KR20180050121A - 인유두종바이러스 유전자형 검출용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 1 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 검출 프로브를 포함하는 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 인유두종바이러스(HPV)의 진단 또는 유전자형 검출을 신속하고 간편하게 수행할 수 있으며, 특히 33종의 HPV 유전자형을 한 번에 검출할 수 있다는 특징이 있다. 이에 따라 성 매개성 질환의 조기 진단이 용이하게 이루어질 수 있다.
Description
본 발명은 서열번호 1 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 검출 프로브를 포함하는 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 조성물에 관한 것이다.
인유두종바이러스(HPV; Human Papilloma Virus)는 성적 접촉에 의해 인체에 전파되는 바이러스로, 크게 두가지 이유에 의해 매우 중요한 바이러스임을 알 수 있다. 첫째, HPV 감염은 인간에서 가장 흔한 성전파성 감염(Sexually transmitted infection)이라는 것이다. 인유두종바이러스 감염은 단일 요인으로 볼때 가장 유병율이 높은 성감염으로, 전체 여성 중 80%가 일생에 한번 이상 감염되는 것으로 보고되고 있다. 이 때문에 성인 여성에서 주기적인 HPV검사는 필수적이며, 성감염 검사시 HPV 검사는 기본적으로 포함된다. 둘째, HPV는 인간의 접촉부위 상피세포에 감염이 된 후 과잉증식(hyperproliferation)을 일으킨다는 점이다. 이때의 과잉증식은 단순한 피부의 사마귀(wart)나 외성기, 항문 주위의 곤지름 혹은 첨규콘딜롬(condyloma accuminata)과 같은 양성종양인 경우가 대부분이다. 더 심해지는 경우 HPV에 의해 거의 모든 자궁경부암(uterine cervix cancer or cervical cancer), 구강암, 인두암, 후두암의 상당수, 또는 다수의 항문암(anal cancer)의 발병이 진행되는 것으로 알려져있다.
한편, HPV를 검사하면 자궁경부 및 항문 등의 암과 전암병변을 조기 진단할 수 있으며, 실제 HPV 검사는 자궁경부암 조기검진의 표준검사인 파파니콜로 도말 세포검사(Pap smear)보다 자궁경부암의 예측 민감도가 더 우수함이 밝혀지고 있고, 이에 따라 미국 FDA 등 여러 국가에서 HPV 검사가 자궁경부암 선별검사로 인정되고 있다.
HPV는 현재까지 그 아형(subtype) 내지 유전자형(genotype)에 따라 약 120여개의 형이 알려져 있고 이중 83개는 전체 유전자의 염기서열과 구조가 모두 밝혀져 있다. 40여종의 HPV는 항문과 음부, 즉 질과 자궁경부, 요도, 음경의 피부 및 점막을 침범하는 소위 항문성기형 또는 성기형 HPV(anogenital or genital type HPV)이다. HPV 감염의 대부분은 증상이 없이 잠복되어 있으나, 일부는 사마귀(wart)를 유발한다. 또 다른 일부는 고등급 편평상피내 병변(high grade squamous intraepithelial lesion, HSIL)이나 경부상피내종양(cervical intraepithelial neoplasm)과 같은 전암병변을 유발하며, 이 중 일부는 다시 암으로 진행한다. 전암병변과 암을 유발하는 HPV형을 고위험형(high risk type) HPV라고 하며, 그렇지 않은 HPV형을 저위험형(low risk type) HPV라고 한다. 연구자에 따라서는 HPV를 고위험군, 중위험군, 저위험군으로 구분하기도 한다.
고위험형 HPV로는 HPV type 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 및 82이 포함된다. 이에 대해 저위험형 HPV로는 HPV type 6, 11, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 61, 62, 72 및 81이 포함된다. 고위험으로 의심되나 아직 확립되지 않은 형(probable high risk type)으로 HPV type 26, 53, 66, 67, 69, 70 및 73이 있다. 그 외에 정확하게 분류되지 않은 기타 형으로 HPV type 7, 10, 27, 30, 32, 57, 83, 84 및 91이 있다. 전 세계적으로 자궁경부암 환자의 49.9%가 HPV 16형에, 13.7%가 HPV 18형에, 7.2%가 HPV 31, 33, 35형에, 그리고 8.4%가 HPV 45형에 감염되어 있다고 보고되고 있다.
