CN104655859A - 乳腺癌的诊断标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了异常岩藻糖基化鞘糖脂及编码其合成关键酶的基因FUT1和FUT2基因在制备诊断乳腺癌和/或乳腺癌预后的药物或试剂盒中的用途。

Description

乳腺癌的诊断标志物
技术领域
本发明属于生物医学和临床医学技术领域，更具体地本发明涉及一种可用于诊断乳腺癌和/或乳腺癌预后的异常岩藻糖基化鞘糖脂。
背景技术
糖脂是含有糖基的脂质，由糖的半缩醛羟基通过糖苷键与脂质相连而成。其非脂部分为糖基，脂部分为鞘氨醇或甘油，而且糖脂可根据脂部分的构成而再分为鞘糖脂与甘油糖脂，其中研究得较为深入的是糖鞘脂。鞘糖脂分子中的糖基数目不等。仅含一个糖基的鞘糖脂统称脑苷脂。含多个糖基的鞘糖脂又分为两大类：不含唾液酸的中性鞘糖脂和含有唾液酸的酸性鞘糖脂。
鞘糖脂位于细胞膜脂质双分子层,非极性的碳氢长链埋在外侧脂层中，极性的糖链伸展到胞外水相中，是哺乳动物细胞膜上的必需组成成分之一。细胞膜上的鞘糖脂与细胞生理状况密切相关，参与细胞的多种生物学活动,其生物学功能非常复杂，在免疫应答、细胞发育、细胞识别及分化中都发挥重要的作用。此外，鞘糖脂的组成，无论是神经酰胺部分还是糖链部分，都表现出一定的种族、个体、组织以及同一组织内各部分细胞的专一性。即使同一类细胞,在不同的发育阶段,鞘糖脂的组成也不同。正因为某些类型鞘糖脂是某种细胞在某个发育阶段所特有的，所以组织器官中鞘糖脂的异常表达往往与各种疾病具有明显的相关性，而鞘糖脂也常常被作为细胞表面标志物质。
乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。乳腺癌中99%发生在女性，男性仅占1%。原位乳腺癌虽然不致命，但是由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性，细胞之间的粘连作用变小，容易脱落，也因此非常容易扩散，游离的癌细胞可以随血液或淋巴液播散全身，形成转移，危及生命。目前乳腺癌已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤。全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。近年来，我国乳腺癌的发病率也呈现上升的趋势。据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年公布的2009年乳腺癌发病数据显示：全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第1位，女性乳腺癌发病率（粗率）全国合计为42.55/10万，城市为51.91/10万，农村为23.12/10万。然而，遗憾的是，目前尚不完全清楚乳腺癌的发病机制。因此，目前对于乳腺癌的早期发现、早期诊断，是提高疗效的关键途径。
目前对于乳腺癌的早期诊断大部分还停留在影像学检验、组织病理学检验上，因此急需发展一种生物学的分子诊断标志物。
发明内容
本发明的目的是针对目前乳腺癌分子诊断标志物匮乏的情况下，发现和发展一种新的生物学诊断标志物。这种标志物的发现，将进一步推动乳腺癌的早期诊断、治疗、以及预后处理，具有重要的临床意义。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
在第一方面，本发明提供了异常岩藻糖基化鞘糖脂在制备用于诊断乳腺癌和/或乳腺癌预后的药物中的用途，其中所述异常岩藻糖基化鞘糖脂中包含Fuc-LacCer结构，优选地所述药物中包含以Fuc-LacCer结构为抗原或表位的抗体，更优选地，所述抗体为单克隆抗体。
在第二方面，本发明提供了FUT1基因和/或FUT2基因在制备用于诊断乳腺癌和/或乳腺癌预后的药物或试剂盒中的用途，其中所述FUT1基因的序列为SEQ ID NO:1；所述FUT2基因的序列为SEQ ID NO:2。
本发明的FUT1基因和/或FUT2基因在制备用于诊断乳腺癌和/或乳腺癌预后的药物或试剂盒中的用途中，所述药物或所述试剂盒包含可扩增FUT1基因和/或FUT2基因的引物对。
本发明的FUT1基因和/或FUT2基因在制备用于诊断乳腺癌和/或乳腺癌预后的药物或试剂盒中的用途中，所述可扩增FUT1基因的引物对为：FUT1-F：GCAGGTTATGCCTCAGCG（SEQ ID NO:3）；FUT1-R：TCCATCGCCAGCAAACG（SEQ ID NO:4）。
本发明的FUT1基因和/或FUT2基因在制备用于诊断乳腺癌和/或乳腺癌预后的药物或试剂盒中的用途中，所述可扩增FUT2基因的引物对为：FUT2-F：CGTTCAGATGCCTTTCTCCTTT（SEQ ID NO:5）；FUT2-R：GGTCCCAGTGCCTTTGATGTTG（SEQ ID NO:6）。
本发明的FUT1基因和/或FUT2基因在制备用于诊断乳腺癌和/或乳腺癌预后的药物或试剂盒中的用途中，所述药物组合物或所述试剂盒还包含对照引物对：β-actin-F：CACCATTG GCAATGAGCGGTTCC（SEQ ID NO:7）；β-actin-R：GTAGTT TCGTGGATGCCACAGG（SEQ ID NO:8）。
