KR20050017703A - 중합효소연쇄반응에 의한 고위험군 인유두종바이러스검출을 위한 프라이머와 검출 방법 - Google Patents

중합효소연쇄반응에 의한 고위험군 인유두종바이러스검출을 위한 프라이머와 검출 방법

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Abstract

본 발명은 중합효소연쇄반응에 의하여 자궁경부암으로 발병률이 높은 것으로 밝혀진 고위험군 HPV 유형의 DNA를 선택적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머와 상기 프라이머를 사용하여 샘플 내에 존재하는 고위험군 HPV DNA를 선택적으로 증폭시켜, 고위험군 HPV의 존재를 분석하고 상기 고위험군 HPV를 효과적으로 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의한 상기 프라이머를 포함하고 있는 HPV PCR용 키트(kit)는 종래의 방법과 비교하여 경제성, 정확성 및 효율성이 뛰어나고 간편하면서도 신속하게 고위험군 HPV DNA를 탐지할 수 있다.

Description

중합효소연쇄반응에 의한 고위험군 인유두종바이러스 검출을 위한 프라이머와 검출 방법{Primers and Method for Detecting High Risk Human Papillomavirus by PCR}
본 발명은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, 이하 "PCR"이라 한다.)에 사용할 수 있는 프라이머 및 상기 프라이머를 사용하는 증폭 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고위험군 인유두종바이러스(High Risk Human Papillomavirus)의 핵산과 상보적으로 결합되어 증폭시킬 수 있는 뉴클레오티드 및 상기 뉴클레오티드를 프라이머로 이용하여 고위험군 인유두종바이러스의 존부를 탐지할 수 있는 방법에 관한 것이다.
인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV)는 8kb의 환상의 이중나선 바이러스로서, 모든 유형의 HPV 바이러스는 유사한 성질의 단백질을 합성하는 DNA 부분인 열린해독틀(open reading frames, ORFs)을 가지며, 크게 초기 유전자(early gene)와 후기 유전자(late gene)로 구분된다. 약 4.5kb의 초기 유전자는 바이러스 DNA 복제(E1), 숙주 세포의 악성화 변형(malignant transformation)을 야기하는 단백질을 형성하는 DNA의 작용을 유발하거나 억제(E2), 숙주세포와 바이러스 성장과 관련된 단백질의 합성(E4), EGF(epidermal growth factor)와 CSF(colony stimulator factor) 수용체의 작동유발(E5), 세포의 영구생존 및 암 유전자의 활성과 암 억제인자의 비활성화 기전에 의한 악성화 변형(E7) 등으로 나눌 수 있다. 특히 HPV가 숙주의 상피세포를 감염시킨 후에 발현되는 종양원성(oncogenic) 단백질인 E6와 E7은 각각 숙주세포의 종양 억제 단백질인 p53과 pRB와 결합하여 이들 종양억제 단백질의 기능을 억제함으로써, 결과적으로 감염 세포의 형질전환에 따른 종양형성으로 발전하는 것으로 규명되고 있다.
한편, 2.5kb의 후기 유전자는 바이러스 주외피 단백질(L1)과 부외피 단백질(L2)의 합성을 담당하는 DNA와 이들의 전사와 번역 기능을 조절하는 비발현 부분(non-coding region)인 1kb 크기의 LCR(long control region)으로 이루어져 있다.
최근 분자생물학적 기법의 급속한 발전에 따라 HPV의 유전학적 구조가 밝혀지면서 많은 유형(genotype)의 HPV 게놈 염기서열이 밝혀지고 있다. HPV는 E6, E7, L1 유전자의 열린해독틀(ORF) 서열의 차이에 따라 유형이 결정되는데, 상기 ORF의 뉴클레오티드 서열이 10% 이상 다르면 새로운 유형으로 정의되고, 2%이상 10% 미만 다르면 아형(subtype)으로, 2% 미만이 다른 경우에는 변이체(variant)로 정의된다. 이와 같은 구분에 따라 현재까지 HPV는 120여종 이상의 유형이 알려져 있다.
HPV는 항문생식기암과 후두암 및 설암 등과 관련이 있을 뿐 아니라, 특히 자궁경부암(Cervical Cancer)에 있어서는 발암 개시 및 암의 필수적 유지인자로 규명되고 있다. 자궁경부암은 자궁경부에서 발생하는 악성종양으로 전체 자궁암 발생빈도의 95% 이상을 차지하고 있으며, 전 세계 여성 암 가운데 유방암 다음으로 발생빈도가 높아 해마다 약 44만 건 정도가 신규로 보고되고 있다.
그 중에서 HPV-16, -18, -26, -30, -31, -33, -34, -35, -39, -45, -51, -52, -53, -56, -58, -59, -61, -66, -67, -68, -69, -70, 및 -73과 같은 유형의 HPV는 자궁경부암으로의 진행률이 상대적으로 높은 것으로 밝혀져 있어 '고위험군(high-risk)' HPV로 분류되며, HPV -2, -3, -6, -7, -10, -11, -13, -32, -40, -42, -43, -44, -55, -54 및 -57과 같은 유형의 HPV는 자궁경부암으로의 진행률이 낮아 '저위험군(low-risk)' HPV로 분류되고 있다.
이와 같은 HPV의 감염과 자궁경부암과의 밀접한 관련성 및 자궁경부암에 의한 높은 사망률로 인하여 자궁경부암의 조기진단을 위한 방법이 모색되고 있는데, 현재까지 인정되고 있는 HPV 관련 자궁경부암 진단방법은 크게 세포학적 방법과 분자생물학적 방법으로 구분할 수 있다.
HPV 감염세포의 형태변화를 관찰하여 판별하는 세포학적 방법은 1940년대 이후 HPV 감염 여부에 대한 표준 검사법으로 시행되어 자궁경부암으로 인한 사망률을 크게 감소시키고 있다. 자궁경부암을 진단하는 세포학적 방법은 세포 병리학적으로 피검체의 세포를 양성에서 악성까지 분류하는 기준에 따라 세포진 검사(Papanicolaou[Pap] Smear) 체계, CIN(cervical intraepithelial neoplasia) 체계, 세계보건기구(World health organization, WHO) 체계 및 TBS(The bethesda system) 등으로 구분될 수 있다.
세포학적 방법은 경제성, 조작의 용이성 및 안전성 등에서 장점을 가지고 있으나, 세포의 형상에 의하여 진단하는 것이기 때문에 진단의 객관성이 낮을 뿐 아니라 높은 위음성율 때문에(15∼45%) 일관된 정확성을 갖지 못하는 것으로 지적되고 있다.
한편, 분자생물학적 방법은 크게 HPV DNA를 직접적으로 확인하는 방법과 증폭에 의한 PCR 방법으로 나눌 수 있는데, 분자생물학적 방법은 자궁경부암의 원인 바이러스 DNA를 객관적으로 검출하여 진단의 정확성을 꾀할 수 있다는 장점이 있기 때문에, 세포진 검사나 조직 검사 등에서 진단이 불명확한 경우에 자궁경부암의 병리학적 진단에 앞서 조기에 자궁경부암을 진단할 수 있다. .
