CN116087534A

CN116087534A - 一种红细胞抗原检测方法及检测试剂盒

Info

Publication number: CN116087534A
Application number: CN202211719552.9A
Authority: CN
Inventors: 庞伟; 魏立巧; 黄志刚
Original assignee: Tianjin Texiang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Tianjin Texiang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2023-05-09
Anticipated expiration: 2042-12-30

Abstract

本发明属于血型检测领域，具体涉及一种红细胞抗原检测方法及检测试剂盒。本发明提供的检测方法先将红细胞抗体用抗体包被液稀释100‑200倍后包被到硝酸纤维素膜上制成检测线和质控线，然后将20μL‑30μL待检测的含红细胞的全血或红细胞悬浮液滴加到所述检测线和质控线中间，利用毛细扩散的作用使所述含红细胞的全血或红细胞悬浮液与检测线和质控线上包被的红细胞抗体结合并反应；最后再加入冲洗液辅助所述含红细胞的全血或红细胞悬浮液在所述硝酸纤维素膜上均匀扩散并将未反应的红细胞冲走。

Description

一种红细胞抗原检测方法及检测试剂盒

技术领域

本发明属于血型检测领域，具体涉及一种红细胞抗原检测方法及检测试剂盒。

背景技术

红细胞血型是根据血液中红细胞膜表面抗原来划分的，根据抗原种类的不同，可以划分出20多个常见的分类系统，其中包括ABO血型系统和Rh血型系统。正确的血型鉴定对输血至关重要，输入不相容的血型会导致溶血的发生，进而导致严重的医疗事故。因此，快速、准确、操作简便的血型鉴定方法可为抢救危急病人、应对突发事件提供保障。

目前血型鉴定主要分为凝集法和基因法两大类。凝集法的原理为检测血液中红细胞(RBC)表面抗原，只要RBC表面存在相应抗原，即可与相应抗体发生凝集反应，包括纸片法、试管法、微柱法等。其优点是检测速度快，但受抗体保存条件限制，不适用于野外紧急条件，且通常误差较大。基因法主要通过特异性引物对RBC基因进行分型，以此对各自血型进行鉴定，尤其适合复杂血型的鉴定。但其检测速度慢、操作不便、成本高。因此，依然有必要开发操作简便、检测速度快，检测结果准确的血型检测工具。

目前主流的是利用迁移层析法检测人血型的试剂卡，其通常采用胶体金系统进行显色，一般都需要在试剂卡上专门设置含有胶体金标记抗体的结合垫使检测样本中的A血型抗原或B血型抗原先与胶体金标记抗体完成特异性结合，然后再通过检测线和质控线的显色情况进行结果判读。此类试剂卡在制备过程中由于引入胶体金和微球标记的蛋白，使得操作步骤繁琐，且引入胶体金和微球后，使反应物更加复杂。此外，此类试剂卡只能单侧加样，而且对结合垫的要求较高(血型抗原和胶体金的结合情况直接影响检测结果)，因此结果判读时间较长，一般为加样后15-30min。另外，这类试剂卡需依据检测线和质控线处胶体金显色进行结果判读，但由于检测样本(全血或者红细胞悬液)中所含有的血红蛋白本身就有颜色，因此有可能会在结果判读时呈现肉眼可见的颜色干扰，进而影响检测结果的准确性和精读。

虽然现有技术中也有尝试通过红细胞凝集直接显色的技术方案，但目前只能做到用单一抗体来检测未知血型。例如，中国发明专利申请CN101603967B公开了一种快速检测人ABO/Rh/MN血型的方法及试剂盒，该专利通过判断血液与单一抗体在玻璃纤维上是否有发生凝集反应的红细胞残留来判断血型，每次只能用一种已知抗体来检测未知血型，如果要检测多种血型抗原就要增设多张彼此独立的试纸检测条，分别加样检测，导致检测效率低，多次加样导致样本整体用量大，检测卡消耗严重等问题。并且检测的精度也容易因不同试纸条之间的差异和多次加样时存在的操作差异而受到影响。

