KR20210023201A - 구강암 조기진단용 dna 키트와 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 구강암 관련 바이오마커 10종을 한 번의 반응으로 확인하여 조기진단에 활용할 수 있는 등온증폭반응 키트와 유전자칩 진단키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 구강암 유발에 관련이 높은 고위험군 바이오마커 HPV type 16, type 31, type 33, type 35, type 52 및 type 58과 저위험군 바이오마커 HPV type 6, type 11, HSV type 1 및 type 2의 유전자를 한 번의 반응으로 등온증폭하고 이를 다시 프로브가 집적된 유전자칩 기술을 이용하여 하나의 멤브레인 유전자칩으로 육안으로 손쉽게 바이오마커를 확인할 수 있는 기술로서 구강암의 조기진단과 위험도를 진단하는데 도움이 되는 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물 및 방법을 이용하여 등온증폭반응과 멤브레인 유전자칩을 수행하는 경우 한번의 유전자증폭 반응 및 유전자칩 형광반응을 통해 구강암 관련 HPV 및 HSV type을 신속 정확하게 검출할 수 있으므로, 높은 신뢰성으로 용이하게 임상진단을 할 수 있다.

Description

구강암 조기진단용 DNA 키트와 이의 용도{DNA kit for early diagnosis of oral cancer and its use}
본 발명은 구강암 관련 바이오마커 10종을 한 번의 반응으로 확인하여 조기진단에 활용할 수 있는 등온증폭반응 키트와 유전자칩 진단키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 구강암 유발에 관련이 높은 고위험군 바이오마커 HPV type 16, type 31, type 33, type 35, type 52 및 type 58과 저위험군 바이오마커 HPV type 6, type 11, HSV type 1 및 type 2의 유전자를 한 번의 반응으로 등온증폭하고 이를 다시 프로브가 집적된 유전자칩 기술을 이용하여 하나의 멤브레인 유전자칩으로 육안으로 손쉽게 바이오마커를 확인할 수 있는 기술로서 구강암의 조기진단과 위험도를 진단하는데 도움이 되는 진단 키트에 관한 것이다.
구강암은 입 안에 발생하는 악성종양으로 편평상피세포암, 소타액선암, 육종, 림프종, 흑색종 등이 있으며 이중 구강내 평편상피세포암이 약 90%로 가장 높은 발병률을 보인다. 세계보건기구에 따르면 매년 전세계적으로 60만명 이상의 구강암 환자가 발생하고 있으며 30만명에 달하는 사망자가 나오고 있다.
대한민국 건강보험심사평가원(HIRA)에 의하면 2013년 한해 약 24,000명 이상의 환자가 구강암 치료를 받았으며, 현재 대다수의 환자들은 시각 테스트 및 증상을 통해 해당 질병의 여부가 확인되고 있으나 조기진단이 어려워 초기에 발견하기 어렵다. 구강암은 발병 후 5년 안에 40% 정도가 사망할 정도로 치명적인 암이며 초기증상이 뚜렷하지 않아 조기진단이 어려우며, 조기진단으로 초기에 발견할 경우 80% 이상의 치료율을 기대할 수 있다.
20년 전까지 구강암의 최대 유발 요인은 흡연과 음주이었으나, 구강성교가 원인으로 추정되는 구강암 발병 환자가 최근 10년 사이에 급속도로 증가하고 있으며 그 원인은 자궁경부암의 원인으로 밝혀진 인유두종바이러스로 확인되었다. 헤르페스 바이러스는 입 주변의 단순포진과 입안의 구강염 발생과 관련이 있으며, 구강암 발생율이 높아진다는 연구결과가 보고되고 있다. 인유두종바이러스로 인한 암환자는 화학적 치료 및 방사선 치료 효율이 좋고 암의 전이와 재발율이 낮은 특성을 보이며 바이러스 음성 암환자와는 다른 임상적 양상을 보이기 때문에 구강암의 새로운 원인 인자로 인식되는 주요 미생물에 대한 진단으로써 산업적 활용 기대가 증가되고 있다.