HPV DNA의 직접적인 확인을 위해서 종래 HPV 유형 특이적인 탐침(probe)을 이용하는 서던 블롯팅(southern blotting), 도트 블롯(dot blotting) 및 FISH(Filter in situ hybridization)와 같은 방법이 사용되었고, 최근 하이브리드캡처 시스템(Hybrid Capture System, Digene 사)이 개발되어 널리 활용되고 있다. 하이브리드캡처는 기존의 HPV DNA 진단 방법과 비교해 정확성이 높고 고위험군/저위험군을 진단할 수 있는 장점이 있으나, 많은 양의 HPV DNA를 필요로 하기 때문에 HPV의 초기 감염 또는 적절한 시료 채취가 미흡할 경우에는 검출 한계를 나타내고 RNA 탐침을 사용하므로 안전성이 낮을 뿐 아니라, 장비가 비교적 고가이고 민감도가 떨어지는 문제점을 가지고 있다.
PCR법은 목적 병원체의 핵산 염기서열에 특이적으로 결합하는 상보적 핵산(올리고머 프라이머)을 이용하여 미량의 병원체 핵산을 증폭시켜 그 존부를 검출할 수 있는 기술로서(미합중국 특허 제 4683195호 및 제 4683202호), 상기한 세포학적 방법 및 HPV DNA 직접 검사법에 비해 정확성, 용이성 및 비용 측면에서 높은 상대적 우수성을 평가받고 있다.
현재까지 PCR에 의한 HPV 검출법에서 사용되는 프라이머는 HPV 유형에 관계없이 그 DNA를 증폭시킬 수 있는 공통 프라이머(general primer) 또는 유형 특이적인 HPV DNA만을 선택적으로 증폭시킬 수 있는 유형 특이 프라이머(type-specific primer)들이 개발되었다.
그러나 공통 프라이머를 사용하여 PCR 반응에 의하여 증폭 산물을 얻더라도 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 고위험군 HPV 유형인지 확인할 수 없기 때문에, 자궁경부암의 정확한 진행정도를 확인하기 곤란한 문제점을 갖고 있다. 다시 말하면, 모든 유형에 상보적으로 결합될 수 있는 공통 프라이머를 사용하게 되면 HPV 유형에 관계없이 일관적으로 증폭이 일어나게 되어 HPV 감염의 진행 정도 또는 자궁경부암의 전이 정도를 정확히 예측하기 곤란하기 때문에 이를 위해서는 상기 기술된 하이브리드캡처와 같은 방법을 사용하지 않으면 안되는 문제가 있다.
한편, 각각의 유형에 특이적으로 결합할 수 있는 유형 특이적 프라이머를 사용하는 경우에는 샘플 내의 HPV 존재를 확인하기 위해서 각각 다른 프라이머를 사용해야 하는 번거로움이 있다. 즉, 어떤 환자가 HPV에 감염되었음에도 불구하고 유형 특이적 프라이머와 상보적으로 결합할 수 없는 유형의 HPV에 감염된 경우에는 PCR 반응에 의해서도 증폭산물이 얻어지지 않기 때문에, 실질적으로 HPV에 감염되었음에도 불구하고 정상 환자인 것처럼 진단될 수 있고, 결국 다양한 프라이머를 동시에 사용할 수밖에 없어 임상적으로 폭넓게 활용하기에는 한계를 갖는다.
결국, PCR을 이용한 HPV DNA 증폭 여부에 따른 자궁경부암 진단의 실용적 효율성을 높이기 위해서는 자궁경부암으로의 진행률이 높은 것으로 밝혀진 고위험군 HPV 유형을 선택적으로 포괄 증폭시킴으로써, 1회의 PCR 증폭과정을 통하여 고위험군 HPV의 감염여부를 조기에 탐지하고, 고위험군 HPV에 의하여 야기되는 자궁경부암을 한번에 간단히 진단할 수 있는 프라이머 개발의 필요성이 절실히 제기되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 100여 개가 넘는 다양한 유형을 갖는 HPV 중에서 자궁경부암의 진행과 밀접한 관련이 있는 고위험군 HPV 유형의 DNA를 1회의 PCR 반응에 따른 증폭으로 검출할 수 있는 프라이머를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머를 이용하여 표적 DNA를 증폭시키고 증폭 여부에 따라 고위험군 HPV 유형의 존부를 분석할 수 있는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 신속하고 정확하며 효율적이고 경제적으로 샘플 내에 고위험군 HPV 유형의 존부를 확인할 수 있는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일관점에 따르면 고위험군 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV)를 증폭시킬 수 있는 올리고 뉴클레오티드로 구성되는 프라이머를 제공한다.
상기 올리고 뉴클레오티드는 서열번호 1과 서열번호 2로 구성되는 뉴클레오티드; 서열번호 3과 서열번호 4로 구성되는 뉴클레오티드; 및 서열번호 5와 서열번호 6으로 구성되는 뉴클레오티드로 구성되는 군중에서 선택된 적어도 1조 이상의 고위험군 HPV DNA를 증폭하는 합성된 프라이머를 제공한다.
또한 본 발명은 상기한 프라이머를 이용하여 PCR 반응에 따라 표적 DNA를 증폭시키고 증폭 여부에 따라 고위험군 HPV 유형의 존재여부를 탐지할 수 있는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기한 프라이머, dNTP, 내열성 중합효소 및 PCR 완충용액을 포함하는 특정 유형의 HPV DNA를 증폭시킬 수 있는 PCR용 키트(kit)를 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
종래의 하이브리드캡처에 의한 고위험군 HPV의 탐지는 현재까지 발견된 100 여기 이상의 HPV 유형의 수에 비하여 검출할 수 잇는 유형의 수가 적고 HPV 유형에 따라 민감도가 크게 떨어진다. 그러나 본 발명에서는 고위험군 HPV 유형을 신속, 정확하게 탐지할 수 있는 프라이머를 합성하고, 상기 프라이머에 의한 1회의 PCR 증폭을 수행함으로써 많은 고위험군 HPV 유형을 검출할 수 있었다.
상기에서 기술한 바와 같이, HPV는 현재까지 120개 이상의 유형이 밝혀졌으며, 특히 자궁경부암의 관련성에 따라서 고위험군 HPV 유형과 저위험군 HPV 유형으로 구분된다. 고위험군 HPV 유형으로는 HPV -16, -18, -26, -30, -31, -33, -34, -35, -39, -45, -51, -52, -53, -56, -58, -59, -61, -66, -67, -68, -69, -70, 및 -73 등이 있으며, 저위험군 HPV 유형으로는 HPV -2, -3, -6, -7, -10, -11, -13, -32, -40, -42, -43, -44, -55, -54 및 -57 등이 있다.