HPV 감염은 배양이나 염색, 조직검사, 면역학적 검사로는 진단이 어렵고, 오로지 유전자검사로만 정확한 진단이 가능하다. 최근 HPV 감염 검사로 HPV의 존재 유무 뿐 아니라 그 형(type)을 함께 확인하는 소위 유전자형 분석 검사(genotyping analysis) 방법이 많이 사용되고 있다. 이의 소위 황금표준율적 검사(golden standard test)는 PCR 후 그 산물을 HPV DNA 마이크로어레이로 유전자형을 분석하는 방법이다. 다만, HPV 검사와 동시에 다양한 HPV 유형에 대하여 유전자형을 검출해낼 수 있는 조성물, 키트 및 방법에 대한 연구는 미미한 실정이다.
본 발명자들은 상기와 같은 사항을 고려하여 HPV 검사와 동시에 다양한 HPV 유전자형을 검출해내기 위한 HPV 각 유형에 특이적인 프로브를 설계하였으며, 이의 효율을 높이기 위하여 마이크로디스크를 이용하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 검출 프로브를 포함하는 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 검출 프로브를 포함하는, 인유두종 유전자형 검출용 키트 또는 마이크로디스크를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (1) 시료에 서열번호 1 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 검출 프로브를 가하여 혼성화하는 단계; (2) 혼성화 반응물을 검출하는 단계;를 포함하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 진단에 대한 정보제공방법을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 검출 프로브를 포함하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 검출 프로브를 포함하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 검출 프로브를 포함하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 마이크로디스크를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 시료에 서열번호 1 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 검출 프로브를 가하여 혼성화하는 단계; (2) 혼성화 반응물을 검출하는 단계;를 포함하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 진단에 대한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 인유두종바이러스(HPV)의 진단 또는 유전자형 검출을 신속하고 간편하게 수행할 수 있으며, 특히 33종의 HPV 유전자형을 한 번에 검출할 수 있다는 특징이 있다. 이에 따라 성 매개성 질환의 조기 진단이 용이하게 이루어질 수 있다.
도 1은 코드화된 고분자 미세입자(마이크로디스크)의 제조방법을 나타낸 공정 흐름을 나타내는 도이다.
도 2는 검출된 HPV를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 검출된 HPV를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
본 발명은 서열번호 1 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 검출 프로브를 포함하는 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에서 '검출'은 시료에서 인유두종바이러스 확인하고 동시에 유전자형을 분리하여 식별할 수 있는 것을 의미한다
본 발명은 서열번호 1 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 검출 프로브를 포함하는 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에서 '검출'은 시료에서 인유두종바이러스를 확인하고 동시에 인유두종바이러스의 유전자형을 분리하여 식별할 수 있는 것을 의미한다.
상기 인유두종바이러스 유전자형은 저위험군 및 고위험군으로 넓게 분류될 수 있으며, 유전적으로 구별되는 유형에 속하는 바이러스들은 ‘인간 파필로마바이러스’ 또는 ‘HPV’를 의미한다. ‘저위험군’ HPV 타입은 이에 제한되지 않지만, HPV11, HPV40, HPV42, HPV43, HPV44, HPV54, HPV61, HPV70, HPV72, 및 HPV81과 같은 HPV 타입을 포함한다. ‘고위험’ HPV 타입은, 이에 제한되지 않지만, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73 및 HPV82를 포함한다.