본 발명의 진단키트는 상기의 설명과 같이 조기진단의 필요성이 높고 치료와 관리 방법에 대한 새로운 원인 인자로 인식되는 구강암 관련 바이오마커 유전자의 진단에 도움을 주며 분자진단 분야의 특성상 신속 정확한 검사법으로서 제공될 수 있고 산업적 활용도 또한 높은 발명이라 할 수 있다.
이에 본 발명자는 구강암의 조기진단에 활용되는 구강암 관련 고위험군 HPV type 16, type 31, type 33, type 35, type 52 및 type 58과 저위험군 HPV type 6, type 11, HSV type 1 및 type 2의 유전자를 확인하기 위해 유전자 정보를 기반으로 등온증폭반응용 프라이머쌍과 유전자칩용 프로브를 설계하였고, 상기 프라이머, 프로브 및 이를 포함하는 조성물 또는 키트를 이용하여 등온증폭반응 및 유전자칩 hybridization 반응을 실시함으로써 구강암 관련 바이오마커 유전자를 신속하고 용이하게 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 22의 프라이머 세트를 포함하는 등온증폭반응 키트 및 서열번호 23 내지 32의 프로브를 포함하는 유전자칩으로 구강암 관련 바이오마커 유전자를 진단하는 조성물을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 22의 프라이머 세트를 포함하는 등온증폭반응 키트 및 서열번호 23 내지 32의 프로브를 포함하는 유전자칩으로 구강암 관련 바이오마커 유전자를 진단하는 구강암 조기진단 분석용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 (a) 임상시료로부터 인체 유전자를 추출하는 단계; (b) 상기 얻어진 유전자를 서열번호 1 내지 22의 프라이머 세트를 이용하여 구강암 관련 바이오마커 유전자를 등온증폭하는 단계; 및 (c) 상기 얻어진 유전자 증폭 산물을 서열번호 23 내지 32의 프로브가 포함된 유전자칩을 이용하여 DNA 교잡반응(DNA hybridization)을 수행하는 단계를 포함하는 구강암 관련 바이오마커의 유전자 확인 및 구강암 조기진단과 발생위험에 연관된 고위험도 및 저위험도 바이오마커의 유·무를 확인하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 서열번호 1 내지 22의 프라이머 세트를 포함하는 등온증폭반응 키트 및 서열번호 23 내지 32의 프로브를 포함하는 유전자칩으로 구강암 관련 바이오마커 유전자를 진단하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 서열번호 1 내지 22의 프라이머 세트를 포함하는 등온증폭반응 키트 및 서열번호 23 내지 32의 프로브를 포함하는 유전자칩으로 구강암 관련 바이오마커 유전자를 진단하는 구강암 조기진단 분석용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 (a) 임상시료로부터 인체 유전자를 추출하는 단계; (b) 상기 얻어진 유전자를 서열번호 1 내지 22의 프라이머 세트를 이용하여 구강암 관련 바이오마커 유전자를 등온증폭하는 단계; 및 (c) 상기 얻어진 유전자 증폭 산물을 서열번호 23 내지 32의 프로브가 포함된 유전자칩을 이용하여 DNA 교잡반응(DNA hybridization)을 수행하는 단계를 포함하는 구강암 관련 바이오마커의 유전자 확인 및 구강암 조기진단과 발생위험에 연관된 고위험도 및 저위험도 바이오마커의 유·무를 확인하는 방법을 제공한다.
상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명에 따른 조성물 및 방법을 이용하여 등온증폭반응과 멤브레인 유전자칩을 수행하는 경우 한번의 유전자증폭 반응 및 유전자칩 형광반응을 통해 구강암 관련 HPV 및 HSV type을 신속 정확하게 검출할 수 있으므로, 높은 신뢰성으로 용이하게 임상진단을 할 수 있다.
