WO2015083852A1 - 개선된 자궁경부암 진단 방법 및 그 진단용 키트 - Google Patents

개선된 자궁경부암 진단 방법 및 그 진단용 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 개선된 자궁경부암 진단 방법 및 그 진단용 키트에 관한 것이다.

Description

개선된 자궁경부암 진단 방법 및 그 진단용 키트
본 발명은 개선된 자궁경부암 진단 방법 및 그 진단용 키트에 관한 것이다.
자궁경부암은 세계적으로 여성에게 발생하는 암 중 두 번째로 많이 발생하는 암이며(Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM.Int J Cancer. 2010. 127: 2893-2917.), 국가암등록사업에 의해 자궁경부암의 5년 생존율이 약 80%이상으로 나타났고 이에 따라 조기에 발견 할수록 생존율이 높아짐을 알 수 있다. 자궁경부암 환자의 99.7%에서 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV)의 유전자가 존재하는 것이 밝혀졌으며, 이러한 HPV 감염의 존속이 침윤성 자궁경부암, 자궁경부 전암으로의 전이를 일으키는 것으로 알려져 있다.
현재 HPV의 유전자형은 100가지 이상이 알려져 있고 이 중에서 사람에게 질병을 일으킬 수 있는 유전자형은 30가지 정도로 알려선져 있으며 그 유전자형은 고위험군 (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82) 과 저위험군 (6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81), 잠재위험군(34, 57, 83)으로 분류하고 있으며, 각각의 유전자형을 지닌 HPV가 병소의 위치와 병변의 진행정도에 따라 유전자형 특이적으로 발견됨으로써 HPV 감염의 생물학적 다양성을 인지하게 되었다.
HPV의 감염여부를 진단하기 위하여 가장 많이 쓰이는 방법은 자궁경부에서부터 얻은 탈락세포를 이용해 세포진단학적 검사를 수행하는 자궁경부 세포진검사 (Papanicolaou smear, 이하 Pap 도말검사)가 있으며, 이는 검사방법이 간단하고 비용이 적게 드는 경제적인 이유로 자궁경부암 선별 검사로서 유용성이 높다고 알려져 있지만, 민감도가 약 20~50% 로 위음성률이 매우 높다는 단점이 있다 (Hwang TS, Jeong JK, Park M, Han HS, Choi HK, Park TS. Gynecol Oncol.2003. 90: 51-56). 특히 High-grade squamous intraepithelial lesion (이하 HSIL)에 대한 낮은 민감도와 예측도 (predictive value)가 보고되고 있고, 편평세포암에 비해 선병변 (grandular lesion)이나 선암 (adenocarcinoma)에 대한 낮은 선별력으로 인해 자궁경부암의 조기 진단이 어렵다는 등 자궁경부암 진단에 있어 Pap 도말검사의 여러 가지 제한점이 나타나고 있다 (Kim YS, Lee HJ, Lee GG. Korean J Clin Pathol. 2001. 21: 210-214;Kwon HS, Kim YT, Kim JW, Kim SH. Korean J Gynecol Oncol Colposc. 2002. 13: 327-335.).
또한 질확대경을 이용한 검사 방법은 자궁세포진 검사보다 정확한 결과를 얻을 수는 있지만, 숙련된 기술자와 고가의 장비가 필요하며, HPV의 감염유무를 구별할 수 없다는 단점이 있다.
자궁경부암으로 진행하는 과정에 HPV가 중요한 원인으로 알려지면서 기존에 자궁경부암검사에 사용되던 세포학적 검사법인 Pap test와 더불어 자궁암의 조기 진단에 HPV DNA의 존재 유무를 밝히는 것이 중요하게 여겨지고 있다.
자궁경부암으로 발전함에 있어서 인유두종바이러스 (human papillomavirus; 이하 HPV)의 감염이 연관이 있다는 점이 알려지면서, 자궁경부에서부터 HPV DNA를 검출하는 방법부터 HPV의 캡시드 단백질을 암호화하는 L1 유전자를 기초로 HPV 유전형을 검사하는 HPV 유전형 검사법 등 HPV DNA 검사법들이 많이 개발되어 상용화되었고, 현재 이러한 분자진단학적 방법들은 Pap 도말검사의 보조적인 검사로 함께 사용되고 있으며 (Thomas I, Liesje G, Ryan S. J Clin Microbiol. 1999. 37: 2508-2517), 그 이용이 국내에서 또한 증가하고 있다 (Cho EJ, Do JH, Kim YS, Bae S, Ahn WS. J Med Microbiol.2011. 60: 162-171).