본 발명에서 '프로브(probe)'란 시료의 DNA 또는 RNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 PNA 등의 핵산 단편을 의미하며 특정 DNA 또는 RNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 본 발명의 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 PNA(single stranded PNA) 프로브, 이중쇄 PNA(double stranded PNA) 프로브 등의 형태로 제작될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 프로브는 포스포르아미다이트 고체지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
상기 검출 프로브는 인간인유두종 바이러스(HPV) 유형 중 HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV26, HPV31, HPV32, HPV33, HPV34, HPV35, HPV39, HPV40, HPV42, HPV43, HPV44, HPV45, HPV51, HPV52, HPV53, HPV54, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, HPV61, HPV62, HPV66, HPV68, HPV69, HPV70, HPV73, HPV81 및 HPV82를 표적으로 할 수 있으며, 각 프로브의 구체적인 정보는 하기와 같다.
서열번호 1은 HPV 6을 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 2는 HPV 11을 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 3은 HPV 16을 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 4는 HPV 18을 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 5는 HPV 26을 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 6은 HPV 31을 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 7은 HPV 32를 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 8은 HPV 33을 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 9는 HPV 34를 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 10은 HPV 35를 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 11은 HPV 39를 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 12는 HPV 40을 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 13은 HPV 42를 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 14는 HPV 43을 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 15는 HPV 44를 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 16은 HPV 45를 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 17은 HPV 51을 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 18은 HPV 52를 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 19는 HPV 53을 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 20은 HPV 54를 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 21은 HPV 55를 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 22는 HPV 56을 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 23은 HPV 58을 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 24은 HPV 59를 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 25는 HPV 61을 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 26은 HPV 62를 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 28은 HPV 66을 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 28은 HPV 68을 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 29는 HPV 69를 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 30은 HPV 70을 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 31은 HPV 73을 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 32는 HPV 81을 검출하기 위한 프로브(probe);
서열번호 33은 HPV 82를 검출하기 위한 프로브(probe)이다.
상기 검출 프로브의 서열은 HPV 게놈 중 L1, L2 또는 E6/E7 유전자에 대해 PCR을 수행한 후 그 산물의 염기서열을 분석하여 HPV 검출에 특이적인 서열로 구성하였다. 특히, 본 발명의 프로브 서열은 L1 유전자 영역과 상보적으로 결합할 수 있는 DNA 가닥인 것을 특징으로 하며, 이에 제한되지는 않는다.
상기 유전자형 검출시에 사용하는 시료를 얻는 추출 위치는 자궁경부 및 질의 스왑, 자궁경부의 조직, 남성 성기의 조직, 소변, 항문, 직장, 인두, 구강 및 두경부로 이루어진 군에서 선택된 곳 중 하나일 수 있고, 이들은 곤지름, 남성 성기의 암, 남성 요로의 암, 항문암, 두경부암 및 이들의 전암 세포로 이루어진 군에서 선택된 세포일 수 있으나, 본 발명의 시료의 추출부위 및 추출 세포의 유형은 이에 제한되지 않는다.
상기 검출 프로브는 마이크로디스크와 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 조성물을 제공한다.
상기 마이크로디스크는 KR 특허출원번호 제10-2013-0140211호에 개시된 코드화된 고분자 미세입자를 제작하는 방법과 유사한 방식으로 제작할 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 검출 프로브를 포함하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 키트를 제공한다.
상기 유전자형 검출용 키트는 타겟 유전자를 PCR 증폭하기 위한 프라이머를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, ‘프라이머 (primer)’란 적절한 완충용액 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 25 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
상기 프라이머는 서열번호 34 내지 55로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머를 포함할 수 있으며, 이는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 구성되어 있으며, 이에 제한되지 않는다. 각 프라이머의 구체적인 정보는 하기와 같다.
