KR20140064035A - 리퀴드 비드 어레이와 다중중합효소연쇄반응법을 이용한 종양원성 인유두종바이러스 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인유두종바이러스를 검출하기 위한 유형 특이적 PCR 프라이머와 프로브 및 이를 이용한 다중중합효소연쇄반응과 리퀴드 비드 어레이를 이용한 인유두종바이러스의 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 종양원성 HPV의 핵산 서열과 상보적으로 결합할 수 있는 유형 특이적 PCR 프라이머와 프로브 및 이를 이용하여 샘플 내에서 21종의 고위험군 인유두종바이러스 유형과 13종의 저위험군 인유두종바이러스의 핵산 서열을 동일한 검출한계로 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법, 인유두종바이러스 감염 여부 및 감염된 유전형의 진단을 위한 정보 제공 방법 및 자궁경부암 치료제의 스크리닝 방법에 의하면, 신속하고 정확하게 검체로부터 인유두종바이러스 감염 여부 및 그 유전자형을 확인할 수 있으며, 치료제 후보 물질을 정확하고 간편하게 스크리닝할 수 있다.

Description

리퀴드 비드 어레이와 다중중합효소연쇄반응법을 이용한 종양원성 인유두종바이러스 검출 방법{A METHOD FOR DETECTING ONCOGENIC TYPES OF HUMAN PAPILLOMA VIRUS USING LIQUID BEADS ARRAY AND MULTIPLEX PCR}

본 발명은 인유두종바이러스를 검출하기 위한 유형 특이적 PCR 프라이머와 프로브 및 이를 이용한 다중중합효소연쇄반응과 리퀴드 비드 어레이를 이용한 인유두종바이러스의 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 종양원성 HPV의 핵산 서열과 상보적으로 결합할 수 있는 유형 특이적 PCR 프라이머와 프로브 및 이를 이용하여 샘플 내에서 21종의 고위험군 인유두종바이러스 유형과 13종의 저위험군 인유두종바이러스의 핵산 서열을 동일한 검출한계로 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.

자궁경부암(Cervical Cancer)은 여성의 자궁경부에서 발생하는 악성 종양으로서 전체 자궁암 발생 빈도의 95% 이상을 차지하고 있으며, 전세계 여성암 가운데 유방암 다음으로 발생빈도가 높아 매년 약 44만 건 정도의 신규환자가 보고되고 있다.

국내의 경우, 2000년도 보건복지부 암 등록 조사통계를 참고하면, 1년에 약 5,000명 가량의 새로운 환자들이 발생하는 것으로 확인되고 있다. 이는 전체 여성암에 있어서 약 10.6%를 차지하는 것으로 발생 빈도상 위암(15.7%)과 유방암(15.1%)에 이어 3위를 차지하고 있다. 특히, 최근에는 20~30대의 젊은 여성의 감염율이 크게 증가하여 전체 자궁경부암 환자의 약 32%를 차지하는 등 국민보건상 심각한 문제로 대두되고 있다. 이 때문에 성인 여성에서 주기적인 HPV검사는 필수적이며, 성감염 검사시 HPV검사는 기본적으로 포함된다(Tchernev G. An Bras Dermatol. 2009; 84(4): 377-89).

HPV는 인체 감염 부위에 종양을 일으킬 수 있으며, 암을 유발함이 명백하게 입증된 바이러스이다. HPV는 인간의 접촉부위 상피세포에 감염이 된 후 과잉증식(hyperproliferation)을 일으킨다. 이때의 과잉증식은 단순한 피부의 사마귀(wart)나 외성기, 항문 주위의 곤지름 혹은 첨규콘딜롬(condyloma accuminata)과 같은 양성종양인 경우가 대부분이다. 그러나, HPV는 발암의 원인이 될 수도 있으며, 실제 거의 모든 자궁경부암(uterine cervix cancer or cervical cancer)과 구강암이나 인두암, 후두암의 상당수, 그리고 다수의 항문암(anal cancer)이 HPV에 의해 발병함이 확인되고 있다. HPV는 암을 유발하여 생명을 앗아갈 수 있다는 점에서 그 중요성이 더할 나위 없이 크며, 한편으로는 HPV를 검사하면 자궁경부 및 항문 등의 암과 전암병변을 조기 진단할 수 있다. 실제 HPV검사는 자궁경부암 조기검진의 표준검사인 Papa nicolaou 세포검사(Pap smear) 보다 자궁경부암의 예측 민감도가 더 우수함이 밝혀지고 있고, 이에 따라 미국 FDA 등 여러 나라에서 자궁경부암 선별검사로 인정되고 있다(Howley PM. Virology. Vol 2, 1996, 2045-2109; Murinoz N et al., N Engl J Med, 2003, 348:518-27). 이러한 이유들로 인해 HPV 관련 분야의 시장은 매우 크며, HPV검사의 경제적 가치도 매우 큰 것으로 보고되고 있다.

자궁경부암은 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV)와 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되고 있다. 즉, HPV가 자궁경부 상피기저 세포에 감염한 후 저급 상피 이형성증(Low-grade SIL), 고급 상피 이형성증(High grade SIL), 상피내암(squamous intraepithelial lesion, SIL) 등의 오랜 전구 단계를 거쳐 최종 침윤암으로 발전하게 되는데, 이처럼 암으로 발전하기 전 단계인 전암 단계 병변이 존재하기 때문에, 이들 병변을 조기에 효과적으로 치료함으로써 자궁경부암을 예방할 수 있다.

인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV)는 8kb의 환상의 이중나선 바이러스로서, 모든 유형의 HPV 바이러스는 유사한 성질의 단백질을 합성하는 DNA 부분인 열린해독틀(open reading frames, ORFs)을 가지며, 크게 초기 유전자(early gene)와 후기 유전자(late gene)로 구분된다. 약 4.5kb의 초기 유전자는 바이러스 DNA 복제(E1), 숙주 세포의 악성화 변형(malignant transformation)을 야기하는 단백질을 형성하는 DNA의 작용을 유발하거나 억제(E2), 숙주 세포와 바이러스 성장과 관련된 단백질의 합성(E4), EGF(epidermal growth factor)와 CSF(colony stimulator factor) 수용체의 작동유발(E5), 세포의 영구생존 및 암 유전자의 활성과 암 억제인자의 비활성화 기전에 의한 악성화 변형(E7) 등으로 나눌 수 있다. 특히, HPV가 숙주의 상피세포를 감염시킨 후에 발현되는 종양원성(oncogenic) 단백질인 E6와 E7은 각각 숙주 세포의 종양 억제 단백질인 p53과 pRB와 결합하여 이들 종양 억제 단백질의 기능을 억제함으로써, 결과적으로 감염 세포의 형질전환에 따른 종양형성으로 발전하는 것으로 규명되고 있다. 한편, 2.5kb의 후기 유전자는 바이러스 주외피 단백질(L1)과 부외피 단백질(L2)의 합성을 담당하는 DNA와 이들의 전사와 번역 기능을 조절하는 비발현 부분(non-coding region)인 1kb 크기의 LCR(long control region)로 이루어져 있다.

현재까지 HPV는 120가지 이상의 각각 다른 유형(type)들이 발견되었고, 이 가운데 약 36종의 HPV 유형(HPV-6, -11, -16, -18, -26, -30, -31, -32, -33, -34, -35, -39, -40, -42, -43, -44, -45, -51, -52, -53, -54, -56, -58, -59, -61, 61, -66, -67, -68, -69, -70, -73, 81, 82, 83, 90)은 자궁경부암을 야기하는 이른바 종양원성 HPV 유형으로 밝혀졌다. 이 가운데 HPV-16, -18, -26, -30, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -53, -56, -58, -59, -66, -67, -68, -69, -70, -73 및 -82와 같은 유형의 HPV는 자궁경부암으로의 진행률이 상대적으로 높은 것으로 밝혀져 있어 고위험군(high-risk) HPV로 분류되며, HPV -6, -11, -32, -34, -40, -42, -43, -44, -54, -61, -62, -81, -83 및 -90과 같은 유형의 HPV는 자궁경부암으로의 진행률이 낮아 저위험군(low-risk) HPV로 분류되고 있다(Garrenstroom et al., J. Gynecol. Cancer 4:73-78, 1994).

