CN114384064B - 一种基于印迹MOFs探针高灵敏快速检测农残的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农产品安全检测技术领域，涉及一种基于印迹MOFs探针高灵敏快速检测农残的方法。首先构建了基于MOFs仿酶探针的比色试纸条，采用分子印迹MOFs仿酶为比色探针，催化氧化底物使体系的颜色发生变化；以低成本滤纸为比色探针负载基底，划分为质控区、标准区和检测区；质控区可以依据待测环境的温度、湿度和光照等选择最佳的比色分析参数；标准区是通过滴加不同浓度标准品得到标准比色区域并用于建立比色分析数学模型；检测区用于实际样品的检测。通过比色试纸条即可初步判定待测样品中农残的浓度范围；进一步通过反应体系颜色信号计算其灰度值，建立比色分析模型，实现多个复杂基质样品中痕量农残的灵敏、准确、实时定量分析。
Description
技术领域
本发明属于农产品安全检测技术领域，具体涉及一种基于印迹MOFs探针高灵敏快速检测农残的方法。
背景技术
农药的广泛使用有效控制了农作物生长过程中病虫害的侵害，但由于其难降解、强毒性、易残留等特点，极易在农产品、土壤、水源中富集，对生态环境、人类健康均造成了较大威胁；因而对其残留的检测至关重要。目前农残的检测方法主要有高效液相色谱法、液质联用技术等传统方法，以及近年来兴起的电化学、拉曼、荧光等快速检测方法；这些方法检测灵敏度高、结果准确，但通常需要在实验室条件下进行，存在试剂用量多、依赖于专用仪器设备，且对操作人员的技术水平要求较高，难以满足农残现场、快速检测的需求；因此，开发一种原位监测、快速便携的野外实地分析方法尤为重要。
近来，现有的农药残留比色探针检测方法存在两方面的不足，一是现有的成品化试纸条无法依据实施条件及时调节分析参数，由于比色分析方法易受温度、湿度、光照等周围环境影响，致使试纸条产生不准确的信号输出；二是当待测样品浓度过高或者过低时，现有的试纸条易产生较大误差；三是实际样品本身的颜色会对比色信号产生不同程度的干扰，在不利用专门仪器条件下，仅借助肉眼、比色卡判断颜色变化，无法实现目标物的精准定量分析。上述因素导致比色分析方法仅局限于定性、半定量检测，难以用于复杂基质样品中目标物的低成本、高灵敏、抗干扰性检测。
综上，不借助专门的仪器设备，发展能够因地制宜的比色分析方法，实现复杂基质样品中农残灵敏、准确分析是一个重点难点。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明构建了一种基于印迹金属-有机框架(MOFs)仿酶探针高灵敏快速检测农残的比色试纸条。采用分子印迹MOFs仿酶为比色探针，催化氧化底物使得体系的颜色发生变化；以低成本滤纸为比色探针负载基底，其中A区为质控区、B区为标准区、C为检测区。质控区主要是为了依据待测环境的温度、湿度和光照等选择最佳的比色分析参数；标准区是在质控区优化的分析条件下，通过滴加不同浓度标准品得到标准比色区域并用于建立比色分析数学模型；检测区用于实际样品的测定。值得注意的是，在实际样品检测之前，通过对照分析检测区与标准区的颜色变化，首先初步判定待测样品中农残的浓度范围，进而对农残浓度过大或过小的样品加以调整，以达到精准分析的要求；然后借助智能手机稳定捕获反应体系颜色信号(RGB值)，通过计算其Gray值建立比色分析数学模型，以消除样品自身颜色对终点颜色的干扰，从而实现多个复杂基质样品中痕量农残的灵敏、准确、实时定量分析。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本文首先提供了一种基于印迹MOFs探针高灵敏快速检测农残的比色试纸条。所述试纸条由直接滴加印迹MOFs探针构建，并将其分为质控区、标准区和检测区。其中A部分为质控区，用于优化现场测定环境下的比色分析参数；B部分为标准区用于检测标准样品，通过智能手机拍照功能收集RGB值并计算Gray值以建立比色分析数学模型；C区为检测区，首先通过对比分析检测区与标准区的颜色变化，初步判定待测样品中的农残浓度范围，以便对过大或过小浓度加以调整，从而满足精准测定的需求；将待测样品的Gray值代入标准区的比色分析数学模型中，从而实现复杂样品中农残的灵敏、准确定量检测。
具体步骤如下：
步骤一：比色试纸制备主要包括：印迹MOFs仿酶探针合成，空白滤纸制备及比色传感界面构建。
步骤1.1：印迹MOFs仿酶探针合成；将金属-有机框架(MOFs)和氨丙基三乙氧基硅(APTES)溶于氨水中，得到混合溶液；然后选择一种农药标品，记为NY，加入上述混合溶液中进行第一次搅拌，搅拌后再加入硅酸乙酯(TEOS)进行第二次搅拌，搅拌后经离心、洗涤、干燥，得到印迹MOFs仿酶探针；
步骤1.2：空白滤纸制备；
取普通滤纸分为A、B、C三个区域，其中A区为质控区，B区为标准区，C区为检测区；