HPV DNA 검사법으로는 대표적으로 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 이용해 HPV의 DNA 존재 유무를 알아볼 수 있는 방법 또는 DNA chip나 reverse blot hybridization assay(REBA)를 이용해 HPV의 유전자형을 검사하는 방법이 알려져 있다.
HPV DNA 검사와 HPV Genotyping 검사는 민감도가 매우 높고, 감염되어 있는 HPV의 유전형을 알 수 있다는 장점이 있지만, 분석적 민감도가 너무 높아 고등급 병변인 SCC와 HSIL에서 뿐만 아니라 저등급 병변과 정상 소견에서도 약 40~50% 가량 높은 비율로 검출이 된다는 제한점이 있으며 HPV DNA의 존재만으로는 HPV의 감염을 검출할 수는 있지만, 자궁겸부암을 바로 진단할 수 없다는 단점이 있다.
자궁경부가 HPV에 감염되면, HPV의 발암유전자인 E6/E7가 과발현되어 p53과 pRB와 같은 암 억제 단백질의 기능을 억제해 암을 유도하게 된다.
하지만, 최근 몇 년간의 연구결과에 따르면, 자궁경부암환자 뿐만 아니라 암으로 발생하기 이전인 염증단계 또는 정상인의 자궁경부에서도 HPV DNA 양성률이 매우 높게 나오고 있기 때문에, HPV DNA가 검출되더라도 임상적인 자궁경부암의 치료 및 예방을 하기에 매우 어려운 실정에 있다.
그동안 HPV DNA 검출 및 유전자형 검출을 위해서 HPV의 핵산 중 가장 큰 크기의 L1(late gene 1) capsid 단백질을 암호화하는 부위를 표적으로 개발되어 왔지만, 이 보다는 암을 유도할 때 발현되는 단백질인 E6/E7을 암호화하는 mRNA를 표적으로 그 유전자 발현양의 정도를 검출하는 것이 자궁경부암 및 자궁경부암의 예후를 판정하는데 보다 유용성이 있다고 본다.
현재까지 알려진 바로는 국내에서는 HPV 발암유전자 E6, E7 mRNA를 표적으로 한 HPV mRNA검사법의 개발이 미미한 상황이며 국내 중대형병원에서의 HPV DNA 유전형검사의 수행은 증가하고 있는 추세에 있지만, HPV DNA 양성율이 자궁경부암뿐만 아니라 정상에서의 양성율이 모두 높게 나타났기 때문에 직접적인 임상적 치료나 예방치료에 바로 적용하기는 힘든 상황이다.
최근에는 HPV의 DNA를 이용한 검사가 아닌 HPV 고위험군의 발암유전자인 E6와 E7유전자를 암호화 하고 있는 mRNA를 표적으로 한 검사법이 개발되고 있는 추세이며, 이미 전 세계적으로 자궁경부암에서 가장 많이 존재한다고 알려진 HPV 16, 18, 31, 33, 45형의 E6, E7 mRNA를 검출할 수 있는 real-time NASBA 검사법이 상용화되었지만 이러한 검사키트들은 상당히 고가(단가:3만원/검사)이며, real-time NASBA를 하기위해서는 전용분석기계가 필요하지만, 현재 중대형 병원에서는 이러한 전용분석기계를 보유하고 있지 않기 때문에, 실질적으로 임상검사에 적용하기는 힘든 상황이며, 또한, 현재 상용화되어있는 E6, E7 mRNA 검사법의 경우 전 세계적으로 유행하는 HPV의 5개 유전형(HPV 16, 18, 31, 33, 45)을 포함하고 있기 때문에 국내에서 발생하는 자궁경부암으로부터 분리되는 HPV의 유전형과는 차이를 나타내기 때문에 국내의 환자들에게 적용하기에는 제한점이 있다.