HPV와 관련하여 또 하나 중요한 사실은 최근 백신이 개발됨에 따라 바이러스의 감염 예방 및 바이러스로 인한 암의 예방이 가능해지고 있다는 것이다. 현재 시판되는 HPV 예방 백신에는 2종류가 있다. 하나는 Gardasil(Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, NJ, USA)로, 이는 HPV 16, 18, 6, 11형의 4종의 HPV를 예방하기 위해 만들어진 4가 백신이다. 또 다른 하나는 Cervarix(GlaxoSmithKline Biologicals, Rixensart, Belgium)로 types 16과 18의 2종의 HPV를 예방하기 위해 만들어진 2가 백신이다. 이들 백신은 성관계를 갖기 전의 청소년 여성에 가장 효과적이며, 이전에 HPV 16형이나 HPV 18형에 감염된 적이 있는 여성의 경우 효과가 떨어진다. 이 때문에 성인 여성에 대한 적응 여부에 논란이 있으나, HPV에 감염된 적이 있더라도 그 형이 type 16이나 18이 아닌 경우 HPV 백신이 적응 가능할 수도 있다. 따라서, HPV의 감염 유무뿐 아니라 그 형(type)도 정확히 아는 것이 더욱 중요해지고 있다(Selva L, et al., Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2009; 64: 416-421).

현재 자궁경부암과 그 전구 병변의 일차 진단과 관련하여 기본적으로 세포진 검사(Papanicolaou(Pap) Smear)가 1940년대 이후 표준 검사법으로 시행되고 있다. 세포진 검사는 자궁 경부 세포진의 세포학적 형태를 기초로 하여 자궁경부암을 진단하는 것으로 이를 통하여 자궁경부암으로 인한 사망률을 크게 감소시키는데 공헌하였다. 그러나, 검사자의 숙련도에 의존하여 검사의 정확도가 떨어지는 단점이 있다(Menezes et al., Acta Cytol. 45:919-926, 2001). 질확대경을 시행하면 HPV의 감염을 70%까지 진단할 수 있으나, 수련된 전문가와 고가의 장비가 필요하며 인유두종바이러스의 유전자형을 분류할 수 없는 단점이 있다(Reidet al., Clin Obstet Gynecol. 32:157-179, 1989).

한편, 자궁경부 세포진의 HPV DNA와 RNA 탐침(probe) 간의 액상 상보 결합을 항체 효소 발색에 의하여 검출하는 "HPV hybrid capture" 방법이 1994년 개발된 이후, 자궁경부암과 그 전구 병변의 보조적 선별 또는 추적 검진의 한 방법으로 활용되고 있으며, 최근 미국 FDA로부터 자궁경부암의 일차 선별을 위한 사용 승인까지 받은 상태이다. 그러나, hybrid capture를 포함하여 자궁경부암을 진단하기 위한 다양한 분석 방법들이 존재하지만 전 세계적으로 자궁경부암으로 인하여 매년 5~50만명의 사망자가 발생하는 것에서 알 수 있듯이 자궁경부암 및 그 전구 병변의 포괄적 조기 검출 또는 진단을 위한 범용적 방법의 개발이 시급한 것이 현실이다.

최근, 다양한 HPV 유형의 감염 여부를 검출/진단함에 있어서 특정 염기서열의 DNA 단편을 신속하고 간단하게 증폭할 수 있는 중합효소연쇄반응(PCR) 기법이 보편화되면서 이를 이용하여 지금까지 밝혀진 모든 유형의 HPV를 포괄적으로 검출하고자 하는 노력이 활발하게 시도되고 있다.

또한, L1 부위를 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭한 후에 제한 효소를 사용하는 PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)는 간단하고 쉽게 결과를 얻을 수 있는 장점이 있으나, 사용하는 제한 효소가 변이부분을 인식하지 못하면 분석하지 못하는 단점이 있다(Lungu et al., JAMA 267:2493-2496, 1992).

PCR 기법은 목적 병원체의 핵산 염기 서열에 특이적으로 결합하는 상보적 핵산 단편 서열(프라이머)을 가하여 온도에 따른 변성(denaturation), 재결합(annealing) 및 중합(polymerization) 과정을 반복하여 미량의 병원체 핵산을 증폭시켜 그 존부를 검출할 수 있는 기술로서(미합중국특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호), 다양한 유형의 HPV 감염 여부를 진단하는데 사용되는 대표적인 기술 중 하나이다.

이러한 PCR 기법은 임상 진단의 실용적 측면에서 세포진 검사(Pap smear)의 세포학적 검사와 달리 객관적인 대규모 검사가 가능하며, 측정 원리상 세포검사나 액상 hybrid capture에 비해 검사 비용, 실험 절차, 검출 감도(sensitivity) 및 특이도(specificity) 등에서 상대적 우위를 가지고 있는 것으로 확인되어 있다. 그러나, 현재까지 HPV 감염 여부를 조기에 광범위하게 1차적으로 검출/진단하기에 적합한 공통 프라이머(general primer)가 부족하여 PCR을 이용하여 HPV의 감염 여부를 임상적으로 적용하기에는 많은 어려움을 겪고 있다.

현재 전 세계적으로 임상에서 HPV 감염 여부를 검출/진단하기 위하여 널리 사용되는 대표적인 공통 프라이머로는 크게 북아메리카, 남아메리카 및 아시아에서 주로 사용되는 MY09/MY11 프라이머 세트와, 유럽 지역에서 주로 사용되는 GP5⁺/GP6⁺ 프라이머 세트 및 SPF1/SPF2 프라이머 세트로 구분될 수 있다. 이 밖에 최근 새롭게 개발되어 사용되고 있는 FAP59/FAP64 프라이머 세트와 PGMY09/PGMY11 프라이머 세트가 있으며, 일부 연구 목적으로 사용되는 많은 HPV 검출/진단을 위한 공통 프라이머 세트가 있으나, 현재까지 밝혀진 바 있는 다양한 HPV 유형과 비교할 때, 극히 제한된 유형의 HPV 검출/진단에만 국한되어 있을 뿐 아니라 HPV 유형에 따라 검출의 민감도가 크게 떨어지는 등 많은 문제점을 가지고 있는 것으로 판명되었다. 또한, HPV 유전자형에 따라서 PCR 증폭의 효율이 달라 검사의 정확도가 문제될 수 있다. 아울러, 현재 KFDA에 승인된 모든 DNA칩의 경우 분석시 스크리닝 프라이머와 인터널 콘트롤 프라이머를 개별 증폭하여 혼합한 후 교잡반응을 시켜야 하므로 경제적인 비용이 많이 들어갈 수밖에 없다(Qu et al., J. Clin. Microbiol. 35:1304-1310, 1997; Karksen et al., J. Clin. Microbiol. 34:2095-2100, 1996; Gravitt et al., J. Clin. Microbiol. 38:357-361).

이에 따라 인유두종바이러스의 검출에 따른 자궁경부암을 예방하기 위한 현재의 검출 시스템은 현재 그 가치와 필요성이 있음에도 불구하고 실제 임상 목적에서의 활용에 큰 제약이 있다. 특히, 새롭게 동정, 분류된 HPV 유형이 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 종양원성의 HPV 유형인지 또한 고위험군인지에 대해서는 단서를 찾을 수 없기 때문에 HPV 검출/진단과 관련하여 많은 혼란을 야기하고 있다.

한편, 리퀴드 비드 어레이(Liquid Beads Array)의 특징은 한 튜브(Tube) 안에서 교잡반응이 일어나는 3차원적 방법으로 반응 후 Luminex 100(Luminex사, 미국) 시스템에서 동시에 532nm과 633nm 파장을 측정함으로써 형광값을 표시하게 된다. 633nm 파장에서 측정된 형광값은 프로브가 부착된 비드를 식별하며, 532nm 파장에서 측정된 형광값은 각 프로브와 반응한 PCR 산물이 Streptavidin-Cy3 또는 Streptavidin-Phycoerythrin 결합으로 나타난 값이다(Keji et al., Cytometry 33:318-323, 1998). 리퀴드 비드 어레이는 프로우메트리(Fluorometry) 기술을 이용한 Luminex 100(Luminex사, 미국) 시스템을 사용함으로써 고속 측정이 가능하며, 1회 측정으로 100개 비드의 형광값의 최대 빈도를 확인하기 때문에 정확한 분석이 가능하며, 형광반응의 결과가 수치값으로 나타남으로써 정량 분석 및 자동화 시스템 적용이 용이하다(Armstrong et al., Cytometry 40:102-108,2000).

KR 10-2011-0126076 A

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 종양원성 HPV DNA 검출/진단을 위하여 자궁경부암의 진행과 관련하여 밀접한 관련이 있는 HPV의 특정 서열 또는 HPV DNA 복제에 있어 필수적인 HPV 특정 서열과 상보적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 유형 특이적 프라이머 및 프로브를 이용한 분석 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 인유두종바이러스의 E6/E7 유전자 단일 가닥을 증폭하는 방법 및 이를 통한 인유두종바이러스 감염 여부 및 감염된 유전형의 진단을 위한 정보 제공과 자궁경부암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 1) 분석하고자 하는 시료로부터, 34종의 인유두종바이러스(HPV) E6/E7 유전자 스크리닝을 위한 특이 프라이머를 사용하여 HPV 유전자를 PCR 증폭하는 제 1단계; 2) 제 1단계에서 증폭된 이중 가닥의 E6/E7 유전자 산물을 열 변성을 통해 단일 가닥 E6/E7 유전자 산물을 수득하는 제 2단계; 및 3) 제 2단계에서 수득된 단일 가닥의 유전자 산물을 34종 각각의 유전형에 특이적인 프로브를 사용하여 E6/E7 유전자의 유전형을 확인하는 제 3단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법을 제공한다.