서열번호 34은 P11-1 정방향 프라이머(forward primer);
서열번호 35는 P11-2 정방향 프라이머(forward primer);
서열번호 36은 P11-3 정방향 프라이머(forward primer);
서열번호 37은 P11-4 정방향 프라이머(forward primer);
서열번호 38은 P11-5 정방향 프라이머(forward primer);
서열번호 39는 P09-6 정방향 프라이머(forward primer);
서열번호 40은 베타-G 정방향 프라이머(forward primer);
서열번호 41은 P09-1 역방향 프라이머(reverse primer);
서열번호 42는 P09-2 역방향 프라이머(reverse primer);
서열번호 43은 P09-3 역방향 프라이머(reverse primer);
서열번호 4는 P09-4 역방향 프라이머(reverse primer);
서열번호 45는 P09-5 역방향 프라이머(reverse primer);
서열번호 46은 P09-6 역방향 프라이머(reverse primer);
서열번호 47은 P09-7 역방향 프라이머(reverse primer);
서열번호 48은 P09-8 역방향 프라이머(reverse primer);
서열번호 49는 P09-9 역방향 프라이머(reverse primer);
서열번호 50은 P09-10 역방향 프라이머(reverse primer);
서열번호 51은 P09-11 역방향 프라이머(reverse primer);
서열번호 52는 P09-12 역방향 프라이머(reverse primer);
서열번호 53은 P09-13 역방향 프라이머(reverse primer);
서열번호 54는 P09-14 역방향 프라이머(reverse primer);
서열번호 55는 베타-G 역방향 프라이머(reverse primer)이다.
본 발명에서 ‘정방향(forward) 프라이머’ 및 ‘역방향(reverse) 프라이머’는 유전자 증폭반응에 의해 증폭되는 유전자의 특정 부위의 3'-말단 및 5'-말단에 각각 결합하여 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머를 의미한다.
상기 프라이머의 서열은 HPV 게놈 중 L1, L2 또는 E6/E7 유전자에 대해 PCR을 수행한 후 그 산물의 염기서열을 분석하여 HPV 검출에 필요한 시료 DNA 가닥의 증폭에 특이적인 서열로 구성하였다.
상기 프라이머는 표지수단으로 표지될 수 있으며, 상기 표지수단은 Cy3, Cy5, Cy5.5, 보디피(Bodipy), 알렉사 488(Alexa 488), 알렉사 532, 알렉사 546, 알렉사 568, 알렉사 594, 알렉사 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, 플루오르 X(Fluor X), ROX, 텍사스 레드(Texas Red), 오렌지 그린 488X(Orange green 488X), 오렌지 그린 514X, HEX, TET, JOE, 오이스터 556, 오이스터 645(Oyster 645), 보디피 630/650, 보디피 650/665, 칼플루오르 오렌지 546(Calfluor Orange 546), 칼플루오르 레드 610(calfluor red 610), 퀘이사 670(Quasar 670), 비오틴, 포스페이트, 은, 금, 폴리스티렌에서 임의로 선택할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게 본 발명의 프라이머를 구성하는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 서로 다른 표지자로 표지를 하는 것이 바람직하며, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 중 하나의 프라이머는 엑소뉴클레아제에 의해 인식되어 절단될 수 있는 표지자로 표지되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 정방향 프라이머는 포스페이트(PHOS), 역방향 프라이머는 비오틴(biotin)으로 표지할 수 있다.
또한, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 중 하나의 프라이머에 표지된 표지는 추가적으로 투여되는 표지자에 의해 검출될 수 있는 표지자인 것이 바람직하며, 예컨대 프라이머의 표지자는 비오틴일 수 있고, 이를 스트렙타아비딘으로 검출할 수 있다.
상기 키트는 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머 중 어느 하나에 표지수단이 결합된 DNA 가닥을 인식하는 엑소뉴클레아제를 포함하며, 예컨대 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머 중 어느 하나가 포스페이트로 표지된 경우에 상기 키트는 람다 엑소뉴클레아제를 포함할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 검출 프로브를 포함하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 마이크로디스크를 제공한다.
상기 마이크로디스크는 KR 특허출원번호 제10-2013-0140211호에 개시된 코드화된 고분자 미세입자를 제작하는 방법과 유사한 방식으로 제작할 수 있다.