도 1은 HPV type 6, type 11, type 16, type 31, type 33, type 35, type 52, type 58, HSV type 1 및 type 2에 대한 100pg/ul 농도의 표준물질을 등온증폭반응 및 멤브레인 유전자칩 반응을 시킨 후 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 멤브레인 유전자칩에 위치한 각 타입별 프로브가 고정된 위치를 도표로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 조성물을 이용한 임상시료에서의 등온증폭반응 및 멤브레인 유전자칩 반응을 이용한 임상시료별 형광 반응을 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험준비>
1. 프라이머 및 프로브의 제작
본 발명에서 사용하는 프라이머와 프로브는 미국립보건원 산하 NCBI에서 운영하는 유전자 은행(www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록되어 있는 Nucleotide에서 검색된 염기서열을 Hitachi 소프트웨어사의 DNAsis프로그램을 이용하여 분석한 다음 그 염기서열을 결정하고, 이를 다시 BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)로 분석하여 ApoE 유전자의 SNP에 대하여 각각 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 염기서열임을 확인하였다.
구강암 관련 바이오마커 유전자 염기서열의 특이적 프라이머
명칭 염기서열(5'→3') 증폭가능 type 서열번호 결합
온도
HOF01 gctcagggacataacaatgg HPV6, 11 1 56.1
HOF02 gcacaaggtcataataatgg HPV 33, 35, 38 2 52.0
HOF03 gctcagggccacaataatgg HPV 16, 31, 52 3 58.1
SVOF agcgccgtcagcgaggat HSV1, 2 4 60.0
HOR01 ccaaagttccagtcctccaaaac HPV6, 11 5 58.6
HOR02 ccaaaattccaatcctccaaaat HPV 33, 35, 38 6 53.3
HOR03 ccaaattgccagtcctctaaaat HPV 16, 31, 52 7 55.1
SVOR ccgtgccacccggcgat HSV1, 2 8 62.3
H06IF tgtatgtggaagatgtagttacggattttttttgttactgtggtagataccacacgcagtac HPV6 9 63.4
H11IF ttagtgtatgtagcagatttagacacatttttttgttactgtggtagataccacacgcagtac HPV11 10 63.4
H16IF tctgaagtagatatggcagcacataattttttttgttactgttgttgatactacacgcagtac HPV16 11 60.9
H31IF gtatcactgtttgcaattgcagctttttttgttactgtggtagataccacacgtagtac HPV31 12 62.1
H33IF tgtactgtcactagttacttgtgtgtttttttgttactgtggtagataccactcgcagtac HPV33 13 63.4
H35IF tgtactgtcactagttacttgtgtgtttttttgttactgtagttgatacaacccgtagtac HPV35 14 60.9
H52IF tatatgtgctttcctttttaacctcatttttttgtcacagttgtggataccactcgtagcac HPV52 15 64.7
H58IF gtaccttccttagttacttcagtgtttttttgttaccgtggttgataccactcgtagcac HPV58 16 64.7
SVIF tccgtccagtcgtttatcttcacttttttcctgatgcacgccccc HSV1,2 17 60.0
HIRB1635 biotin-gaRgaatatgatttacagtttatttttcattttttcatagtatgtatRtatgtcataacRtctgc HPV16, 35 18 58.0
HIRB0611 biotin-gaRgagtatgatttacagtttatttttcattttttcattgtgtgtatataggccatKacttcWgc HPV6, 11 19 61.5
HIRB3152 biotin-gaggaatttgatttacaatttatatttcatttttccatcctgtgaatRtatgtcatWaYRtcWgc HPV31, 52 20 61.5
HIRB3358 biotin-gaagaatatgacctacagtttgtttttcatttttccatagcatgWatatatgtcatWaYYtctgc HPV33, 58 21 59.6
SVIRB biotin-aggcctaccaRcagggttttgcgacggtgcgctggtt HSV1,2 22 59.9
구강암 관련 바이오마커 유전자 염기서열의 특이적 프로브
명칭 염기서열(5'→3') type 서열
번호 		결합 온도
H06AP Amine-atccgtaactacatcttccacataca HPV6 23 57.4
H11AP Amine-atctgtgtctaaatctgctacatacactaa HPV11 24 58.0
H16AP Amine-tatgtcattatgtgctgccatatctacttcagaa HPV16 25 60.9
H31AP Amine-gctgcaattgcaaacagtgatac HPV31 26 56.8
H33AP Amine-tgcacacaagtaactagtgacagtaca HPV33 27 59.1
H35AP Amine-gttctgctgtgtcttctagtgacagta HPV35 28 60.6
H52AP Amine-tgaggttaaaaaggaaagcacatata HPV52 29 54.3
H58AP Amine-tgcactgaagtaactaaggaaggtac HPV58 30 59.0
HS1AP Amine-aagggctcctgtaagtacgccc HSV1 31 62.2
HSV2AP Amine-cgcgcctcctgcaagtacg HSV2 32 62.2
2. 프라이머의 합성
실시예 1에서 분석한 프라이머는 molecular cloning 3판(sambrook과 rusell, cold spring harborlaboratory press, New York, USA, 2001년)의 10.42에 기술된 올리고뉴클레오타이드 합성과 같은 방법을 이용하여 바이오니아사(bioneer, 한국)에 의뢰하여 합성하였다.
