CN114621477A - 一种基于表面液体单向流动的免疫层析膜及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于表面液体单向流动的免疫层析膜及其制备方法和应用。所述层析膜具有亲水性，其表面具有微纳仿生结构；该结构由一系列轴向排布的不对称沟槽以及沟槽内部的楔形或棘齿状结构组成。与传统NC膜材的层析膜相比，避免由毛细作用驱动在多孔NC膜内流动产生的非特异性吸附；基于微纳仿生结构模具的复制制造比NC膜的制作和改性具有更简单、更均一的实施条件，制备工艺稳定性和重现性好。本发明提供的免疫层析膜，有望替代传统NC膜，改善当前免疫层析技术样本损失、假阳性结果频出、检测线/质控线易增宽或异位、重现性及稳定性不佳等现状；其成本低，可用于制备快速检测的免疫层析试纸条以实现快速的免疫检测。
Description
技术领域
本发明属于医学诊断技术领域。更具体地，涉及一种基于表面液体单向流动的免疫层析膜及其制备方法和应用。
背景技术
免疫层析已经成为现代医学诊断领域的一个重要细分领域。由于其便携易用、制造成本低、以及毛细流动的特点，免疫层析试纸条能够在较短时间内完成免疫反应，实现现场快速检测的技术目的，在现场快速检测或筛查、居民疾病自查方面，已经产生了巨大的医学应用价值。免疫层析试纸条主要由4个纸基功能组件组成，分别是样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫，这些纸基功能组件在一个带有粘合面的塑料制成底板上依次叠放，即可完成组装。在这4个纸基功能组件中，层析膜是最重要的核心组件，是免疫层析过程中液体流动的场所和特异性免疫反应终点，也是免疫层析检测中的结果判读组件。层析膜的固有性质、加工工艺和产品质量能够直接影响免疫层析结果的可靠性。
目前，现有技术中免疫层析方法主要采用的层析膜为硝酸纤维素(Nitrocellulose，NC)，(也有采用醋酸纤维素或尼龙作为层析膜材料，但其性能不好，使用频率较低)。NC具有很好的疏水性能和负电荷吸附力，制成NC膜后，即可具备很强的蛋白质吸附能力，特别适合作为抗原、抗体的固相固定/包被介质，能够方便地制作结果判读所需的检测线、质控线等免疫结合区域。但是，NC膜的材料固有特性、加工工艺特点，也导致这种关键的膜材料对免疫层析过程带来的一系列不稳定因素：
1)非特异性吸附问题。NC膜的蛋白质强吸附能力没有特异性，同时适用于免疫结合区域上的包被抗原或抗体、样本溶液中携带的目标检测物、从结合垫上释放的信号标记抗体等。NC膜占试纸条总长的40％以上，是重要的试纸条毛细流动通道。在长达10～15分钟的检测过程中，样本溶液在NC膜内部大面积地毛细流动，非特异性吸附极易发生，进而导致样本损失、假阳性、检测线/质控线增宽或异位等导致结果失准的后续问题。
2)流动与疏水性的均一性问题。NC是一种疏水性强的材料；为了促使水性溶液流动，必须进行亲水改性。NC膜通常采用滚轮蒸发工艺制作、改性，得到带有一定尺寸孔隙的NC纤维层；工艺中的改性反应程度与孔隙尺寸的大小，将对NC膜材的流速、疏水性产生重要影响。滚轮蒸发工艺的均一性较低，很难制作出品质均匀的成片NC膜材。这意味着，试纸条上的一条层析膜中，不同区域的疏水性、流动性可能是不一致的，这将影响免疫层析过程的稳定性和重现性。