상기 마이크로디스크는 EDC(1-에틸-(3-3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드)와 N-하이드록시설포숙시닉이미드(sulfo-NHS)를 이용한 가교 결합에 의해 실리카 표면의 카르복실 그룹과 DNA의 아미노 그룹 사이에 아마이드 결합이 형성되면서 마이크로디스크와 프로브 사이에 결합이 형성될 수 있으며, 사용되는 용매는 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 코드화된 마이크로디스크에 서열번호 1 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 검출 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하며, 마이크로디스크에 다양한 수의 검출 프로브 고정화에 의한 코드화가 가능하다.
상기 마이크로디스크는 웰(well) 안에서 비고정형태인 것을 특징으로 한다. 상기 웰은 80 내지 110개의 웰(well)을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 96개의 웰을 이용할 수 있다.
상기 웰은 코드화된 다수의 비드, 즉 플렉스(plex)를 이용할 수 있고, 예컨대 웰 당 1000 플렉스를 사용할 수 있으며, 10 플렉스 내지 800 플렉스를 사용할 수도 있으며, 10 플렉스 내지 500 플랙스를 사용할 수도 있으며, 10 플랙스 내지 200 플랙스를 사용할 수도 있다. 바람직하게는 121개의 플렉스를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 이에 따라 상기 마이크로디스크를 통하여 인유두종 바이러스의 진단 및 유전자형 검출은 빠른 속도로 수행될 수 있다.
상기 마이크로디스크의 크기는 40 μm 이상이며, 바람직하게는 40 μm 내지 80 μm인 것을 특징으로 한다.
상기 코드화된 마이크로디스크를 이용한 본 발명은 각 웰에서 형광으로 발광하는 표지자에 의하여 각 코드의 위치에 따른 HPV 유전자형에 대한 정보를 제공하므로 33종의 HPV 유전자형을 한 번에 검출할 수 있다. 이에 따라 본 발명은 종래의 발명들에 비해 현저히 빠른 속도로 HPV 진단과 동시에 HPV 유전자형 검출을 가능케한다.
상기 마이크로디스크는 DNA 칩 형태로 인유두종바이러스 진단 및 이의 유전자형을 검출하는 데 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 복수개의 인유두종바이러스 유전자형을 검출할 수 있는 형태라면 어느 형태로라도 사용될 수 있다.
본 발명은 (1) 시료에 서열번호 1 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 검출 프로브를 가하여 혼성화하는 단계; (2) 혼성화 반응물을 검출하는 단계;를 포함하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 진단에 대한 정보제공방법을 제공한다.
상기 (1) 단계의 검출 프로브는 이를 포함하는 마이크로디스크 형태일 수 있으며, 이에 따라 서열번호 1 내지 33으로 이루어진 검출 프로브로 구성된 마이크로디스크에 시료를 첨가하여 시료의 DNA와 검출 프로브를 혼성화시킬 수 있다.
상기 시료는 실시간(real-time) PCR를 이용하여 증폭한 산물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 QMAPTM(QUANTAMATRIX사)를 이용하여 증폭한 산물일 수 있다.
상기 (2) 단계의 혼성화 반응물을 검출하는 단계는 PCR 증폭에 사용된 프라이머에 표지된 표지자를 이용하여 해당 유형의 HPV를 검출할 수 있게 하며, 예컨대 프라이머에 표지된 비오틴과 스트렙타아비딘을 반응시켜 형광을 발하게 하여 해당 유형의 HPV를 검출할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
시료 내에 인간인유두종바이러스(HPV)가 존재하는 경우 형광 표지자에 의해 형광확인이 가능하며, 마이크로디스크 내에 코드화된 프로브와 결합한 검출 DNA 가닥의 형광 표지자를 판독하여 HPV 특정 유전자형을 분석하여 진단할 수 있다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. HPV 검출 프로브-결합된 마이크로디스크 제작
1-1. 코드화된 마이크로디스크(coded microdisk) 제작
HPV 검출 프로브가 결합된 마이크로디스크 제작을 위하여, 코드화된 마이크로디스크를 제작하였으며, KR 특허출원번호 제10-2013-0140211호에 개시된 방법과 유사한 방식을 이용하였다. 보다 구체적으로 우선 광경화성 물질 및 상기 광경화성 물질과 중합 가능한 작용기와 알콕시실릴기를 함께 구비한 링커로 혼합물을 만들었다. 패턴화된 에너지를 인가하여 상기 혼합물을 경화하고, 이 후에 광학적 리소그래피 방법을 적용하여 그래피컬 코드를 패터닝하는 방법으로 경화된 혼합물을 코드화함으로써 코드화된 고분자 미세입자 코어를 얻었다. 그리고 나서 코드화된 고분자 미세입자 코어에 실리카 전구체인 테트라에틸오르토실리케이트(TEOS)를 처리하여 상기 코드화된 고분자 미세입자 코어 위에 당업자에게 공지된 방법으로 실리카 쉘을 형성하였다. 도 1에서 코드화된 마이크로디스크의 제조방법을 공정흐름도로 도식화하였다.
