPi分解和Cu(II)的释放，CoA-Cu(II)CP形成，H2O2的催化分解反应发生。与此同时，当我们加入ALP抑制剂，由于酶的活性被抑制导致底物PPi无法水解成Pi，阻碍了CoA-Cu(II)CP的形成，基于此，我们也实现了ALP抑制剂的筛选。目前，国内外还没有公开任何基于铜的类核酸配位聚合物构建的新型电化学方法用于检测Cu(II)、PPi、ALP及其抑制剂的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提出一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及应用。此方法首次将基于铜的类核酸配位聚合物构建的电化学生物传感器用于铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的检测。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及应用，具体步骤如下：
(1)一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的电化学传感器的制备：
Electrode 1的制备：
首先将玻碳电极(GCE，直径为1～4mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末(0.01～0.1μm)抛光2～8min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗2～8min，然后用N2吹干，得到裸玻碳电极，该电极记为Electrode 1；
Electrode 2的制备：
将石墨烯分散在HAc-NaAc(0.1～0.5M，pH 4～7)缓冲溶液中，控制浓度为0.5～1.0mg·mL-1，超声分散1～2h。将裸GCE电极置于上述溶液中，通过循环伏安法在-1.5V～+0.5V的电位范围内以5～30mV·s-1的扫速扫描10～20圈。得到GO修饰电极，该电极记为Electrode 2；
Electrode 3的制备：
取Cu(II)(终浓度为0～500μM，0.5～1μL)和CoA(终浓度200～1000μM，0.5～1μL)加入到8～9μL磷酸缓冲溶液(10～100mM，pH 5～8)中，在30℃恒温磁力搅拌机上震荡(100～600rpm)反应约8～10min，便得到CoA-Cu(II)CP。反应结束后，将此CoA-Cu(II)CP移至4℃冰箱避光保存备用。
取2.5～5μL合成的CoA-Cu(II)CP溶液滴至Electrode 2表面，10～30min后用PBS(10～100mM，pH 5～8)冲洗电极，标记为Electrode 3。
(2)一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法的应用
①Cu(II)的检测
在Electrode 3之CoA-Cu(II)CP合成过程中，固定CoA的浓度为1mM，改变Cu(II)的浓度，用于CoA-Cu(II)CP合成。其它如(1)步骤，制备一系列传感器，用来检测不同浓度Cu(II)的电化学响应。
②PPi的检测
在Electrode 3之CoA-Cu(II)CP合成过程中，配位聚合物合成后，加入不同浓度的PPi，室温震荡5～10min。其它如(1)步骤，制备一系列传感器，用来检测不同浓度PPi的电化学响应。
③ALP的检测
在Electrode 3之CoA-Cu(II)CP合成过程中，配位聚合物合成后，加入PPi(10～500μM，0.1～1μL)的溶液，室温震荡5～10min。反应完成后，在上述溶液中加入不同浓度的ALP溶液，混合溶液35～40℃孵育80～120min。其它如(1)步骤，制备一系列传感器，用来检测不同浓度ALP的电化学响应。
利用上述一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法，检测Cu(II)、PPi浓度以及ALP活性。采用循环伏安法，设置电位范围为-1～0V，扫描速率为50mV·s-1，检测所制备电化学生物传感器在PBS(0.1M，pH 7.0，含5mM的H2O2)中对Cu(II)、PPi、ALP的电化学循环伏安电流响应，获得Cu(II)、PPi、ALP对应的电化学循环伏安响应电流大小，建立响应电流与Cu(II)、PPi、ALP浓度对数之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中Cu(II)、PPi、ALP含量。
