KR20110093392A - Ｈｐｖ 유전자형 진단용 프로브 및 그 분석방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 HPV 유전자형 진단용 프로브 및 그 분석방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 HPV 유전자형 진단용 프로브 및 그 분석방법에 관한 것이다.
전 세계적으로 자궁경부암 환자의 99.7%에서 HR (High Risk)-HPV DNA가 존재하며 이러한 HR-HPV 감염의 존속이 침윤성 자궁경부암, 자궁경부 전암으로의 전이를 일으키는 것으로 알려져 있다. 자궁경부암의 경우 전 세계적으로는 매년 50만명, 우리나라의 경우 6000명의 새로운 환자가 발생하고 있으며 50%는 치명적인 결과를 보인다. 이러한 자궁경부 종양으로 진행하는 과정에 인두유종 바이러스 (Human Papilloma Virus, HPV)가 중요한 원인으로 알려지면서 자궁암의 조기 진단에 HPV DNA의 존재 유무를 이용하고 있다 (Bernard, H. U., I. E. Calleja-Macias, and S. T. Dunn. 2006. Int J Cancer 118:1071-6). HPV는 약 7.9 kb의 이중나선 구조의 DNA 바이러스로 papovavirus에 속하는 것으로 100개 이상의 subtype이 존재하고 있으며 이중 40개의 subtype은 생식기를 통해 감염 되는 것으로 알려져 있다. 또한 HPV 바이러스는 10개의 바이러스성 단백질을 지니고 있는데 바이러스의 캡시드를 구성하는 구조 단백질 합성에 관여하는 2개의 early 유전자 산물인 L1, L2와 바이러스의 감염 의 활성과 잠복을 결정하는 바이러스의 복제에 관여하는 단백질의 합성을 조절하는 8개의 late 유전자 산물인 E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8을 발현한다. 특히 E6와 E7은 전암 단백질을 암호화 하고 있고, 암과 연관이 있는 부분으로 알려져 있으며 (Sedman, S. A., 등. 1991. J Virol 65:4860-6), 여러 보고에 의하여 HPV 바이러스가 여성의 자궁경부암을 유발하고, 여러 가지 악성 종양과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다 (Godfroid, E., 등. 1998. J Virol Methods 75:69-81).
여성의 자궁경부암은 전 세계적으로 유방암에 이어 두 번째로 높은 발병율을 나타내고 있고, 우리나라에서도 매년 1,000명 이상의 사망자가 보이고 있어 자궁경부암의 조기 진단을 위한 노력이 매우 중요하게 여겨지고 있다 (Wui, J. H., 등. 2006. Journal of Gynecologic oncology and Coloscopy 17:39-4711).
현재 HPV의 유전자형은 100가지 이상이 알려져 있고 (Likes, W. M., 및 J. Itano. 2003. Clin J Oncol Nurs 7:271-6), 이 중에서 사람에게 질병을 일으킬 수 있는 유전자형은 30가지 정도로 알려져 있다. 그 유전자형은 고위험군 (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82) 과 저위험군 (6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81), 잠재위험군(34, 57, 83)으로 분류하고 있으며 (Munoz, N., 등. 2003. N Engl J Med 348:518-27), 각각의 유전자형을 지닌 HPV가 병소의 위치와 병변의 진행정도에 따라 유전자형 특이적으로 발견됨으로써 HPV 감염의 생물학적 다양성을 인지하게 되었다.
이러한 HPV의 감염여부를 진단하기 위하여 가장 많이 쓰이는 방법은 자궁세포진 검사(Papnicolaou Smear, Pap) 방법으로서 현재도 자궁경부암의 조직학적 진단은 이 검사법에 의해 진단하고 있으나 이 검사법은 검사자의 경험과 숙련도에 많은 의존을 해야 하고, 그 때문에 정확도가 떨어진다는 단점을 가지고 있다(Kurman, R. J., D. E. Henson, A. L. Herbst, K. L. Noller, and M. H. Schiffman. 1994. JAMA 271:1866-9). 뿐만 아니라, 질확대경을 이용한 검사 방법은 자궁세포진 검사보다 정확한 결과를 얻을 수는 있지만, 숙련된 기술자와 고가의 장비가 필요하며, HPV의 유전자형을 구별할 수 없다는 단점이 있으며 위 두 방법을 통해서는 악성화 위험도가 다른 HPV 유전형을 분류할 수 없다는 단점이 있다.
상기한 단점을 보완하기 위하여 PCR, HC, DNA chip등을 이용하여 HPV 특이적 DNA 증폭을 통해 자궁경부암 전암 단계를 진단하고 유전자형을 확인하는 방법들의 연구가 계속 진행되고 있는 실정이다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 기존의 DNA chip 보다 HPV에 대한 특이도와 민감도가 좋은 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프로브를 이용한 HPV 유전자형 분석방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 5 내지 서열번호 28의 염기서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 HPV 진단용 올리고뉴크레오타이드 프로브를 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 HPV 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 4에 기재된 프라이머인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 키트는 PCR 산물을 탐지하기 위한 표지수단을 더욱 포함하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 a) 상기 본 발명의 프로브를 고체 서포트에 부착하는 단계;
b) 상기 프로브에 증폭된 HPV PCR 산물을 교잡하는 단계; 및
c) 상기 교잡된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 HPV 유전자형 확인 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 고체 서포트는 막, 슬라이드, 또는 웰 플레이트인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 검출단계는 발광 또는 발색반응을 이용하여 검출하는 것이 바람직하다.