3)安全性问题。NC膜本质是一种硝基酯化的纤维素，硝基不仅具有毒性，更重要的是，硝基氧化后将快速提高爆炸风险，是炸药的前体材料。在干燥、摩擦、高热环境下，堆叠存放的NC膜容易发生燃烧现象；由于机械强度低，容易产生粉尘，粉尘环境中大量储备的NC剧烈燃烧，可能会引起爆炸。因此，NC膜目前已成为一种国家管制的材料，一般企业或实验室均没有资质自制备NC膜材料。
4)成本较高。纯NC膜在试纸条产品中的价格比重较高，是其他3种纸基组件成本总和的2倍或以上。另外，NC膜的机械强度低，容易在加工或使用过程中断裂、损坏，进而降低成品率，导致制造成本增加。
综上可知，尽管NC膜是免疫层析技术中的核心纸基材料，但目前仍面临着众多问题，这些问题成为了免疫层析技术的发展及能进行可靠检测的阻碍。因此，有必要研究和开发出一种新的能用于免疫层析的膜，以够解决NC膜出现的问题；并能取代NC膜，成为免疫层析试纸条中的核心组件，为免疫层析技术以及进行可靠的免疫层析检测提供保障。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于表面液体单向流动的免疫层析膜，解决原有层析膜出现的非特异性吸附问题、流动与疏水性的均一性问题、安全性问题以及高成本问题，从而改善免疫层析技术当前样本损失、假阳性结果频出、检测线/质控线易增宽或异位、重现性及稳定性不佳的现状。
本发明的第一个目的是提供一种免疫层析膜。
本发明的第二个目的是提供所述免疫层析膜的制备方法。
本发明的第三个目的是提供所述免疫层析膜的应用。
本发明的第四个目的是提供一种快速检测的免疫层析试纸条。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一种基于表面液体单向流动的免疫层析膜，所述层析膜具有亲水性，其表面具有微纳仿生结构；该结构由一系列轴向排布的不对称沟槽以及沟槽内部的楔形或棘齿状结构组成。
本发明提供的具有特殊微纳仿生结构的亲水固相薄膜，是仿造猪笼草中定向连续搬运液体的表面构造来制作的；该结构在运输方向上优化并加强毛细运输，同时阻止反方向的回流，从而自发引导流体自动地单向流动。
这种微纳表面引导流体定向流动的原理分为两个部分。首先，楔形或棘齿状结构具有特殊的形貌取向，这些形貌取向能够形成局部的固有接触角和流动角度。由于亲水固相总是存在高浸润性的表面，液体在其固有的表面张力和连续流动性质的共同作用下，能够在亲水表面自发地扩散或流动。因此，楔形或棘齿状结构的特殊形貌取向，能够借助表面张力为流体的被动流动提供动力，流体从而只能沿着这种形貌取向引导的方向自发流动。此时，沟槽起到了流向限制的作用，限制流体只能实现轴向的流动，而非横向流动。综上所述，在沟槽及其内部的楔形或棘齿状结构的共同作用下，采用微纳表面结构可设计并引导一种液体只能从起点端朝目标终点端定向流动的可控、单向流动行为。
优先地，所述层析膜采用热塑性或热固性材料制成。
进一步优选地，所述热塑性或热固性材料为聚苯乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯、聚氯乙烯或聚氨酯中的一种。
具体地，所述不对称沟槽宽为40～100μm，沟槽间距小于20μm，沟槽总长度与层析膜长度一致；所沟槽的内部具有长直径不均、短直径小于80μm的椭圆状形貌，其截面空心凹陷部分呈楔形孔，其截面凸起部分呈棘齿状棱。
本发明提供所述免疫层析膜的制备方法，包括如下步骤：
S1.将热塑性或热固性材料固相薄膜加热至熔融温度，将制作微纳仿生结构的模具压至固相薄膜表面；
S2.在一定压力下保持模具对固相薄膜的印制，并维持一段时间；
S3.印制结束后，将固相薄膜与模具进行冷却；