本发明的FUT1基因和/或FUT2基因在制备用于诊断乳腺癌和/或乳腺癌预后的药物或试剂盒中的用途中，所述试剂盒还包含逆转录体系。
本发明的FUT1基因和/或FUT2基因在制备用于诊断乳腺癌和/或乳腺癌预后的药物或试剂盒中的用途中，所述逆转录体系包含T重复寡核苷酸OlogodT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。
本发明的FUT1基因和/或FUT2基因在制备用于诊断乳腺癌和/或乳腺癌预后的药物或试剂盒中的用途中，所述试剂盒还包含PCR扩增体系。
本发明的FUT1基因和/或FUT2基因在制备用于诊断乳腺癌和/或乳腺癌预后的药物或试剂盒中的用途中，所述PCR扩增体系为SYBR Green聚合酶链反应体系。
附图简述
图1显示乳腺癌中的Fuc-LacCer高表达（A为癌旁对照组织的鞘糖脂质谱结构，B为肿瘤组织的鞘糖脂质谱图谱，其中m/z1184即为Fuc-LacCer）；
图2显示Fuc-LacCer在乳腺癌中高表达（A质谱的相对定量统计学证明Fuc-LacCer在乳腺癌中表达，B为ROC分析结果证明Fuc-LacCer同Globo-H一样在乳腺癌中有很高的阳性率）
图3为显示在多个乳腺癌细胞系中的FUT1和FUT2的表达水平都高于对照组的PCR扩增结果
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
乳腺癌组织中Fuc-LacCer水平的的检测，样本从苏州大学附属第二人民医院获得，信息如表1所示。
具体操作步骤：
收集临床乳腺癌患者的血清样本或者肿瘤组织样本，将组织（研碎）或者血清混匀置于玻璃试管中，加『氯仿：甲醇=1:1，（v/v）』2mL，用滴管轻轻捣碎组织，超声1h，超声结束，离心（1500rpm/min，5min）取上清，重复抽提4次,接着换『异丙醇：正己烷：水=55:25:20（v/v v）』2mL提取液提取，超声1h，超声结束，离心取上清，重复抽提4次。合并两次抽提上清液，于旋转真空干燥器中干燥，干燥物-20℃低温冰箱放置备用。接着分离酸中性鞘糖脂，并甲基化之后进入质谱检测（图1）。得到的结果进一步用相对定量的方法，采用SPSS软件和GraphPad Prism5软件进行Student-Newman-Keulsa,b检验、ROC分析分析，得到的结果如图2所示。结果发现，在乳腺癌的组织中存在异常高表达的Fuc-LacCer，统计学发现，这种高表达有很高的阳性率，可以作为诊断乳腺癌的标志物。
实施例2
乳腺癌各种细胞系FUT1和FUT2水平的表达检测，具体引物为：
FUT1-F：GCAGGTTATGCCTCAGCG（SEQ ID NO:3），
FUT1-R：TCCATCGCCAGCAAACG（SEQ ID NO:4）；
FUT2-F：CGTTCAGATGCCTTTCTCCTTT（SEQ ID NO:5），
FUT2-R：GGTCCCAGTGCCTTTGATGTTG（SEQ ID NO:6）；
β-actin-F：CACCATTG GCAATGAGCGGTTCC（SEQ ID NO:7），
β-actin-R：GTAGTT TCGTGGATGCCACAGG（SEQ ID NO:8）。
具体的操作步骤如下：
(1)逆转录：配置逆转录反应体系，每20μL的逆转录反应体系包括10μL的待测样品的RNA、1μL的Ologo dT共浴70℃10分钟，取出立即置于冰上2分钟，再加入2μL的dNTPs、1μL的RNA酶抑制剂、5μL的逆转录反R应液及1μL的M-MLV逆转录酶，共浴42℃60分钟，然后70℃10分钟，得到cDNA，4℃保存；
(2)在荧光定量PCR仪上进行扩增检测：配置PCR扩增反应体系，每25μL的PCR扩增反应体系包括：SYBR Green聚合酶链反应体系12.5μL，上下游引物各0.25μL，cDNA2μL，DEPC水10μL；反应条件为：50℃2分钟，95℃10分钟，95℃15秒、60℃60秒共40个循环；得到待测样品的荧光定量PCR扩增结果；(3)采用步骤(2)的方法对试剂盒中的模板cDNA进行荧光定量PCR扩增，得到阳性对照和阴性对照的荧光定量PCR扩增结果；然后分析上述待测样品、阳性对照、阴性对照的荧光定量PCR扩增结果的Ct值(FUT1和FUT2)和Ct值(β-actin)，通过公式：β（FUT1）和β（FUT2）基因的mRNA相对水平=计算得到待测样品、阳性对照、阴性对照的β3Gn-T5的mRNA相对水平，以待测样品的β（FUT1和FUT2）的mRNA相对水平值和阳性对照、阴性对照的β（FUT1和FUT2）的mRNA相对水平相比。得到的实例结果如图3所示。结果发现，在大多数的乳腺癌细胞系中，FUT1和FUT2的表达水平都高于对照PBMC的水平。因此，FUT1和FUT2也可以作为乳腺癌的标志物。
实施例3