发明原理：基于铜的类核酸配位聚合物开发出一种快速、有效、无标记的Cu(II)、PPi离子传感器和ALP活性检测及其抑制剂筛选的电化学方法。选用CoA作为底物，CoA可以与Cu(II)作用形成CoA-Cu(II)配位聚合物，命名为CoA-Cu(II)CP，其可以催化H2O2的分解。在PPi的存在下，PPi可以与Cu(II)形成Cu(II)-PPi复合物，致使CoA-Cu(II)CP无法形成。因此，H2O2的催化分解反应不能发生。通过ALP酶促分解反应，致使PPi分解和Cu(II)的释放，CoA-Cu(II)CP形成，H2O2的催化分解反应发生。与此同时，当我们加入ALP抑制剂，由于酶的活性被抑制导致底物PPi无法水解成Pi，阻碍了CoA-Cu(II)CP的形成，基于此，我们也实现了ALP抑制剂的筛选。
相对于现有技术，本发明所述的一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及应用具有以下优势：
(1)高灵敏度。实验得出传感器的电流响应对Cu(II)对数的线性范围为0.01～250μM，线性相关方程为I＝-40.26lgCu(II)-106.40，R2＝0.9994，检测限为0.0021μM。对PPi对数的线性范围为0.01～200μM，线性相关方程为I＝37.37lgPPi-112.09，R2＝0.9981，检测限为0.0035μM。对ALP对数的线性范围为0.001～20U/L，线性相关方程为I＝-41lgALP-146.88，R2＝0.9995，检测限为0.0003U/L可实现对Cu(II)、PPi、ALP的高灵敏度检测。
(2)高效率。无繁琐耗时的样品预处理过程，耗时少，可实现高效的Cu(II)、PPi、ALP检测。
(3)结果准确。回收率均在90％～110％之间。
(4)传感器可以用于ALP抑制剂正钒酸钠(Na3VO4)的筛选，IC50为1.39μM，对于临床诊断意义重大。
综上所述，本发明是一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及应用，通过对H2O2还原电流响应来实现对Cu(II)、PPi、ALP及其抑制剂的筛选，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现低浓度Cu(II)、PPi、ALP的检测，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明传感器的可行性实验图；
图2为本发明传感器对Cu(II)的电流响应对浓度对数的校准曲线图；
图3为本发明传感器对PPi的电流响应对浓度对数的校准曲线图；
图4为本发明传感器对ALP的电流响应对浓度对数的校准曲线图
图5为本发明传感器对ALP抑制剂正钒酸钠的校准曲线图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1传感器的制备
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及应用，具体步骤如下：
Electrode 1的制备：
首先将玻碳电极(GCE，直径为3mm)在麂皮上用三氧化二铝粉末(0.05μm)抛光5min，抛光后将电极置于超声清洗器中用二次蒸馏水中超声清洗5min，然后用N2吹干，得到裸玻碳电极。该电极记为Electrode 1；
Electrode 2的制备：
将石墨烯分散在HAc-NaAc(0.2M，pH 5.0)缓冲溶液中，控制浓度为1.0mg·mL-1，超声分散2h。将裸GCE电极置于上述溶液中，通过循环伏安法在-1.5V～+0.5V的电位范围内以10mV·s-1的扫速扫描10圈。得到GO修饰电极，该电极记为Electrode 2；
Electrode 3的制备：
取Cu(II)(250μM，1μL)和CoA(500μM，1μL)加入到8μL磷酸缓冲溶液(10mM，pH 7.0)中，在30℃恒温磁力搅拌机上震荡(500rpm)反应约10min，便得到CoA-Cu(II)CP。反应结束后，将此CoA-Cu(II)CP移至4℃冰箱避光保存备用。
取2.5μL合成的CoA-Cu(II)CP溶液滴至Electrode 2表面，30min后用PBS(10mM，pH7.0)冲洗电极，标记为Electrode 3。
将制备的Electrode 1～Electrode 3置于PBS(0.1M，pH 7.0，含5mM的H2O2)溶液中检测其电化学响应。方法为循环伏安法，设置电位范围为-1～0V，扫描速率为50mV·s-1。从图1可以看出：Electrode 3在PBS(0.1M，pH 7.0，含5mM的H2O2)中有明显的电化学响应信号，其它电极的电化学响应信号几乎可以忽略。由此证明了CoA-Cu(II)CP的电催化活性，说明其在理论上和技术上是可行的。