S4.待固相薄膜恢复硬度后，分离固相薄膜与模具，即制得具有微纳仿生结构的层析膜；
S5.将S4步骤中得到的具有微纳仿生结构的层析膜，进行亲水化处理。
优选地，步骤S1中的固相薄膜为聚苯乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚氨酯中的一种。
优选地，步骤S1中制作微纳仿生结构的模具印制出的结构为：由一系列轴向排布的不对称沟槽以及沟槽内部的楔形或棘齿状结构组成，其不对称沟槽宽为40～100μm，沟槽间距小于20μm，沟槽总长度与层析膜长度一致；所沟槽的内部具有长直径不均、短直径小于80μm的椭圆状形貌，其截面空心凹陷部分呈楔形孔，其截面凸起部分呈棘齿状棱。
优选地，步骤S2中印制压力为1～30kPa；印制时间为2～20s。
优选地，步骤S5中亲水化处理方法采用化学修饰法或物理处理法，具体根据层析膜的材料类型灵活变动。
本发明提供所述免疫层析膜在免疫检测、核酸检测、生物颗粒检测中的应用。
本发明提供所述免疫层析膜在免疫层析或在制备免疫层析检测产品中的应用。
本发明提供一种快速检测的免疫层析试纸条，含有上述免疫层析膜，在层析膜表面设有检测包被抗体、质控包被抗体，形成免疫结合区域。
具体地，所述快速检测的免疫层析试纸条包括支撑底板、免疫层析膜、结合垫、吸水垫、样品垫；免疫层析膜直接固定在支撑底板表面，在免疫层析膜两端分别放置吸水垫和结合垫；其中，吸水垫、结合垫与免疫层析膜部分重叠，其余部分与支撑底板表面固定；在结合垫的另一端，放置样品垫，样品垫与结合垫部分重叠，其余部分与支撑底板表面固定。
本发明提供的快速检测的免疫层析试纸条的组装方法为：将免疫层析膜粘合、固定在粘性支撑底板表面，在免疫层析膜两端分别放置吸水垫和结合垫；其中，吸水垫、结合垫与免疫层析膜重叠的长度为2～3mm，其余部分与粘性支撑底板表面粘合、固定；在结合垫的另一端，放置样品垫，样品垫与结合垫重叠的长度为2～3mm，其余部分与粘性支撑底板表面粘合、固定。
优选地，所述层析膜的免疫结合区域，有多种固定方法，包括直接包被法、抗体纤维层固定法和共价交联法等，根据不同的实施方案灵活变动。
更优选地，抗体纤维层固定法包括纤维层表面粘附法、印刷成型或丝网印刷成型法。
优选地，所述检测包被抗体、质控包被抗体直接包被在免疫层析膜上。
优选地，所述检测包被抗体、质控包被抗体粘附在免疫层析膜上。
优选地，所述检测包被抗体、质控包被抗体嵌入在免疫层析膜上。
优选地，所述免疫层析膜的免疫结合区域，其尺寸、数量，根据实际检测需求灵活变动。
优选地，所述试纸条的宽度约为2.0～5.0mm。
优选地，所述样品垫的长度约为1.5～2.0cm。
优选地，所述结合垫的长度约为1.0～1.5cm。
优选地，所述层析膜的长度约为2.5～5.5cm。
优选地，所述吸水垫的长度约为1.5～2.5cm。
本发明提供的快速检测的免疫层析试纸条在使用过程中，按常规免疫层析试纸条的使用方法，将样本溶液滴加在样品垫上；经毛细流动后，样本溶液充分渗入结合垫，释放标记抗体并与待测样本结合；此时，在结合垫与所述微纳表面结构基础的重叠部分底端，所述微纳表面结构将牵引样本溶液从结合垫中释放，并继续向前流动；流体流动过程中，样本溶液与所述新型免疫层析膜中部的含有单分子层、或非单分子层的免疫结合区域充分接触，完成免疫反应；最后，样本溶液到达流动终点，即吸水垫。吸水垫提供的毛细作用力，在微纳表面结构牵引作用的基础上，进一步地将试纸条前端的样本溶液向流动终点牵引，最终使所有(或大部分)携带检测物的样本溶液流经免疫结合区域。