乳腺癌的标志物可以用于生产乳腺癌临床诊断试剂盒，逆转录体系和PCR扩增体系；所述逆转录体系包括：T重复寡核苷酸Ologo dT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs；所述PCR扩增体系包括：SYBR Green聚合酶链反应体系、引物对；其中，所述逆转录反应液含有焦炭酸二乙酯处理的水、M-MLV逆转录酶缓冲液；所述SYBR Green聚合酶链反应体系含有PCR缓冲液、模板cDNA、dNTPs、SYBR Green荧光染料；所述模板cDNA包括：正常人cDNA和乳腺癌患者血样cDNA，其中，正常人血样cDNA作为阴性对照，乳腺癌血样cDNA作为阳性对照。
所述引物对为可扩增人岩藻糖基化合成酶FUT1、FUT2和人β-actin的引物对，技术人员可以根据引物设计的常规技术设计；优选的技术方案中，所述引物对由上游引物和下游引物组成，其中引物序列：
FUT1-F：GCAGGTTATGCCTCAGCG（SEQ ID NO:3），
FUT1-R：TCCATCGCCAGCAAACG（SEQ ID NO:4）；
FUT2-F：CGTTCAGATGCCTTTCTCCTTT（SEQ ID NO:5），
FUT2-R：GGTCCCAGTGCCTTTGATGTTG（SEQ ID NO:6）；
β-actin-F：CACCATTG GCAATGAGCGGTTCC（SEQ ID NO:7），
β-actin-R：GTAGTT TCGTGGATGCCACAGG（SEQ ID NO:8）。
上述技术方案中，所述焦炭酸二乙酯处理的水的制备方法为：将焦炭酸二乙酯原液与超纯水按照体积1∶1000稀释，搅拌12～24小时，取该混合均匀的溶液进行高压湿热灭菌即制得焦炭酸二乙酯处理的水。
上述技术方案中，所述M-MLV逆转录酶缓冲液包括：250mM PH8.3的Tris-HCl，375mM的KCl，15mM的MgCl2，50mM的DTT。
上述技术方案中，所述RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA酶抑制剂，优选为E.coli表达的非竞争性抑制RNase的重组蛋白酶。
上述技术方案中，所述PCR缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选的技术方案中，所述PCR缓冲液包括：25mM的KCl，终浓度2.5mM的MgCl2，200mM的(NH4)2SO4。
上述试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

Claims (10)

1.异常岩藻糖基化鞘糖脂在制备用于诊断乳腺癌和/或乳腺癌预后的药物中的用途，其中所述异常岩藻糖基化鞘糖脂中包含Fuc-LacCer结构，优选地所述药物中包含以Fuc-LacCer结构为抗原或表位的抗体，更优选地，所述抗体为单克隆抗体。
2.FUT1基因和/或FUT2基因在制备用于诊断乳腺癌和/或乳腺癌预后的药物或试剂盒中的用途，其中所述FUT1基因的序列为SEQ ID NO:1；所述FUT2基因的序列为SEQ ID NO:2。
3.根据权利要求2中所述的用途，其特征在于，所述药物或所述试剂盒包含可扩增FUT1基因和/或FUT2基因的引物对。
4.根据权利要求3中所述的用途，其特征在于，所述可扩增FUT1基因的引物对为：FUT1-F：GCAGGTTATGCCTCAGCG（SEQ ID NO:3）；FUT1-R：TCCATCGCCAGCAAACG（SEQ ID NO:4）。
5.根据权利要求3或4中所述的用途，其特征在于，所述可扩增FUT2基因的引物对为：FUT2-F：CGTTCAGATGCCTTTCTCCTTT（SEQ ID NO:5）；FUT2-R：GGTCCCAGTGCCTTTGATGTTG（SEQ ID NO:6）。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的用途，其特征在于，所述药物组合物或所述试剂盒还包含对照引物对：β-actin-F：CACCATTGGCAATGAGCGGTTCC（SEQ ID NO:7）；β-actin-R：GTAGTTTCGTGGATGCCACAGG（SEQ ID NO:8）。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的用途，其特征在于，所述试剂盒还包含逆转录体系。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述逆转录体系包含T重复寡核苷酸Ologo dT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs，优选地所述逆转录体系还包含焦炭酸二乙酯处理的水、M-MLV逆转录酶缓冲液。
9.根据权利要求3至8中任一项所述的用途，其特征在于，所述试剂盒还包含PCR扩增体系。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述PCR扩增体系为SYBR Green聚合酶链反应体系。
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