따라서, 본 발명에서는 자궁경부암으로의 진행률이 높은 고위험군 HPV 유형을 탐지할 수 있는 프라이머를 설계하고, 상기 프라이머에 의한 1회의 PCR을 수행하여 보다 많은 고위험군 HPV 유형을 검출할 수 있도록 하였다. 이를 위하여 본 발명에서는 총 72가지 HPV 유형의 전 서열 중 자궁경부암으로의 진행률이 높은 고위험군 HPV DNA 서열을 기준으로 컴퓨터 프로그램을 이용하여 고위험군에 특이적인 PCR 프라이머를 설계하였다. 상기 설계된 프라이머는 다른 컴퓨터 프로그램을 사용하여 다양한 HPV 유형에 대한 증폭도를 확인하고 그 중 최종적으로 3조의 프라이머를 선별하였다.
상기에서 선별된 프라이머는 핵산자동합성기(ExpediteTM 8909 합성기, ABI 사)를 사용하여 합성되었다. 이와 같이 합성된 프라이머는 먼저 대표적인 HPV 감염세포주인 CaSki(HPV-16) 및 HeLa(HPV-18) DNA를 표적 DNA로 하여 PCR을 실시하여 HPV 유형 특이적인 증폭을 확인하였다.
이어, 상기 3조의 프라이머와 1조의 병용 프라이머 세트를 사용하여 다양한 유형의 HPV 플라스미드(plasmid) DNA를 표적으로 하여 PCR 증폭여부를 실시해 본 결과 모두 이에 상응하는 특정 유형의 HPV DNA만을 선택적으로 증폭시킨다는 사실을 확인하였다.
더욱이 본 발명에서 확인된 프라이머를 사용하여 인체에서 수득한 샘플을 대상으로 PCR 증폭을 수행하여 증폭 여부에 따라 HPV의 감염 여부를 조기에 진단할 수 있다. 즉, 본 발명에서는 해당 임상의의 책임 하에 자궁경부 촬영진(cervicography), 조직생검(biopsy) 및 세포진도말(Pap-smear) 검사 등의 전문적 검진을 통하여 자궁경부암 관련 비정상 환자[(미세침윤암(SCC), 미확인 비정형세포(ASCUS), 저등급 병변(LSIL), 고등급 병변(HSIL)] 32명과 자궁경부암과 관련이 없는 것으로 판명된 정상인 8명을 대상으로 하이브리드캡처 Ⅱ법(hybrid captureⅡ, Digene 사)과 병행하여 PCR 실험을 수행하였다. 그 결과 본 발명에서 확인된 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행하면 상기 하이브리드 캡처Ⅱ 법 보다 많은 유형의 HPV를 검출할 수 있어 정확한 HPV 감염여부 및 조기 진단이 가능함을 확인하였다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 자세하게 설명한다.
실시예 1
본 실시예에서는 컴퓨터 시뮬레이션을 통하여 확인한 3조의 프라이머를 합성하여 각각 상기 프라이머와 1조의 병용 프라이머 세트를 이용하여 HPV-16 감염세포주인 CaSki와 HPV-18 감염세포주인 HeLa, HPV 비감염 세포주인 K562를 대상으로 PCR을 수행하였다.
(1) PCR 프라이머의 설계 및 선별
본 실시예에서는 자궁경부암의 주요 유발인자로서 고위험군 HPV DNA와 상보적으로 결합하여 상기 DNA를 포괄적으로 증폭시킬 수 있는 PCR 프라이머로서의 뉴클레오티드를 설계하였다. 우선, 미국 NCBI (National Center for Biotechnology Information)와 미 국립 로스 알라모스 HPV 데이터베이스로부터 HPV-1a, -2a, -3, -4, -5, -6b, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -15, -16, -16r, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30, -31, -32, -33, -34, -35, -35h, -36, -37, -38, -39, -40, -41, -42, -44, -45, -47, -48, -49, -50, -51, -52, -53, -54, -55, -56, -57, -58, -59, -60, -61, -63, -65, -66, -67, -68, -70, -72, -73, -75, -76, -77, -80 의 총 72가지 HPV 유형의 전 DNA 염기서열을 확보하였다. 확보한 DNA 서열을 컴퓨터 프로그램 'DNA STAR(MegAlignTM 5, DNASTAR Inc.)'를 활용하여 ClustalW 방법으로 쌍정렬(pairwise alignment) 및 다중서열정렬(multiple sequence alignment)을 실행한 후 분류계통도(Phylogenetic tree)를 작성하고 각 그룹에서 고위험군 HPV 유형을 대표하는 염기서열을 선별한 다음, 컴퓨터 프로그램 프라이머 프리미어 5(primer premier 5, PREMIER Biosoft International Co.)를 활용하여 고위험군 HPV 유형만을 증폭하는 PCR 프라이머를 설계하였다. 이때 프라이머의 길이는 27±3 및 31±2의 올리고 뉴클레오티드로 설정하였으며 PCR 산물의 크기는 대략 300bp로 제한하여 PCR 프라이머를 설계하였다.
이와 같이 설계된 프라이머 가운데 3조를 선별하여 이를 각각 AlbioHRP1, AlbioHRP2 및 AlbioHRP3로 명명하였다.
(2) 선별된 PCR 프라이머의 가상 증폭
상기 과정에서 선별된 총 3조의 프라이머를 대상으로 다른 컴퓨터 프로그램(Amplify 1.2, University of Wisconsin)을 사용하여 각각 증폭도를 확인하였다. 이를 위해서, 상기 설계 과정에서 이미 확보한 총 72가지의 다른 HPV 유형을 대상으로 가상 증폭실험을 수행하였다.
본 실시예에서는 자궁경부암과 관련된 HPV-2a, -3, -6b, -7, -10, -11, -13, -16, -18, -26, -30, -31, -32, -33, -34, -35, -39, -40, -42, -44, -45, -51, -52, -53, -54, -55, -56, -57, -58, -59, -61, -66, -67, -68, -70, -73의 36종 중 고위험군 HPV 유형을 증폭할 수 있는 것에 초점을 맞추었으며, 상기 선별된 프라이머에 따른 서열번호, 증폭유형, 증폭 산물의 크기, 증폭 위치를 예측하였으며, 이에 대한 결과는 하기 표 1에 표시하였다.
표 1. 고위험군 HPV DNA의 특이적 증폭을 위해 선별한 프라이머
프라이머 서열번호 증폭 HPV 유형 증폭산물 크기(bp)
AlbioHRP1 서열번호 1서열번호 2 16, 31, 33, 34, 35, 35H, 52, 53, 58, 59, 66, 67, 73 300-314
AlbioHRP2 서열번호 3서열번호 4 26, 30, 33, 35, 35H, 51, 52, 53, 56, 58, 66 297-312
AlbioHRP3 서열번호 5서열번호 6 18, 39, 45, 59, 68, 70 277-286
상기 표 1의 서열번호 중 홀수의 서열번호는 정방향 프라이머(forward primer)로 사용되며 짝수의 서열번호는 역방향 프라이머(reverse primer)로 사용된 것이다.
(3) 선별된 PCR 프라이머의 합성
상기 과정에서 선별된 AlbioHRP1, AlbioHRP2, AlbioHRP3 3조의 프라이머를 합성하였다. 상기 프라이머는 올리고 뉴클레오티드 포스포르아미다이트 합성화학에 근거한 고체상 합성기법을 탑재하고 있는 ExpediteTM 8909 핵산 합성기(ABI 사)를 이용하여 합성하였다.