综上所述，有必要针对现有的红细胞抗原检测方法做出优化和改进。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种红细胞抗原检测方法及检测试剂盒。具体技术方案如下。

一种红细胞抗原检测方法，包括如下步骤：

步骤1)：准备一张硝酸纤维素膜并在其上设置显色线，将红细胞抗体用抗体包被液稀释100-200倍后包被到所述显色线上并进行风干，所述抗体包被液包括质量分数为4％-6％的蔗糖、0.3％-0.5％的BSA、0.1％-0.3％的Proclin 300和PBS缓冲液，所述显色线之间平行排列，相邻显色线之间的间距为3-5mm；

步骤2)：将20μL-30μL待检测的含红细胞的全血或红细胞悬浮液滴加到步骤1)所述的显色线中间，利用毛细扩散的作用使所述含红细胞的全血或红细胞悬浮液与显色线上包被的红细胞抗体结合并反应，所述硝酸纤维素膜的毛细爬速为65-75s/4cm；

步骤3)：再滴加100-150μL冲洗液到所述硝酸纤维素膜上，促进所述含红细胞的全血或红细胞悬浮液在所述硝酸纤维素膜上均匀扩散并将未反应的红细胞冲走(使检测背景干净，便于结果判读)，所述冲洗液包括质量分数为0.5％-0.7％的Tween-80、0.1％-0.3％的Proclin 300和PBS缓冲液。

进一步，所述显色线包括检测线和质控线，包被的红细胞抗体包括抗A单克隆抗体，抗B单克隆抗体，抗RhD抗原的单克隆抗体和抗红细胞抗体(RBC抗体)。分别对应制成检测线A线、B线、D线和质控线C线。

进一步，所述红细胞抗体的起始浓度为2.0-3.0mg/ml。

优选的，所述硝酸纤维素膜的毛细爬速为70s/4cm。

进一步，步骤1)中所述的硝酸纤维素膜上包被好抗体后于30-37℃条件下风干8-16h。

优选的，所述PBS缓冲液的浓度为0.01M。

一种红细胞抗原检测试剂盒，所述红细胞抗原检测试剂盒包括含有血型抗原检测试纸条的试剂卡、红细胞抗体、抗体包被液和冲洗液；所述抗体包被液包括质量分数为4％-6％的蔗糖、0.3％-0.5％的BSA、0.1％-0.3％的Proclin 300和PBS缓冲液；所述冲洗液包括质量分数为0.5％-0.7％的Tween-80、0.1％-0.3％的Proclin 300和PBS缓冲液。

优选的，所述PBS缓冲液的浓度为0.01M。

进一步，所述血型抗原检测试纸条包括硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水纸基两部分，所述吸水纸基边缘压在所述硝酸纤维素膜边缘上。

进一步，所述红细胞抗体包括抗A单克隆抗体，抗B单克隆抗体，抗RhD抗原的单克隆抗体和抗红细胞抗体；所述红细胞抗体的浓度为2.0-3.0mg/ml。

进一步，所述硝酸纤维素膜上设置有显色线并在其上包被所述红细胞抗体，所述显色线之间平行排列，相邻显色线之间的间距为3-5mm。可以理解的是，所述硝酸纤维素膜下方设置有样品垫，所述样品垫和所述吸水纸基设置在背衬上。

可以理解的是，所述血型抗原检测试纸条放置在外壳内，所述外壳上设置观察窗口，所述观察窗口用于显示所述显色线和加样位置；所述外壳上的端部还设置有缓冲液孔。可以理解的是，所述端部可以是检测卡外壳的上端部，也可以是检测卡外壳的下端部。所述观察窗口的长度可以是15mm、16mm、17mm、18mm或19mm。