1-2. HPV 검출 프로브-결합된 마이크로디스크 제작
HPV 검출에 특이적으로 사용할 수 있는 마이크로디스크를 제작하기 위하여, 상기 실시예 1-1에서 제조한 마이크로디스크에 HPV 검출 프로브를 결합시켰다. 구체적으로 약 200,000개의 마이크로디스크에 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 및 서열번호 1 내지 33으로 표시되는 검출 프로브(capture probe)가 각각 30 mg/ml 및 5 μM이 되도록 추가하여 100 μl이 되도록 최종 혼합물을 만들었다. 이 후에 상기 혼합물을 1시간 동안 1100 rpm으로 교반 배양(shaking incubation)을 하였다. 이 후에 마이크로디스크 각 코드별로 HPV 유형 특이적 검출 프로브를 1:1로 매칭하였다. 매칭 후에 마이크로디스크 외의 여액을 제거하고, 0.02% tween 20/PBS 버퍼로 1회 세척하였다. 다시 마이크로디스크 외 여액을 제거한 후에 0.1% SDS/PBS 버퍼로 1회 추가 세척하였다. 마이크로디스크 외 여액을 제거하는 단계를 한 번 더 거친 후, 1구배 TE 버퍼로 2회 세척한 다음, 1구배 TE 버퍼에 보관하였다.
실시예 2. HPV 검출 프로브-결합된 마이크로디스크 분석(microdisk assay) 실시
2-1. 시료로부터 DNA 추출
시료 DNA를 분리하기 위해, 자궁탈락세포에서 세포 시료를 수득하고, 시중에 판매되고 있는 qiagen DNA prep kit(https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation)를 이용하여 제조사가 제공하는 방법에 따라 DNA를 수득하였다. 보다 구체적으로, 본 실험에 사용한 DNA는 HPV 아형, 즉, HPV 06, 11, 16, 18, 26, 31, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 68, 69, 70, 73, 81, 82 각각에 감염된 사람의 자궁탈락세포로부터 얻은 세포 시료로부터 수득하였다.
2-2. PCR 실시를 통한 타겟 유전자 증폭 및 정제
마이크로디스크 분석에 앞서, 검체로부터 추출한 상기 DNA를 주형으로 PCR 반응을 통해 하기 분석에 필요한 타겟 유전자들을 증폭하였다. 우선 상기 실시예 2-1에서 추출한 DNA를 주형으로 하고, 여기에 택 중합효소(taq polymerase) 5 μl, 서열번호 34 내지 44로 표시되는 정방향 프라이머 서열 및 역방향 프라이머 서열을 혼합하였으며 최종적으로 20 μl가 되도록 멸균수를 첨가하였다. 이때 사용한 정방향 및 역방향 프라이머 혼합물에서 정방향 프라이머는 5' 말단에 포스페이트로 표지하고 역방향 프라이머는 5'에 비오틴으로 표지하였다.