步骤1.3：比色传感界面构建。
将质控区分为两个质控分区，分别标记为质控分区1、质控分区2；将质控分区1从左到右按照列分为n个区域，这n个区域分别标记为H1、H2、H3……Hn-1、Hn；质控分区2也从左到右按照列分为m个区域，这m个区域分别标记为I1、I2、I3……Im-1、Im；(其中n、m均为大于1的整数)；
步骤2.1：质控区的建立；
步骤2.1.1：确定最适印迹MOFs仿酶探针溶液的浓度；
将步骤1.1制备的印迹MOFs仿酶探针加入乙醇中，得到不同浓度印迹MOFs仿酶探针溶液依次标记为1、2，……、n-1、n，然后将V1体积的1、2、……，n-1、n的印迹MOFs仿酶探针溶液分别对应滴加在质控分区1的H1、H2、H3……Hn-1、Hn的区域上待其干燥；然后取步骤1.1中的NY溶于水中，形成NY溶液；再于质控分区1的H1、H2、H3……Hn-1、Hn的区域上均滴加上V2体积的NY溶液，反应一段时间后，再于质控分区1的H1、H2、H3……Hn-1、Hn的区域上依次滴加V3体积的显色剂(显色剂由3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、过氧化氢(H2O2)和pH 4.0NaAc-HAC组成)，然后观察质控分区1中H1、H2、H3……Hn-1、Hn的区域的颜色变化，并获取各区域的图片对应的RGB值，进一步计算其灰度值，灰度值最大的区域所对应的印迹MOFs仿酶探针溶液浓度即为最适印迹MOFs仿酶探针溶液浓度；
步骤2.1.2：确定最适显色剂的浓度；
经步骤2.1.1确定最适印迹MOFs仿酶探针溶液浓度后，再将V4体积最适浓度的印迹MOFs仿酶探针溶液依次滴加在质控分区2所对应的I1、I2、I3……Im-1、Im上待其干燥后，在质控分区2的I1、I2、I3……Im-1、Im的区域上再滴加上V5体积步骤2.1.1中的NY溶液，反应一段时间后，再于质控分区2的I1、I2、I3……Im-1、Im的区域上滴加上V6体积不同浓度的显色剂，其中显色剂由3,3',5,5'-四甲基联苯胺、过氧化氢、pH为4.0的NaAc-HAC组成；然后观察，质控分区2中I1、I2、I3……Im-1、Im的颜色变化，并获取各区域的图片及对应的RGB值，进一步计算其灰度值，灰度值最大的区域所对应的显色剂浓度即为最适显色剂浓度；
步骤2.2：标准区的建立；
将标准区从上到下分为n个区域并依次标记为E1、E2、E3、……En-1、En；经步骤2.1.1确定最适印迹MOFs仿酶探针溶液浓度后，将V7体积最适印迹MOFs仿酶探针溶液浓度分别滴在对应的标准区E1、E2、E3、……En-1、En表面，待其干燥后，配制不同浓度的NY溶液，并将其标记为C1、C2、……、Cn-1、Cn，然后将V8体积不同浓度的NY溶液分别滴在对应的E1、E2、E3、……En-1、En区域，进行第一次反应；再根据步骤2.1.2中确定的最适显色剂浓度，再在E1、E2、E3、……En-1、En区域滴加上V9体积的显色剂后进行第二次反应，从而建立标准区的标准比色卡；标准区的标准比色卡的颜色维持时间20min以上不变色，为后面检测区农残浓度的初步判定预留足够的时间；
步骤2.3：获取步骤2.2的标准区的标准比色卡对应检测不同浓度NY溶液的显色图片，分析出NY溶液在不同浓度下的RGB值，根据公式(1)计算其对应的Gray值分别为G1、G2，、G3、……Gn-1、Gn；
其中R指的是图片提取的red值，G是图片提取的green值，B指的是图片提取的blue值，Gray是灰度值；
并将根据公式(1)计算的标准区的Gray值和对应NY溶液浓度m构建比色分析数学模型，得到Y＝k*m+b，其中b、k为常数，m是NY溶液浓度(μM)；
标准区NY溶液判别值记为P，P的取值区间为M*(1-10％)～M*(1+10％)，其中M是标准区不同NY溶液浓度所得的灰度值的中间值；
步骤2.4：检测区的建立；
将检测区从左到右按列平均分为N个区域，并将N个区域，即N列的上部分别标记为样品1、样品2、样品3、……、样品n-1、样品n；其中样品1之下的区域分别划分为11、12、13、……1i；样品2之下的区域分别划分为21、22、23、……2i；样品3的区域分别划分为31、32、33……3i；样品n-1之下分别标记为n-11、n-12、n-13……n-1i；样品n之下分别标记为n1、n2、n3……ni；
取n个待测样品预处理后得到待测样品溶液，依次编号为待测样品溶液1、待测样品溶液2、……、待测样品溶液N；然后根据步骤2.1.1得到最佳浓度的印迹MOFs仿酶探针溶液，并将V10体积最适印迹MOFs仿酶探针溶液浓度分别滴在对应的检测区的N个区域上，待其干燥后；将V11体积的待测样品溶液1分别滴在11、12、13……1i上；将V11体积待测样品溶液2分别滴在21、22、23……2i上；将V11体积的待测样品溶液n-1滴在n-11、n-12、n-13……n-1i上；将V11体积的待测样品溶液n滴在n1、n2、n3、……、ni上(其中i、n均为大于1的整数)，并反应一段时间；
