CN110575852A - 一种集成样品前处理的多重数字rpa微流控芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种集成样品前处理的多重数字RPA微流控芯片，具有六层结构，分为样品前处理区域和多重数字RPA检测区域，2个区域之间通过通道连接，并通过螺杆微阀控制开合。所述样品前处理是基于磁珠法进行核酸提取，具有4个反应腔室，通过中间区域的矿物油将裂解，清洗，洗脱三个部分分隔开，所述多重数字RPA区域由4个独立的进样口进行反应组分预包埋，具有1个阴性对照区域以及3个阳性对照区域，可以同时检测3种目的基因。该集成式微流控芯片操作简单，可以在45分钟内完成整个检测过程，可直接给出目标基因的绝对拷贝数，检测方法十分快速、简单，降低检测成本的同时给用户最直观的准确结果。非常适用于体外诊断。

Description

一种集成样品前处理的多重数字RPA微流控芯片
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种集成样品前处理的多重数字RPA芯片，尤其涉及一种集成样品前处理的多重数字RPA微流控芯片。
背景技术
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：单链DNA结合蛋白，重组酶和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。该技术能够在30分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。
数字化的计数方法最先应用于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)。随着微流控技术的发展，这种数字化的技术方法已经成功应用于微流控芯片。通过对微流控芯片结构的设计、多种功能单元的配合，实现试剂的操控、生化反应的进行以及反应结果的检测等。该技术通过将反应液进行一定程度的稀释，使每个小腔室中有1个或0个核酸分子，随后经过指数级的扩增，使得单个分子在单个腔室中的浓度扩增达到可检测的水平。该类型的方法不依靠标准曲线，不需要参考对照，只需对阳性的反应小室进行计数，从而真正意义上实现绝对定量。基于此原理，RPA技术同样可以应用于数字化的微流控芯片实现对核酸的精准定量。类似于数字PCR的过程，只需要将RPA反应所需要的模版，引物，探针及酶等成分进行一定体积的配制，加入到微流控芯片中，就可以实现数字RPA(digitalRPA，dRPA)的检测。Li等制作了一款皮升级微流控芯片，用于数字RPA的检测。Shen等制作了一款滑动式的微流控芯片并与RPA技术相结合，通过数字RPA芯片能够在30分钟内对病原菌进行检测。但是，当前的数字RPA芯片无法对一个样品实现多个靶标检测，即多重数字化检测无法达到。
样品前处理是PCR以及RPA检测所必须的一个环节。通过对样品中核酸分离、纯化得到所需要的核酸是成功进行核酸检测的前提和关键。微流控芯片为样品前处理提供了一个有效的平台。通过将样品前处理集成到微流控芯片上可以在短时间内从少量样本中获得核酸。Gunal等人设计了一款微流控芯片将单分散的多孔二氧化硅应用到微流体芯片上，该芯片可以从10μL的全血裂解物中分离14ng DNA。但是，当前的样品前处理的微流控芯片无法实现与数字化检测相结合，操作者依然需要经过一个配制反应液的环节来完成整个检测过程。
发明内容
本发明的目的是提供一种集成样品前处理与多重数字RPA检测的微流控芯片。该芯片能够在45分钟内完成样品前处理到多重数字检测的整个过程。芯片体积小巧，手工操作环节少，可以同时检测3种目的基因并配有阴性对照区域，从而可以实现“样品进-数字化结果出”。
本发明提供的一种集成样品前处理与多重数字RPA检测的微流控芯片，具有六层结构，从下到上依次为：载玻片1，空白层2，小室层3，支撑层4，负压维持层5和封口层6，按区域划分，该芯片分为样品前处理区域21和多重数字RPA检测区域20。样品前处理区域由4个直径为5mm的圆柱组成，贯穿3-5层，多重数字RPA检测区域由4个检测区域组成，其中3个阳性检测区域以及1个阴性对照区域。小室层3设置反应小室14。
样品前处理区域用于裂解细胞、提取核酸。多重数字RPA检测区域用于绝对定量样品中核酸浓度。