进一步，所述吸水纸基厚度大于等于0.6mm，长度大于等于10mm；所述硝酸纤维素膜长度为25mm，毛细爬速为65-75s/4cm。

有益技术效果

1)本发明提供了一种红细胞抗原检测方法，具体来说，以硝酸纤维素膜(NC膜)为检测载体，通过优化包被到所述硝酸纤维素膜上的红细胞抗体浓度、稀释所述红细胞抗体的抗体包被液成分、冲洗检测样品的冲洗液成分以及所述硝酸纤维素膜上的显色线设置等，提供了一种以有生物活性的红细胞直接作为阴阳性指示系统(即包被在检测线和质控线上的抗体直接与红细胞抗原结合)，无需介入胶体金、微球等非生物活性指示系统进行指示，实现了对血液里的不同抗原进行同时检测的方法。本发明方法还通过吸水纸基的长度及厚度、硝酸纤维素膜毛细爬速和加样位置的优化，提高了检测的准确率，减少了假阳性和假阴性出现的概率，同时操作简单、灵敏度高。在简化血型检测方式、缩短血型检测时间的同时实现了在同一张试纸条上对血液里的不同血型抗原的同时检测，提高了血型检测的精度和效率。

2)本发明提供的红细胞抗原检测方法利用毛细作用均匀分布的原理，将加样位置设置在NC膜几条显色线中间，再辅以冲洗液促进待测样本在NC膜上均匀扩散，使得红细胞样本一经扩散就能快速跟显色线上包被的抗体发生结合反应，极大的缩短了结果判读的时间；此外冲洗液还能冲走未反应的红细胞，使背景更加干净。利用本发明的红细胞抗原检测方法或试剂盒进行检测，结果判读的时间为加样5min后。而传统检测卡利用虹吸作用加样位置一般在检测卡一侧的尽头，加入的全血或红细胞悬液需依次爬行到试纸条不同检测线位置再与分别检测线上包被的抗体发生结合反应，因此判读时间一般为加样后15-30min。此外，本发明方法还能做到仅需检测一次，就能对未知血液样品里的ABO抗原和RhD抗原进行同时检测，节约了血液样品和试剂卡的用量。

3)本发明还提供的稀释红细胞抗体的抗体包被液可以牢固地将抗体固定在NC膜上，此外还能保护抗体，使抗体的稳定性提高，进而提高了检测方法的准确性，同时还能使制得的血型检测试剂卡存放时间更长而不至于使其包被的抗体变性失活。

4)本发明提供的红细胞抗原检测方法由于采用了特别的抗体包被液和冲洗液协同配合，使得待测样品能够均匀扩散且与检测线上包被的抗体在短时间内就能紧密结合，因此需要的样品加样量少，仅需20μL或30μL样品就能实现ABO血型和RhD血型的同时检测，节约了样本量。传统检测卡由于采用虹吸作用原理，需要足够的样本量才能使样本爬行到最远处的检测线并与此结合，因此需要的加样量一般需要大于60μL。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明红细胞抗原检测方法加样位置示例；

图2为本发明红细胞抗原检测试剂盒中的检测卡的一种示例；

图3为本发明红细胞抗原检测试剂盒中的检测卡的另一种示例。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。

如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。

在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围

的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。

本发明方法采用免疫层析法原理，检测人ABO血型和Rh血型。

本发明的红细胞抗原检测试剂盒中包含人ABO血型及Rh血型检测的试剂卡，所述试剂卡包含一种血型抗原检测试纸条，所述试纸条包括NC膜和吸水纸基两部分。可以理解的是，所述血型抗原检测试纸条放置在外壳内。所述NC膜上包被三条检测线T线(A线、B线、D线)和一条质控线C线。T线包被有A抗体、B抗体、RhD抗体，C线包被有红细胞单抗。所述NC膜的毛细爬行速度为65-75s/4cm(优选为70s/4cm)，可以让样本中的红细胞与显色线上的抗体充分反应，也可以让红细胞在NC膜上顺畅穿行，有效缩短血型检测显示有效结果的时间。在一些实施例中，NC膜的长度(Y2)为大约25mm，这样长度的NC膜可以使4条显色线在优化的距离内进行均匀排布；吸水纸基的长度(Y1)为大于等于10mm，这样在血型检测时可以使整个试纸条的跑样背景干净清晰(参见实施例5-表5)。