步骤2.5：将V12体积的步骤2.1.2中得到的最适浓度的显色剂滴加到步骤2.4制得的检测区的N个区域上待其反应一段时间后，将其与步骤2.2标准区中已建立标准比色卡的颜色进行对照，初步判断样品中农药的浓度范围；并根据公式(1)计算待测样品中农药的Gray值，当其不在判别值P的取值范围内，需调整样品中农药的浓度；
如若样品中农残浓度的Gray值大于M*(1+10％)，则需要对该样品进行稀释，直至其取值在在判别值P的范围内，记录稀释倍数；
如若样品中农残浓度的Gray值小于中间值M*(1-10％)则需要对该样品进行浓缩，直至其取值在在判别值P的范围内，记录浓缩倍数；
将调整后的农残浓度再次重复上步骤2.4和2.5，根据公式(1)计算显色图片的Gray值G0，再与判别值P进行比较，若G0值在判别值P范围值内，进而根据比色分析数学模型得到样品中农残含量为Y0＝(G0-b)/k，其中M是标准区不同NY溶液浓度所得的灰度值的中间值，b、k是常数，Y0是调整后样品中农药的浓度。
进一步的，步骤1.1中所述MOFs、氨丙基三乙氧基硅、氨水、农药标品和硅酸乙酯的用量关系为400～700mg：10～30μL：2～10mL：10～20mg：5～15mL；所述氨水体积分数为5～15％，所述第一次搅拌、第二次搅拌的时间均为5～15min。
进一步的，步骤1.1中所述农药标品包括杀虫剂、除螨剂、杀菌剂和除草剂；具体为噻虫啉、氧化乐果、阿维菌素、哒螨灵、灭菌丹、克菌丹、甲草胺或莠去津的任意一种。
进一步的，步骤1.2中所述A、B、C三个区域的面积比为2:1:2。
进一步的，步骤2.1.1中所述NY溶液的浓度为2μM，所述NY为噻虫啉、氧化乐果、阿维菌素、哒螨灵、灭菌丹、克菌丹、甲草胺或莠去津的任意一种；所述反应一段时间为5-10分钟；所述印迹MOFs仿酶探针溶液浓度为1mg/mL～3mg/mL；所述显色剂为TMB、H2O2和pH 4.0NaAc-HAC组成的混合液；所述显色剂中TMB、H2O2和pH 4.0 NaAc-HAC用量关系为0.4mL～0.8mL：0.4mL～0.8mL:0.1mL～0.8mL，其中TMB和H2O2浓度比为1:20～5:1。
进一步的，步骤2.1.1中所述V1、V2、V3体积比为1:1:1，用量都为10～20μL。
进一步的，步骤2.1.2中印迹MOFs仿酶探针溶液浓度为1mg/mL～3mg/mL，反应时间为5～15min；所述NY溶液的浓度为2μM，所述NY为噻虫啉、氧化乐果、阿维菌素、哒螨灵、灭菌丹、克菌丹、甲草胺或莠去津的任意一种；所述显色剂为TMB、H2O2和pH 4.0NaAc-HAC组成的混合液；显色剂中TMB、H2O2和pH 4.0NaAc-HAC用量为0.4mL～0.8mL：0.4mL～0.8mL:0.1mL～0.8mL，其中TMB和H2O2浓度比为1:20～5:1；所述V4、V5、V6体积比为1:1:1，用量都为10～20μL。
进一步的，步骤2.1中所述灰度值的计算公式如下：
其中R指的是图片提取的red值，G是图片提取的green值，B指的是图片提取的blue值，Gray是灰度值。
进一步的，步骤2.2中所述不同浓度NY溶液的浓度范围为0～20μM；所述NY为噻虫啉、氧化乐果、阿维菌素、哒螨灵、灭菌丹、克菌丹、甲草胺或莠去津的任意一种。
进一步的，步骤2.2中所述第一次反应、第二次反应的时间均为5-10分钟。
进一步的，步骤2.2中所述V7、V8、V9体积比为1:1:1，用量都为10～20μL。
进一步的，步骤2.4中所述V10、V11和V12体积比为1:1:1，用量均为10～20μL。
进一步的，步骤2.4中所述反应一段时间为5-10min。
进一步的，步骤2.4中所述样品预处理的方法为：首先将样品破碎处理后，再通过乙腈提取和旋转蒸发之后，将其残留物溶于水中，得到待测样品溶液。
进一步的，步骤2.5中所述反应一段时间为5-10min。
本发明还提供了上述方法制备的标准比色卡在检测实际样品中农残的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明所述的印迹MOFs仿酶探针具有农药专属识别位点，有效克服了复杂基质样品中其它组分的干扰。
(2)本发明所述的比色试纸是通过将印迹MOFs仿酶探针溶液直接滴加在普通滤纸上即可制得，不需特定的打印、刻蚀等技术辅助，具有低成本、操作简便、实用性强等优势。
(3)本发明以低价值滤纸为基底，利用MOFs催化氧化底物显色，智能手机的拍照功能提取颜色信号；因此不需荧光激发光源、信号获取等专用设备，能够满足资源稀缺的野外环境中农残的便捷、现场、可视化比色检测。