본 발명은 검체로부터 핵산을 추출하고, PCR 증폭을 수행하였다. 세포로부터 핵산을 추출하는 방법 및 PCR 방법은 Sambrook 등의 Molecular cloning(1989)에 기재된 방법과 같은 당업계에 주지된 방법을 통하여 수행하였다.
본 발명의 핵산 증폭 방법은 프라이머를 사용하였다. 일반적으로 프라이머는 약 10에서 25bp 길이의 올리고뉴크레오타이드가 바람직하나 더 긴 것도 가능하며, 프라이머는 단일 가닥이 바람직하나 이중 또는 단일 가닥 형태로 존재할 수도 있으며, 본 발명에서 사용한 특정 프라이머는 본 발명의 실시예에 기재하였다.
본 발명의 프라이머는 통상의 올리고뉴크레오타이드 합성법에 의하여 제조되었으며, 그러한 합성 방법은 미국특허 제 4,659,774, 4,816,571, 5,141,813, 5,264,566, 4,959,463, 5,428,148, 5,554,744, 5,574,146, 및 5,602,244 등에 개재된다.
본 발명의 프라이머와 같은 서열들은 샘플로부터 유래한 DNA와 같은 상보적인 서열들과 선택적으로 이중 나선을 형성하는 데 사용될 수 있다. 당업자는 타겟 서열에 대한 프라이머의 선택성을 변화시키기 위하여 교잡 조건을 변경할 수 있다.
일부 실시예에서는 교잡을 결정하기 위하여 표지와 같은 적당한 수단과 결합하여 본 발명의 한정된 서열의 핵산을 채택할 수 있다. 적당한 표지수단은 형광, 방사성동위원소 효소 또는 다른 리간드를 포함하는 다양한 표지수단이 가능하다.
다양한 주형 의존적인 과정들이 주어진 세포 샘플에 존재하는 특정 유전자 산물을 증폭하는데 가능하다. 가장공지된 증폭 방법 중 하나가 중합효소 연쇄반응(PCR)이다 이 방법은 미국특허 제 4,683,202 및 4,800,159 등에 기재된다.
일반적으로 한 단계 또는 또 다른 단계에서 증폭산물을 주형 또는 초과 프라이머 또는 다른 증폭산물로부터 분리하는 것이 바람직하다. 예를 들어 증폭 산물은 Sambrook 등의 Molecular cloning(1989)에 기재된 표준 방법을 아가로스, 아가로스-아크릴아마이드 또는 PAGE를 사용하여 분리될 수 있다.
또 흡착, 분배, 이온교환 등과 같은 크로마토그래피도 효과적인 분리방법으로 채택될 수 있다. 이들 분리방법들은 대량의 샘플을 가공하기 위하여 임상 셋팅에서 기능하도록 채택될 수 있으며, 수천개의 샘플을 한번에 분리하거나 검출할 수 있는 새로운 방법인 FMAT (fluorometric microvolume assay technique), chemiluminescence,sequence detection systems (Applied Biosystems) 및 질량 분광법 등이 있다.
본 발명에 따른 핵산은 검출되고 정량화될 것이다. 일 실시예에서 그 검출은 시각적 수단에 의하여 수행될 수 있다. 전형적인 시각적 수단 방법은 ethidium bromide로 젤을 염색하고, UV 광 하에서 밴드들을 시각화하는 것이다. 또 만약 증폭 산물이 방사선 또는 형광으로 표지된 뉴크레오타이드이면 분리된 증폭산물은 삽입된 방사선 동위원소 표지의 방사성 신티그램 촬영 또는 형광 검출을 수행한다.
본 발명은 상기 방법을 수행하기 위한 키트를 포함한다. 비한정적인 실시예에서 본 발명의 키트는 프라이머들,증폭을 위한 효소 및 부가적인 시약을 포함할 수 있다. 따라서 본 키트들은 적당한 용기 수단들에 이들 하나 이상의 시약들을 포함할 것이다. 그 키트들은 또한 핵산을 분리하고 증폭 산물을 정제하는 시약들을 포함할 수도 있다. 키트들의 구성성분은 수용성 매체 또는 동결건조 형태로 포장될 수 있고, 키트의 적당한 용기 수단은 구성성분이 들어갈 수 있는 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병 등을 포함한다. 키트에 하나 이상의 구성요소가 존재한다면 부가적인 구성요소들이 따로 위치될 수 있는 제2, 제3 등의 다른 부가적인 용기를 포함할 수 있다. 그러나 여러 구성요소의 조합이 하나의 용기에 포함될 수도 있다.