우선, 합성반응은 올리고뉴클레오티드 3' 말단에 위치한 뉴클레오사이드를 고정시킨 CPG 컬럼에서 수행하였으며, 기본적으로 디트리틸레이션(detritylation), 커플링(coupling), 캡핑(capping), 산화(oxidation) 반응을 반복주기로 하여 선별된 PCR 프라이머의 올리고 뉴클레오티드 중합반응을 행하였다. 합성 종료 후 30% 암모니아수를 CPG 컬럼에 가하여 상기 올리고머를 격리시킨 다음 55℃에서 12시간 이상 탈보호(deprotection)시켜 고속진공(Speed Vac.)으로 농축 건조하였으며 다시 역상액체크로마토그래피 및 음이온교환 크로마토그래피를 행하여 순수 정제하였다. 최종 정제된 올리고머는 260nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
(4) 합성된 PCR 공통 프라이머에 의한 PCR 증폭 시험
상기 합성과정에서 합성한 3조의 프라이머와 이들 중 2조(AlbioHRP1, AlbioHRP3)를 병용한 프라이머 세트를 사용하여 HPV-16 감염세포주인 Caski(ATCC CRL-1550), HPV-18 감염세포주인 HeLa(ATCC CCL-2) 및 비감염세포주인 K562(KCLB-10243, Korean Cell Line Bank)를 대상으로 PCR 증폭시험을 수행하였다.
우선 CaSki와 HeLa는 제조사의 지시에 따라 배양한 다음 0.25% 트립신 용액을 가하여 배양 플라스크로부터 탈락시켜 원심 채집하였으며, 이들을 Dulbecco's phosphate-buffered saline(Gibco 사)로 한번 세척한 후 현미경상에서 그 세포 수를 계측한 다음 2×104 세포를 증류수 150㎕에 현탁하고 100℃에서 15분간 가열하여 세포 DNA를 추출하였다. 이들은 최종적으로 실온에서 완전히 식힌 다음 12000rpm에서 5분간 원심분리 후 그 상등액을 취하여 주형 DNA 용액으로 활용하였다.
PCR 실험은 슈퍼바이오(SuperBio. Co)로부터 구입한 10×buffer 2.5㎕, 10 mM MgCl2 3.75㎕, 10 mM dNTP 0.5㎕, Taq 중합효소 0.5㎕ (5unit)와 프라이머 1㎕ (50 pmoles), 증류수 5.2 ㎕ 주형 DNA 11.5㎕로 구성된 반응액을 94℃에서 5분간 반응시켜 충분히 변성시킨 후 94℃ 1분-58℃ 1분-72℃ 1분을 30회 반복하고 최종적으로 72℃에서 5분간 연장하였다. 최종 반응액 5㎕를 DNA 사이즈 스탠더드 마커(size standard marker)와 함께 2% 아가로스 겔(agarose gel)에 부과하여 전기영동 하였다. 이때 전기영동 겔의 염색은 0.00005% 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 용액으로 행하였으며 겔의 각 경로에서 출현한 밴드의 유효여부는 상기 표 1의 가상증폭 실험에서 얻진 PCR 산물의 예상크기와 비교하여 판정하였다.
도 1a 내지 도 1d는 각각 본 발명에서 합성한 3조의 프라이머와 이들 중 2조(AlbioHRP1, AlbioHRP3)를 병용한 프라이머 세트를 사용하여 HPV-16 감염 세포주인 CaSki, HPV-18 감염 세포주인 HeLa 및 비감염세포주인 K562를 표적 DNA로 하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다.
도면에서 M은 스탠더드 마커이고, 레인 1은 CaSki, 레인 2는 HeLa, 레인 3은 K562를 표적 DNA로 사용한 것이고, 측면의 숫자는 마커의 크기를 나타낸다. 도면에서 볼 수 있듯이, AlbioHRP1 프라이머는 HPV-16 감염세포주인 CaSki에 대하여 증폭이 일어났으며 (도 1a), AlbioHRP2 프라이머는 감염 세포주와 비감염 세포주 모두에 대하여 증폭이 일어나지 않았고(도 1b), AlbioHRP 3 프라이머는 HPV-18 감염세포주인 HeLa에 대하여 증폭이 일어났다(도 1c). 또한 이들 중 2조(AlbioHRP1, AlbioHRP3)를 병용한 프라이머 세트를 사용한 결과 CaSki 및 HeLa에 대해서만 증폭이 일어났음을 확인하였다(도 1d). 이런 결과는 상기 표 1의 가상증폭결과와 일치하는 것임을 알 수 있다.
실시예 2
본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 확인한 3조의 프라이머와 이들 중 2개의 프라이머를 병용 사용하여 다양한 유형의 HPV 플라스미드 DNA를 함유하는 E. coli 균주를 대상으로 PCR을 수행하였다.
본 실시예에서 사용한 균주는 다음과 같다.
HPV-1a (ATCC 45021);
HPV-2a (ATCC 45022);
HPV-6b (ATCC 45150);
HPV-11 (ATCC 45151);
HPV-16 (ATCC 45113);
HPV-18 (ATCC 45152);
HPV-31 (ATCC 65446);
HPV-43(ATCC 40338);
즉, 본 실시예에서는 자궁경부암의 진행과 밀접한 관련이 있는 고위험군 HPV 유형 중에서 상기 실시예 1의 가상증폭을 통하여 본 발명에서 합성된 프라이머에 증폭되는 것으로 확인된 HPV-16, HPV-18 및 HPV-31 DNA를 포함하고 있는 균주와 저위험군 HPV 유형 중에서 HPV-43, HPV-2a, HPV-6b, HPV-11 및 HPV-1a DNA를 함유하고 있는 균주를 대상으로 PCR 증폭을 실시하였다.
각 HPV 유형의 플라스미드 DNA를 함유하는 각 E. coli 균주는 37℃ LB 액체배지에서 16시간 동안 진탕 배양한 다음 'Qiafilter Plasmid Maxi Kit(Cat. No. 12263, QIAGEN 사)'로 분리 정제하여 10ng/㎕로 농도 조정하였으며, 이들 역시 주형 DNA 용액으로 활용하였다. PCR 증폭은 실시예 1에서와 동일한 반응물과 절차에 따라 각 주형 DNA에 대하여 구성 프라이머별로 독립적으로 수행하였다. 겔의 각 경로 상에서 출현한 밴드의 유효 여부는 HPV-16, HPV-18 HPV-31, HPV-43, HPV-2a, HPV-6b, HPV-11, HPV-1a DNA에 대한 각 프라이머의 컴퓨터 가상 증폭실험인 상기 실시예 1에서 얻어진 PCR 산물의 예상 크기(하기 표 2 참조)와 비교하여 판정하였다.