本发明方法进行血型检测的原理：将红细胞悬液加至NC膜上指定位置，红细胞悬液由于毛细作用均匀分散在NC膜上，与检测线、质控线充分反应，向缓冲液孔滴加冲洗液，判读结果。如果样本中含有A抗原，则该抗原与NC膜上包被的A抗体结合，冲洗后该免疫复合物在A线处显示红色的线条，提示A抗原阳性结果；反之，如果样本中没有A抗原，则检测线A线不显色，显示阴性结果。同理，如果样本中含有B抗原，则该抗原与NC膜上包被的B抗体结合，冲洗后该免疫复合物在B线处显示红色的线条，提示B抗原阳性结果；反之，如果样本中没有B抗原，则检测线B线不显色，显示阴性结果。如果样本中含有D抗原，则该抗原与NC膜上包被的D抗体结合，冲洗后该免疫复合物在D线处显示红色的线条，提示D抗原阳性结果；反之，如果样本中没有D抗原，则检测线D线不显色，显示阴性结果。该检测卡还包含一条质控线C，不管是否有检测线出线(即显出颜色)，红色的质控线C线都应出线；如果质控线C未出线，则表明检测结果无效，此样本需重新进行检测。

本发明所述的“抗体包被液”，用于稀释抗体并将抗体牢固结合到NC膜上，并且进一步增强抗体的稳定性。

本发明所述的“冲洗液”，用于协助促进含红细胞的全血或红细胞悬浮液在硝酸纤维素膜上均匀扩散并将未反应的红细胞冲走。

实施例1

本发明所述的含有血型抗原检测试纸条的检测试剂卡示例(附图2和附图3)。

所述检测试剂卡包括血型抗原检测试纸条和放置血型抗原检测试纸条的外壳(10)。所述外壳(10)上分别于上端部和下端部设置检测卡安装部1(11)和检测卡安装部2(12)；所述外壳(10)的端部还设置有缓冲液孔(13)，可以理解的是，所述缓冲液孔(13)可以设置在所述外壳(10)的上端部，也可以设置在所述外壳(10)的下端部。

所述外壳(10)上还设置观察窗口(14)，用于显示和观察显色线。所述显色线包括A线(20)、B线(21)、C线(22)和D线(23)。可以理解的是，所述A线(20)、B线(21)、C线(22)和D线(23)的位置并不是固定的，但A线(20)和B线(21)相邻排列。

此外，所述观察窗口(14)内还设置加样位置，从上到下依次排列，分别是加样位置1(30)、加样位置2(31)、加样位置3(32)、加样位置4(33)和加样位置5(34)。

本发明所述红细胞抗原检测试纸条包括NC膜和吸水纸基，其中，吸水纸基边缘压在NC膜上下边缘上设置。附图2中的Y1代表吸水纸基纵向长度，Y2代表NC膜纵向长度。

实施例2

红细胞抗原检测方法示例

1)准备一张硝酸纤维素膜，将起始浓度为2.0-3.0mg/ml的红细胞抗体用抗体包被液分别稀释100倍、150倍或200倍后包被到所述硝酸纤维素膜上制成检测线和质控线，所述红细胞抗体包括抗A单克隆抗体，抗B单克隆抗体，抗RhD单克隆抗体和抗红细胞抗体；所述检测线和质控线包被好所述红细胞抗体后进行风干，所述抗体包被液包括质量分数为4％-6％的蔗糖、0.3％-0.5％的BSA、0.1％-0.3％的Proclin 300和PBS缓冲液；