상기 제 1단계의 프라이머는 HPV-16에 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-18에 특이적인 서열번호 3 및 서열번호 4 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-26에 특이적인 서열번호 5 및 서열번호 6 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-30에 특이적인 서열번호 7 및 서열번호 8 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-31에 특이적인 서열번호 9 및 서열번호 10 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-33에 특이적인 서열번호 11 및 서열번호 12 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-35에 특이적인 서열번호 13 및 서열번호 14 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-39에 특이적인 서열번호 15 및 서열번호 16 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-45에 특이적인 서열번호 17 및 서열번호 18 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-51에 특이적인 서열번호 19 및 서열번호 20 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-52에 특이적인 서열번호 21 및 서열번호 22 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-53에 특이적인 서열번호 23 및 서열번호 24 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-56에 특이적인 서열번호 25 및 서열번호 26 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-58에 특이적인 서열번호 27 및 서열번호 28 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-59에 특이적인 서열번호 29 및 서열번호 30 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-66에 특이적인 서열번호 31 및 서열번호 32 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-67에 특이적인 서열번호 33 및 서열번호 34 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-68에 특이적인 서열번호 35 및 서열번호 36 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-70특이적인 서열번호 37 및 서열번호 38 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-73에 특이적인 서열번호 39 및 서열번호 40 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-82에 특이적인 서열번호 41 및 서열번호 42 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-6에 특이적인 서열번호 43 및 서열번호 44 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-11에 특이적인 서열번호 45 및 서열번호 46 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-34에 특이적인 서열번호 47 및 서열번호 48 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-40에 특이적인 서열번호 49 및 서열번호 50 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-42에 특이적인 서열번호 51 및 서열번호 52 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-43에 특이적인 서열번호 53 및 서열번호 54 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-44에 특이적인 서열번호 55 및 서열번호 56 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-54에 특이적인 서열번호 57 및 서열번호 58 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-61에 특이적인 서열번호 59 및 서열번호 60 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-62에 특이적인 서열번호 61 및 서열번호 62 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-81에 특이적인 서열번호 63 및 서열번호 64 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; HPV-83에 특이적인 서열번호 65 및 서열번호 66 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 및 HPV-90에 특이적인 서열번호 67 및 서열번호 68 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택된다.

상기 제 1단계의 PCR 증폭은 Cy3-dCTP, dATP, dGTP 및 dTTP를 포함하는 혼합물을 이용하여 수행된다.

상기 제 1단계의 PCR 증폭의 어닐링(annealing) 온도는 67℃이다.

상기 제 1단계의 PCR 증폭의 프라이머 농도는 0.02 내지 0.03M인 것이 바람직하다.

상기 제 1단계의 PCR 증폭은 내부 대조군으로서 GAPDH 유전자 증폭용 프라이머를 사용할 수 있다.

상기 GAPDH 유전자 증폭용 프라이머는 서열번호 69 및 서열번호 70 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트이다.

상기 제 3단계는 단일 가닥의 E6/E7 유전자 산물을 E6/E7 유전자 유전형 검출용 프로브와 교잡(hybridization) 반응시키고, 형광물질이 부착된 결합제를 반응시킨 후, 형광값을 측정하는 방법으로 수행된다.

상기 제 3단계의 프로브는 E6/E7 유전자 유형 특이적인 부위와 교잡 반응한다.

상기 제 3단계의 프로브는 서열번호 71 또는 서열번호 72로 이루어지는 HPV-16에 특이적인 프로브; 서열번호 73 또는 서열번호 74로 이루어지는 HPV-18에 특이적인 프로브; 서열번호 75 또는 서열번호 76으로 이루어지는 HPV-26에 특이적인 프로브; 서열번호 77 또는 서열번호 78로 이루어지는 HPV-30에 특이적인 프로브; 서열번호 79 또는 서열번호 80으로 이루어지는 HPV-31에 특이적인 프로브; 서열번호 81 또는 서열번호 82로 이루어지는 HPV-33에 특이적인 프로브; 서열번호 83 또는 서열번호 84로 이루어지는 HPV-35에 특이적인 프로브; 서열번호 85 또는 서열번호 86으로 이루어지는 HPV-39에 특이적인 프로브; 서열번호 87 또는 서열번호 88로 이루어지는 HPV-45에 특이적인 프로브; 서열번호 89 또는 서열번호 90으로 이루어지는 HPV-51에 특이적인 프로브; 서열번호 91 또는 서열번호 92로 이루어지는 HPV-52에 특이적인 프로브; 서열번호 93 또는 서열번호 94로 이루어지는 HPV-53에 특이적인 프로브; 서열번호 95 또는 서열번호 96으로 이루어지는 HPV-56에 특이적인 프로브; 서열번호 97 또는 서열번호 98로 이루어지는 HPV-58에 특이적인 프로브; 서열번호 99 또는 서열번호 100으로 이루어지는 HPV-59에 특이적인 프로브; 서열번호 101 또는 서열번호 102로 이루어지는 HPV-66에 특이적인 프로브; 서열번호 103 또는 서열번호 104로 이루어지는 HPV-67에 특이적인 프로브; 서열번호 105 또는 서열번호 106으로 이루어지는 HPV-68에 특이적인 프로브; 서열번호 107 또는 서열번호 108로 이루어지는 HPV-70에 특이적인 프로브; 서열번호 109 또는 서열번호 110으로 이루어지는 HPV-73에 특이적인 프로브; 서열번호 111 또는 서열번호 112로 이루어지는 HPV-82에 특이적인 프로브; 서열번호 113 또는 서열번호 114로 이루어지는 HPV-6에 특이적인 프로브; 서열번호 115 또는 서열번호 116으로 이루어지는 HPV-11에 특이적인 프로브; 서열번호 117 또는 서열번호 118로 이루어지는 HPV-34에 특이적인 프로브; 서열번호 119 또는 서열번호 120으로 이루어지는 HPV-40에 특이적인 프로브; 서열번호 121 또는 서열번호 122로 이루어지는 HPV-42에 특이적인 프로브; 서열번호 123 또는 서열번호 124로 이루어지는 HPV-43에 특이적인 프로브; 서열번호 125 또는 서열번호 126으로 이루어지는 HPV-44에 특이적인 프로브; 서열번호 127 또는 서열번호 128로 이루어지는 HPV-54에 특이적인 프로브; 서열번호 129 또는 서열번호 130으로 이루어지는 HPV-61에 특이적인 프로브; 서열번호 131 또는 서열번호 132로 이루어지는 HPV-62에 특이적인 프로브; 서열번호 133 또는 서열번호 134로 이루어지는 HPV-81에 특이적인 프로브; 서열번호 135 또는 서열번호 136으로 이루어지는 HPV-83에 특이적인 프로브; 및 서열번호 137 또는 서열번호 138로 이루어지는 HPV-90에 특이적인 프로브로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택된다.

상기 제 3단계의 프로브는 비드에 결합된 형태인 것이 바람직하다.

상기 형광물질이 부착된 결합제는 Streptavidin-Cy3 또는 Streptavidin- Phycoerythrin인 것이 바람직하다.

상기 교잡 반응의 온도는 35 내지 38℃인 것이 바람직하다.

상기 교잡 반응을 위한 E6/E7 유전자 증폭 산물은 10 내지 30μl인 것이 바람직하다.

상기 교잡 반응은 내부 대조군으로서 GAPDH 유전자 검출용인 서열번호 139 또는 서열번호 140으로 표시되는 프로브를 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 1) 분석하고자 하는 시료로부터, 34종의 인유두종바이러스(HPV) E6/E7 유전자 스크리닝을 위한 특이 프라이머 및 GAPDH 유전자 증폭용 프라이머를 사용하여 HPV 유전자 및 GAPDH 유전자를 PCR 증폭하는 제 1단계; 2) 제 1단계에서 증폭된 이중 가닥의 유전자 산물을 열 변성을 통해 단일 가닥 유전자 산물을 수득하는 제 2단계; 및 3) 제 2단계에서 수득된 단일 가닥의 유전자 산물을 34종 각각의 유전형에 특이적인 프로브 및 GAPDH 프로브를 사용하여 E6/E7 유전자의 유전형을 확인하는 제 3단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 감염 여부 및 감염된 유전형의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 인유두종바이러스가 감염된 개체에 치료 후보 물질을 투여하는 단계; 및 2) 상기 개체로부터 DNA을 분리하여 상기한 방법들 중의 어느 한 방법으로 인유두종바이러스를 검출하고, 유전형을 확인하는 단계를 포함하는 자궁경부암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법, 인유두종바이러스 감염 여부 및 감염된 유전형의 진단을 위한 정보 제공 방법 및 자궁경부암 치료제의 스크리닝 방법에 의하면, 신속하고 정확하게 검체로부터 인유두종바이러스 감염 여부 및 그 유전자형을 확인할 수 있으며, 치료제 후보 물질을 정확하고 간편하게 스크리닝할 수 있다.