此时，这种藉由表面具有微纳仿生结构控制流体流动的免疫层析反应过程结束。通过多种手段对所述新型免疫层析膜表面的检测信号进行判读，即可获取实时检测结果。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的免疫层析膜，具有亲水性，其表面设计有微纳仿生结构，由一系列轴向排布的不对称沟槽以及沟槽内部的楔形或棘齿状结构组成，能够引导一种液体只能从起点端朝目标终点端的定向、可控的流动行为；与传统硝酸纤维素(NC)膜材的层析膜相比，本发明提供的层析膜可避免因纤维素毛细流动导致的非特异性吸附；基于表面微纳仿生结构模具的复制制造比NC膜的制作和改性具有更简单、更均一的实施条件，制造工艺稳定性和重现性好。本发明提供的免疫层析膜采用热塑性或热固性材料制备得到，其机械强度高，同时可解决NC膜材易燃和成本高的问题。因此，本发明提供的免疫层析膜，有望替代传统NC膜，改善当前免疫层析技术样本损失、假阳性结果频出、检测线/质控线易增宽或异位、重现性及稳定性不佳等现状；其成本低，可用于制备快速检测的免疫层析试纸条以实现快速的免疫检测。
附图说明
图1为采用免疫层析膜的试纸条表面结构示意图；
图2为实施例1提供的使表面液体单向流动的免疫层析膜及采用层析膜的免疫层析试纸条示意图；
图3为基于实施例1提供层析膜的免疫层析试纸条进行样本检测的结果实物图；
图4为实施例2提供的使表面液体单向流动的免疫层析膜及采用层析膜的免疫层析试纸条示意图；
图5为实施例3提供的使表面液体单向流动的免疫层析膜及采用层析膜的免疫层析试纸条；
图6为对比例1提供的所述免疫层析膜与商品化试纸条的原装NC膜的流动对比。
其中，1-样品垫，2-标记抗体结合垫，3-使表面液体单向流动的免疫层析膜，31-直接包被在免疫层析膜的免疫结合区域、32-粘附在免疫层析膜的免疫结合区域、33-嵌入在免疫层析膜的免疫结合区域、4-吸水垫、5-支撑底板。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1免疫层析膜的制备及免疫层析试纸条的制作
1、具有微纳表面结构的免疫层析膜的制备
S1.将平整的聚苯乙烯(PS)薄膜加热至熔融温度，及时将用于制作微纳仿生结构的模具压至平整PS薄膜表面，加热温度为190℃；
S2.保持模具对PS薄膜的印制，维持20s，印制压力30kPa；
S3.印制结束后，将PS薄膜与模具冷却至室温；
S4.待PS薄膜冷却恢复硬度后，分离PS薄膜与模具，即可制得具有微纳仿生结构的层析膜；其结构如图1所示，由一系列轴向排布的不对称沟槽以及沟槽内部的楔形或棘齿状结构组成，其不对称沟槽宽为40～100μm，沟槽间距小于20μm，沟槽总长度与层析膜长度一致；所沟槽的内部具有长直径不均、短直径小于80μm的椭圆状形貌，其截面空心凹陷部分呈楔形孔，其截面凸起部分呈棘齿状棱；
S5.将S4制备的具有微纳仿生结构的层析膜，进行亲水化处理，具体步骤为：首先将压缩空气作为气体源，对具有微纳仿生结构的层析膜进行等离子体处理；随后马上切换气体源为氧气与氨气的混合物，在层析膜表面完成氨基化修饰。
2、免疫层析试纸条的制作
S1.将上述制备得到的免疫层析膜表面划定目标免疫结合区域，将其余层析膜区域掩蔽，将检测包被抗体、质控包被抗体的溶液，分别涂布在目标免疫结合区域表面，37℃下孵育1小时；其中，涂布量超过80μg/cm2；
S2.将免疫层析膜粘合、固定在粘性支撑底板表面；