2)将20μL-30μL待检测的含红细胞的全血或红细胞悬浮液滴加到步骤1)制备的检测线和质控线中间，利用毛细扩散的作用使所述含红细胞的全血或红细胞悬浮液与检测线上包被的红细胞抗体结合并反应；

3)再滴加100-150μL冲洗液到所述硝酸纤维素膜上，促进所述含红细胞的全血或红细胞悬浮液在所述硝酸纤维素膜上均匀扩散并将未反应的红细胞冲走，所述冲洗液包括质量分数为0.5％-0.7％的Tween-80、0.1％-0.3％的Proclin 300和PBS缓冲液；

4)静置5分钟，进行结果判读。

实施例3

包被的抗体浓度验证

方法：将起始浓度为2-3mg/ml的A、B、D抗体用包被液依次稀释10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍后，验证阴阳红细胞，考察线条显色情况，选择合适的包被浓度。可以理解的是，抗体的起始浓度包括2.0mg/ml、2.1mg/ml、2.2mg/ml、2.3mg/ml、2.4mg/ml、2.5mg/ml、2.6mg/ml、2.7mg/ml、2.8mg/ml、2.9mg/ml和3.0mg/ml。

结果：抗体稀释倍数为10倍、25倍、50倍进行包被时，线条会发生聚线，且因包被浓度大易出假阳性，100倍、150倍、200倍线条正常，阴阳性未发现异常，但200倍显色明显较100倍弱，本实验优选最佳包被浓度为抗体稀释100-150倍。

表1抗体不同稀释倍数检测结果

备注：B-型血为B型Rh阴性血。

其中，C表示检测线颜色深浅(C－：很浅或不显色；C+：较浅；C++：适中；C+++：较深；C++++：过深)；D表示扩散程度(D－：清晰不扩散；D+：略微扩散；D++：明显扩散)U表示条带均匀程度(U－：不均匀；U+：较均匀；U++：很均匀)。

实施例4

包被液和冲洗液成分优化

包被液和冲洗液对结果具有一定影响，下面对包被液成分、冲洗液成分进行了梯度优化，并将4种包被液、6种冲洗液进行了交叉验证。

表2包被液成分

	蔗糖	BSA	Proclin 300	缓冲液
					包被液1	1％-1.5％	0.3％-0.5％	0.1％	0.01M PBS(pH7.4)
包被液2	2％-3％	0.3％-0.5％	0.1％	0.01M PBS(pH7.4)
					包被液3	4％-6％	0.3％-0.5％	0.1％	0.01M PBS(pH7.4)
包被液4	7％-9％	0.3％-0.5％	0.1％	0.01M PBS(pH7.4)

表3冲洗液成分

	缓冲液	Tween-80	Proclin 300
				冲洗液1	0.01M PBS(pH7.4)	0-0.1％	0.1％
冲洗液2	0.01M PBS(pH7.4)	0.2％-0.4％	0.1％
				冲洗液3	0.01M PBS(pH7.4)	0.5％-0.7％	0.1％
冲洗液4	0.01M PBS(pH7.4)	0.8％-1％	0.1％
				冲洗液5	0.05M TBS(pH8.5)	0.5％-0.7％	0.1％
冲洗液6	0.05M MES(pH6.0)	0.5％-0.7％	0.1％

结果：包被液中加入7％-9％的蔗糖，包被液粘稠度增大，在跑样时容易出线假阳性结果；包被液中添加1％-6％的蔗糖，显色差异相差不大，但是进行稳定性考评时，1％-3％的蔗糖不能对包被蛋白起到很好的保护作用；4％-6％的蔗糖添加到包被液中，稳定性考评未发现异常。

冲洗液缓冲液成分为0.05M TBS(pH8.5)，显色弱；缓冲液为0.05M MES(pH6.0)，阴性有假阳性出现，最佳的缓冲液为0.01M PBS(pH7.4)。