본 발명에서 사용된 nested PCR 방법은 통상 Two-tube nested PCR을 의미하는데, 'Two-tube nested PCR'은 보통 시료의 DNA양이 매우 제한되어 있어 한번의 PCR로는 검출할 수 없는 경우에 두 번째 PCR을 보다 내측의 primer를 이용하여 시행하는 방법으로, 원하는 부분이 잘 증폭되기 위해서는 4개의 primers가 부착해야 하고, outer primers를 이용한 첫 번째 중합효소 연쇄반응을 실시하고 여기서 나온 산물로 두 번째 증폭을 할 때에는 다시 새로운 시약을 첨가하기 때문에 반응이 원활하게 일어날 수 있으며, 한 쌍의 primers가 비교적 적은 횟수의 반응을 하여 기존의 PCR에 비해 우수한 민감도와 특이성이 높일 수 있는 장점을 가지고 있지만 tube를 바꾸어 두 번의 증폭과정을 거치면서 오염의 문제가 종종 발생하기도 하는데, 이러한 문제를 해결하고자 하나의 tube에 2쌍의 primer를 같이 넣어 one-tube nested PCR을 시도하여, 오염의 문제를 줄이는 동시에 민감도 부분에서도 기존의 Two-tube PCR보다 좋은 결과가 나타남을 확인할 수 있었다(실시예 8 및 도 8과 9 참조).
본 발명의 HPV 유전자형 확인방법은 HPV L1 유전자를 PCR 증폭하고 미리 그 부위에 각 HPV type 특이적으로 결합할 수 있는 프로브를 제작, 부착한 막에 증폭된 DNA를 ECL-Southern hybridization 을 이용한 역 교잡 혼성성화를 이용한 방법으로 최종 목적은 기존의 DNA chip 보다 특이도와 민감도가 좋은 probe 개발과 좀 더 경제적인 방법을 개발하고자 한다.
특히 본 발명에서는 2쌍의 primer를 같은 tube 안에 넣어서 증폭시키는 one-tube nested PCR을 이용하여 HPV의 검출률을 관찰하고 PCR의 결과를 다른 진단방법들과 비교함으로써 새로운 HPV의 진단 방법을 제공하고자한다.
본 발명의 구성 및 도면 등에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 HPV 유전자형 확인방법은 HPV L1 유전자를 PCR 증폭하고 미리 그 부위에 각 HPV type 특이적으로 결합할 수 있는 프로브를 제작, 부착한 막에 증폭된 DNA를 ECL-Southern hybridization 을 이용한 역 교잡 혼성성화를 이용한 방법으로 기존의 DNA chip 보다 특이도와 민감도가 좋고, 더 경제적인 방법임을 알 수 있었다.
도 1은 본 발명에서 언급한 Reverse Blot Hybridization의 기본 원리에 대한 설명도이다. 즉 ① 아민기를 표지한 프로브를 멤브레인에 결합시킴.②타겟 유전자를 biotin이 라벨된 프라이머로 증폭한 후, membrane에 결합된 프로브와 반응시킴. ③ Streptavidin-conjugated alkaline phosphatase와 반응시킴. ④ Alkaline
phosphatase의 기질을 처리하여 프로브와 증폭된 타켓유전자의 결함을 검출함.
도 2는 확보된 ATCC 클론 중 고위험군에 속하는 HPV 타입 35, 43, 56, 16, 18과 저위험군 HPV 타입 6. 11, 44 클론으로부터 HPV L1 유전자를 PCR 증폭하여 membrane에 결합된 프로브와 Reverse Blot Hybridization 반응을 시켜 발광으로 검출하는 것을 보여주는 사진.
도 3은 Capture®2 High-Risk HPV DNA Test™ (HC2) 양성 검체의 REBA 결과를 나타낸 사진이다. 즉 Digene (HC2) 양성검체로부터 전체 44개 검체중 31개의 검체에서 PCR양성이 나왔고, 31개 검체를 REBA(Reverse Blot Hybridization 발광실험)를 수행한 결과 16, 18, 31, 33, 35, 39, 56, 58의 single type으로 나온 19검체와 16/18, 16/58, 52/58, 59/68의 double type으로 나온 4검체, 16/51/58, 16/56/58, 16/51/58의 triple type으로 나온 3검체, 총 26개의 검체에서 HPV type을 보여주는 사진이다.
도 4는 임상샘플의 REBA 결과 (발색실험)를 나타낸 사진이다. 즉 18개의 임상샘플을 이용하여 membrane strip을 가지고 발색실험을 진행한 결과로 16, 18, 53, 56, 58, 59, 70, 81의 single type으로 나온 12검체, 58/70, 31/53, 66/43의 double type으로 나온 3검체, 16/53/56의 triple type으로 나온 1검체, 그리고 113번 샘플처럼 HPV 양성으로 나온 1검체, 총 17개의 임상샘플에서는 HPV 각 타입별로 분리된 것을 확인할 수 있었으며, 131번 샘플의 경우는 PCR이 안되었고 이에 따른 REBA 발색테스트에서도 아무것도 나오지 않음을 보여주는 사진임.