S3.在免疫层析膜两端分别放置吸水垫和结合垫；其中，吸水垫、结合垫与免疫层析膜重叠的长度为2～3mm，其余部分与粘性支撑底板表面粘合、固定；
S4.在结合垫的另一端，放置样品垫，样品垫与结合垫重叠的长度为2～3mm，其余部分与粘性支撑底板表面粘合、固定，其制备得到的免疫层析试纸条如图2所示。
3、免疫层析检测结果
采用上述制备得到的免疫层析试纸条，并在试纸条的样品垫表面，加入高浓度待测抗原样本，进行免疫层析；10分钟后，免疫层析反应完成；肉眼观察带结构的PMMA层析膜表面的显色条带，即可判断结果。
检测结果如图3所示，所述的基于带有微纳表面结构的PMMA膜的免疫层析试纸条，可提供阳性样本的可视化显色结果。
实施例2免疫层析膜的制备及免疫层析试纸条的制作
1、具有微纳表面结构的免疫层析膜的制备
S1.将平整的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄膜加热至熔融温度，及时将用于制作微纳仿生结构的模具压至平整PMMA薄膜表面，加热温度为165℃；
S2.保持模具对PMMA薄膜的印制，维持2s，印制压力不超过10kPa；
S3.印制结束后，将PMMA薄膜与模具冷却至室温；
S4.待PMMA薄膜恢复硬度后，分离PMMA薄膜与模具，即可制得具有微纳仿生结构的层析膜，由一系列轴向排布的不对称沟槽以及沟槽内部的楔形或棘齿状结构组成；其不对称沟槽宽为40～100μm，沟槽间距小于20μm，沟槽总长度与层析膜长度一致；所沟槽的内部具有长直径不均、短直径小于80μm的椭圆状形貌，其截面空心凹陷部分呈楔形孔，其截面凸起部分呈棘齿状棱；
S5.将S4制备的具有微纳仿生结构的层析膜，进行亲水化处理，具体步骤为：首先将压缩空气作为气体源，对具有微纳仿生结构的层析膜进行等离子体处理；随后马上加入半胱氨酸修饰液，浸泡过夜后清洗层析膜表面即可。
2、免疫层析试纸条的制作
S1.将附着有检测包被抗体、质控包被抗体的免疫结合垫，粘附在上述制备得到的层析膜的指定区域表面；其中，免疫结合垫的材料为醋酸纤维素混合膜；
S2.将免疫层析膜粘合、固定在粘性支撑底板表面；
S3.在免疫层析膜两端分别放置吸水垫和结合垫；其中，吸水垫、结合垫与新型免疫层析膜重叠的长度为2～3mm，其余部分与粘性支撑底板表面粘合、固定；
S4.在结合垫的另一端，放置样品垫，样品垫与结合垫重叠的长度为2～3mm，其余部分与粘性支撑底板表面粘合、固定，其制备得到的免疫层析试纸条如图4所示。
实施例3免疫层析膜的制备及免疫层析试纸条的制作
1、具有微纳表面结构的免疫层析膜的制备
S1.将平整的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄膜加热至熔融温度，及时将用于制作微纳仿生结构的模具压至平整PMMA薄膜表面，加热温度为165℃；
S2.保持模具对PMMA薄膜的印制，维持2s，印制压力不超过10kPa；
S3.印制结束后，将PMMA薄膜与模具冷却至室温；
S4.待PMMA薄膜恢复硬度后，分离PMMA薄膜与模具，即可制得具有微纳仿生结构的层析膜，由一系列轴向排布的不对称沟槽以及沟槽内部的楔形或棘齿状结构组成；其不对称沟槽宽为40～100μm，沟槽间距小于20μm，沟槽总长度与层析膜长度一致；所沟槽的内部具有长直径不均、短直径小于80μm的椭圆状形貌，其截面空心凹陷部分呈楔形孔，其截面凸起部分呈棘齿状棱；
S5.通过激光切割或热压成型，在层析膜表面刻蚀出方形凹槽；方形凹槽的尺寸与免疫结合垫的尺寸一致；