도 2a 내지 도 2d는 각각 HPV-16, HPV-18 HPV-31, HPV-43, HPV-2a, HPV-6b, HPV-11, HPV-1a를 대상으로 본 발명에서 합성된 3조의 프라이머와 상기한 병용 프라이머 세트(AlbioHRP1, AlbioHRP3)를 사용하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다. 도면에서 도면 하단의 M은 스탠더드 마커이고, 그 외 숫자는 본 실시예에서 사용된 대상 HPV 유형을 표시한 것이다. 한편 측면의 숫자는 마커의 크기를 나타낸다.
도면에서 볼 수 있는 바와 같이 본 발명의 AlbioHRP1은 HPV-16 및 HPV-18 DNA에 대하여 증폭이 일어났고(도 2a), AlbioHRP2는 본 실시예에서 사용된 대상 HPV DNA 중 어느 곳에서도 증폭이 일어나지 않았으며(도 2b), AlbioHRP3은 HPV-18 DNA에 대하여 증폭이 일어났다(도 2c), 또한 본 발명에서 합성된 3조의 프라이머 중 2조(AlbioHRP1, AlbioHRP3)를 병용 사용한 경우에, HPV-16, HPV-18 및 HPV-31에 대하여 증폭이 일어난 것을 알 수 있다(도 2d). 이런 결과는 하기 표 2의 예측결과와 일치하였다.
표 2. Albio HRP에 의한 HPV PCR 증폭의 예상 산물 크기
증폭 유형 Albio HRP 프라이머의 증폭산물의 크기(bp)
Albio HRP1 Albio HRP2 Albio HRP3
HPV-16 314 -* -
HPV-18 - - 277
HPV-26 - 308 -
HPV-30 - 313 -
HPV-31 314 - -
HPV-33 314 298 -
HPV-35 314 297 -
HPV-39 - - 286
HPV-45 - - 280
HPV-51 - 300 -
HPV-52 314 303 -
HPV-53 313 310 -
HPV-56 - 312 -
HPV-58 314 301 -
HPV-59 314 - 285
HPV-66 313 312 -
HPV-67 314 - -
HPV-68 - - 288
HPV-70 - - 286
HPV-73 314 - -
* 비증폭
이러한 결과로 볼 때 AlbioHRP1, AlbioHRP2, AlbioHRP3 프라이머는 각각 고위험군 HPV DNA에 대한 PCR 증폭 능력이 인정되며 비 선택적 증폭도 나타내지 않은 것으로 판단되었다. 따라서 본 결과는 컴퓨터 가상 증폭 실험에서 예견된 AlbioHRP1, AlbioHRP2, AlbioHRP3 프라이머의 선택적 특이 증폭과 모두 일치하였으며, 이를 바탕으로 AlbioHRP1, AlbioHRP2, AlbioHRP3 프라이머의 본 PCR 증폭 시험 실시예에서 다루지 못한 많은 HPV 유형에 대한 컴퓨터 가상 증폭 결과는 실제 PCR 증폭 실험에서도 충분한 의의가 있을 것으로 전망된다.
비교예 1
본 비교예에서는 임상시료를 대상으로 종래의 세포 검사법에 따른 HPV 감염여부를 확인하였다.
우선 포천중문의과대학 차병원 부인암센터 외래 진료소를 내원한 환자 가운데 무작위로 40명을 추출하여 해당 임상의의 책임 하에 자궁경부촬영진(cervicography), 조직생검(biopsy) 및 세포진도말(Pap-smear) 검사 등의 전문적 검진을 실시하였다. 총 30명의 환자를 대상으로 세포 검사를 통한 검진 결과는 하기 표 3에 표시하였다.
검진결과 하기 표 3에 제시된 바와 같이, 자궁경부암 관련 비정상 환자는 세포검사에서 저등급 편평상피내 병변(LSIL)을 갖는 피검자 29, 31, 34, 35 및 37과 미확인 비정형세포(ASCUS)를 갖는 피검자 6, 9, 11, 12, 19, 20 및 23, 고등급 편평상피내 병변(HSIL)을 갖는 피검자 1, 2, 5, 7, 8, 13, 14, 16, 17, 18, 24 및 25와 미세침윤암(SCC) 환자인 피검자 3, 4, 10, 15, 21 및 22가 포함되었고 나머지 피검자 26, 27, 28, 30, 32, 33, 36, 38, 39 및 40은 자궁경부암과 관련 없는 정상인으로 구분되었다.
표 3. 세포 검진에 따른 임상 시험결과
피검자 No. 세포 검사 피검자 No. 세포 검사 피검자 No. 세포 검사 피검자 No. 세포 검사
1 HSIL* 11 ASCUS 21 SCC 31 LSIL
2 HSIL 12 ASCUS 22 SCC 32 정상
3 SCC** 13 HSIL 23 ASCUS 33 정상
4 SCC 14 HSIL 24 HSIL 34 LSIL
5 HSIL 15 SCC 25 HSIL 35 LSIL
6 ASCUS*** 16 HSIL 26 정상 36 정상
7 HSIL 17 HSIL 27 정상 37 LSIL
8 HSIL 18 HSIL 28 정상 38 정상
9 ASCUS 19 ASCUS 29 LSIL**** 30 정상
10 SCC 20 ASCUS 30 정상 40 정상
* 고등급 편평상피내 병변(High Squamous Intraepithelial lesion)
** 미세침윤암(Squamous Cell Carcinoma)
*** 미확인 비정형 세포(Atypical Squamous Cell Undetermined significance)
**** 저등급 편평상피내 병변(Low Squamous Intraepithelial lesion)
비교예 2
본 비교예에서는 상기 비교예 1의 검사 결과, 자궁경부암 관련 비정상 환자 30명과 자궁경부암과 관련 없는 정상인 10명에 대하여 하이브리드캡처Ⅱ법(Hybrid Capture Ⅱ, Digene사) 검사를 실시하였다. 하이브리드캡처Ⅱ법에 따른 검진 결과는 하기 표 4에 간략하게 표시하였다.
표 5에 표시한 것과 같이, 상기 비교예 1에서 비정상인 것으로 검진된 총 25명의 환자 중 피검자 1~11과 13~18, 21~25는 고위험군 HPV 감염자인 것으로 판명되었으며, 피검자 29, 31, 34, 35 및 37은 저위험군 HPV 감염자인 것으로 판명되었다. 또한, 상기 비교예 1에서 정상인 것으로 판정된 피검자 26, 27, 28, 30, 32, 33, 36, 38, 39 및 40은 본 비교예에서도 HPV 비감염인 것으로 판명되었다. 그러나, 상기 비교예 1에서 미확인 비정형세포(ASCUS)를 갖는 것으로 판정된 피검자 1, 피검자 19 및 피검자 20은 본 비교예에서는 정상인으로 판명되었다.