도 5는 임상샘플의 REBA 결과 (발색실험-88)에 대한 sequencing결과를 나타낸 그림이다. 즉 도 5a는 도 4의 발색결과에서 나온 임상샘플 88번을 가지고 GP6 primer를 이용하여 sequencing을 실시하였고 chromas 프로그램을 이용하여 각각의 염기서열이 나열되어 sequencing결과가 나온 사진이고, 도 5b와 c는 도 5a에서 나온 염기서열을 가지고 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 사이트에서 blast search 하여 나온 결과를 보여주는 사진임.
도 6은 Plasmid DNA 클론의 REBA 결과 (발광실험)를 나타낸 사진이다. 즉 확보된 각 타입별 임상샘플을 가지고 positive control로 이용하기 위하여 cloning을 실시하였으며 cloning을 실시하여 확보된 plasmid DNA 클론을 가지고 REBA(발광실험)을 수행한 사진임.
도 7은 Plasmid DNA 클론의 REBA 결과 (발색실험)를 나타낸 사진이다. 즉 확보된 각 타입별 임상샘플을 가지고 positive control로 이용하기 위하여 cloning을 실시하였으며 cloning을 실시하여 확보된 plasmid DNA 클론을 가지고 REBA(발색실험)을 수행한 사진임.
도 8과 도 9는 각각 two-tube nested PCR과 one-tube nested PCR의 결과를 나타내는 사진이다.
phosphatase의 기질을 처리하여 프로브와 증폭된 타켓유전자의 결함을 검출함.
도 2는 확보된 ATCC 클론 중 고위험군에 속하는 HPV 타입 35, 43, 56, 16, 18과 저위험군 HPV 타입 6. 11, 44 클론으로부터 HPV L1 유전자를 PCR 증폭하여 membrane에 결합된 프로브와 Reverse Blot Hybridization 반응을 시켜 발광으로 검출하는 것을 보여주는 사진.
도 3은 Capture®2 High-Risk HPV DNA Test™ (HC2) 양성 검체의 REBA 결과를 나타낸 사진이다. 즉 Digene (HC2) 양성검체로부터 전체 44개 검체중 31개의 검체에서 PCR양성이 나왔고, 31개 검체를 REBA(Reverse Blot Hybridization 발광실험)를 수행한 결과 16, 18, 31, 33, 35, 39, 56, 58의 single type으로 나온 19검체와 16/18, 16/58, 52/58, 59/68의 double type으로 나온 4검체, 16/51/58, 16/56/58, 16/51/58의 triple type으로 나온 3검체, 총 26개의 검체에서 HPV type을 보여주는 사진이다.
도 4는 임상샘플의 REBA 결과 (발색실험)를 나타낸 사진이다. 즉 18개의 임상샘플을 이용하여 membrane strip을 가지고 발색실험을 진행한 결과로 16, 18, 53, 56, 58, 59, 70, 81의 single type으로 나온 12검체, 58/70, 31/53, 66/43의 double type으로 나온 3검체, 16/53/56의 triple type으로 나온 1검체, 그리고 113번 샘플처럼 HPV 양성으로 나온 1검체, 총 17개의 임상샘플에서는 HPV 각 타입별로 분리된 것을 확인할 수 있었으며, 131번 샘플의 경우는 PCR이 안되었고 이에 따른 REBA 발색테스트에서도 아무것도 나오지 않음을 보여주는 사진임.
도 5는 임상샘플의 REBA 결과 (발색실험-88)에 대한 sequencing결과를 나타낸 그림이다. 즉 도 5a는 도 4의 발색결과에서 나온 임상샘플 88번을 가지고 GP6 primer를 이용하여 sequencing을 실시하였고 chromas 프로그램을 이용하여 각각의 염기서열이 나열되어 sequencing결과가 나온 사진이고, 도 5b와 c는 도 5a에서 나온 염기서열을 가지고 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 사이트에서 blast search 하여 나온 결과를 보여주는 사진임.
도 6은 Plasmid DNA 클론의 REBA 결과 (발광실험)를 나타낸 사진이다. 즉 확보된 각 타입별 임상샘플을 가지고 positive control로 이용하기 위하여 cloning을 실시하였으며 cloning을 실시하여 확보된 plasmid DNA 클론을 가지고 REBA(발광실험)을 수행한 사진임.
도 7은 Plasmid DNA 클론의 REBA 결과 (발색실험)를 나타낸 사진이다. 즉 확보된 각 타입별 임상샘플을 가지고 positive control로 이용하기 위하여 cloning을 실시하였으며 cloning을 실시하여 확보된 plasmid DNA 클론을 가지고 REBA(발색실험)을 수행한 사진임.
도 8과 도 9는 각각 two-tube nested PCR과 one-tube nested PCR의 결과를 나타내는 사진이다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위하여 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예
1:
HPV
양성 클론 확보
ATCC로부터 HPV genotype 중 8개에 해당하는 플라스미드를 확보하였으며 특히 pHPV-16(Cat. No.45133)을 전체 실험의 양성 대조군으로 사용하였다. ATCC로부터 확보한 플라스미드는 HPV-6b (Cat. No.45150), HPV-11 (Cat. No.45151), HPV-18 (Cat. No.45152), HPV-35 clone 2A (Cat. No.40330), HPV-43 Clone 2A (Cat. No.40338), HPV-44 Clone 2 (Cat. No.40353), HPV-56 Clone 2C (Cat. No.40549)이며, 이들 모두 E. coli에 형질전환 된 상태이기 때문에 배양 후 플라스미드 DNA를 추출 (GeneAll, Seoul, Korea)하여 중합효소연쇄증폭반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)의 주형으로 사용하였다.