(4)本发明设计的MOFs催化底物显色在5min内实现，显色颜色可以保持20min不褪色，能够满足快速显色、稳定颜色获取的需求。
(5)本发明将比色试纸分为质控区、标准区和检测区，质控区用来现场筛选最佳的比色分析参数，从而有效克服了分析环境差异引起的测定误差；通过对比检测区与标准区的颜色，初步判断样品中农残的浓度范围，以便对过大或过小浓度加以调整，进而满足精准测定的需求，在很大程度上提高了检测的准确度借助智能手机提取RGB值计算其Gray值，克服了样品自身颜色对比色信号的影响，进一步提高了传感分析的可靠性。
附图说明
图1为印迹MOFs仿酶探针的扫描电镜图。
图2为印迹MOFs仿酶探针的透射电镜图。
图3为比色传感试纸条的结构示意图。
图4为实施例中制备的比色传感试纸条。
图3中A为质控区；B为标准区；C为检测区；D为质控分区1；E为质控分区2；F为标准区。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1：
以检测噻虫啉为例，一种快速检测噻虫啉比色试纸的制备；
步骤一：比色试纸制备主要包括：印迹MOFs仿酶探针合成，空白滤纸制备及比色传感界面构建。
步骤1.1：印迹MOFs仿酶探针制备(专一识别噻虫啉的印迹MOFs仿酶探针)；将500mgMOFs和20μL氨丙基三乙氧基硅(APTES)溶于2mL 10％氨水中，然后向上述溶液中加入10mg噻虫啉，并搅拌5min；向上述制备的溶液中加入5mL硅酸乙酯(TEOS)并搅拌后，进行离心、洗涤、干燥，得到印迹MOFs仿酶探针。
图1为印迹MOFs仿酶探针的扫描电镜图。从图中可以看出，本发明制备的印迹MOFs仿酶探针形貌规则，且在MOFs表面形成了一层分子印迹聚合物。图2为印迹MOFs仿酶探针的透射电镜图。从图中可以看出，聚合物层均匀分布在MOFs表面，厚度约为28nm。
步骤1.2：空白滤纸制备。将价格低廉的普通滤纸分为三大部分，A区为质控区，B区为标准区，C区为检测区。其中A:B:C面积比为2:1:2。
步骤1.3：比色传感界面构建。直接将10μL超声均匀的印迹MOFs仿酶探针溶液滴在空白滤纸上的质控区等待干燥即可，操作简单、无需打印等程序。将质控区平均分为两个质控分区，并标记为质控分区1，质控分区2。将质控分区1从左到右平均分为3个区域(即3列)，这3个区域分别标记为H1、H2、H3；质控分区2也从左到右平均分为3个区域(即3列)，这3个区域分别标记为I1、I2、I3。
图3为比色传感试纸条的结构示意图。A为质控区；B为标准区；C为检测区；A质控区分为质控分区1和质控分区2，D为质控分区1优化印迹MOF仿酶溶液浓度区域；E为质控分区2优化显色剂浓度区域；F为标准区测定标准农药样品对应的显色区域。其中标准区中黑色虚线线框为用来初步判断农残范围，以便对过大或过小浓度加以调整。其中A:B:C面积比为2:1:2；检测区能够用于多个样品的同时在线检测。
步骤2.1：质控区的建立；
步骤2.1.1：最适印迹MOFs仿酶探针溶液浓度的优化
将1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL，印迹MOFs仿酶探针溶液标记为1、2、3，然后将10μL的1、2、3的印迹MOFs仿酶探针溶液分别滴在对应的质控分区1的H1、H2、H3的区域上待其干燥；然后将噻虫啉加入水中形成噻虫啉标品溶液；在质控分区1的H1、H2、H3的区域上滴加上10μL的2μM噻虫啉标品溶液，反应10分钟后，再滴加上10μL的显色剂(显色剂组成显色剂由3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、过氧化氢(H2O2)、pH 4.0 NaAc-HAC组成)后，并获取各区域的图片，并根据对应的RGB值，进一步计算其灰度值，灰度值最大的区域所对应的印迹MOFs仿酶探针溶液浓度即为最适印迹MOFs仿酶探针溶液浓度。此时对应的印迹MOFs仿酶探针溶液浓度为3mg/mL。
步骤2.1.2：最适显色剂浓度的优化：
再将10μL3mg/mL的印迹MOFs仿酶探针溶液滴加在质控分区2所对应的I1、I2、I3上待其干燥后，在质控分区2的I1、I2、I3的区域上滴加上的10μL浓度为2μM噻虫啉标品溶液，反应10分钟后，再滴加上10μL不同浓度的显色剂(以TMB和H2O2浓度比作为不同浓度的判别依据，具体设定3组，分别为1:20、1:2、5:1)后，并获取各区域的图片，并根据对应的RGB值，进一步计算其灰度值，灰度值最大的区域所对应的所对应的显色剂浓度即为最适显色剂浓度，为0.4mL TMB(0.05M)、0.1mLH2O2(10M)和0.5mL pH4.0的NaAc-HAC(0.1M)组成的混合溶液；
步骤2.2：标准区的建立；