도 1은 인유두종바이러스 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 20인의 환자군으로부터 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 MPCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3t는 20인의 환자군으로부터 본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 증폭된 증폭 산물을 본 발명의 프로브를 사용한 리퀴드 비드 어레이 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

종래 PCR 기법을 활용하여 샘플 내에 존재하는 여러 유형의 HPV DNA와 혼성화(hybridization) 또는 상보적 결합(complementary binding)할 수 있는 공통적인 올리고뉴클레오티드 프라이머는 현재까지 발견된 HPV 유형의 수와 비교할 때, 검출/진단할 수 있는 유형의 수가 크게 제한될 뿐 아니라 HPV 유형에 따라 민감도가 크게 떨어진다. 이와 같이 현존하는 HPV 검출/진단을 위한 PCR 공통 프라이머는 HPV 게놈 중 L1 영역과 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 대상으로 한 것이었기 때문이었다.

상기한 것과 같이 HPV 게놈을 구성하는 E6 유전자 및 E7 유전자는 각각 숙주 세포의 종양 억제 단백질 중의 하나인 p53 또는 pRb와의 결합부위를 암호화(encoding)하는 특정 핵산 서열을 가지고 있는데, 자궁경부암의 진행과 밀접한 관련이 있는 종양원성 HPV 유형, 예컨대 고위험군의 HPV 유형에서는 p53 또는 pRb와의 결합부위를 암호화하는 핵산 서열이 잘 보전되어 있다. 또한, HPV 게놈의 E1 유전자는 HPV 게놈의 복제를 개시하는 단백질을 암호화하고 있으므로, HPV가 숙주 세포에서 생장하기 위한 필수적인 서열이다.

본 발명자들은 이와 같은 발견을 토대로 종양원성 HPV 유형의 핵산 서열과 상보적으로 결합할 수 있고, 이에 따라 해당 HPV 유형의 핵산 서열을 증폭시킬 수 있는 유형 특이적 프라이머를 설계하였다. 본 발명에 따라 합성된 유형 특이적 프라이머는 특히 HPV 게놈 중의 E6/E7 영역과 상보적으로 결합할 수 있기 때문에, 샘플 내의 이들 유전자의 증폭 여부를 통하여 샘플 내에 HPV DNA의 존부를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 합성된 유형 특이 프라이머를 사용하면 1회의 PCR 과정을 통하여 종양원성 HPV 유형의 존재 여부를 분석/검출할 수 있음은 물론 이들 유형을 정확하게 동정할 수 있다.

이하, 예증적인 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 올리고 DNA 합성

이를 위하여 본 발명에서 프라이머(primer)는 유형별 즉, 인유두종바이러스 타입 특이적인 증폭이 가능하도록 타겟 부위(target region)를 선별하였다. 또한, 필요한 경우 유형별 타겟 부위 염기서열을 ClustalW method를 이용하여 다중정렬(multiple alignment)을 실시하고, 이에 따라 각 유형 특이적인(specific) 프라이머 타겟 부위를 선별하였다. 이후, 선별된 프라이머 타겟 부위로부터 프라이머 프리미어(Primer premier version 5, Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA), 디엔에이시스 맥스(DNASIS MAX Version 2.7, MiraiBio Group, South San Francisco, CA, USA) 프로그램을 응용하여 유형-특이적 또는 유전자-특이적 프라이머를 디자인하였다. 프라이머 선발의 기본 요건은 다음과 같다; 프라이머 길이(30-35base pair), 융해 온도[Tm(℃), 74-80℃], 3' 말단의 GC 함량이 높지 않아야 하며, 프라이머 서열내 염기 4개 이상 연속해서 상보적이지 않도록 해서 hairpin 이차 구조 형성을 방지하였으며, 3' 말단에 동일한 염기가 3개 이상 연속해서 위치하지 않도록 해서 프라이머 이합체(dimer)의 형성을 방지하였다. 그리고, 타겟 부위 내에 단일염기 다형성(single nucletide polymorphism, SNP)이 포함되지 않도록 하여 높은 특이도를 확보하였다. 또한, 해당 프라이머 염기서열이 본 발명이 목적하는 리퀴드 비드 어레이를 구성하는 타 유전자 또는 병원체 염기서열들과 cross-reactive한 특성을 나타내지 않음을 미국 NCBI 염기서열 데이터베이스 등 다양한 염기서열 검색 툴(tool)을 활용하여 검증하였다. 본 발명에 사용하는 프라이머(primer)는 마크로젠사(한국)를 통해 합성하였다(표 1).

본 발명의 바람직한 구현을 통해, 인유두종바이러스 유형 진단을 위한 프라이머는 형광 색소가 표지되지 않은 일반적인 프라이머를 사용하고 멀티플렉스 PCR 반응 중에 형광 색소가 표지된 디옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트(Cy3-dCTP) 형광 색소를 표지시키는 방법을 사용하였다. 상기 형광 색소 이외에도 6-FAM(6-carboxyfluorescein), Cy3, JOE(6-carboxy-4', 5'-dichloro-2', 7'-dimethoxy- fluorescein), Rhodamine Green, TAMRA NHS(N-hydroxysuccinimide) Ester, Texas Red 등을 선택적으로 사용할 수 있다.

프라이머의 농도는 제조사(마크로젠사, 한국)의 QC 보고서를 통해 확인하고 최종 100pmole/μL 범위의 농도가 되도록 3차 탈이온 멸균 증류수로 재현탁(resuspension)하고 aliquots으로 -70℃에 냉동 보관하였다.

< 실시예 2> 임상검체 채취 및 이로부터 DNA 분리

본 발명이 실현하고자 하는 비침습적(non-invasive) 진단을 위해서, 자궁경부세포진, 소변 등의 검체로부터 효율적인 DNA 분리가 주요 선행 조건 중의 하나였다. 검체는 채취 후 바이러스 수송배지(viral transport media)에 넣어서 검사실로 운송하였다. 인유두종바이러스 유형 진단을 위해 검체로부터 게노믹 DNA(genomic DNA)를 분리하였으며, 상용화된 DNA 추출 키트(G-Spin^TM Genomic DNA isolation kit, 인트론바이오테크놀로지, 성남, 한국)를 사용하였다. 자궁경부세포진을 비롯한 여타 검체가 점도가 낮아서 바로 pipetting이 가능하면 2N 수산화나트륨(NaOH)을 사용하지 않고 검체 0.3mL를 200μl의 TG 완충용액(buffer)과 20μl의 프로테나아제 K가 녹여져 있는 1.5mL 에펜도르프 튜브에 첨가하고 약하게 교반(vortex)한 후 70℃에서 10분간 반응시켰다. 이후, 반응물에 TB 완충용액 400μL를 첨가하고 교반하여 반응물을 혼합하였다. 이어서, 반응물을 스핀 칼럼(spin column)의 상층부에 로딩(loading)하고 12,000rpm, 2분 원심분리하였다. 컬렉션 튜브를 새로 교체하고 멤브레인으로부터 불순물을 제거하는 WB 완충용액 500μL를 첨가하고 12,000rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 이후, 스핀 칼럼 상층부를 새로운 에펜도르프 튜브로 옮긴뒤 DNA를 용출시키기 위해 탈이온(de-ionized) 멸균 3차 증류수 100μL를 로딩하고 실온에서 2분 처리한 후, 12,000rpm에서 2분 동안 원심분리하여 순수한 DNA를 분리하였다.

< 실시예 3> 인유두종바이러스 스크리닝을 위한 PCR 증폭

인유두종바이러스 비드 어레이 분석에 앞서, 임상 검체로부터 분리한 바이러스 DNA를 주형으로 멀티플렉스 PCR 반응을 통해 리퀴드 비드 어레이 분석을 위한 타겟 유전자들을 증폭하고 전기영동을 통해 확인하였다. 이후, 증폭된 앰플리콘들은 리퀴드 비드 어레이 표면의 DNA 프로브들과 듀플렉스(duplex)를 형성함으로써 인유두종바이러스 원인균별 유형 판정 결과가 확인된다. 본 발명의 바람직한 일 양태에 따른 멀티플렉스 PCR은 내부 대조군(internal control)으로 인간 GAPDH 유전자를 포함한다.