실시예
2:
HPV
임상적 검체의 확보
본 발명에 사용된 임상검체는 2005년 11월부터 6개월간 강서 미즈메디 병원에서 이미 Hybrid Capture 2 High-Risk HPV DNA Test™ (HC2, Digene, Gaithersburg, USA)로 검사를 받은 환자 137명 중 양성 고위험군 (High Risk, HR)으로 결과를 얻은 환자 44명을 대상으로 본 발명의 실험군으로 사용하였다. 이들 임상검체의 경우 PCR 효율성을 증폭시키기 위해 DNA가 들어있는 용액을 중화시키기 위해 0.45N HCl을 동량 넣어 섞어준 후 이를 주형으로 사용하였다. 또한 본 연구의 신뢰도 검증을 위하여 대한민국 미즈메디 병원의 환자로부터 분리된 임상학적 검체 중 sequencing으로 genotyping이 끝난 HPV type 고위험군 16, 31, 33, 39, 51, 56, 58과 저위험군 6, 11을 확보하였고 HPV type 42, 45는 바이오메트릭스를 통해서, 고위험군 HPV type 52, 53, 59, 68과 저위험군 HPV type 70, 72, 81, 84, 87은 전남대병원과 원주기독병원을 통해서 확보하였다.
실시예
3:
PCR
반응
PCR 반응은 베타-globin PCR를 먼저 수행하도록 하여 DNA산물에 inhibitor 가 있는지 없는지를 확인한 후에 진행하였다. 반응조건으로는 94℃의 변성 (denaturation) 온도에서 5분간 예비 변성시킨 후, 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 결합(annealing), 72℃에서 30초 신장(extension)을 총 35회 반복하고 마지막으로 72℃에서 7분간 최종 신장 반응을 하였다.
반응 후 PCR이 증폭된 산물의(양성검체) DNA를 가지고 One-tube nested PCR을 실시하였다. 200㎕ PCR용 tube에 20 mM Tris-HCl (pH8.0), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Tween-20, 0.5% Nonidet P-40과 각각의 10 mM dNTP, 25 mM MgCl2, 각각의 10 pmole primer과 1 unit의 Taq polymerase를 사용하였으며 총 반응 양은 20㎕로 실시하였다.
반응 조건은 94℃의 변성 (denaturation) 온도에서 5분간 예비 변성 시킨 후, 94℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초 결합(annealing)로 15cycle을 먼저 반응시킨 후, 다시 94℃에서 30초 변성, 52℃에서 30초 결합(annealing)로 45 cycle을 반응시키고 마지막에 72℃에서 10분간 최종 신장 반응을 하였다. 이 때 사용한 primer는 MY11/09-GP5-1/6+를 사용하며 이로 인해 150bp의 증폭 산물을 얻을 수 있다. 각각의 primer의 염기서열은 표 1에 표기하였다.
표 1은 프라이머 서열을 나타낸다. 표 1에서 MY11, MY09, GP5-1 및 GP6+ 서열은 각각 서열번호 1 내지 4에 기재하였다.
표 2는 PCR조건을 나타낸다.
실시예
4:
Probe
로 사용할
oligonucleotide
와
probe
가 부착된 막의 제작
HPV type 특이적 probe의 oligonucleotide의 염기서열은 표 3과 같다.
Probe로 사용할 oligonucleotide는 막의 음성전위를 띄는 카르복실기와 결합시키기 위해 양성전위를 갖도록 5'말단에는 아민기를 첨가하도록 바이오니아(대한민국)에 제작을 의뢰하였으며 준비된 probe를 막에 부착하기 위하여 0.5 M NaHCO3용액에 전체 probe 농도가 100 pmole이(각타입별로 농도를 조절하여) 되도록 희석하였고, 1.6 g/10 ml EDAC로 10분간 반응시킨 Miniblotter-MN45 (Immunetics, Cambridge, MA)를 이용하여 각각의 슬롯에 probe를 로딩한 후 실온에서 1시간 동안 반응하였다. 이 후 100 mM NaOH로 9분간 반응시킨 후, 최종적으로 100 ml의 2X SSPE/0.1% (w/v) SDS 용액으로 60℃에서 5분간 반응시켜 비 결합 probe를 제거하였다.