S6.将S5制备的具有微纳仿生结构的层析膜，进行亲水化处理，具体步骤为：首先将压缩空气作为气体源，对具有微纳仿生结构的层析膜进行等离子体处理；随后马上加入半胱氨酸修饰液，浸泡过夜后清洗层析膜表面即可。
2、免疫层析试纸条的制作
S1.将上述制备得到的免疫层析膜附着检测包被抗体、质控包被抗体的免疫结合垫，嵌入在层析膜的凹槽中，其中，免疫结合垫的材料为醋酸纤维素膜；
S2.将免疫层析膜粘合、固定在粘性支撑底板表面；
S3.在免疫层析膜两端分别放置吸水垫和结合垫；其中，吸水垫、结合垫与新型免疫层析膜重叠的长度为2～3mm，其余部分与粘性支撑底板表面粘合、固定；
S4.在结合垫的另一端，放置样品垫，样品垫与结合垫重叠的长度为2～3mm，其余部分与粘性支撑底板表面粘合、固定，其制备得到的免疫层析试纸条如图5所示。
对比例1免疫层析膜与常规NC膜的流动对比
按实施例1的方法制备得到PMMA免疫层析膜；采用PMMA免疫层析膜，与试纸条商品上原装的NC膜进行流动性的对比，同时在两种膜的左侧加入10μL红墨水，观察流动情况。
其流动性结果如图6所示，本发明制备得到的PMMA免疫层析膜比NC膜具备更加快速、定向流动的能力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于表面液体单向流动的免疫层析膜，其特征在于，所述层析膜具有亲水性，其表面具有微纳仿生结构，该结构由一系列轴向排布的不对称沟槽以及沟槽内部的楔形或棘齿状结构组成。
2.根据权利要求1所述免疫层析膜，其特征在于，所述层析膜采用热塑性或热固性材料制成。
3.根据权利要求2所述免疫层析膜，其特征在于，所述热塑性或热固性材料为聚苯乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯、聚氯乙烯或聚氨酯中的一种。
4.根据权利要求1～3任一所述免疫层析膜，其特征在于，所述不对称沟槽宽为40～100μm，沟槽间距小于20μm，沟槽总长度与层析膜长度一致；所沟槽的内部具有长直径不均、短直径小于80μm的椭圆状形貌，其截面空心凹陷部分呈楔形孔，其截面凸起部分呈棘齿状棱。
5.权利要求1～4任一所述免疫层析膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将热塑性或热固性材料固相薄膜加热至熔融温度，将制作微纳仿生结构的模具压至固相薄膜表面；
S2.在一定压力下保持模具对固相薄膜的印制，并维持一段时间；
S3.印制结束后，将固相薄膜与模具进行冷却；
S4.待固相薄膜恢复硬度后，分离固相薄膜与模具，即制得具有微纳仿生结构的层析膜；
S5.将S4步骤中得到的具有微纳仿生结构的层析膜，进行亲水化处理。
6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，步骤S2中印制压力为1～30kPa；印制时间为2～20s。
7.权利要求1～4任一所述免疫层析膜在免疫检测、核酸检测、生物颗粒检测中的应用。
8.权利要求1～4任一所述免疫层析膜在免疫层析或在制备免疫层析检测产品中的应用。
9.一种快速检测的免疫层析试纸条，其特征在于，含权利要求1所述免疫层析膜；免疫层析膜表面设有检测包被抗体、质控包被抗体，形成免疫结合区域。
10.根据权利要求9所述免疫层析试纸条，其特征在于，所述检测包被抗体、质控包被抗体直接包被在免疫层析膜上、粘附在免疫层析膜上或嵌入在免疫层析膜上。
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