본 실시예에서 바람직하게 기술하는 인유두종바이러스 34종 멀티플렉스 PCR반응은 퀴아젠사의 다중중합효소연쇄반응 키트(Multiplex PCR 키트)를 사용한다. 인유두종바이러스 유형 진단을 위한 멀티플렉스 PCR에 포함되는 개별 dNTPs들 가운데 dCTP에 Cy3 형광 색소를 표지시켜 합성하였다(마크로젠사, 한국).

본 발명의 또한 바람직한 일 양태에 따른 말단에 형광 색소 변형이 없는 프라이머를 포함하는 멀티플렉스 PCR 키트는 PCR 과정 중에 Cy3 형광 색소가 표지된 디옥시사이토신 트리포스페이트(Cy3-dCTP)가 증폭산물을 구성하는 뉴클레오티드로 첨가되도록 하여 반응의 민감도와 특이도를 향상시킬 수 있었다. Cy3-dCTP를 사용하는 34종 멀티플렉스 PCR 반응에 사용하는 PCR 완충용액은 최종농도 50mM KCl, 3.5mM MgCl₂, 10mM Tris-HCl, pH 8.2이었으며, 2.5unit의 Taq 중합효소, 300μM dATP, 300μM dGTP, 300μM dTTP, 25μM dCTP, 275μM Cy3-dCTP(FluoroLink Cy3-dCTP, Amersham Pharmacia Biotech AB, Piscataway, NJ, USA), 10mg/mL 소혈청알부민(Bovine serum albumin)을 첨가하여 PCR 분석은 94℃에서 10분간 예비변성시키고 94℃, 30초 변성, 67℃, 1분 어닐링, 72℃, 1.5분 확장의 반응을 총 35회 시행한 후 최종 확장은 72℃에서 5분간 반응시켜 증폭하였다.

< 실시예 4> HPV 리퀴드 비드 어레이 제작을 위한 프로브 합성

리퀴드 비드의 카르복실기와 공유결합을 시키기 위하여 모든 프로브의 5' 말단에 아미노 링크를 붙이고 교잡 반응시 반응을 용이하게 하기 위하여 10개의 올리고(dT)를 부착한 다음 표 2와 같은 염기서열을 붙여 합성하였다. 즉, "Amino link-Oligo(dT)₁₀-프로브 염기서열"의 순서로 하여 마크로젠사(한국)에 의뢰하여 합성하였다. 이때, 결정한 HPV 유전자형의 염기서열은 총 34종의 HPV 유전자형을 분석하여 결정하였다.

< 실시예 5> 인유두종바이러스 유형 분석 비드 어레이 키트 제작

본 발명의 인유두종바이러스 유형 진단 리퀴드 비드 어레이는 34종의 HPV 유형을 고-특이도로 판별할 수 있는 탐침이 포함되는데, 이들 탐침과 준비된 비드(xMAP carboxylated microspheres ; Luminex Corp. Austin, TX)를 이용하여 비드에 탐침을 붙이는 작업을 통해 아래와 같이 리퀴드 비드 어레이를 제작하였다. 그 절차는 아래와 같다.

100pmol의 아미노기가 붙어 있는 프로브를 0.1M MES(M2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid pH4.5)에 10μM이 되도록 혼합하였다. 리퀴드 비드에 프로브를 부착하기 위하여 Miraibio LabMaP bead(미국)에서 구입하여 사용하였다. LabMAP bead를 10μl를 1.5ml tube로 분주한 후 10,000g에서 1분간 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 제거하였다. 침사물에 50μl의 0.1M MES buffer(pH4.5)를 넣고 sonication하였다. 10μM 프로브 2.5μl를 취하여 상기 제조된 비드에 첨가하였다. 1% EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimided hydrochlo- ride) 용액 2.5μl를 첨가하여 암소에서 30분간 2회 반복 반응하였다. 0.02% Tween 20 용액 200μl를 첨가한 후 10,000g에서 1분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 0.1% SDS 용액 200μl를 첨가한 후 10,000g에서 1분간 원심분리 후 상층액을 제거하였다. 침사물을 0.1M MES(pH4.5) 100μl에 녹인 후 암소에서 냉장 보관하였다.

< 실시예 6> 인유두종바이러스 리퀴드 비드 어레이 교잡반응 및 분석

상기에서 제조한 프로브가 포함된 리퀴드 비드를 상온에서 30분간 방치한 후 2분간 vortex mixer를 이용하여 비드를 풀어주었다. 하이브리다이제이션 용액(3X SSC, 0.3% SDS)을 60℃에서 10분간 방치하였다. PCR 증폭산물 10μl를 95℃에서 5분간 변성시킨 다음, 즉시 아이스에서 2분간 방치한 후 준비한 하이브리다이제이션 용액(3X SSC, 0.3% SDS)과 l:4의 비율로 혼합한 후 Streptavidin-Cy3 또는 Streptavidin- Phycoerythrin이 1/500이 되도록 첨가하였다. 60℃의 배양기에서 1시간 동안 반응시켜 결합 반응을 수행하였다. 반응이 완료된 후 각 튜브에 멸균증류수를 첨가하여 반응을 종료시킨 후 리퀴드 비드 어레이 전용 플레이트로 옮겨 담았다. 결과 확인은 상기에서 준비된 샘플을 이용하여 리퀴드 비드 어레이에서 well 별로 Bead를 읽었다. Luminex 100은 2개의 lazer를 이용하여 한 개는 Bead 번호를 한 개는 반응된 피코에리트린의 양을 계산하여 수치로 나타내었다. 총 35종류의 비드를 읽으며 각각의 HPV 유전형의 판정은 그 유전형을 대표하는 비드의 MFI 값으로 대변되고, 이를 통해 그 유전형을 판정하였다. 분석 소프트웨어를 이용하여 양성 대조군 비드에 결합되어 있는 프로브들간의 평균 MFI 값 및 표준오차 값들과 비교하여 이 비율을 구한 뒤 그 값이 인터널 콘트롤의 MFI 값 150~200 이상일 경우에 양성 값으로 스코어링(scoring) 처리하였다.

< 실시예 7> 프로브 테스트

표 3 및 표 4는 34종의 HPV에 대한 프로브의 최대 검출 수치를 확인하기 위한 리퀴드 비드 어레이 이미지를 나타낸다. 리퀴드 비드 어레이의 MFI 값을 특정하기 위하여 Luminex 100(Luminex사, 미국) 시스템을 이용하여 프로브 간의 MFI 값을 측정하여 분석하였다.

표 3 및 표 4에서 보는 바와 같이, Luminex 100(Luminex사, 미국) 시스템 소프트웨어를 이용하여 프로브 간의 MFI 값을 분석한 결과 그 값이 1500~2000의 값에서 최대 검출 수치를 나타내었고 양성판정 기준은 인터널 콘트롤의 양성 기준인 100~200 사이의 값을 최소 검출 한계치이며 양성판정 기준치로 판정하였다.

< 실시예 8> 임상검체 실험

본 실시예는 임상시료를 대상으로 종래의 세포 검사법에 따른 HPV 감염 여부 및 자궁경부암 관련 여부를 검진하였다. 이를 위해 이원의료재단에서 의뢰한 검체 20건을 대상으로 담당 임상의의 책임 하에 질확대경진(colposcopy) 검사, 자궁경부촬영진(cervicography) 검사, 조직생검(biopsy) 및 세포진도말(pap-smear) 검사 등의 전문적 검진을 수행하였다. 본 실시예에 따른 세포 검사법에 따른 검진 결과는 하기 표 5에 표시하였다.

검진 결과, 표 5에 도시된 것과 같이, 피검자 2,4,5,7,9,10,11 및 12는 저급 상피 이형성증(Low-grade SIL), 피검자 3,6,14,15 및 20은 고급 상피 이형성증(High-grade SIL), 피검자 1,8,13 및 19는 상피내암(squamous Cell carcinoma, SCC) 환자로 진단되었다. 나머지 피검자(피검자 16, 17, 및 18)는 본 실시예에 따른 자궁경부암 세포진 도말 검사에서 정상 세포를 가지는 자궁경부암 비관련 환자로 진단되었다.