표 4. 하이브리드캡처Ⅱ를 사용한 HPV 감염 여부 임상 시험결과
피검자 No. 검진 결과(High/Low) 피검자 No. 검진 결과(High/Low) 피검자 No. 검진 결과(High/Low) 피검자 No. 검진 결과(High/Low)
1 +/- 11 +/- 21 +/- 31 -/+
2 +/- 12 -/- 22 +/- 32 -/-
3 +/- 13 +/- 23 +/- 33 -/-
4 +/- 14 +/- 24 +/- 34 -/+
5 +/- 15 +/- 25 +/- 35 -/+
6 +/- 16 +/- 26 -/- 36 -/-
7 +/- 17 +/- 27 -/- 37 -/+
8 +/- 18 +/- 28 -/- 38 -/-
9 +/+ 19 -/- 29 -/+ 39 -/-
10 +/- 20 -/- 30 -/- 40 -/-
실시예 3 : 임상시료에 대한 선별된 HR 프라이머의 PCR 증폭 시험
본 실시예에서는 상기 실시예 1 및 실시예 2에서 확인된 3조의 프라이머(AlbioHRP1, AlbioHRP2, AlbioHRP3)와 상기 1조의 병용 프라이머(AlbioHRP1+AlbioHRP3) 세트를 사용하여 상기 비교예 1 통하여 자궁경부암 관련 비정상 환자와 자궁경부암과 관련이 없는 정상인에서 얻은 DNA의 증폭여부를 확인하고 이들이 고위험군 HPV에 감염되어 있는지 여부는 물론 조기에 자궁경부암의 원인인자를 동정할 수 있는지를 확인하였다.
이를 위해서, 상기 실시예 1에서 확인된 3조의 프라이머와 상기 병용 프라이머 세트를 사용하여 피검자들로부터 수득한 DNA 샘플을 대상으로 PCR을 수행한 후 전기영동을 실시하였다. 피검자들로부터의 DNA는 구체적 명기 또는 실시예와 동일한 방법에 따라 수득하였으며, PCR 반응 조건은 상기 실시예 1과 동일한 절차에서 수행하였다.
본 발명의 프라이머는 자궁경부암 관련 비정상환자(피검자 1 내지 25와 29, 31, 34, 35, 37, 38 및 40)로부터 얻은 DNA 샘플 가운데 하이브리드캡처 검사에서 고위험군 HPV 감염으로 진단된 환자 샘플에 대해서는 명확하게 증폭이 일어났으며 일부 하이브리드캡처 검사에서 정상인으로 진단된 환자(피검자 12, 19 내지 20)의 DNA 샘플에 대해서도 증폭이 일어난 것을 확인할 수 있었다.
한편 하이브리드캡처에서 저위험군 HPV 감염으로 진단된 환자(피검자 29, 31, 34, 35, 37, 38 내지 40)와 자궁경부암과 관련 없는 정상인(26, 27, 28, 30, 32, 33, 36 내지 39)으로 진단된 DNA 샘플에 대해서는 증폭이 일어나지 않은 것을 확인할 수 있었다. 이는 자궁경부암 관련 환자 30명과 자궁경부암 관련 환자 10명의 병인학적 추론과 일치함을 확인할 수 있다.
도 3a 내지 3y는 본 발명에 따른 3조의 프라이머와 상기 병용 프라이머 세트를 이용하여 상기 비교예 1에서 고위험군 병변(HSIL), 미세침윤암(SCC) 또는 미확인 비정형세포(ASCUS) 등 고위험군 HPV에 감염된 것으로 판정된 환자로부터 얻은 DNA 시료를 대상으로 PCR을 실시하고 전기영동한 사진이다. 도 3a는 피검자 1, 도 3b는 피검자 2, 도 3c는 피검자 3, 도 3d는 피검자 4, 도 3e는 피검자 5, 도 3f는 피검자 6, 도 3g는 피검자 7, 도 3h는 피검자 8, 도 3i는 피검자 9, 도 3j는 피검자 10, 도 3k는 피검자 11, 도 3l은 피검자 12, 도 3m은 피검자 13, 도 3n은 피검자 14, 도 3o는 피검자 15, 도 3p는 피검자 16, 도 3q는 피검자 17, 도 3r은 피검자 18, 도 3s는 피검자 19, 도 3t는 피검자 20, 도 3u는 피검자 21, 도 3v는 피검자 22, 도 3w는 피검자 23, 도 3x는 피검자 24 및 도 3y는 피검자 25의 환자로부터 수득한 DNA를 대상으로 한 것이다. 여기서 M은 스탠더드 마커이고, 레인 1은 AlbioHRP 1 프라이머, 레인 2는 Albio HRP 2 프라이머, 레인 3은 Albio HRP 3 프라이머 그리고 레인 4는 Albio HRP 1와 Albio HRP 3의 병용 프라이머를 나타낸다. 또한 좌측면의 숫자는 DNA 마커의 사이즈를 나타낸 것이다.
도시한 것과 같이 상기 비교예 1을 통하여 고위험군 HPV에 감염된 것으로 판정된 모든 피검자(피검자 1 내지 피검자 24)로부터 수득한 DNA를 대상으로 본 발명에서 합성된 프라이머 중 적어도 1조의 프라이머에 대해서는 증폭이 일어났음을 확인하였다. 즉, 피검자 1은 Albio HRP 1 프라이머, Albio HRP 2 프라이머 및 병용 프라이머(도 3a), 피검자 2는 Albio HRP 2 프라이머(도 3b), 피검자 3은 Albio HRP 1 프라이머 및 병용 프라이머(도 3c), 피검자 4는 Albio HRP 3 프라이머 및 병용 프라이머(도 3d), 피검자 5는 Albio HRP 2 프라이머(도 3e), 피검자 6은 Albio HRP 1 프라이머 및 병용 프라이머(도 3f), 피검자 7은 Albio HRP 1 프라이머 및 병용 프라이머(도 3g), 피검자 8은 Albio HRP 1 프라이머, Albio HRP 2 프라이머 및 병용 프라이머(도 3h), 피검자 9는 Albio HRP 2 프라이머(도 3i), 피검자 10은 Albio HRP 1 프라이머 및 병용 프라이머(도 3j), 피검자 11은 Albio HRP 2 프라이머(도 3k), 피검자 12는 Albio HRP 1 프라이머, Albio HRP 2 프라이머 및 병용 프라이머(도 3l), 피검자 13은 Albio HRP 2 프라이머(도 3m), 피검자 14는 Albio HRP 1 프라이머 및 병용 프라이머(도 3n), 피검자 15는 Albio HRP3 프라이머 및 병용 프라이머(피검자 3o), 피검자 16은 Albio HRP 1 프라이머 및 병용 프라이머(도 3p), 피검자 17은 Albio HRP 1 프라이머, Albio HRP 2 프라이머 및 병용 프라이머(도 3q), 피검자 18은 Albio HRP 2 프라이머(도 3r), 피검자 19는 Albio HRP 2 프라이머(도 3s), 피검자 20은 Albio HRP 1 프라이머 및 병용 프라이머(도 3t), 피검자 21은 Albio HRP 3 프라이머 및 병용 프라이머(도 3u), 피검자 22는 Albio HRP 1 프라이머 및 병용 프라이머(도 3v), 피검자 23은 Albio HRP 1 프라이머 및 병용 프라이머(도 3w), 피검자 24는 Albio HRP 2 프라이머(도 3x), 피검자 25는 Albio HRP 1 프라이머, Albio HRP 2 프라이머 및 병용 프라이머(도 3y)를 사용한 경우에 가상증폭에서 예측한 크기의 증폭 산물이 얻어짐을 알 수 있었다.