3. 표준물질의 준비
표준물질은 식품의약품안전평가원 산하 의료기기연구과에서 관리하는 체외진단용의료기기 국가표준품 중 인유두종바이러스(HPV) L1 DNA(코드번호 08/023)을 구입하여, 최초 type별 농도 1ng/ul부터 시작하여 10배씩 희석하여 제조하였다. 특이도용 음성표준물질은 KCTC(한국생명공학연구원 생물자원센터)에서 분양받은 미생물에서 DNA를 분리한 후, NanoDrop 2000 (Thermo Scientific co., USA) spectrophotometer를 이용하여 100pg/ul 농도로 제조하였다. HSV type1과 type2의 표준물질은 코스모진텍사(cosmogenetech, 한국)에 의뢰하여 305bp 유전자를 각각 합성 의뢰한 후 클로닝을 하여 제공받았으며 ExprepTM Plasmid SV DNA 추출 키트(진올바이오테크놀러지, 한국)를 이용하여 제조회사의 지시에 따라 plasmid DNA를 추출하였다. 추출한 plasmid DNA는 NanoDrop 2000 (Thermo Scientific co., USA) spectrophotometer를 이용하여 측정하였으며, 초기 DNA 농도를 1ng/ul로 희석한 후, 10배씩 순차희석(serial dilution) 하였다.
4. 임상샘플의 DNA의 추출
임상샘플에서 ExgeneTM Clinic SV 추출 키트(진올바이오테크놀러지, 한국)를 이용하여 제조회사의 지시에 따라 유전체 DNA를 추출하였다. 추출한 유전체 DNA는 곧바로 -20℃에 보관하였으며, 등온증폭반응 실험하기 이전에 녹여서 바로 사용하였다.
<실시예 1>
진단키트의 특이도 확인
상기 실험준비 단계에서 제작한 서열번호 1 내지 22의 프라이머로 조성된 등온증폭반응 키트와 서열번호 23 내지 32의 프로브로 조성된 유전자칩 키트가 HPV type 6, type 11, type 16, type 31, type 33, type 35, type 52, type 58, HSV type 1 및 type 2에 대해서 특이성을 보이는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 진행하였다.