根据步骤2.1优化结果，将标准区从上到下分为6个区域并依次标记为E1、E2、E3、E4、E5、E6；根据步骤2.1.1中确定的最适印迹MOFs仿酶探针溶液浓度，分别将10μL 3mg/mL印迹MOFs仿酶探针溶液滴在对应的标准区E1、E2、E3、E4、E5、E6表面，待其干燥后，配制浓度为0μM、0.3μM、0.5μM、1.2μM、2μM、8μM的噻虫啉标品溶液并将其标记为C1、C2、C3、C4、C5、C6，然后将10μL体积不同浓度的噻虫啉标品溶液分别滴在对应的E1、E2、E3、E4、E5、E6上，反应10分钟；再根据步骤2.1.2中得到的最适显色剂浓度(显色剂为0.4mL TMB(0.05M)、0.1mLH2O2(10M)和0.5mL pH4.0的NaAc-HAC(0.1M)组成的混合溶液)。再在E1、E2、E3、E4、E5、E6上滴加上10μL体积的显色剂后10分钟，从而建立标准区的标准比色卡；标准区的标准比色卡的颜色维持时间20min以上不变色，为后面检测区农残浓度的初步判定预留足够的时间；
步骤2.3：通过智能手机的拍照功能获取步骤2.2制得的标准区标准比色卡检测不同浓度农药的显色图片，然后通过手机软件分析出不同噻虫啉标品溶液浓度的RGB值：0μM，0.3μM,0.5μM，1.2μM，2μM，8μM的RGB值分别为{169,192,187}；{163,181,177}；{154,173,169}；{156,171,166}；{152,168,163}；{149,166,159}。
根据公式(1)
计算其对应的Gray值G1＝186.06，G2＝167.91，G3＝163.98，G4＝161.83，G5＝147.51，G6＝138.11；得到质控区的Gray值的中间值M为：(G3+G4)/2＝162.9，据此确定最适待测物分析灰度值，即判别值P范围为162.9×(1±10％)；同时，依据标准区的Gray值和噻虫啉标品溶液浓度的相关关系构建比色分析数学模型，得到Y＝-5.87m+169.4(m的范围在0.3μM到2μM之间)，检出限为0.134μM。
实施例2：实际样品中噻虫啉的检测
步骤1.1：首先对绿茶、黑茶、土壤、苹果、生菜油麦菜分别标记为待测样品1、待测样品2、待测样品3、待测样品4、待测样品5、待测样品6；然后对其进行预处理，通过乙腈提取和旋转蒸发后，将其残留物溶解于水中，得到相应的待测样品溶液；
步骤1.2：检测区的建立。
将检测区从左到右平均分为6个区域(即6列)，并将6个区域的顶部分别标记为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6，其中样品1对应下的区域分为5个子区域，分别标记为11、12、13、14、15；样品2对应下的区域分为5个子区域，分别标记为21、22、23、24、25；样品3对应下的区域分为5个子区域，分别标记为31、32、33、34、3 5；样品4对应下的区域分为5个子区域，分别标记为41、42、43、44、45；样品5对应下的区域分为5个子区域，分别标记为51、52、53、54、55；样品6对应下的区域分为5个子区域，分别标记为61、62、63、64、65；根据步骤2.1.1得到最佳的印迹MOFs探针浓度为3mg/mL，后将10μL体积3mg/mL印迹MOFs仿酶探针溶液分别滴在对应的检测区中的6个样品下的5个区域上，待其干燥后，则检测区已经建立；
步骤1.3：取步骤1.1中处理后的10μL样品溶液1分别滴涂在步骤1.2所述的试纸条检测区11、12、13、14、15的表面；10μL样品溶液2分别滴涂在步骤1.2所述的试纸条检测区21、22、23、24、25的表面；10μL样品溶液3分别滴涂在步骤1.2所述的试纸条检测区31、32、33、34、35的表面；10μL样品溶液4分别滴涂在步骤1.2所述的试纸条检测区41、42、43、44、45的表面；10μL样品溶液5分别滴涂在步骤1.2所述的试纸条检测区51、52、53、54、55的表面；10μL样品溶液6分别滴涂在步骤1.2所述的试纸条检测区61、62、63、64、65的表面；反应10min后，在上述区域分别再滴加10μL最适显色剂(最适显色剂为TMB、H2O2和pH 4.0NaAc-HAC以用量为0.5mL，0.4mL，0.1mL混合，且其中TMB和H2O2浓度比为1:20)。
步骤1.4：步骤1.3所述的滴加显色剂后反应5min后，通过手机拍照得到不同区域的RGB值并计算相应的Gray值，如若其灰度值不在162.9×(1±10％)之内，需要对原有样品进行调整后，重复上诉步骤2.4中检测区的建立这一步骤，然后再次通过手机拍照得到RGB值并计算Gray值；
将样品1得到的颜色与标准区进行对比，初步判定其农残范围为0.5-1.2μM，然后拍照并计算样品1显色区域的灰度值为163.5，位于162.9×(1±10％)之内，不需对样品1中农残浓度进行调整，直接将样品1灰度值163.5代入到比色分析数学模型中得得到其农残浓度为0.4μM。