실시예
5:
Reverse
Blot
Hybridization
(
REBA
)의 발광과
발색
실험
역 교잡 혼성화 반응 수행을 위하여는 probe에 상보적으로 결합 가능한 염기서열을 가지고 있는 PCR 산물을 얻기 위해 MY11/09-GP5-1/GP6+ primer를 5'-biotin (바이오틴)으로 표지하여 제작하였다. 이 primer로 얻은 150 bp의 PCR 산물 중 20 ㎕를 HPV 특이적 probe들이 부착된 막에 miniblotter를 이용하여 혼성화 하였다. 즉, 증폭 확인된 PCR 산물 15 ㎕를 DS(0.2N NaOH, 0.2mM EDTA)와 동량 섞은 후 5분간 실온에 방치하여 단일가닥으로 만든 후 115 ㎕의 2X SSPE/0.1% (w/v) SDS로 희석하였다. PCR 산물을 막에 혼성화하기 전에, 막을 활성화시키기 위해 100 ml 2X SSPE/0.1% (w/v) SDS 용액에 넣고 실온에서 5분 동안 반응시킨 다음, 막을 miniblotter 상에 놓인 지지체 큐션 위에 올려놓았다. 슬롯 내 여분의 습기를 흡입장치를 통해 제거하고 probe들이 붙은 방향과 수직이 되게 하여 PCR 산물을 침적하였다. Oligonucleotide probe가 부착되어 있는 방향은 잉크를 이용하여 혼성화 전에 막에 표시하였다. PCR 산물이 침적된 슬롯 주변의 빈 슬롯은 2X SSPE/0.1% (w/v) SDS로 채워서 교차흐름을 방지하였다. 이것을 바닥이 고른 50℃에서 30분 동안 혼성화 형성 반응을 진행하였고 이후 흡입장치를 이용하여 남아있는 시료를 miniblotter에서 모두 제거한 후 막을 100 ml 2X SSPE/0.5% SDS용액으로 50℃에서 10분간 2회 반복 세척하였다.
막을 rolling bottle에 넣고, streptavidine-alkaline phosphatase conjugate (AP conjugate, Roche Applied Science, Germany)를 2X SSPE/0.5% SDS 적당량에 1:2000 (v/v)으로 희석하여 잘 섞은 후, 실온에서 30분간 반응시켰다. 이 후 막을 2X SSPE/0.5% SDS 용액 100 ml으로 실온에서 두 번 세척한 후, 2X SSPE 용액 100 ml 으로 두 번 세척하였다. 화학형광 검출을 위해 막에 10 ml의 CDP-Star TM detection reagent (Amersham pharmacia biotech., Buckinghamshire, England)에 넣고 4분간 반응시킨 후 Hyper sensitivity film에 20분간 노출시켜 결과를 확인하였다 (도 1).
발색반응을 위해서는 AP conjugate 반응이 끝난 막을 TBS (50 mM Tis-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5)로 1분간 2회 세척하고 발색용 기질용액인 NBT/BCIP [Nitro Blue Tertrazolium Chloride and 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl Phosphate, Toluidine salt in 67% DMSO (v/v), Roche Applied Science, Germany)]를 TBS (100 mM Tis-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, pH 9.5)에 1:50 (v/v)으로 희석하여 실온에서 5분 동안 반응시키면서 원하는 정도의 발색이 끝나면 발색 용액을 완전히 제거하고 3차 증류수를 첨가하여 반응을 정지시켰다.
실시예
6: 임상적 검체의
plasmid
DNA
클로닝
클론으로 보유하고 있지 않은 HPV 유전자형과 바이오메트릭스에서 얻은 HPV 유전자형 42, 45와 역 교잡 혼성화 방법을 통하여 typing이 된 검체를 최종적으로 검증하기 위하여 MY11/09-GP5-1/6 primer로 PCR 한 후 TOPO TA Cloning kit를 이용하여 클로닝을 수행하였다. 양성 클론은 코스모에 sequencing을 의뢰하여 분석한 후 유전자 형이 정확한지를 분석한 후 최종 HPV type의 클론으로 확보하였다.
실시예
7:
DNA
칩과의 민감도 비교
HPV의 임상 샘플은 전남대 의대(광주, 대한민국)으로부터 제공받고. 모든 HPV 테스팅은 DNA 칩에 의하여 수반되었다.
한편 DNA 칩과의 민감도 비교를 위한 본 발명의 HPV 유전자 HPV 추출, PCR 및 reverse blot hybridization 분석은 상기 본 발명의 실시예에 기재된 방법에 의하여 수행되었다.
실시예
8:본 발명의
one
-
tube
PCR
과 기존의
two
-
tube
PCR
의 비교
HPV에 대한 two-tube nested PCR은 대한민국 특허공개번호 10-2009-0129639의 실시예 3 등에 자세하게 기재되었다. 요약하면 먼저 outer primer(MY11/09 primer)를 이용하여 45 cycle로 PCR을 한 다음 여기서 나온 산물을 가지고 inner primer (GP5/6 primer)를 이용하여 다시 45 cycle로 PCR을 진행한다(도 8). 이때 나온 PCR의 민감도가 100ag이 나온 것을 확인할 수 있었다. 첫 번째 중합효소 연쇄반응을 실시하고 여기서 나온 산물로 두 번째 증폭을 할 때에는 다시 새로운 시약을 첨가하기 때문에 반응이 원활하게 일어날 수 있으며, 한 쌍의 primers가 비교적 적은 횟수의 반응을 하여 기존의 PCR에 비해 우수한 민감도와 특이성이 높일 수 있는 장점을 가지고 있지만 tube를 바꾸어 두 번의 증폭과정을 거치면서 오염의 문제가 종종 발생하기도 하는위험성이 있었다.