진단키트 특이도 검증에 사용된 등온증폭 반응용액은 2ul(100pg/ul)의 표준물질 DNA, 0.6ul(10pmol/ul) 씩의 서열번호 1 내지 8의 프라이머, 0.28ul(100pmol/ul) 씩의 서열번호 9 내지 22의 프라이머, 1ul(8 unit)의 Bst DNA polymerase(enzynomics, 한국), 2ul(10X 농도)의 Bst DNA polymerase reaction buffer(enzynomics, 한국), 오염 방지를 위한 0.1ul(0.1 unit)의 SolGentTM Uracil-DNA Glycosylase(Solgent co., 한국), 2ul(dATP, dCTP, dGTP 각각 2mM과 dUTP 6mM)의 dNTP(Solgent co., 한국) 혼합액에 DNase, RNase free water(Sigma-Aldrich co., USA)를 넣어 총 반응용액이 20ul가 되도록 하였다. 등온증폭반응은 Peltier thermal cycler(Model PTC-100 DNA EngineTM, MJ Research Inc., USA) 기기를 사용하여 5880℃에서 30분간 등온증폭 단계를 거치고, 95℃에서 5분간 효소 불활성화 반응을 거친 후, 마지막으로 20℃ 5분간 반응시켰다. 증폭된 반응산물 10ul를 각각 교잡반응용액(SSC buffer based) 40ul와 혼합하여 멤브레인 유전자칩에 63℃에서 10분간 반응시켰으며, 이후 gold-streptavidin 용액 3ul와 교잡반응용액 30ul를 섞은 용액을 다시 멤브레인 유전자칩에 63℃ 10분간 반응시킴으로써 육안으로 유전자칩에 나타난 형광 반응을 확인하여 진단키트의 특이도를 확인하였다.
이에 대한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
하기 표 3에 나타낸 바와 같이, HPV type 6, type 11, type 16, type 31, type 33, type 35, type 52, type 58, HSV type 1 및 type 2에 대한 표준물질 DNA 가 진단키트 유전자칩 각각에 해당하는 형광반응 결과를 확인하였으며 음성표준물질인 Streptococcus mutans(Smu), Streptococcus mitis(Smi), Streptococcus sobrinus(Ss), Fusobacterium nucleatum(Fn) 및 증류수(D.W)에는 어떠한 반응도 나타내지 않아 그 특이도가 매우 우수함을 확인할 수 있었다.
설계한 프라이머 세트 및 유전자칩 키트 내 교차반응 특이도 확인
표준물질
100pg/ul 		유전자칩 결과
type 6 type 11 type 16 type 31 type 33 type 35 type 52 type 58 HSV1 HSV2
HPV6 + - - - - - - - - -
HPV11 - + - - - - - - - -
HPV16 - - + - - - - - - -
HPV31 - - - + - - - - - -
HPV33 - - - - + - - - - -
HPV35 - - - - - + - - - -
HPV52 - - - - - - + - - -
HPV58 - - - - - - - + - -
HSV1 - - - - - - - - + -
HSV2 - - - - - - - - - +
Smu - - - - - - - - - -
Smi - - - - - - - - - -
Ss - - - - - - - - - -
Fn - - - - - - - - - -
D.W - - - - - - - - - -
<실시예 2>
진단키트 검출 민감도 평가
진단키트의 검출 민감도를 확인하기 위해 HPV type 6, type 11, type 16, type 31, type 33, type 35, type 52, type 58, HSV type 1 및 type 2에 대한 표준물질 DNA를 각각 500 ag/ul(100 copy/ul) 및 50 ag/ul(10 copy/ul)로 희석한 후, 각각의 표준물질 2ul와 0.6ul(10pmol/ul) 씩의 서열번호 1 내지 8의 프라이머, 0.28ul(100pmol/ul) 씩의 서열번호 9 내지 22의 프라이머, 1ul(8 unit)의 Bst DNA polymerase(enzynomics, 한국), 2ul(10X 농도)의 Bst DNA polymerase reaction buffer(enzynomics, 한국), 오염 방지를 위한 0.1ul(0.1 unit)의 SolGentTM Uracil-DNA Glycosylase(Solgent co., 한국), 2ul(dATP, dCTP, dGTP 각각 2mM과 dUTP 6mM)의 dNTP(Solgent co., 한국) 혼합액에 DNase, RNase free water(Sigma-Aldrich co., USA)를 넣어 총 반응용액이 20ul가 되도록 하였다. 등온증폭반응은 Peltier thermal cycler(Model PTC-100 DNA EngineTM, MJ Research Inc., USA) 기기를 사용하여 5880℃에서 30분간 등온증폭 단계를 거치고, 95℃에서 5분간 효소 불활성화 반응을 거친 후, 마지막으로 20℃ 5분간 반응시켰다. 증폭된 반응산물 10ul를 각각 교잡반응용액 40ul와 혼합하여 멤브레인 유전자칩에 63℃에서 10분간 반응시켰으며, 이후 gold-streptavidin 용액 3ul와 교잡반응용액 30ul를 섞은 용액을 다시 멤브레인 유전자칩에 63℃ 10분간 반응시킴으로써 육안으로 유전자칩에 나타난 형광 반응을 확인하여 진단키트의 민감도를 확인하였다.