将样品2得到的颜色与标准区进行对比，初步判定其农残范围为2-4μM，然后拍照并计算样品2显色区域的灰度值为120.8，不在162.9×(1±10％)之内，初步判断出其农药残留值过大，为了保证其准确度，对样品2进行稀释0.5倍之后再进一步测定并计算出其灰度值为152.4，将其代入到比色分析数学模型中得其农残浓度为1.3μM，所以样品2中农药残留浓度为1.3μM×2＝2.6μM；
将样品3得到的颜色与标准区进行对比，初步判定其农残范围为0-0.5μM，然后拍照并计算样品3显色区域的灰度值为190.5，不在162.9×(1±10％)之内，初步判断出其农药残留值过小，为了保证其准确度，对样品3浓缩5倍之后再进一步测定并计算出其灰度值为145.8，将其代入到比色分析数学模型中得其农残浓度为1.2μM，所以样品3中农药残留浓度为1.2μM÷5＝0.24μM。
将样品4得到的颜色与标准区进行对比，初步判定其农残范围为0.5-1.2μM，然后拍照并计算样品4显色区域的灰度值为166.5，位于162.9×(1±10％)之内，不需对样品1中农残浓度进行调整，直接将样品4灰度值166.5代入到比色分析数学模型中得得到其农残浓度为0.5μM。
将样品5得到的颜色与标准区进行对比，初步判定其农残范围为0.5-1.2μM，然后拍照并计算样品5显色区域的灰度值为175.5，位于162.9×(1±10％)之内，不需对样品5中农残浓度进行调整，直接将样品1灰度值166.5代入到比色分析数学模型中得得到其农残浓度为0.63μM。
将样品6得到的颜色与标准区进行对比，初步判定其农残范围为0-0.5μM，然后拍照并计算样品6显色区域的灰度值为150，位于162.9×(1±10％)之内，不需对样品6中农残浓度进行调整，直接将样品1灰度值166.5代入到比色分析数学模型中得得到其农残浓度为0.32μM。
图4为检测不同样品中噻虫啉残留的示意图；其中黑色虚线框区域为标准区中噻虫啉标品对应的显色情况，用来初步判定待测样品中农药残留的中间值。
为了进一步验证所构建的试纸条的准确度和灵敏度，将本发明所述比色传感体系与标准高效液相色谱法(HPLC)进行对照。结果如表1所示，本发明检测结果的相对标准偏差(RSD)在3.4～5.8％，在可以接受范围内；而且试纸条检测方法的RSD值略小于标准方法HPLC的RSD值，说明本发明中的试纸条检测方法结果较为稳定、重现性好。
表1 比色阵列与HPLC检测方法对比
| 样品编号 | 比色阵列(μM) | RSD(％) | HPLC(μM) | RSD(％) |
| 1 | 0.40 | 4.3 | 0.38 | 5.6 |
| 2 | 2.62 | 5.8 | 2.70 | 6.9 |
| 3 | 0.24 | 3.4 | 0.19 | 4.8 |
| 4 | 0.52 | 4.2 | 0.49 | 6.5 |
| 5 | 0.63 | 5.1 | 0.68 | 4.3 |
| 6 | 0.32 | 3.9 | 0.40 | 5.8 |
该比色阵列方法灵敏度高、稳定性好、特异性好的原因在于：(1)本发明所述印迹MOFs仿酶探针不需使用抗体、适配体等生物分子，能够用于特定环境中目标物的特异识别与原位催化，进而提高了测定灵敏度和传感体系的抗干扰能力；(2)本发明所述比色分析方法操作简单，不需荧光激发光源、信号获取等专用设备；(3)本发明所述试纸条分为质控区、检测区和标准区；质控区用于选择现场分析最适的比色参数，从而有效克服了环境差异引起的实验误差；标准区用于建立比色分析数学模型，并初步判断实际样品的农残含量，以便调整过大或过小的农残浓度，从而确保分析的准确度；同时，通过手机获取图像RGB值并计算得到Gray值作为比色信号，有效避免了样品本身颜色对检测结果的干扰。
综上所述，本发明以分子印迹MOFs为比色探针，特异识别不同农残，并催化氧化底物发生显色反应；以低成本滤纸构建比色试纸条，并将其分为质控区、标准区和检测区；质控区有效克服了现有试纸条易受环境干扰的不足，而将检测区和标准区进行对比，可以初步判断实际样品的农残含量，以便调整过大或过小的农残浓度，从而确保分析的准确度。同时借助智能手机稳定捕获显色体系RGB颜色信号，根据Gray值与农残浓度间的相关关系，实现了痕量农残的高敏特异比色分析。该比色传感分析方法具有简便快捷、灵敏度高、可靠性好等优势，为环境、农产品等复杂基质中农残的野外实地监测提供了新的技术支持。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于印迹MOFs探针高灵敏快速检测农残的方法，其特征在于，步骤如下：