자궁경부암의 진행과 밀접한 관련이 있는 고위험군 HPV 유형은 다양하게 존재하고 있으며 상기 비교예 1에서 고위험군 HPV에 감염된 것으로 판정된 환자의 샘플에는 서로 다른 고위험군 HPV에 의하여 감염되어 있을 수 있기 때문에, 개별 환자로부터 얻은 DNA 샘플에 따라 본 실시예에서 사용된 프라이머에 의하여 증폭되는 산물이 달라질 수 있고, 본 실시예에서 사용된 프라이머 중에서 일부의 프라이머에 대해서만 증폭이 일어났음을 알 수 있다.
특히, 하이브리드캡처 시스템에서 정상인으로 진단한 일부 피검자의 경우(피검자 12, 19 및 20) 본 발명에 의한 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하면 증폭이 일어난 것을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 프라이머를 이용한 PCR 증폭 방법이 하이브리드캡처 시스템보다 민감도나 특이도가 다소 높은 것을 의미한다.
도 4a 내지 4o는 본 발명에 따른 3조의 프라이머(Albio HRP 1 프라이머, Albio HRP 2 프라이머, Albio HRP 3 프라이머)와 병용 프라이머(Albio HRP 1 프라이머+ Albio HRP 3 프라이머) 세트를 이용하여 상기 비교예 1 및 비교예 2의 검진 결과 자궁경부암 관련 비정상 환자 가운데 하이브리드캡처 검사에서 저위험군 HPV 감염으로 진단된 환자(LSIL)와 정상인으로부터 얻은 DNA 시료를 대상으로 PCR을 실시하고 전기영동한 사진이다.
도 4a는 피검자 26, 도 4b는 피검자 27, 도 4c는 피검자 28, 도 4d는 피검자 29, 도 4e는 피검자 30, 도 4f는 피검자 31, 도 4g는 피검자 32, 도 4h는 피검자 33, 도 4i는 피검자 34, 도 4j는 피검자 35, 도 4k는 피검자 36, 도 4l은 피검자 37, 도 4m은 피검자 38, 도 4n은 피검자 39 및 도 4o는 피검자 40의 환자로부터 수득한 DNA를 대상으로 한 것이다.
여기서 M은 스탠더드 마커이고, 레인 1은 Albio HRP 1 프라이머, 레인 2는 Albio HRP 2 프라이머, 레인 3은 Albio HRP 3 프라이머 그리고 레인 4는 Albio HRP 1+Albio HRP 3 병용 프라이머를 나타낸다. 또한 좌측면의 숫자는 DNA 마커의 사이즈를 나타낸 것이다. 도면에서 알 수 있는 바와 같이 상기 비교예 1 및 비교예 2에서 정상 또는 저위험군 병변(LSIL)으로 판정된 피검자로부터 수득한 DNA를 대상으로 본 실시예에서 합성된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭과정을 수행한 결과 증폭산물이 생성되지 않았음을 확인하였다.
이상에서 본 발명의 실시예를 설명하였으나, 이는 예시일 뿐, 본 발명의 정신을 벗어나지 않고 다양한 변경과 변형이 가능하다는 것은 당업자에게는 자명할 것이나, 이들은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 것은 첨부된 청구의 범위를 통해 분명해 질 것이다.
본 발명에서 합성된 올리고 뉴클레오티드는 고위험군 HPV 유형의 DNA와 상보적으로 결합하여 고위험군 HPV 유형을 특이적으로 증폭할 수 있기 때문에, 자궁경부암의 진행률과 밀접한 관련이 있는 고위험군 HPV 유형의 감염여부를 조기에 진단할 수 있다.
즉, 본 발명에서 합성된 프라이머와 인체에서 수득한 샘플을 대상으로 PCR을 실시하면, 고위험군 HPV에 감염된 샘플에 대해서만 증폭이 일어나기 때문에 자궁경부암을 신속하고 경제적이면서 정확하게 진단할 수 있다.
특히, 본 발명에서 합성된 프라이머와 이미 알려진 공통 프라이머(general Primer)를 사용함으로서 보다 효율적인 HPV 감염여부를 확인할 수 있다.
즉, 우선 공통 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 증폭 여부에 따라 HPV 감염 여부를 1차적으로 확인하고, 증폭 산물이 얻어진 샘플에 대해서만 본 발명에서 합성된 프라이머를 사용하여 PCR을 실시함으로써, 보다 정확한 HPV 감염 여부 및 자궁경부암의 진행정도를 조기에 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머는 고위험군 HPV의 게놈과 상보적으로 결합될 수 있기 때문에, 직접적으로 고위험군 HPV DNA를 검출할 수 있는 프로브(probe)로서도 활용될 수 있다.
도 1a 내지 도 1d는 각각 HPV-16 감염 세포주인 CaSki, HPV-18 감염 세포주인 HeLa 및 HPV 비감염세포주인 K562를 표적 DNA로 하여 본 발명에서 합성한 3조의 프라이머와 이들 중 2조를 병용한 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다.
도 2a 내지 도 2d는 각각 HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-43, HPV-2a, HPV-6b, HPV-11 및 HPV-1a 유형의 HPV 플라스미드를 표적 DNA로 하여 본 발명에서 합성한 3조의 프라이머와 이들 중 2조를 병용한 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다.
도 3a 내지 도 3y는 각각 본 발명에서 합성한 3조의 프라이머와 상기 병용한 프라이머 세트를 사용하여 자궁경부 관련 비정상 환자[(미세침윤암(SCC), 미확인 비정형세포(ASCUS), 고등급 병변(HSIL)]로 진단된 인체에서 수득한 DNA를 대상으로 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다.
도 4a 내지 도 4o는 각각 본 발명에서 합성한 3조의 프라이머와 상기 병용 프라이머 세트를 사용하여 자궁경부 관련 비정상 환자가운데 저등급 병변(LSIL) 환자와 정상인 인체에서 수득한 DNA를 대상으로 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다.