冲洗液中表面活性剂的量影响跑样背景和显色持久度，Tween-80浓度为0-0.4％，跑样背景红，反应10min内线条深浅变化不大；Tween-80浓度为0.5％-0.7％，跑样背景符合要求，且反应10min内线条深浅变化不大；Tween-80浓度为0.8％-1％，跑样背景符合要求，但反应10min内线条明显变浅，表面活性剂浓度大会将NC膜上的反应复合物冲走。

综上所述，包被缓冲液的最佳成分为0.01M PBS(pH7.4)，4％-6％蔗糖，0.3％-0.5％BSA，0.1％Proclin 300；冲洗液的最佳成分为0.01M PBS(pH7.4)，0.5％-0.7％Tween-80，0.1％Proclin 300。

表4包被液和冲洗液交叉验证结果

其中，C表示检测线颜色深浅(C－：很浅或不显色；C+：较浅；C++：适中；C+++：较深；C++++：过深)。

实施例5

吸水纸基性能验证

方法：为验证吸水纸厚度、长度对跑样过程及跑样背景的影响，选择以下3种不同厚度、不同品牌的吸水纸进行验证，吸水纸长度优化了1cm、1.5cm、2cm、2.5cm、3cm五个条件：

1)吸水纸ABP-S270(厚度0.68mm，吸水量500g/m²，克重270g/m²)；

2)吸水纸H5072(厚度：0.85mm，克重：270g/m²，吸水量：＞950g/m²)；

3)吸水纸ABP-S370(厚度0.95mm，吸水量750g/m²，克重370g/m²)。

结果：验证3种常用厚度的吸水纸，随吸水纸厚度的增加，跑样背景逐渐变好，且跑样背景的好坏也跟吸水纸长度呈正相关，吸水纸越长，跑样背景越干净。实验中吸水纸厚度应大于0.6mm且吸水纸长度最好大于1cm。

表5不同吸水纸长度验证

实施例6

红细胞样本上样量与包被液间距验证

方法：红细胞悬液加至NC膜后，会迅速被膜吸附并与NC膜上包被的抗体反应，如果红细胞加入量少，无法完全覆盖包被线条，加入冲洗液后可能会导致假阴性结果出现，所以样本上样量与包被间距相关。

结果：包被间距小于3mm对包被过程要求较高，易发生交叉污染，包被间距大于5mm时卡壳视窗需要同等程度的变大，由于市面上此类型卡壳很少且受NC膜长宽度限制，因此优选包被间距为3-5mm之间。

包被间距为3mm的最佳上样量为20μL；包被间距为4mm时上样量20μL、30μL差异不大，但30μL上样量会导致样本在膜面无法短时间内被吸附，加入冲洗液会发生错误结果，故包被间距为4mm时上样量优选20μL；包被间距为5mm的最佳上样量为30μL。

从美观性及包被操作简便性而言，四条线之间等距离分布，效果较好，但在NC膜宽度限制范围内，优化好上样量，保证加样后样本能够完全覆盖住所有线条，非等距分布也可，为避免包被时交叉污染，线条间间距应不小于3mm。

表6包被间距3mm不同上样量验证

上样量	A型血	B型血
			10μL	C+D－U－	C+D+U－
20μL	C++D－U+	C++D－U+
			30μL	C++D－U+	C++D－U+
40μL	C+++D－U+	C+++D－U－
			50μL	C++++D－U－	C++++D+U－

表7包被间距4mm不同上样量验证

表8包被间距5mm不同上样量验证

上样量	A型血	B型血
			10μL	C－D+U－	C－D++U－
20μL	C+D－U+	C+D－U+
			30μL	C++D－U++	C++D－U++
40μL	C++D+U++	C++D－U++
			50μL	C+++D+U+	C+++D－U+

实施例7

加样位置验证

如附图1所示，样本加至上样位置1或上样位置5，样本会大部分被吸水纸基/样品垫吸收，剩余的部分无法流动至其它包被线位置，导致显色弱或无显色；样本加至上样位置2或上样位置4，也会存在样本不能完全覆盖所有包被线条的风险，造成错误的结果；所以最佳的上样位置为四条线的中心位置即上样位置3。