그 후에 써모사이클러(thermocylcer)를 이용하여 상기 혼합물을 차례로 4분 동안 50℃, 15분 동안 95℃ 조건으로 처리한 후, 40초 동안 95℃, 1분 동안 55℃, 1분 동안 72℃ 조건의 증폭을 35 사이클 반복하였다. 반복이 끝난 후에 5분 동안 72℃ 조건을 유지한 뒤 4℃로 항온 조건을 만들어주었다. PCR 반응이 끝난 산물 20 μl에 5 μl의 람다 엑소뉴클레아제 혼합물을 첨가하여 포스페이트 표지된 가닥을 엑소뉴클레아제로 제거하여 단일가닥을 형성하였다. 이 후 분석을 실시할 DNA 가닥을 정제하고, DNA 시료를 얻었다.
2-3. HPV 검출 프로브-결합된 마이크로디스크 분석 실시
상기 실시예 2-2에서 PCR을 이용하여 증폭한 산물이 인유두종바이러스 중 어떤 유형에 속하는지 확인하기 위하여, 마이크로디스크 분석을 수행하였다. 먼저, 상기 실시예 2-2에서 수득한 PCR로 증폭된 DNA 시료를 써모사이클러(thermocylcer)를 이용하여 30분동안 37℃, 10분 동안 70℃ 조건을 만들어주었고, 이 후에 4℃로 항온 조건을 만들어주었다. 96 웰 유리 바닥 플레이트에 34개의 플렉스(plex) HPV 마이크로디스크 약 5,000개, PCR로 증폭된 DNA 시료 10 μl, 혼성화 버퍼 45 μl를 주입한다. 열 차단제(heat block)를 이용하여 30분 동안 40 ℃에서 650 rpm으로 교반 배양(shaking incubation)을 하였다. 이러한 과정을 통해 마이크로 디스크에 결합된 HPV 검출 프로브에 이와 상보적인 HPV 서열의 혼성화가 유도된다.
충분한 교반이 이루어진 후에 마이크로디스크 외 여액을 제거한 뒤, 2.5 구배 SSPE 세척 버퍼(0.1% 트윈(tween) 20)로 2회 세척한다. 50 μl의 검출 버퍼(2 μg/ml 스트렙타아비딘 피코에리트린)를 첨가하고 상온에서 10분 동안 650 rpm으로 교반 배양하였다. 이 후 마이크로디스크 외 여액을 제거한 후 세척 버퍼로 2회 세척하는 단계를 반복한다. 세척 버퍼 100 μl를 추가한 뒤에 상기 PCR 산물을 분석하였다. 마이크로디스크에 결합된 특정 HPV 유형의 검출 프로브와 상보적인 HPV 서열이 존재하는 경우, 혼성화를 통해 PCR 증폭시 사용된 프라이머에 표지된 비오틴과 스트렙타아비딘이 반응하여 해당 유형의 HPV을 검출할 수 있다. 검출된 HPV를 확인한 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2의 +, - 값은 [표 1]에 나타낸 각 형광신호의 최소검출한계 농도(LOD; limit of detection)를 기준으로, 그 이상의 신호가 검출되는 경우는 +으로, LCD 값 미만의 신호가 검출되는 경우는 -으로 표시하였다.
[표 1]
도 2에 나타낸 바와 같이, 알고 있는 각 HPV 유형에 감염된 사람으로부터 HPV 검출 및 유전자형을 파악한 결과, 특이적으로 높은 형광신호를 분석하여 각 HPV 유전자형을 검출할 수 있음을 확인하였다. 이는 본 발명을 통하여 미량의 인유두종바이러스를 검출할 수 있음과 동시에 HPV 각 유전자형에 대한 정보를 정확하게 확인할 수 있음을 나타낸다.
종합적으로, 상기 본 발명에 따른 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 조성물을 통하여 HPV 검출과 동시에 HPV 유전자형을 정확히 파악할 수 있어 각 유전자형에 따른 특이적인 치료방법을 이용한 인유두종바이러스 치료가 가능해지므로, 본 발명은 인유두종바이러스 진단 및 치료 산업에 크게 기여할 수 있음을 알 수 있다.