진단키트의 검출 민감도
표준물질 유전자칩 결과
type 6 type 11 type 16 type 31 type 33 type 35 type 52 type 58 HSV1 HSV2
HPV6 500a + - - - - - - - - -
50a + - - - - - - - - -
HPV11 500a - + - - - - - - - -
50a - + - - - - - - - -
HPV16 500a - - + - - - - - - -
50a - - + - - - - - - -
HPV31 500a - - - + - - - - - -
50a - - - + - - - - - -
HPV33 500a - - - - + - - - - -
50a - - - - + - - - - -
HPV35 500a - - - - - + - - - -
50a - - - - - + - - - -
HPV52 500a - - - - - - + - - -
50a - - - - - - + - - -
HPV58 500a - - - - - - - + - -
50a - - - - - - - + - -
HSV1 500a - - - - - - - - + -
50a - - - - - - - - + -
HSV2 500a - - - - - - - - - +
50a - - - - - - - - - -
상기와 같은 결과들을 통해, 본 발명으로 설계된 진단키트에 의해 HPV type 6, type 11, type 16, type 31, type 33, type 35, type 52, type 58 및 HSV type 1 표준물질 DNA를 50 ag/ul 까지 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었으며, HSV type 2 표준물질 DNA는 500 ag/ul 까지 특이적으로 검출할 수 있었다. 또한 표준물질 1ng/ul가 2×108 copy/ul인 점을 고려하면, 본 발명에 의한 검출 민감도는 HSV type 2의 경우 100 copy/ul 이며 이외 나머지 type들은 모두 10 copy/ul 임을 확인하였다.
<실시예 3>
진단키트의 임상샘플 적용
서열번호 1 내지 22의 프라이머 세트로 구성된 본 발명의 조성물을 이용하여 등온증폭반응을 수행한 이후 멤브레인 유전자칩 반응을 수행하였을 때, 임상샘플 내에서도 목적하는 바이오마커 유전자를 정확하게 구분하고 분석할 수 있는지의 여부를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 진행하였다.
임상샘플에서 DNA를 추출하고 -20℃에서 보관 후 실험시작 전에 녹여서 준비시켰다. 등온증폭반응 용액은 임상샘플 DNA 2ul와 0.6ul(10pmol/ul) 씩의 서열번호 1 내지 8의 프라이머, 0.28ul(100pmol/ul) 씩의 서열번호 9 내지 22의 프라이머, 1ul(8 unit)의 Bst DNA polymerase(enzynomics, 한국), 2ul(10X 농도)의 Bst DNA polymerase reaction buffer(enzynomics, 한국), 오염 방지를 위한 0.1ul(0.1 unit)의 SolGentTM Uracil-DNA Glycosylase(Solgent co., 한국), 2ul(dATP, dCTP, dGTP 각각 2mM과 dUTP 6mM)의 dNTP(Solgent co., 한국) 혼합액에 DNase, RNase free water(Sigma-Aldrich co., USA)를 넣어 총 반응용액이 20ul가 되도록 하였다. 등온증폭반응은 Peltier thermal cycler(Model PTC-100 DNA EngineTM, MJ Research Inc., USA) 기기를 사용하여 5880℃에서 30분간 등온증폭 단계를 거치고, 95℃에서 5분간 효소 불활성화 반응을 거친 후, 마지막으로 20℃ 5분간 반응시켰다. 증폭된 반응산물 10ul를 각각 교잡반응용액(SSC buffer based) 40ul와 혼합하여 멤브레인 유전자칩에 63℃에서 10분간 반응시켰으며, 이후 gold-streptavidin 용액 3ul와 교잡반응용액 30ul를 섞은 용액을 다시 멤브레인 유전자칩에 63℃ 10분간 반응시킴으로써 육안으로 유전자칩에 나타난 형광 반응을 확인하였다.