본 실시예에서는 상기 임상검체를 이용한 HPV 타입 분석은 먼저 도 2에서 보는 바와 같이 PCR 분석을 통한 증폭능을 확인한 다음, 증폭 반응이 끝난 튜브에 각각의 타입을 대표하는 프로브가 붙어 있는 비드들을 섞어 만든 혼합 비드와 교잡반응 후, 세척 과정 후 스트렙타비딘 피코에리트린과 반응 후 읽은 형광 수치(Mean fluorescent intensity; MFI)를 나타내었다. 피검자 2,4,5,7,9,10,11 및 12는 저급 상피 이형성증(Low-grade SIL), 피검자 3,6,14,15 및 20은 고급 상피 이형성증(High-grade SIL), 피검자 1,8,13 및 19는 상피내암(squamous Cell carcinoma, SCC) 환자 모두에서는 각각 서로 다른 유형의 인유두종바이러스 유형이 검출되었으나 이외에 세포학적 소견에서 정상으로 확인된 검체에 대하여는 인유두종바이러스 유형이 확인되지 않았다. 그 결과를 도 3a 내지 도 3t에 나타내었다.

이와 같이 HPV 유전자형을 분석하는데 HPV E6/E7 부위을 다중중합효소연쇄반응으로 증폭하여 HPV 유전자형을 검출하면 기존 L1영역을 대상으로 한 공통 스크리닝 프라이머가 지니는 한계를 극복하고 그 단점을 최소화하였다. 또한, 이 E6/E7 부위에서의 HPV 유전자형 분석은 기존 영역에 비해 그 염기서열 보존이 잘 되어 있어 보다 정확하게 HPV 유형을 판독하는데 있어서 그 근본적인 문제인 프라이머 및 프로브 선택에 크게 구애받지 않는다는 점이 본 발명의 이점이라 할 수 있다.

상기에서 본 발명의 바람직한 실시예를 기술하였으나, 이는 어디까지나 예시일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야의 당업자라면 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형과 변경이 가능하다는 점은 자명하다. 그러나, 그와 같은 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 사실은 첨부하는 청구의 범위를 통하여 보다 분명해질 것이다.