所述样品前处理区域中4个圆柱排列方式为中间一个圆柱体，其余三个圆柱体间隔120度围绕中间圆柱体排列。4个圆柱分别为裂解区16、清洗区17、矿物油区18和洗脱区19。
所述多重数字RPA检测区域20由4个检测区域组成。每个区域反应小室数量在3600个～4800个之间，每个反应小室的大小范围比较宽泛：长度在50μm～250μm之间，宽度在50μm～250μm之间，高度在100μm～300μm之间。每个检测区域连接1条通道15，每个检测区域的通道分别连接第一进样口7、第二进样口8、第三进样口9和第四进样口10。
样品前处理区域的4个圆柱和多重数字RPA检测区域通过100μm宽的通道15连通，第二螺杆微阀12设置在这段连接通道上，第一螺杆微阀11和第三螺杆微阀13分别设置在连接多重数字RPA检测区域的通路上，从而通过第一螺杆微阀11、第二螺杆微阀12、第三螺杆微阀13可以控制这两个区域的连通和关闭，以及进样。
所述芯片共有12800个反应小室和16条通道15，每条通道的两侧排布反应小室，并和所述通道连通，每个反应小室体积为2nL。
样品前处理区域的4个圆柱的底部在小室层，并与通道连通，顶部在负压维持层，因此4个圆柱形贯穿小室层3、支撑层4和负压维持层5。
所述载玻片1为玻璃材质，大小为3cm×7cm。
所述空白层2为聚二甲基硅氧烷(PDMS)材质，PDMS透明且具有很强的透气性储气性，同时还具有疏水性。
所述小室层3由软光刻法制作模具，再浇筑脱PDMS，待其固化后模制作而成。小室材质为PDMS材质，用来保证整个反应环境的均一性。
所述支撑层4由高度在3mm～7mm之间，用来支撑反应小室层所需要的三个螺杆微阀以及提供一定的负压。
所述负压维持层5为parylene C组成，该层厚度可在1μm～1mm之间，用于维持负压以及防止反应小室中水分蒸发。
所述螺杆微阀11-13为不锈钢材料，直径为2mm，高度为6mm。
所述所述空白层2、小室层3、支撑层4都由疏水材料聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。
所述小室层3、空白层2通过不可逆等离子体键合。
本发明的另一个目的是提供所述的集成样品前处理的多重数字RPA微流控芯片的制备方法，通过以下步骤：
(1)用浓硫酸彻底预清洁4英寸硅晶片；
(2)用软光刻法制作小室层模具；
(3)将模具用三甲基氯硅烷处理5分钟；
(4)将PDMS浇筑到小室层模具上，固化后制成小室层；
(5)不锈钢螺杆微阀放在小室层上并对齐阀门位置；
(6)将10：1的PDMS(A：B)倾倒在小室层上，制成支撑层；
(7)通过等离子体处理将芯片用与涂有固化的PDMS的载玻片封接；
(8)将Parylene C添加到气相沉积系统中以形成负压维持层；
(9)对芯片进行打孔，形成进样口；
(10)在负压维持层上贴聚丙烯薄膜，密封进样口；
本发明的另一个目的是提供利用上述的集成样品前处理的多重数字RPA微流控芯片进行数字RPA检测的方法，通过以下步骤实现：
(1)将含有反应组分包括引物、探针、酶的混合物加入到芯片中，再进行冻干，形成预包埋物；
(2)将预包埋好的集成样品前处理的多重数字RPA微流控芯片的进样口封闭后，置于提供真空环境的仪器设备，对芯片进行脱气处理；
(3)将待检测样品加入到样品前处理区域依次经过裂解、清洗、洗脱过程，打开螺杆微阀，含有纯化核酸的洗脱液进入芯片，充满反应小室；
(4)矿物油随即充满连通小室的通道将各个反应小室进行分隔，形成互不连通的独立反应小室，并关闭螺杆微阀，贴上聚丙烯薄膜；
(5)将芯片放置于39℃热板上进行孵育30min；
(6)用Maestro Ex IN-VIVO系统进行成像，激发光波长为455nm，发射光为495nm，对阳性小室的数目进行统计，最后得到待测样品的核酸浓度。
其中步骤(1)所述的反应组分预埋方法，通过以下步骤实现：
(1)将芯片抽成真空；
(2)用移液枪吸取配制好的用于RPA反应的组分，通过4个单独的进样口在负压作用下进入芯片内；
(3)使用矿物油将进样口封堵；
(4)将密封后的芯片放入到冻干机进行冻干。
本发明具有的有益效果为：
(1)本发明提供的集成样品前处理与多重数字RPA检测的微流控芯片，制备相对简单。由于具有单独的预埋材料进样口，可以根据检测需求，灵活改变检测对象。在应用时，由于此芯片的小室基板为具有透气性储气性的疏水材料，因此进样方式是基于负压的自吸分液，小室在数秒内就会被液相充满，而无需进行亲水疏水等表面修饰对其进行处理或需施加离心力等外界力。