이에 대한 결과를 도 3 및 하기 표 5에 나타내었다.
진단키트를 이용한 임상샘플에 대한 분석 결과
임상샘플번호 유전자칩 결과 위험도 분류
1 HPV type 16 고위험군
2 HPV type 11, type 31 저위험군, 고위험군
3 HPV type 31 고위험군
4 음성 음성
5 HPV type 33, type 35, type 58 고위험군
도 3 및 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 임상샘플에서도 구강암 관련 바이오마커의 유전자 분석이 가능하였다.
본 발명에 따른 조성물 및 방법을 이용하여 등온증폭반응과 멤브레인 유전자칩을 수행하는 경우 한번의 유전자증폭 반응 및 유전자칩 형광반응을 통해 구강암 관련 HPV 및 HSV type을 신속 정확하게 검출할 수 있으므로, 높은 신뢰성으로 용이하게 임상진단을 할 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.
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Artificial Sequence <220> <223> H06IF <400> 9 tgtatgtgga agatgtagtt acggattttt tttgttactg tggtagatac cacacgcagt 60 ac 62 <210> 10 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H11IF <400> 10 ttagtgtatg tagcagattt agacacattt ttttgttact gtggtagata ccacacgcag 60 tac 63 <210> 11 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H16IF <400> 11 tctgaagtag atatggcagc acataatttt ttttgttact gttgttgata ctacacgcag 60 tac 63 <210> 12 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H31IF <400> 12 gtatcactgt ttgcaattgc agcttttttt gttactgtgg tagataccac acgtagtac 59 <210> 13 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H33IF <400> 13 tgtactgtca ctagttactt gtgtgttttt ttgttactgt ggtagatacc actcgcagta 60 c 61 <210> 14 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H35IF <400> 14 tgtactgtca ctagttactt gtgtgttttt ttgttactgt agttgataca acccgtagta 60 c 61 <210> 15 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H52IF <400> 15 tatatgtgct ttccttttta 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23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H06AP <400> 23 atccgtaact acatcttcca cataca 26 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H11AP <400> 24 atctgtgtct aaatctgcta catacactaa 30 <210> 25 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H16AP <400> 25 tatgtcatta tgtgctgcca tatctacttc agaa 34 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H31AP <400> 26 gctgcaattg caaacagtga tac 23 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H33AP <400> 27 tgcacacaag taactagtga cagtaca 27 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H35AP <400> 28 gttctgctgt gtcttctagt gacagta 27 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H52AP <400> 29 tgaggttaaa aaggaaagca catata 26 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H58AP <400> 30 tgcactgaag taactaagga aggtac 26 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HS1AP <400> 31 aagggctcct gtaagtacgc cc 22 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV2AP <400> 32 cgcgcctcct gcaagtacg 19

Claims (4)

  1. 서열번호 1 내지 22의 프라이머 세트 및 서열번호 23 내지 32의 프로브를 포함하는 HPV type 6, type 11, type 16, type 31, type 33, type 35, type 52, type 58, HSV type 1 및 type 2의 동시 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 HPV type 6, type 11, type 16, type 31, type 33, type 35, type 52, type 58, HSV type 1 및 type 2는 구강암 관련 바이오마커인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 18 내지 22 프라이머의 5'말단은 streptavidin 물질과 결합이 가능한 Biotin 기가 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 서열번호 1 내지 22의 프라이머 세트 및 서열번호 23 내지 32의 프로브를 포함하는 HPV type 6, type 11, type 16, type 31, type 33, type 35, type 52, type 58, HSV type 1 및 type 2의 동시 검출용 키트.
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