<110> 1111, 1111 <120> A METHOD FOR DETECTING ONCOGENIC TYPES OF HUMAN PAPILLOMA VIRUS USING LIQUID BEADS ARRAY AND MULTIPLEX PCR <160> 140 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-16 forward primer <400> 1 gagcgaccca gaaagttacc acagttatgc acagag 36 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-16 reverse primer <400> 2 gcacacaatt cctagtgtgc ccattaacag gtc 33 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-18 forward primer <400> 3 gaggatccaa cacggcgacc ctacaagcta c 31 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-18 reverse primer <400> 4 tgctgagctt tctactacta gctcaattct ggc 33 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-26 forward primer <400> 5 gagctatgtg aaagcttgaa tactactttg c 31 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-26 reverse primer <400> 6 gtgcagcaca ctgatggcac acc 23 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-30 forward primer <400> 7 caccatcttt gtgaggtaca agaaacatcg ttgc 34 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-30 reverse primer <400> 8 gcacacaggg gacacactag ctccag 26 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-31 forward primer <400> 9 cctgcagaaa gacctcggaa attgcatgaa c 31 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-31 reverse primer <400> 10 ggcacacgat tccaaatgag ccca 24 <210> 11 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-33 forward primer <400> 11 gcagtaaggt actgcacgac tatgtttcaa gacactg 37 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-33 reverse primer <400> 12 taggtcactt gctgtactgt tgacacataa acgaactg 38 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-35 forward primer <400> 13 ttacaaactg catgatttgt gcaacgaggt agaag 35 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-35 reverse primer <400> 14 gaacagccgg ggcacactat tccaaatg 28 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-39 forward primer <400> 15 tagcctgtgt ctattgcaga cgaccac 27 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-39 reverse primer <400> 16 gttgcacacc acggacacac aaatcctagt g 31 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-45 forward primer <400> 17 tacaagacgt atctattgcc tgtgtatatt gcaaagc 37 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-45 reverse primer <400> 18 acggacacac aaaggacaag gtgctc 26 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-51 forward primer <400> 19 caagagggaa agaccacgaa cgctgcatg 29 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-51 reverse primer <400> 20 taacatctgc tgtacaacgc gaagggtgtc 30 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-52 forward primer <400> 21 cggccatgtt tgaggatcca gcaacac 27 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-52 reverse primer <400> 22 caacagcatt tgctgtagag tacgaaggtc cgtc 34 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-53 forward primer <400> 23 gcactgtgta caacacccag gacatcc 27 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-53 reverse primer <400> 24 ctgcaccaac gactcacacc tacaacactg 30 <210> 25 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-56 forward primer <400> 25 ccacaattca acaatccaca ggaacgtcca cg 32 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-56 reverse primer <400> 26 caggtcctct ttggtactct gaatgtccaa ctg 33 <210> 27 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-58 forward primer <400> 27 gatttgtgtc aggcgttgga gacatctgtg catg 34 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-58 reverse primer <400> 28 gtgcacagct agggcacaca atggtacatg 30 <210> 29 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-59 forward primer <400> 29 atttgagcac aacattgaat attcctctgc atgatattcg c 41 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-59 reverse primer <400> 30 cagctgctgt aaggctcgca atccgtc 27 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-66 forward primer <400> 31 ccatattcag caatacacag gaacgtccac gaagc 35 <210> 32 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-66 reverse primer <400> 32 cgtagctcct ctttggtact ctgaatgtcc aactgc 36 <210> 33 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-67 forward primer <400> 33 cagacgaaaa accacgcaac ctgcacgaat tgtg 34 <210> 34 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-67 reverse primer <400> 34 ctattcctag tgtgttcata agcatctgct ggattgttcg g 41 <210> 35 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-68 forward primer <400> 35 cattggacac cacattgcat gacgttacaa tagactg 37 <210> 36 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-68 reverse primer <400> 36 gtccataaac agcagttcta cgttccgcag g 31 <210> 37 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-70 forward primer <400> 37 tagactgtgt ctattgtaaa acacagctac agcaaac 37 <210> 38 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-70 reverse primer <400> 38 gatgcacacc agggacacac aaatgacagt g 31 <210> 39 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-73 forward primer <400> 39 gtttcccaat tcagaagaac gaccatacaa gctac 35 <210> 40 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-73 reverse primer <400> 40 ggcacacaat acctagtgta cccataagca actc 34 <210> 41 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-82 forward primer <400> 41 gaaagaccac gaacgctgta cgaattatgt gaagc 35 <210> 42 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-82 reverse primer <400> 42 ggtcacccat taacagttgc tgaaatatgc gaagg 35 <210> 43 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-6 forward primer <400> 43 ggcattatgg aaagtgcaaa tgcctccacg tctgcaac 38 <210> 44 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-6 reverse primer <400> 44 cccaacagaa gctgttgcac ttctctgatg tc 32 <210> 45 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-11 forward primer <400> 45 gcagacgagg cattatggaa agtaaagatg cctccacg 38 <210> 46 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-11 reverse primer <400> 46 gtgtgcccag caaaaggtct tgtagttgtc tgatgtctc 39 <210> 47 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-34 forward primer <400> 47 caatcctgag gaacggccat acaagctacc agc 33 <210> 48 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-34 reverse primer <400> 48 cacccataag caggtcttct aacactaata ggtcagcg 38 <210> 49 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-40 forward primer <400> 49 ccaggaccct gtatgaactg tgtgaccagt gc 32 <210> 50 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-40 reverse primer <400> 50 cactctgtag ctgcacagtt ggggcac 27 <210> 51 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-42 forward primer <400> 51 ggcagaatgt caggtacatc tgcctcatca cag 33 <210> 52 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-42 reverse primer <400> 52 ttactccacg cgggcacaca aaggacac 28 <210> 53 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-43 forward primer <400> 53 gcttgttgtg tatgtatggt gtgtttgtgt tacgtacttg 40 <210> 54 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-43 reverse primer <400> 54 cacaagctat ggtttttggg tggtttatat atgtaccgct ttcg 44 <210> 55 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-44 forward primer <400> 55 gcaagcgggg cataatggaa agtgcaaatg c 31 <210> 56 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-44 reverse primer <400> 56 cacacaggac acaatatatc cagtgaaccc agcag 35 <210> 57 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-54 forward primer <400> 57 ccgaaaccgg tacatataaa agcggttgta gaaaacag 38 <210> 58 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-54 reverse primer <400> 58 gtcgtgaagc acaggtggga cacactattt gcagtgc 37 <210> 59 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-61 forward primer <400> 59 cgtagggtca gcaaagcaca ctcatctatg ggaccg 36 <210> 60 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-61 reverse primer <400> 60 cagccaggac acactatgga caagtcgccc agcag 35 <210> 61 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-62 forward primer <400> 61 aaggcccacg aacctgtttt tgctgtgtaa gg 32 <210> 62 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-62 reverse primer <400> 62 gtcacttatg cgcagccggg acacactatc 30 <210> 63 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-81 forward primer <400> 63 ccagcaaatc ctaccaattt gtttttgctg tgtaaggag 39 <210> 64 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-81 reverse primer <400> 64 ctatggacag tgtatccgtc agtagttgtt gcag 34 <210> 65 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-83 forward primer <400> 65 gtaccccacc aacatatttc tgctgtgcaa agactg 36 <210> 66 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-83 reverse primer <400> 66 gacacactat atccactgca ttcaccaaaa ggtcc 35 <210> 67 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-90 forward primer <400> 67 cctattgtgc aaagtctatg aactggacct gc 32 <210> 68 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-90 reverse primer <400> 68 atgcgcagag cggacacact atatgcagtg 30 <210> 69 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 69 cccacaagta tcactaagct cgctttcttg ctgtcc 36 <210> 70 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 70 gcagaatcca gatgctcaag gcccttcata atatcc 36 <210> 71 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-16 probe <400> 71 atcatgcatg gagatacacc tacattgcat g 31 <210> 72 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-16 probe <400> 72 cgtacaaagc acacacgtag acattcg 27 <210> 73 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-18 probe <400> 73 caacattgca agacattgta ttgcatttag ag 32 <210> 74 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-18 probe <400> 74 cacaacgtca cacaatgttg tgtatgtgtt gtaag 35 <210> 75 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-26 probe <400> 75 ccagacaagc tggacaagaa gtgtgttac 29 <210> 76 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-26 probe <400> 76 cagagcagtc gacagaacgt tcgag 25 <210> 77 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-30 probe <400> 77 cgtccactga gacagcagta taatcatgc 29 <210> 78 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-30 probe <400> 78 ggctgttcag agtcccacaa agg 23 <210> 79 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-31 probe <400> 79 ctgacctcca ctgttatgag caattaccc 29 <210> 80 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-31 probe <400> 80 cgtttgtgtg tacagagcac acaagtagat attc 34 <210> 81 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-33 probe <400> 81 acgtagagaa actgcactgt gacgtgtaaa 30 <210> 82 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-33 probe <400> 82 cagccacagc tgattactac attgtaacct g 31 <210> 83 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-35 probe <400> 83 tgtattacat gtcaaaaacc gctgtgtcca gtt 33 <210> 84 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-35 probe <400> 84 gacactacgt ctgtgtgtac agagcac 27 <210> 85 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-39 probe <400> 85 aagagaaacc caagtataac atcagatatg cg 32 <210> 86 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-39 probe <400> 86 ggatactctg cgacaactac agcagc 26 <210> 87 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-45 probe <400> 87 tgcatttgga acctcagaat gaattagatc ct 32 <210> 88 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-45 probe <400> 88 gtagagagct cggcagagga ccttag 26 <210> 89 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-51 probe <400> 89 atgtaccaca attaaaagat gtagtattgc at 32 <210> 90 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-51 probe <400> 90 gcaggtgttc aagtgtagta caactggc 28 <210> 91 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-52 probe <400> 91 accccgacct gtgacccaag tgtaac 26 <210> 92 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-52 probe <400> 92 ccagatggac aagcagaaca agcc 24 <210> 93 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-53 probe <400> 93 cacttccaca atatattata gaacttatac ca 32 <210> 94 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-53 probe <400> 94 gacgggacga acaacatcct tgttacc 27 <210> 95 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-56 probe <400> 95 ctgcaagacg ttgtattaga actaacacct 30 <210> 96 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-56 probe <400> 96 ctaatacacg taccttgttg tgagtgtaag tttgtg 36 <210> 97 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-58 probe <400> 97 ccatgagagg aaacaaccca acgctaag 28 <210> 98 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-58 probe <400> 98 caaccgacgt acgaacccta cagc 24 <210> 99 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-59 probe <400> 99 aacaatgcat ggaccaaaag caacactttg 30 <210> 100 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-59 probe <400> 100 gctagtagta gaaacctcgc aagacggatt g 31 <210> 101 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-66 probe <400> 101 taccaacgtt gcaagaggtt atattagaac ttg 33 <210> 102 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-66 probe <400> 102 gttggtggtg cagttggaca ttcag 25 <210> 103 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-67 probe <400> 103 agtgtgttgg agacctcaac gaacg 25 <210> 104 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-67 probe <400> 104 ccatattgtt actgtgtgta acatctgtga gtgc 34 <210> 105 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-68 probe <400> 105 tgcaatgaaa tagagccggt cgaccttg 28 <210> 106 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-68 probe <400> 106 cgtgttgtaa gtgtaacaac ctactgcaac tag 33 <210> 107 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-70 probe <400> 107 cggtcgacct tgtatgtcac gagcaattag a 31 <210> 108 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-70 probe <400> 108 agcctcacaa gagaacctgc gatc 24 <210> 109 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-73 probe <400> 109 aggcgatata gacaatcagt atatggcact 30 <210> 110 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-73 probe <400> 110 cacagtatgc cttgccattg aaagcaac 28 <210> 111 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-82 probe <400> 111 caggtgttca agtttgctac agttgg 26 <210> 112 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-82 probe <400> 112 ggtgttcaag tttgctacag ttgg 24 <210> 113 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-6 probe <400> 113 gacgaagtgg acggacaaga ttcacaac 28 <210> 114 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-6 probe <400> 114 gtgacctgtt gctgtggatg tgac 24 <210> 115 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-11 probe <400> 115 cacaacatta ccaaatactg acctgttgct gtg 33 <210> 116 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-11 probe <400> 116 caacgtccga ctggttgtgg ag 22 <210> 117 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-34 probe <400> 117 tagaagatat aaccaatcag tgtatggacg g 31 <210> 118 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-34 probe <400> 118 ccacagtgtg tcttaccatt gagagcac 28 <210> 119 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-40 probe <400> 119 ctgcaccctg aacctgtatg tctaaact 28 <210> 120 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-40 probe <400> 120 gtgcattgtt ccatcactga tataacacag ttcc 34 <210> 121 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-42 probe <400> 121 gcagtgtaca gaggcggaca taagaaac 28 <210> 122 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-42 probe <400> 122 gtgtacacag tgttacaagt ctgttaaact cgttg 35 <210> 123 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-43 probe <400> 123 catggaaaaa agccgacgat cagagactat g 31 <210> 124 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-43 probe <400> 124 aattattata cttgtagttt aaggtgggac cgaaaacgg 39 <210> 125 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-44 probe <400> 125 gaaacaaata agtcaattct ggacgtgctg 30 <210> 126 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-44 probe <400> 126 cagtgcacag gaacagacat ccatcac 27 <210> 127 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-54 probe <400> 127 acacaggcat aagggtactg caggaactg 29 <210> 128 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-54 probe <400> 128 gcaggaactg cttcatcagg acg 23 <210> 129 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-61 probe <400> 129 aaccataaag gacatagtcc ttgaagagcg 30 <210> 130 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-61 probe <400> 130 tgcagtgcgg agacgcagac ctgaaggtgc t 31 <210> 131 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-62 probe <400> 131 aaccataaag gacatagtcc ttgaagagcg 30 <210> 132 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-62 probe <400> 132 gaactcagac ggctgcaaca actact 26 <210> 133 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-81 probe <400> 133 gttaggctgg tggtgttaag tggagac 27 <210> 134 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-81 probe <400> 134 gtatttgtag gtgtttagtt aggctggtgg tg 32 <210> 135 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-83 probe <400> 135 gcacttagac tagcagtgct gtgtgaag 28 <210> 136 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-83 probe <400> 136 tgtgtgaaga cgcagaccta aaacgtc 27 <210> 137 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-90 probe <400> 137 gtggacacgc agaaataaga caactccag 29 <210> 138 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV-90 probe <400> 138 ctgtacagta aggctggtgg tggag 25 <210> 139 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH probe <400> 139 ctattaaagg ttcctttgtt ccctaagtcc 30 <210> 140 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH probe <400> 140 gttccctaag tccaactact aaactggg 28

Claims (17)

1) 분석하고자 하는 시료로부터, 34종의 인유두종바이러스(HPV) E6/E7 유전자 스크리닝을 위한 특이 프라이머를 사용하여 HPV 유전자를 PCR 증폭하는 제 1단계;
2) 제 1단계에서 증폭된 이중 가닥의 E6/E7 유전자 산물을 열 변성을 통해 단일 가닥 E6/E7 유전자 산물을 수득하는 제 2단계; 및
3) 제 2단계에서 수득된 단일 가닥의 유전자 산물을 34종 각각의 유전형에 특이적인 프로브를 사용하여 E6/E7 유전자의 유전형을 확인하는 제 3단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.