(2)本发明提供的集成样品前处理与多重数字RPA检测的微流控芯片可以在芯片上同时完成核酸提取与多重数字RPA检测。该芯片可以在15min内完成核酸提取，30min内完成核酸检测，45min内就可以完成对3种基因的定量检测。方法十分快速、简单，应用也非常广。
(3)本发明提供的集成样品前处理与多重数字RPA检测的微流控芯片可以直接给出目标基因的绝对拷贝数，与其它的集成前处理的芯片相比，不需要建立标准曲线或者标准物质作为对照，可以大大降低检测成本的同时给用户最直观的准确结果。
附图说明
图1是本实施例提供的集成样品前处理与多重数字RPA检测的微流控芯片的三维结构图，其中1为载玻片，2为空白层，3为小室层，4为支撑层，5为负压维持层，6为封口层，7-10为预包埋反应组分混合物进样口，11-13为螺杆微阀，14为反应小室，15为通道，16为裂解区，17为清洗区，18为矿物油区，19为洗脱区，20为多重数字RPA检测区域，21为样品前处理区域。
图2是集成样品前处理与多重数字RPA检测的微流控芯片的平面示意图，其中，20为多重数字RPA检测区域，21为样品前处理区域，7-10为预包埋反应组分混合物进样口，11-13为螺杆微阀，14为反应小室，15为通道。
图3是样品前处理区域平面示意图，其中，16为裂解区，17为清洗区，18为矿物油区，19为洗脱区。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以说明本发明，仅为本发明的最优选实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1集成样品前处理的多重数字RPA微流控芯片
参见图1，所述微流控芯片具有六层结构，从下到上依次为：载玻片1，空白层2，小室层3，支撑层4，负压维持层5和封口层6，按区域划分，该芯片分为样品前处理区域21和多重数字RPA检测区域20。样品前处理区域21由4个直径为5mm的圆柱形组成，4个圆柱分别为裂解区16、清洗区17、矿物油区18和洗脱区19，对应装有裂解缓冲液、清洗缓冲液、洗脱缓冲液以及矿物油。多重数字RPA检测区域20由4个检测区域组成，包括3个阳性检测区域以及1个阴性对照区域。参见图2，每个检测区域包含2组通道15，每条通道15两边排布与之连同的反应小室14，每个反应小室14体积为2nL。支撑层4起到提供负压的作用。应当理解的是，此处仅作为举例而非限制，RPA反应小室并不限于两两对称，实际还可以是相间排列在道的两侧。样品前处理区域21的圆柱的底部在小室层3，底部侧面与通道15连接，圆柱的顶部在负压维持层5，因此4个圆柱形贯穿小室层3、支撑层4和负压维持层5。
参见图2，小室层3包括通道15和分布在通道两边的独立的RPA反应小室14，共有12800个反应小室14和16条通道15，每2条通道15为一组。多重数字RPA检测区域20的四个检测区域的通道15分别连接第一进样口7、第二进样口8、第三进样口9和第四进样口10，可以对反应组分进行预包埋，进而能实现多重检测。
样品前处理区域21的4个圆柱和多重数字RPA检测区域20通过100μm宽的通道15连通，第二螺杆微阀12设置在这段连接通道上，第一螺杆微阀11和第三螺杆微阀13分别设置在连接多重数字RPA检测区域的通路上，从而通过第一螺杆微阀11、第二螺杆微阀12、第三螺杆微阀13可以控制这两个区域的连通和关闭，以及进样。
所述多重数字RPA检测区域20的每个检测区域中反应小室数量在3600个～4800个之间，每个反应小室的大小范围：长度在50μm～250μm之间，宽度在50μm～250μm之间，高度在100μm～300μm之间。
参见图3，所述样品前处理区域21中的4个圆柱排列方式为中间一个圆柱体，其余三个圆柱体间隔120度围绕中间圆柱体排列，由中间区域的矿物油将裂解缓冲液，清洗缓冲液，洗脱缓冲液分开。
支撑层4是可以是任意比例的PDMS材料，在正常情况下可以储存气体，在真空条件下可以形成负压，为后续的进样提供动力。
空白层2、小室层3之间通过不可逆的等离子体键合贴合在一起。
负压维持层5上的4个进样口可通过封口油进行封闭，无需加热和紫外照射，封口油由5:1PDMS(A:B)和铂金催化剂制成。
反应小室14的油为硅油、10:1PDMS(A:B)和铂金催化剂制成，保存在-20℃。