表9不同加样位置验证

位置	位置1	位置2	位置3	位置4	位置5
						A型血	C－D+U－	C+D+U+	C+++D－U++	C+D+U+	C－D－U+

实施例8

包被膜干燥条件优化验证

硝酸纤维素膜上包被好抗体后，置于30-37℃鼓风干燥箱中干燥1h、2h、4h、8h、12h、16h，观察试纸条检测线的颜色、清晰程度等。

表10不同风干条件的检测结果

结果：包被后选择在37℃干燥8-16小时，条带颜色适中且均匀。进行包被膜干燥的目的是使结合的抗体更加稳定和均一。

实施例9

本发明血型检测方法与传统血型检测方法对比

表11不同血型检测方法对比

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims

1.一种红细胞抗原检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤2)：将20μL-30μL待检测的含红细胞的全血或红细胞悬浮液滴加到步骤1)所述的显色线中间，利用毛细扩散的作用使所述含红细胞的全血或红细胞悬浮液与所述显色线上包被的红细胞抗体结合并反应，所述硝酸纤维素膜的毛细爬速为65-75s/4cm；

步骤3)：再滴加100-150μL冲洗液到所述硝酸纤维素膜上，促进所述含红细胞的全血或红细胞悬浮液在所述硝酸纤维素膜上均匀扩散并将未反应的红细胞冲走，所述冲洗液包括质量分数为0.5％-0.7％的Tween-80、0.1％-0.3％的Proclin 300和PBS缓冲液。

2.如权利要求1所述的红细胞抗原检测方法，所述显色线包括检测线和质控线，包被的红细胞抗体包括抗A单克隆抗体，抗B单克隆抗体，抗RhD抗原的单克隆抗体和抗红细胞抗体。

3.如权利要求1所述的红细胞抗原检测方法，其特征在于，所述红细胞抗体的起始浓度为2.0-3.0mg/ml。

4.如权利要求1所述的红细胞抗原检测方法，其特征在于，步骤1)中所述的硝酸纤维素膜上包被好抗体后于30-37℃条件下风干8-16h。

5.如权利要求1所述的红细胞抗原检测方法，其特征在于，所述PBS缓冲液的浓度为0.01M。

6.一种红细胞抗原检测试剂盒，其特征在于，所述红细胞抗原检测试剂盒包括含有血型抗原检测试纸条的试剂卡、红细胞抗体、抗体包被液和冲洗液；所述抗体包被液包括质量分数为4％-6％的蔗糖、0.3％-0.5％的BSA、0.1％-0.3％的Proclin 300和PBS缓冲液；所述冲洗液包括质量分数为0.5％-0.7％的Tween-80、0.1％-0.3％的Proclin 300和PBS缓冲液。

7.如权利要求6所述的红细胞抗原检测试剂盒，其特征在于，所述血型抗原检测试纸条包括硝酸纤维素膜和吸水纸基两部分，所述吸水纸基边缘压在所述硝酸纤维素膜边缘上。

8.如权利要求6所述的红细胞抗原检测试剂盒，其特征在于，所述红细胞抗体包括抗A单克隆抗体，抗B单克隆抗体，抗RhD抗原的单克隆抗体和抗红细胞抗体；所述红细胞抗体的浓度为2.0-3.0mg/ml。

9.如权利要求7所述的红细胞抗原检测试剂盒，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上设置有显色线并在其上包被所述红细胞抗体，所述显色线之间平行排列，相邻显色线之间的间距为3-5mm。

10.如权利要求7所述的红细胞抗原检测试剂盒，其特征在于，所述吸水纸基厚度大于等于0.6mm，长度大于等于10mm；所述硝酸纤维素膜长度为25mm，毛细爬速为65-75s/4cm。