步骤1.1：将MOFs和氨丙基三乙氧基硅溶于氨水中，得到混合溶液；然后选择一种农药标品，记为NY，加入上述混合溶液中进行第一次搅拌，搅拌后再加入硅酸乙酯进行第二次搅拌，搅拌后经离心、洗涤、干燥，得到印迹MOFs仿酶探针；
步骤1.2：取普通滤纸分为A、B、C三个区域，其中A区为质控区，B区为标准区，C区为检测区；
步骤1.3：将质控区分为两个质控分区，分别标记为质控分区1、质控分区2；将质控分区1从左到右按照列分为n个区域，这n个区域分别标记为H1、H2、H3……Hn-1、Hn；质控分区2也从左到右按照列分为m个区域，这m个区域分别标记为I1、I2、I3……Im-1、Im；其中n、m均为大于1的整数；
步骤2.1：质控区的建立；
步骤2.1.1：确定最适印迹MOFs仿酶探针溶液的浓度；
将步骤1.1制备的印迹MOFs仿酶探针加入乙醇中，得到不同浓度印迹MOFs仿酶探针溶液依次标记为1、2，……、n-1、n，然后将V1体积的1、2，……、n-1、n的印迹MOFs仿酶探针溶液分别对应滴加在质控分区1的H1、H2、H3……Hn-1、Hn的区域上，待其干燥；然后取步骤1.1中的NY溶于水中，形成NY溶液；再于质控分区1的H1、H2、H3……Hn-1、Hn的区域上均滴加上V2体积的NY溶液；反应一段时间后，再于质控分区1的H1、H2、H3……Hn-1、Hn的区域上依次滴加V3体积的显色剂，其中显色剂由3,3',5,5'-四甲基联苯胺、过氧化氢和pH为4.0的NaAc-HAC组成；然后观察质控分区1中H1、H2、H3……Hn-1、Hn的区域的颜色变化，并获取各区域的图片及对应的RGB值，进一步计算其灰度值，灰度值最大的区域所对应的印迹MOFs仿酶探针溶液浓度即为最适印迹MOFs仿酶探针溶液浓度；
步骤2.1.2：确定最适显色剂的浓度；
经步骤2.1.1确定最适印迹MOFs仿酶探针溶液浓度后，再将V4体积最适浓度的印迹MOFs仿酶探针溶液依次滴加在质控分区2所对应的I1、I2、I3……Im-1、Im上待其干燥后，在质控分区2的I1、I2、I3……Im-1、Im的区域上再滴加上V5体积步骤2.1.1中的NY溶液，反应一段时间后，再于质控分区2的I1、I2、I3……Im-1、Im的区域上滴加上V6体积不同浓度的显色剂，其中显色剂由3,3',5,5'-四甲基联苯胺、过氧化氢和pH为4.0的NaAc-HAC组成；然后观察，质控分区2中I1、I2、I3……Im-1、Im的颜色变化，并获取各区域的图片及对应的RGB值，进一步计算其灰度值，灰度值最大的区域所对应的显色剂浓度即为最适显色剂浓度；
步骤2.2：标准区的建立；
将标准区从上到下分为n个区域并依次标记为E1、E2、E3、……En-1、En；经步骤2.1.1确定最适印迹MOFs仿酶探针溶液浓度后，将V7体积最适印迹MOFs仿酶探针溶液浓度分别滴在对应的标准区E1、E2、E3、……En-1、En表面，待其干燥后，配制不同浓度的NY溶液并将其标记为C1、C2、……、Cn-1、Cn，然后将V8体积不同浓度的NY溶液分别滴在对应的E1、E2、E3、……En-1、En区域，进行第一次反应；再根据步骤2.1.2中确定的最适显色剂浓度，再在E1、E2、E3、……En-1、En区域滴加上V9体积的显色剂后进行第二次反应，从而建立标准区的标准比色卡；标准区的标准比色卡的颜色维持时间20min以上不变色；
步骤2.3：获取步骤2.2的标准区的标准比色卡对应检测不同浓度NY溶液的显色图片，分析出NY溶液在不同浓度下的RGB值，根据公式(1)计算其对应的Gray值分别记为G1、G2，G3、……Gn-1、Gn；
其中R指的是图片提取的red值，G是图片提取的green值，B指的是图片提取的blue值，Gray是灰度值；
并将根据公式(1)计算的标准区的Gray值和对应NY溶液浓度m构建比色分析数学模型，得到Y＝k*m+b，其中b、k为常数；m是NY溶液浓度，单位μM；
标准区NY溶液判别值记为P，P的取值区间为M*(1-10％)～M*(1+10％)，其中M是标准区不同NY溶液浓度所得的灰度值的中间值；
步骤2.4：检测区的建立；
将检测区从左到右按列平均分为N个区域，并将N个区域，即N列的上部分别标记为样品1、样品2、样品3、……、样品n-1、样品n；其中样品1之下的区域分别划分为11、12、13、……1i；样品2之下的区域分别划分为21、22、23、……2i；样品3的区域分别划分为31、32、33……3i；样品n-1之下分别标记为n-11、n-12、n-13……n-1i；样品n之下分别标记为n1，n2，n3……ni；
取n个待测样品预处理后得到待测样品溶液，依次编号为待测样品溶液1、待测样品溶液2……、待测样品溶液N；然后根据步骤2.1.1得到最佳浓度的印迹MOFs仿酶探针溶液，并将V10体积最适印迹MOFs仿酶探针溶液浓度分别滴在对应的检测区的N个区域上，待其干燥后；将V11体积的待测样品溶液1分别滴在11、12、13、……1i上；将V11体积待测样品溶液2分别滴在21、22、23、……2i上；将V11体积的待测样品溶液n-1滴在n-11、n-12、n-13……n-1i上；将V11体积的待测样品溶液n滴在n1、n2、n3、……、ni上，其中i、n均为大于1的整数，并反应一段时间；