이러한 문제를 해결하고자 본 발명은 상기 실시예 3에서 같이, 하나의 tube에 2쌍의 primer(MY11/9-GP5-1/6)를 같이 넣어 먼저 55℃에서 15cylce로 증폭을 시킨다음 온도를 낮춰(52℃) nested PCR을 시도하여, 오염의 문제를 줄이는 동시에 민감도 부분에서도 기존의 Two-tube PCR에 영향을 미치지 않는 결과(도 9)가 나타나 one-tube nested PCR 조건을 확립하였다
이하 상기 실시예의 결과를 설명한다.
1)
ATCC
클론의
HPV
typing
(도 2)
ATCC로부터 확보한 클론을 PCR을 수행한 결과 HPV type 43을 제외하고 모두 PCR 산물이 증폭되었고, 이 산물을 본 발명의 HPV 특이적 probe에 역 교잡 혼성화 방법을 통해 그 유전자형을 재 검증할 수 있었다. 그러나 HPV type 43의 경우 비특이적 결합을 보였다. 이 실험은 독립적으로 각각 2개의 플라스미드를 추출하여 PCR을 수행한 산물을 사용하였으나 type 44의 경우에는 실험상의 문제로 1개의 플라스미드만 추출하여 얻은 결과이다.
2) 역 교잡
혼성화
방법을 통한
Digene
양성 검체와 이미
sequencing
으로
genotype
이 확인된 임상검체의 검증
미즈메디 병원의 Digene (by HC2) 양성 검체로부터 고위험군 결과를 얻은 검체의 경우 MY11/09 primer를 사용한 첫 번째 PCR에서는 450bp의 PCR 산물 증폭된 것과 안된 것이 존재였으나 모든 첫 번째 PCR 산물을 nested primer인 GP5-1/6+로 PCR을 수행한 결과, 전체 44개 검체 중 31개의 검체에서 PCR 양성이 나왔고, 31개 검체를 Reverse Blot Hybridization (REBA, 도 3) 결과 26개의 검체에서 HPV type을 확인할 수 있었다. 이때 양성대조군으로 ATCC로부터 획득한 HPV type 56 클론을 사용하였다.
이들 HPV type의 분포를 살펴 보면 단독 감염의 경우 총 19개 중 HPV type 16이 31.5%, HPV type 58이 21%를 차지하고 있으며 다른 임상검체의 전체적인 genotype의 결과는 표 4에 표기하였다. 특히 역 교잡 혼성성화 (REBA)를 통해 type이 결정된 검체 26개 중 7개의 검체는 중복 감염된 것으로 추정하였으며 이들 모두 자궁경부암으로 발전할 가능성이 높은 고위험군들이 중복 감염된 것으로 추정된다(표 4). 또한 임상검체의 일부를 발색방법으로 테스트를 실시하였으며(도 4), 그 중 일부 샘플을 sequencing으로 확인한 결과 동일하게 나옴을 알 수 있었다(도 5)
| No . | REBA 결과 | Sequencing 결과 | 유사도 |
| 72 | 59 | 59 | 86% |
| 73 | 58 | 58 | 89% |
| 74 | 16, 53, 59 | 16, 54 | 71% |
| 75 | 56 | 56 | 94% |
| 76 | 16 | 16 | 100% |
| 78 | 16, 53, 56 | 56 | 87% |
| 81 | 18 | 18 | 98% |
| 82 | 31, 53 | 31 | 77% |
| 84 | 53 | 53 | 91% |
| 88 | 58 | 58 | 97% |
| 92 | 58 | 58 | 95% |
| 102 | 16, 53, 56 | 16 | 94% |
| 104 | 16, 70 | 16 | 92% |
| 113 | HPV (+) | 62 | 94% |
| 116 | 70, 58 | 70 | 97% |
| 119 | 81 | 81 | 95% |
| 132 | 58 | 58 | 97% |
표 5는 임상검체에서 REBA결과와 sequencing 결과의 비교한 표이다.
3)
Plasmid
DNA
클론의 확보
위에 기술한 검체들을 최종적으로 genotyping을 하기 위해서 본 발명에서는 HPV L1 유전자를 MY11/09-GP5-1/6 primer로 증폭한 산물을 플라스미드 DNA 클론을 확보하고자 하였다. 임상검체에서 분리된 DNA 중 HPV type 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 66, 59, 68, 42, 43, 70, 72, 81, 84, 87의 클론을 확보하였다. 이들 플라스미드 DNA 클론들의 REBA결과는 도 4에 제시한 바와 같이 본 발명에서 사용한 probe와 실험방법 (REBA)으로 타 집단에서 수행한 결과와 동일함을 알 수 있었으며 (도 6) 상기한 발광 실험에서 도출된 결과를 통해 발색반응을 수행하여 동일한 결과는 얻었다 (도 7).