제 1항에 있어서,
상기 제 1단계의 프라이머는 HPV-16에 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-18에 특이적인 서열번호 3 및 서열번호 4 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-26에 특이적인 서열번호 5 및 서열번호 6 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-30에 특이적인 서열번호 7 및 서열번호 8 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-31에 특이적인 서열번호 9 및 서열번호 10 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-33에 특이적인 서열번호 11 및 서열번호 12 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-35에 특이적인 서열번호 13 및 서열번호 14 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-39에 특이적인 서열번호 15 및 서열번호 16 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-45에 특이적인 서열번호 17 및 서열번호 18 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-51에 특이적인 서열번호 19 및 서열번호 20 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-52에 특이적인 서열번호 21 및 서열번호 22 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-53에 특이적인 서열번호 23 및 서열번호 24 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-56에 특이적인 서열번호 25 및 서열번호 26 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-58에 특이적인 서열번호 27 및 서열번호 28 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-59에 특이적인 서열번호 29 및 서열번호 30 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-66에 특이적인 서열번호 31 및 서열번호 32 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-67에 특이적인 서열번호 33 및 서열번호 34 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-68에 특이적인 서열번호 35 및 서열번호 36 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-70특이적인 서열번호 37 및 서열번호 38 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-73에 특이적인 서열번호 39 및 서열번호 40 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-82에 특이적인 서열번호 41 및 서열번호 42 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-6에 특이적인 서열번호 43 및 서열번호 44 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-11에 특이적인 서열번호 45 및 서열번호 46 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-34에 특이적인 서열번호 47 및 서열번호 48 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-40에 특이적인 서열번호 49 및 서열번호 50 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-42에 특이적인 서열번호 51 및 서열번호 52 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-43에 특이적인 서열번호 53 및 서열번호 54 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-44에 특이적인 서열번호 55 및 서열번호 56 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-54에 특이적인 서열번호 57 및 서열번호 58 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-61에 특이적인 서열번호 59 및 서열번호 60 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-62에 특이적인 서열번호 61 및 서열번호 62 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-81에 특이적인 서열번호 63 및 서열번호 64 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
HPV-83에 특이적인 서열번호 65 및 서열번호 66 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 및
HPV-90에 특이적인 서열번호 67 및 서열번호 68 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.

제 1항에 있어서,
상기 제 1단계의 PCR 증폭은 Cy3-dCTP, dATP, dGTP 및 dTTP를 포함하는 혼합물을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.

제 1항에 있어서,
상기 제 1단계의 PCR 증폭의 어닐링(annealing) 온도는 67℃인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.

제 1항에 있어서,
상기 제 1단계의 PCR 증폭의 프라이머 농도는 0.02 내지 0.03M인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.

제 1항에 있어서,
상기 제 1단계의 PCR 증폭은 내부 대조군으로서 GAPDH 유전자 증폭용 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.

제 6항에 있어서,
상기 GAPDH 유전자 증폭용 프라이머는 서열번호 69 및 서열번호 70 또는 이들 각각의 상보적 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.

제 1항에 있어서,
상기 제 3단계는 단일 가닥의 E6/E7 유전자 산물을 E6/E7 유전자 유전형 검출용 프로브와 교잡(hybridization) 반응시키고, 형광물질이 부착된 결합제를 반응시킨 후, 형광값을 측정하는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.

제 1항에 있어서,
상기 제 3단계의 프로브는 E6/E7 유전자 유형 특이적인 부위와 교잡 반응하는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.

제 1항에 있어서,
상기 제 3단계의 프로브는 서열번호 71 또는 서열번호 72로 이루어지는 HPV-16에 특이적인 프로브;
서열번호 73 또는 서열번호 74로 이루어지는 HPV-18에 특이적인 프로브;
서열번호 75 또는 서열번호 76으로 이루어지는 HPV-26에 특이적인 프로브;
서열번호 77 또는 서열번호 78로 이루어지는 HPV-30에 특이적인 프로브;
서열번호 79 또는 서열번호 80으로 이루어지는 HPV-31에 특이적인 프로브;
서열번호 81 또는 서열번호 82로 이루어지는 HPV-33에 특이적인 프로브;
서열번호 83 또는 서열번호 84로 이루어지는 HPV-35에 특이적인 프로브;
서열번호 85 또는 서열번호 86으로 이루어지는 HPV-39에 특이적인 프로브;
서열번호 87 또는 서열번호 88로 이루어지는 HPV-45에 특이적인 프로브;
서열번호 89 또는 서열번호 90으로 이루어지는 HPV-51에 특이적인 프로브;
서열번호 91 또는 서열번호 92로 이루어지는 HPV-52에 특이적인 프로브;
서열번호 93 또는 서열번호 94로 이루어지는 HPV-53에 특이적인 프로브;
서열번호 95 또는 서열번호 96으로 이루어지는 HPV-56에 특이적인 프로브;
서열번호 97 또는 서열번호 98로 이루어지는 HPV-58에 특이적인 프로브;
서열번호 99 또는 서열번호 100으로 이루어지는 HPV-59에 특이적인 프로브;
서열번호 101 또는 서열번호 102로 이루어지는 HPV-66에 특이적인 프로브;
서열번호 103 또는 서열번호 104로 이루어지는 HPV-67에 특이적인 프로브;
서열번호 105 또는 서열번호 106으로 이루어지는 HPV-68에 특이적인 프로브;
서열번호 107 또는 서열번호 108로 이루어지는 HPV-70에 특이적인 프로브;
서열번호 109 또는 서열번호 110으로 이루어지는 HPV-73에 특이적인 프로브;
서열번호 111 또는 서열번호 112로 이루어지는 HPV-82에 특이적인 프로브;
서열번호 113 또는 서열번호 114로 이루어지는 HPV-6에 특이적인 프로브;
서열번호 115 또는 서열번호 116으로 이루어지는 HPV-11에 특이적인 프로브;
서열번호 117 또는 서열번호 118로 이루어지는 HPV-34에 특이적인 프로브;
서열번호 119 또는 서열번호 120으로 이루어지는 HPV-40에 특이적인 프로브;
서열번호 121 또는 서열번호 122로 이루어지는 HPV-42에 특이적인 프로브;
서열번호 123 또는 서열번호 124로 이루어지는 HPV-43에 특이적인 프로브;
서열번호 125 또는 서열번호 126으로 이루어지는 HPV-44에 특이적인 프로브;
서열번호 127 또는 서열번호 128로 이루어지는 HPV-54에 특이적인 프로브;
서열번호 129 또는 서열번호 130으로 이루어지는 HPV-61에 특이적인 프로브;
서열번호 131 또는 서열번호 132로 이루어지는 HPV-62에 특이적인 프로브;
서열번호 133 또는 서열번호 134로 이루어지는 HPV-81에 특이적인 프로브;
서열번호 135 또는 서열번호 136으로 이루어지는 HPV-83에 특이적인 프로브; 및
서열번호 137 또는 서열번호 138로 이루어지는 HPV-90에 특이적인 프로브로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.

제 1항에 있어서,
상기 제 3단계의 프로브는 비드에 결합된 형태인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.

제 8항에 있어서,
상기 형광물질이 부착된 결합제는 Streptavidin-Cy3 또는 Streptavidin- Phycoerythrin인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.

제 8항에 있어서,
상기 교잡 반응의 온도는 35 내지 38℃인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.

제 8항에 있어서,
상기 교잡 반응을 위한 E6/E7 유전자 증폭 산물은 10 내지 30μl인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.

제 8항에 있어서,
상기 교잡 반응은 내부 대조군으로서 GAPDH 유전자 검출용인 서열번호 139 또는 서열번호 140으로 표시되는 프로브를 사용하는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 검출 및 유전형 확인 방법.

1) 분석하고자 하는 시료로부터, 34종의 인유두종바이러스(HPV) E6/E7 유전자 스크리닝을 위한 특이 프라이머 및 GAPDH 유전자 증폭용 프라이머를 사용하여 HPV 유전자 및 GAPDH 유전자를 PCR 증폭하는 제 1단계;
2) 제 1단계에서 증폭된 이중 가닥의 유전자 산물을 열 변성을 통해 단일 가닥 유전자 산물을 수득하는 제 2단계; 및
3) 제 2단계에서 수득된 단일 가닥의 유전자 산물을 34종 각각의 유전형에 특이적인 프로브 및 GAPDH 프로브를 사용하여 E6/E7 유전자의 유전형을 확인하는 제 3단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 감염 여부 및 감염된 유전형의 진단을 위한 정보 제공 방법.

1) 인유두종바이러스가 감염된 개체에 치료 후보 물질을 투여하는 단계; 및
2) 상기 개체로부터 DNA을 분리하여 상기 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 방법으로 인유두종바이러스를 검출하고, 유전형을 확인하는 단계를 포함하는 자궁경부암 치료제의 스크리닝 방법.

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