步骤2.5：将V12体积的步骤2.1.2中得到的最适浓度的显色剂滴加到步骤2.4制得的检测区的N个区域上待其反应一段时间后，将其与步骤2.2标准区中已建立标准比色卡的颜色进行对照，初步判断样品中农药的浓度范围；并根据公式(1)计算待测样品中农药的Gray值，当其不在判别值P的取值范围内，需调整样品中农药的浓度；
如若样品中农残浓度的Gray值大于M*(1+10％)，则需要对该样品进行稀释，直至其取值在在判别值P的范围内，记录稀释倍数；
如若样品中农残浓度的Gray值小于中间值M*(1-10％)则需要对该样品进行浓缩，直至其取值在在判别值P的范围内，记录浓缩倍数；
将调整后的农残浓度再次重复上步骤2.4和2.5，根据公式(1)计算显色图片的Gray值G0，再与判别值P进行比较，若G0值在判别值P范围值内，进而根据比色分析数学模型得到样品中农残含量为Y0＝(G0-b)/k，其中M是标准区不同NY溶液浓度所得的灰度值的中间值，b、k是常数，Y0是调整后样品中农药浓度。
2.根据权利要求1所述的基于印迹MOFs探针高灵敏快速检测农残的方法，其特征在于，进一步的，步骤1.1中所述MOFs、氨丙基三乙氧基硅、氨水、农药标品和硅酸乙酯的用量关系为400～700mg：10～30μL：2～10mL：10～20mg：5～15mL；所述氨水体积分数为5～15％，所述第一次搅拌、第二次搅拌的时间均为5～15min；
所述农药标品为噻虫啉、氧化乐果、阿维菌素、哒螨灵、灭菌丹、克菌丹、甲草胺或莠去津的任意一种。
3.根据权利要求1所述的基于印迹MOFs探针高灵敏快速检测农残的方法，其特征在于，步骤1.2中A、B、C三个区域的面积比为2:1:2。
4.根据权利要求1所述的基于印迹MOFs探针高灵敏快速检测农残的方法，其特征在于，步骤2.1.1中所述NY溶液的浓度为2μM，所述NY为噻虫啉、氧化乐果、阿维菌素、哒螨灵、灭菌丹、克菌丹、甲草胺或莠去津的任意一种；所述反应一段时间为5-10分钟；所述印迹MOFs仿酶探针溶液浓度为1mg/mL～3mg/mL；所述显色剂中TMB、H2O2和pH 4.0NaAc-HAC用量关系为0.4mL～0.8mL：0.4mL～0.8mL:0.1mL～0.8mL，其中TMB和H2O2浓度比为1:20～5:1；
所述V1、V2、V3体积比为1:1:1，用量均为10～20μL。
5.根据权利要求1所述的基于印迹MOFs探针高灵敏快速检测农残的方法，其特征在于，步骤2.1.2中印迹MOFs仿酶探针溶液浓度为1mg/mL～3mg/mL，反应时间为5～15min；所述NY溶液的浓度为2μM，所述NY为噻虫啉、氧化乐果、阿维菌素、哒螨灵、灭菌丹、克菌丹、甲草胺或莠去津的任意一种；显色剂中TMB、H2O2和pH 4.0NaAc-HAC用量为0.4mL～0.8mL：0.4mL～0.8mL:0.1mL～0.8mL，其中TMB和H2O2浓度比为1:20～5:1；
所述V4、V5、V6体积比为1:1:1，用量都为10～20μL。
6.根据权利要求1所述的基于印迹MOFs探针高灵敏快速检测农残的方法，其特征在于，步骤2.1中所述灰度值的计算公式如下：
其中R指的是图片提取的red值，G是图片提取的green值，B指的是图片提取的blue值，Gray是灰度值。
7.根据权利要求1所述的基于印迹MOFs探针高灵敏快速检测农残的方法，其特征在于，步骤2.2中所述不同浓度NY溶液的浓度范围为0～20μM；所述NY为噻虫啉、氧化乐果、阿维菌素、哒螨灵、灭菌丹、克菌丹、甲草胺或莠去津的任意一种；
所述第一次反应、第二次反应的时间均为5-10分钟；
所述V7、V8、V9体积比为1:1:1，用量都为10～20μL。
8.根据权利要求1所述的基于印迹MOFs探针高灵敏快速检测农残的方法，其特征在于，步骤2.4中所述V10、V11和V12体积比为1:1:1，用量均为10～20μL；所述反应一段时间为5-10min；所述样品预处理的方法为：首先将样品破碎处理后，再通过乙腈提取和旋转蒸发之后，将其残留物溶于水中，得到待测样品溶液。
9.根据权利要求1所述的基于印迹MOFs探针高灵敏快速检测农残的方法，其特征在于，步骤2.5中所述反应一段时间为5-10min。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的方法制备的标准比色卡用于快速检测农残用途。
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