空白层2，小室层3，支撑层4由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成，负压维持层由Parylene C制成，封口层6由聚丙烯薄膜制成。
参见图2，螺杆微阀12设置在样品前处理区域21与样品前处理区域21连接的通道15上，通道15又与小室层3连接，当螺杆微阀12拧紧的时候，样品前处理区域21与小室层3无法连通，通路被阻断，当螺杆微阀12拧松的情况下，样品前处理区域21涉及的4个圆柱中的反应液可以进入小室层3的通道15进入反应小室14。
实施例2本发明提供的微流控芯片通过以下步骤制备：
(1)清洗硅片：用浓硫酸浸泡硅片，再用去离子水清洗，最后180℃烘烤30min。
(2)小室层模具制作：倾倒1g的SU-8 3025负性光胶在硅片中央，涂覆程序为：500rpm，10s；1500rpm，30s，旋涂的光胶厚度为70μm。前烘：65℃烘烤1min，95℃烘烤10min，缓慢冷却至室温。将掩膜对准涂有光胶的硅片，然后利用单面光刻机进行曝光，波长360nm，曝光时间为12s。后烘：65℃烘烤1min，95℃烘烤4min，缓慢冷却至室温。显影：在通风橱里，将硅片放入玻璃平皿中，倒入显影液没过硅片，盖上平皿的盖子放在摇床上，显影15min后取出硅片，用异丙醇清洗硅片，若硅片上出现乳白色絮状物，则将其放入显影液中继续显影，直至用异丙醇清洗不会出现乳白色沉淀，最后用去离子水清洗硅片，并用空气吹干。显影后的硅片放置在热板上进行硬烘，200℃烘烤30min。待硅片降至室温，用三甲基氯硅烷处理模具表面5min，以便后期PDMS更容易脱模。
(3)小室层制作：配制5:1的PDMS预聚物6g，混匀后用匀胶机离心并真空脱气去除气泡。将配好的预聚物倒在制作好的模具上，放入旋转涂覆机中旋涂，程序为：500rpm，10s；1500rpm，30s，厚度大约为300μm，85℃烘烤5min。将三个螺杆微阀放在小室层上方相应的位置。
(4)支撑层制作：在小室层上方旋涂一层10:1的PDMS，厚度约为4mm，在85℃烘烤40min。
(5)空白层制作：在干净的载玻片上旋涂100μm厚度的5:1的PDMS，85℃烘烤5min，固化后冷却至室温。
(6)负压维持层制作：在支撑层上方沉积厚度为1μm左右的Parylene C。
(7)空白层、小室层键合，用等离子体处理空白层和小室层表面，再将两者贴合，并在85℃烘烤过夜。
(8)将固化的PDMS从模具上揭下并打孔。
(9)整个芯片使用Parylene C维持负压，至此，获得完整的芯片。
(10)最后在芯片上贴上聚丙烯薄膜，用以密封进样口。
实施例3
所述的样品前处理所需反应液的组分如下：
裂解缓冲液：10mg/mL溶菌酶、20mg/mL蛋白酶K、0.1％SDS、1mM EDTA、10mMTris-Hcl和1μL RNA酶抑制剂，50mg/mL硅基超顺磁珠。
清洗缓冲液：6M GuHKCl。
洗脱缓冲液：体积比为9:1的无核酸酶水和醋酸镁。
将三种缓冲液分别加入芯片上各自的区域。样本首先进入裂解缓冲液中，样品被裂解，核酸释放，被磁珠吸附，然后磁铁吸附磁珠，穿过矿物油区进入清洗区，清洗时间为2min，然后又由磁铁吸附磁珠经过矿物油进入洗脱区。
所述集成样品前处理的多重数字RPA微流控芯片前处理区域与多重数字RPA区域由螺杆微阀分隔开。当螺杆微阀打开的时候，矿物油和包含核酸的洗脱液可以进入小室层，首先洗脱液将小室填满，其次矿物油将小室进行分隔，形成独立的反应单元。
所述芯片的进样口用封口油将进样口进行密封，最后再贴上聚丙烯薄膜，以防止蒸发。
所述芯片反应条件为39℃热板上进行孵育30min。
所述芯片反应结果用Maestro Ex IN-VIVO系统进行成像，激发光波长为455nm，发射光为495nm。
以上所述的，仅为本实验的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的要求权利保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (10)

1.一种集成样品前处理与多重数字RPA检测的微流控芯片，其特征在于，从下到上依次由：载玻片（1）、空白层（2）、小室层（3）、支撑层（4）、负压维持层（5）和封口层（6）构成，按区域划分，该芯片分为样品前处理区域（21）和多重数字RPA检测区域（20），样品前处理区域（21）和多重数字RPA检测区域（20）通过通道（15）连接，并由第二螺杆微阀（12）控制开放和关闭，小室层（3）包括通道（15）和与通道（15）连通并排布在其两边的反应小室（14）。