实施例2 Cu(II)的检测
在实施例1 Electrode 3的制备过程中，改变Cu(II)浓度，控制Cu(II)终浓度分别为：0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1、2、5、10、20、40、80、150、250、500μM，如实施例1制备一系列电化学生物传感器。实验结果如图2所示，在一定范围内，目标物浓度越大，电流响应越明显。传感器的电流响应对Cu(II)浓度对数值的线性相关方程为I＝-40.26lgCu(II)-106.40，R2＝0.9994，线性范围为0.01～250μM，检测限为0.0021μM，说明传感器对Cu(II)浓度可实现高灵敏检测。
实施例3 PPi的检测
在实施例1 Electrode 3的制备过程中，改变PPi浓度，控制PPi终浓度分别为：0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1、2、5、10、20、50、100、200、500、800μM，如实施例1制备一系列电化学生物传感器。实验结果如图3所示，在一定范围内，目标物浓度越大，电流响应越低，证明PPi与Cu(II)形成复合物。传感器的电流响应对PPi浓度对数值的线性相关方程为I＝37.37lgPPi-112.09，R2＝0.9981，线性范围为0.01～200μM，线性相关方程为检测限为0.0035μM。说明传感器对PPi浓度可实现高灵敏检测。
实施例4 ALP活性的检测
在实施例1 Electrode 3的制备过程中，改变ALP浓度，控制ALP终浓度分别为：0、0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.2、0.5、1、2、5、8、10、20、50、100U/L，如实施例1制备一系列电化学生物传感器。实验结果如图4所示，传感器的电流响应对ALP浓度对数值的线性相关方程为I＝-41lgALP-146.88，R2＝0.9995，线性范围为0.001～20U/L，检测限为0.0003U/L，说明传感器对ALP活性可实现高灵敏检测。
实施例5 ALP抑制剂正钒酸钠的筛选
抑制剂正钒酸钠的检测：在实施例1 Electrode 3的制备过程中，将不同浓度的正钒酸钠(终浓度分别为：0、0.01、0.05、0.08、0.1、0.5、1、2、5、10、20、50、100、500、1000μM)加入到ALP反应液中，如实施例1步骤制备一系列电化学传感器。根据实验结果得知(如图5)，随着抑制剂正钒酸钠浓度的增大，电流响应随之减弱，说明正钒酸钠对ALP活性有良好的抑制作用，半抑制浓度为1.39μM。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。

Claims (3)

1.一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及应用，其特征在于，机理如下：CoA可以与Cu(II)作用形成CoA-Cu(II)配位聚合物，命名为CoA-Cu(II)CP，其可以催化H2O2的分解。在PPi的存在下，PPi可以与Cu(II)形成Cu(II)-PPi复合物，致使CoA-Cu(II)CP无法形成。因此，H2O2的催化分解反应不能发生。通过ALP酶促分解反应，致使PPi分解和Cu(II)的释放，CoA-Cu(II)CP形成，H2O2的催化分解反应发生。与此同时，当我们加入ALP抑制剂，由于酶的活性被抑制导致底物PPi无法水解成Pi，阻碍了CoA-Cu(II)CP的形成，基于此，我们实现了铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的检测及其抑制剂的筛选。
2.根据权利要求1所述的一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及应用，其特征在于：第一次基于铜的类核酸配位聚合物构建了铜离子和磷酸根离子的离子传感器，并实现了ALP及其抑制剂的检测，所用的电化学方法为循环伏安法，电位范围为-1～0V，扫描速率为50mV·s-1。
3.根据权利要求1和权利要求2所述的一种检测铜离子、磷酸根离子和碱性磷酸酶的新型电化学方法及应用，其特征在于：本发明传感器，可以实现不同浓度Cu(II)、PPi和ALP检测及其小分子抑制剂的筛选，检测限分别低至0.0021μM、0.0035μM、0.0003U/L，抑制剂正钒酸钠的IC50为1.39μM，对于临床诊断意义重大。
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