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<223> p09-6 reverse primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p09-9 reverse primer
<400> 49
cgaccaaggg gatattgatc 20
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p09-10 reverse primer
<400> 50
gcccaacgga aactgatc 18
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p09-11 reverse primer
<400> 51
cgacccaagg gaaactggtc 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p09-12 reverse primer
<400> 52
cgtcctaaag gaaactggtc 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p09-13 reverse primer
<400> 53
gcgacccaat gcaaattggt 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p09-14 reverse primer
<400> 54
cgccctaagg gaaactgggt 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-G reverse primer
<400> 55
taacagcatc aggagtggac 20
Claims (15)
- 서열번호 1 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 검출 프로브를 포함하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 조성물.
- 제1항에 있어서,
HPV 유전자형은 HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 26, HPV 31, HPV 32, HPV 33, HPV 34, HPV 35, HPV 39, HPV 40, HPV 42, HPV 43, HPV 44, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HPV 54, HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 61, HPV 62, HPV 66, HPV 68, HPV 69, HPV 70, HPV 73, HPV 81 및 HPV 82으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상인 것을 특징으로 하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 검출 프로브는 마이크로디스크와 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 조성물.
- 서열번호 1 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 검출 프로브를 포함하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 키트.
- 제4항에 있어서,
타겟 유전자를 PCR 증폭하기 위한 프라이머를 추가적으로 포함하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 키트.
- 제5항에 있어서,
상기 프라이머는 서열번호 34 내지 55로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머인 것을 특징으로 하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 키트.
- 제5항에 있어서,
상기 프라이머는 표지수단으로 표지된 것인, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 키트.
- 제7항에 있어서,
상기 표지수단은 Cy3, Cy5, Cy5.5, 보디피(Bodipy), 알렉사 488(Alexa 488), 알렉사 532, 알렉사 546, 알렉사 568, 알렉사 594, 알렉사 660, 로다민(Rhodamine), TAMRA, FAM, FITC, 플루오르 X(Fluor X), ROX, 텍사스 레드(Texas Red), 오렌지 그린 488X(Orange green 488X), 오렌지 그린 514X, HEX, TET, JOE, 오이스터 556, 오이스터 645(Oyster 645), 보디피 630/650, 보디피 650/665, 칼플루오르 오렌지 546(Calfluor Orange 546), 칼플루오르 레드 610(calfluor red 610), 퀘이사 670(Quasar 670), 비오틴, 포스페이트, 은, 금 및 폴리스티렌으로 이루어진 군으로부터 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 키트.
- 제7항에 있어서,
상기 표지수단이 결합된 DNA 가닥을 인식하는 엑소뉴클레아제를 포함하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 키트.
- 서열번호 1 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 검출 프로브를 포함하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 마이크로디스크.
- 제10항에 있어서,
상기 마이크로디스크는 웰(well) 안에서 비고정형태인 것을 특징으로 하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 마이크로디스크.
- 제10항에 있어서,
상기 마이크로디스크의 크기는 40 μm 내지 80 μm인 것을 특징으로 하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 검출용 마이크로디스크.
- (1) 시료에 서열번호 1 내지 33으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 검출 프로브를 가하여 혼성화하는 단계;
(2) 혼성화 반응물을 검출하는 단계;를 포함하는,
인유두종바이러스(HPV) 유전자형 진단에 대한 정보제공방법.
- 제13항에 있어서,
상기 (1) 단계의 시료는 실시간(real-time) PCR을 수행하여 증폭한 산물인 것을 특징으로 하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 진단에 대한 정보제공방법.
- 제13항에 있어서,
HPV 유전자형은 HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 26, HPV 31, HPV 32, HPV 33, HPV 34, HPV 35, HPV 39, HPV 40, HPV 42, HPV 43, HPV 44, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HPV 54, HPV 55, HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 61, HPV 62, HPV 66, HPV 68, HPV 69, HPV 70, HPV 73, HPV 81 및 HPV 82으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상인 것을 특징으로 하는, 인유두종바이러스(HPV) 유전자형 진단에 대한 정보제공방법.
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