4) DNA 칩과의 민감도 비교
하기 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, DNA 칩과 본 발명의 방법의 민감도를 비교하면 DNA 칩은 약 94%의 민감도를 가지지만 본 발명은 100%의 민감도를 나타내었다. 또한 sequencing비교결과를 확인해 보면 REBA결과가 더 정확하게 나온것을 확인할 수 있었다. 즉 하기 표 6에서는 HPV(-)샘플이 DNA chip에서는 4개 샘플이 나왔으나(다른 말로, 4개 샘플에 대해서는 판독이 안 되었으나) REBA 결과에서는 HPV Universal probe에 붙어 HPV 양성샘플로 판독을 했고 이를 시퀀싱 한 결과 REBA안에 있는 25종의 type외 other type으로 나온것을 확인할 수 있었기 때문에 REBA법으로는 70개 모두를 판독했으나 DNA chip에서는 66개(94.29%)만 판독이 되어 REBA법이 DNA chip 보다는 좋은 결과가 나온 것이 확인되었다.
또한 DNA chip을 이용할 경우에는 고도의 기술과 scanner, calibration에 따른 고가의 장비가 필요하나 본 발명의 REBA는 특별한 장비가 필요없이 실험을 진행할 수 있기 때문에 적은 비용으로도 우수한 결과를 낼 수 있는 장점이 있다.
<110> Molecules and Diagnostics Inc.
<120> A PROBE FOR IDENTIFYING HPV GENOTYPE AND A METHOD FOR IDENTIFYING
HPV GENOTYPE
<160> 29
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
gcmcagggwc tataayaatg g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
cgtccmarrg gawactgatc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
tttgttacwg tkgtrgatac 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
gaaaaataaa ctgtaaatca tattc 25
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 5
cattatgtgc tgccatatc 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 6
tgcttctaca cagtctcct 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 7
gcaattgcaa acagtgatac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 8
tgcacacaag taactagtga 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 9
ctgctgtgtc ttctagtga 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 10
atagagtctt ccataccttc 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 11
taatttaaca ttatgtgcct c 21
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 12
tgctgcggtt tccccaa 17
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 13
gaataccttc gtcatggc 18
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 14
aaccacacag tctatgtcta ca 22
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 15
cagaacagtt aagtaaatat g 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 16
tatgcactga agtaactaag 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 17
tctactactt cttctattcc 20
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 18
cagactctac tgtaccagc 19
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 19
tccgtaacta catcttcca 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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tctgtgtcta aatctgctac 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 21
tggtgataca tatacagctg 20
<210> 22
<211> 18
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<220>
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tctactgacc ctactgtg 18
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 23
tactagtgaa caatataagc a 21
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 24
gaaacggcca tacctg 16
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 25
gcgtcctctg tatcaga 17
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 26
agctacatct gctgctgcag a 21
<210> 27
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 27
aacaccgaat cagaatataa acctacc 27
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 28
aaccactgaa tatgacccca ca 22
<210> 29
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 29
gncatgnnga rgaatwtga 19
Claims (8)
- 서열번호 5 내지 서열번호 28의 염기서열로 이루어진 HPV 진단용 올리고뉴크레오타이드 프로브 조성물.
- 제 1항의 프로브 조성물 및 프라이머를 포함하는 HPV 진단용 키트.
- 제 2항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 4에 기재된 프라이머인 것을 특징으로 하는 HPV 진단용 키트.
- 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 키트는 PCR 산물을 탐지하기 위한 표지수단을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 HPV 진단용 키트.
- a) 제 1항의 프로브를 고체 서포트에 부착하는 단계;
b) 상기 프로브에 증폭된 HPV PCR 산물을 교잡하는 단계; 및
c) 상기 교잡된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 HPV 유전자형 확인 방법. - 제 5항에 있어서, 상기 고체 서포트는 막, 슬라이드, 또는 웰 플레이트인 것을 특징으로 하는 HPV 유전자형 확인 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 PCR 산물은 서열번호 1 내지 4에 기재된 프라이머를 통하여 증폭되는 것을 특징으로 하는 HPV 유전자형 확인 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 검출단계는 발광 또는 발색반응을 이용하여 검출하는것을 특징으로 하는 HPV 유전자형 확인 방법.
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Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020100013418A KR101152840B1 (ko) | 2010-02-12 | 2010-02-12 | Ｈｐｖ 유전자형 진단용 프로브 및 그 분석방법 |
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Cited By (2)
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| CN110592279A (zh) * | 2019-09-11 | 2019-12-20 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 检测hpv的组合物、试剂盒及方法 |
| KR102444179B1 (ko) | 2021-11-05 | 2022-09-16 | 주식회사 제이에이치바이오홀딩스 | Hpv 감염 진단용 프라이머 세트, 진단용 조성물, 및 이를 이용한 hpv 감염 진단을 위한 정보제공방법 |
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| KR100914911B1 (ko) * | 2007-07-10 | 2009-08-31 | 의료법인제일의료재단 | 실시간 중합효소 연쇄반응과 ｈｐｖ ｄｎａ 칩을 이용한정량 및 정성적 인유두종바이러스 검사 방법 및 이를 위한검사키트 |
-
2010
- 2010-02-12 KR KR1020100013418A patent/KR101152840B1/ko active IP Right Grant
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| CN110592279A (zh) * | 2019-09-11 | 2019-12-20 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 检测hpv的组合物、试剂盒及方法 |
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