2.根据权利要求1所述的一种集成样品前处理与多重数字RPA检测的微流控芯片，其特征在于，样品前处理区域（21）由4个直径为5 mm的圆柱组成，4个圆柱分别为裂解区（16）、清洗区（17）、矿物油区（18）和洗脱区（19），4个圆柱排列方式为中间一个圆柱体，其余三个圆柱体间隔120度围绕中间圆柱体排列。圆柱底部与通道连通。
3.根据权利要求1所述的一种集成样品前处理与多重数字RPA检测的微流控芯片，其特征在于，多重数字RPA检测区域（20）由4个检测区域组成，每个检测区域连接4条通道（15），每个检测区域的通道（15）分别连接第一进样口（7）、第二进样口（8）、第三进样口（9）和第四进样口（10）。
4.根据权利要求1所述的一种集成样品前处理与多重数字RPA检测的微流控芯片，其特征在于，样品前处理区域（21）的4个圆柱和多重数字RPA检测区域（20）通过100 μm宽的通道（15）连通，并由第一螺杆微阀（11）、第二螺杆微阀（12）、第三螺杆微阀（13）控制这两个区域的连通和关闭。
5.根据权利要求1所述的一种集成样品前处理与多重数字RPA检测的微流控芯片，其特征在于，多重数字RPA检测区域（20）的每个检测区域反应小室数量在3600个～4800个之间，每个反应小室（14）的大小范围为：长度在50 μm～250 μm之间，宽度在50 μm～250 μm之间，高度在100 μm～300 μm之间。
6.根据权利要求1所述的一种集成样品前处理与多重数字RPA检测的微流控芯片，其特征在于，所述芯片共有12800个反应小室和16条通道（15），每条通道（15）的两侧排布反应小室（14），并和所述通道（15）连通，每个反应小室（14）体积为2nL。
7.根据权利要求1所述的一种集成样品前处理与多重数字RPA检测的微流控芯片，其特征在于，所述所述空白层（2）、小室层（3）、支撑层（4）由疏水材料聚二甲基硅氧烷制成，负压维持层（5）为parylene C组成，所述小室层（3）、空白层（2）通过不可逆等离子体键合。
8.权利要求1所述的集成样品前处理的多重数字RPA微流控芯片的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）用浓硫酸彻底预清洁4英寸硅晶片；
（2）用软光刻法制作小室层模具；
（3）将模具用三甲基氯硅烷处理5分钟；
（4）将PDMS浇筑到小室层模具上，固化后制成小室层（3）；
（5）不锈钢螺杆微阀放在小室层上并对齐阀门位置；
（6）将10：1的PDMS按A：B倾倒在小室层（3）上，制成支撑层（4）；
（7）通过等离子体处理将芯片用与涂有固化的PDMS的载玻片（1）封接；
（8）将Parylene C添加到气相沉积系统中以形成负压维持层（5）；
（9）对芯片进行打孔，形成进样口和出样口；
（10）在负压维持层上贴聚丙烯薄膜，密封进出样口。
9.根据权利要求1所述的集成样品前处理的多重数字RPA微流控芯片进行数字RPA检测的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）将含有反应组分包括引物、探针、酶的混合物加入到芯片中，再进行冻干，形成预包埋物；
（2）将预包埋好的集成样品前处理的多重数字RPA微流控芯片的进样口和出样口封闭后，置于提供真空环境的仪器设备，对芯片进行脱气处理；
（3）将待检测样品加入到样品前处理区域依次经过裂解、清洗、洗脱过程，打开螺杆微阀，含有纯化核酸的洗脱液进入芯片，充满反应小室；
（4）矿物油随即充满连通小室的通道将各个反应小室进行分隔，形成互不连通的独立反应小室，并关闭螺杆微阀，贴上聚丙烯薄膜；
（5）将芯片放置于39℃热板上进行孵育30 min；
（6）用Maestro Ex IN-VIVO系统进行成像，激发光波长为455 nm，发射光为495 nm，对阳性小室的数目进行统计，最后得到待测样品的核酸浓度。
10.根据权利要求8所述的检测的方法，其特征在于，步骤（1）所述的反应组分预埋方法，通过以下步骤实现：
（1）将芯片抽成真空；
（2）用移液枪吸取配制好的用于RPA反应的组分，通过4个单独的进样口在负压作用下进入芯片内；
（3）使用矿物油将进样口封堵；
（4）将密封后的芯片放入到冻干机进行冻干。
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