<110> ALBIOMED Co., LTD <120> Primers and Method for Detecting High Risk Human Papillomavirus by Multiplex PCR <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying HPV <400> 1 gagtacctaa gacatgggga ggaatatga 29 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying HPV <400> 2 cgacctaaag gaaactgatc taaatctgc 29 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying HPV <400> 3 caaacagaaa ttgacctaca gtgctatgag caa 33 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying HPV <400> 4 accccttccc ctcctcatct gtaccttca 29 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying HPV <400> 5 ataacatagc tggaaactat acaggacag 29 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying HPV <400> 6 acgctgtggt tcggctcgtc tggctagta 29

Claims (12)

  1. 서열번호 1과 서열번호 2로 구성되는 뉴클레오티드(제 1 프라이머);
    서열번호 3과 서열번호 4로 구성되는 뉴클레오티드(제 2 프라이머); 또는
    서열번호 5와 서열번호 6으로 구성되는 뉴클레오티드(제 3 프라이머)로 구성되는 군중에서 적어도 1조 이상 선택되는 고위험군 HPV DNA를 증폭시키는 합성된 프라이머.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 프라이머는 HPV-16, HPV-31, HPV-33, HPV-34, HPV-35, HPV-35H, HPV-52, HPV-53, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-67 또는 HPV-73 중에서 선택되는 HPV 유형의 DNA를 증폭하는 프라이머이고,
    상기 제 2 프라이머는 HPV-26, HPV-30, HPV-33, HPV-35, HPV-35H, HPV-51, HPV-52, HPV-53, HPV-56, HPV-58 또는 HPV-66 중에서 선택되는 HPV 유형의 DNA를 증폭하는 프라이머이고,
    상기 제 3 프라이머는 HPV-18, HPV-39, HPV-45, HPV-59, HPV-68 또는 HPV-70 중에서 선택되는 HPV 유형의 DNA를 증폭하는 프라이머인 고위험군 HPV 유형의 DNA를 증폭하는 합성된 프라이머.
  3. 제 1항 또는 제 2항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 프라이머는 HPV-16 또는 HPV-31 DNA를 증폭하는 프라이머이고,
    상기 제 2 프라이머는 HPV-18 DNA를 증폭하는 프라이머인 고위험군 HPV 유형의 DNA를 증폭하는 합성된 프라이머.
  4. 서열번호 1과 서열번호 2로 구성되는 뉴클레오티드(제 1 프라이머), 서열번호 3과 서열번호 4로 구성되는 뉴클레오티드(제 2 프라이머), 또는 서열번호 5와 서열번호 6으로 구성되는 뉴클레오티드(제 3 프라이머)로 구성되는 군중에서 적어도 1조 이상 선택되는 뉴클레오티드를 프라이머로 사용하고,
    생물학적 샘플로부터 얻어진 핵산을 표적 DNA로 하는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행함으로써 고위험군 HPV 유형의 DNA를 증폭하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 제 1 프라이머는 HPV-16, HPV-31, HPV-33, HPV-34, HPV-35, HPV-35H, HPV-52, HPV-53, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-67 또는 HPV-73 중에서 선택되는 HPV 유형의 DNA를 증폭하는 프라이머이고,
    상기 제 2 프라이머는 HPV-26, HPV-30, HPV-33, HPV-35, HPV-35H, HPV-51, HPV-52, HPV-53, HPV-56, HPV-58 또는 HPV-66 중에서 선택되는 HPV 유형의 DNA를 증폭하는 프라이머이고,
    상기 제 3 프라이머는 HPV-18, HPV-39, HPV-45, HPV-59, HPV-68 또는 HPV-70 중에서 선택되는 HPV 유형의 DNA를 증폭하는 프라이머인 고위험군 HPV 유형의 DNA를 증폭하는 방법.
  6. 제 4항 또는 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 프라이머는 HPV-16 또는 HPV-31 DNA를 증폭하는 프라이머이고,
    상기 제 2 프라이머는 HPV-18 DNA를 증폭하는 프라이머인 고위험군 HPV 유형의 DNA를 증폭하는 방법.
  7. 서열번호 1과 서열번호 2로 구성되는 뉴클레오티드(제 1 프라이머), 서열번호 3과 서열번호 4로 구성되는 뉴클레오티드(제 2 프라이머), 또는 서열번호 5와 서열번호 6으로 구성되는 뉴클레오티드(제 3 프라이머)로 구성되는 군중에서 적어도 1조 이상 선택되는 뉴클레오티드를 프라이머로 사용하고, 생플로부터 얻어진 핵산을 표적 DNA로 하여 상기 표적 DNA를 증폭시키는 과정; 및
    상기 증폭과정에서 증폭 산물이 존재하는 경우 상기 샘플 내에 고위험군 HPV 유형의 DNA가 존재하는 것으로 판단하는 과정을 포함하는 샘플 내에 고위험군 HPV 유형의 DNA 존재를 분석하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 제 1 프라이머는 HPV-16, HPV-31, HPV-33, HPV-34, HPV-35, HPV-35H, HPV-52, HPV-53, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-67 또는 HPV-73 중에서 선택되는 HPV 유형의 DNA를 증폭하는 프라이머이고,
    상기 제 2 프라이머는 HPV-26, HPV-30, HPV-33, HPV-35, HPV-35H, HPV-51, HPV-52, HPV-53, HPV-56, HPV-58 또는 HPV-66 중에서 선택되는 HPV 유형의 DNA를 증폭하는 프라이머이고,
    상기 제 3 프라이머는 HPV-18, HPV-39, HPV-45, HPV-59, HPV-68 또는 HPV-70 중에서 선택되는 HPV 유형의 DNA를 증폭하는 프라이머인 고위험군 HPV 유형의 DNA 존재를 분석하는 방법.
  9. 제 7항 또는 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 프라이머는 HPV-16 또는 HPV-31 DNA를 증폭하는 프라이머이고,
    상기 제 2 프라이머는 HPV-18 DNA를 증폭하는 프라이머인 고위험군 HPV 유형의 DNA 존재를 분석하는 방법.
  10. 서열번호 1과 서열번호 2로 구성되는 뉴클레오티드(제 1 프라이머), 서열번호 3과 서열번호 4로 구성되는 뉴클레오티드(제 2 프라이머), 또는 서열번호 5와 서열번호 6으로 구성되는 뉴클레오티드(제 3 프라이머)로 구성되는 군중에서 적어도 1조 이상 선택되는 뉴클레오티드;
    dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP);
    내열성 중합효소; 및
    PCR 완충용액을 포함하는 고위험군 HPV 유형의 DNA 검출용 키트.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 제 1 프라이머는 HPV-16, HPV-31, HPV-33, HPV-34, HPV-35, HPV-35H, HPV-52, HPV-53, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-67 또는 HPV-73 중에서 선택되는 HPV 유형의 DNA를 증폭하는 프라이머이고,
    상기 제 2 프라이머는 HPV-26, HPV-30, HPV-33, HPV-35, HPV-35H, HPV-51, HPV-52, HPV-53, HPV-56, HPV-58 또는 HPV-66 중에서 선택되는 HPV 유형의 DNA를 증폭하는 프라이머이고,
    상기 제 3 프라이머는 HPV-18, HPV-39, HPV-45, HPV-59, HPV-68 또는 HPV-70 중에서 선택되는 HPV 유형의 DNA를 증폭하는 프라이머인 고위험군 HPV 유형의 DNA 검출용 키트.
  12. 제 10항 또는 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 프라이머는 HPV-16 또는 HPV-31 DNA를 증폭하는 프라이머이고,
    상기 제 2 프라이머는 HPV-18 DNA를 증폭하는 프라이머인 고위험군 HPV 유형의 DNA 검출용 키트.
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WO2010055109A3 (en) * 2008-11-13 2010-11-11 Ddl Diagnostics Laboratory B.V. Hpv types and variants associated with cervical cancer and the uses thereof
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