[선행 특허문헌]
대한민국특허공개번호 제1020040078506호
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신속하고 정확한 개선된 자궁경부암 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신속하고 정확한 개선된 자궁경부암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a) 환자의 혈액에서 얻은 세포로부터 전장 RNA를 분리하는 단계;b) 상기 분리된 전장 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계;c) 상기 합성된 cDNA를 HPV 타입 16, 35, 31, 58, 33, 및 52를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브;HPV 타입 18, 45, 39, 68, 및 59를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브; HPV 타입 53, 56, 66, 51, 69, 26, 및 30을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍 및 프로브; 및 GAPDH(gyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 및 hTERT(human telomerase reverse transcriptase) 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브를 이용하여 실시간-PCR을 수행하는 단계; 및 d) 상기 발현된 양을 정상인에 대해 발현된 양과 비교하는 단계;를 포함하는 자궁경부암의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
일반적으로 사용되는 전장 RNA(Total RNA)를 분리하는 방법 및 이로부터 cDNA를 합성하는 방법은 공지된 방법을 통해 수행될 수 있으며, 이 과정에 대한 자세한 설명은 Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); 및 Noonan, K. F. 등에 개시되어 있어 본 발명의 참조로서 삽입될 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속,철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광, 화학발광단 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 루오리신(fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine) Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단 및/또는 3' 말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 real-time RT-PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다.
또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 real-time RT-PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용할 수 있다.
표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 본 발명에서는 RT-PCR을 통해 mRNA 수준에서 발현수준을 측정하게 된다. 이를 위하여 상기 HPV 유전자에 특이적으로 결합하는 신규한 프라이머 쌍과 형광이 표지된 프로브가 요구되며, 본 발명에서 특정한 염기서열로 특정된 해당 프라이머 및 프로브를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이들 유전자에 특이적으로 결합하여 검출가능한 시그널을 제공하여 real-time RT-PCR을 수행할 수 있는 것이면, 제한 없이 사용될 수 있다. 상기에서 FAM과 Quen(Quencher)는 형광염료를 의미한다.
본 발명에 적용되는 real-time RT-PCR 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 공지의 과정을 통해 수행될 수 있다.
mRNA 발현수준을 측정하는 단계는 통상의 mRNA 발현수준을 측정할 수 있는 방법이면 제한 없이 사용될 수 있으며, 사용한 프로브 표지의 종류에 따라 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 real-time RT-PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 real-time RT-PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 realtime RT-PCR을 통해 증폭된 PCR 산물에 형광이 표지된 프로브가 붙어 특정 파장의 형광을 내게 되고, 증폭과 동시에 realtime PCR 장치의 형광 측정기에서 본 발명의 유전자들의 mRNA 발현수준을 실시간으로 측정하고, 측정된 값이 계산되어 PC를 통해 시각화 되게 되어 검사자는 쉽게 그 발현정도를 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 HPV 타입 16, 35, 31, 58, 33, 및 52를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 1 및 2에 기재되고, 프로브는 서열번호 3에 기재된 염기서열을 가지는 것이 바람직하고,
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 HPV 타입 18, 45, 39, 68, 및 59를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 4 내지 7에 기재되고, 프로브는 서열번호 8에 기재된 염기서열을 가지는 것이 바람직하며,
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 HPV 타입 53, 56, 66, 51, 69, 26, 및 30을 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 9 및 10, 또는 12 및 13에 기재되고, 프로브는 서열번호 11 또는 14에 기재된 염기서열을 가지는 것이 바람직하며,
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 GAPDH 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 15 및 16에 기재되고, 프로브는 서열번호 17에 기재되며, 상기 hTERT 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 18 및 19에 기재되고, 프로브는 서열번호 20에 기재된 염기서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또한 본 발명은 HPV 타입 16, 35, 31, 58, 33, 및 52를 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 2에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 3에 기재된 염기서열을 가지는 프로브; HPV 타입 18, 45, 39, 68, 및 59를 증폭할 수 있는 서열번호 4 내지 7에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 8에 기재된 프로브; HPV 타입 53, 56, 66, 51, 69, 26, 및 30을 증폭할 수 있는 서열번호 9 및 10 또는 12 및 13에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 11 또는 14에 기재된 프로브; 및 GAPDH 유전자를 증폭할 수 있는 서열번호 15 및 16에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 17에 기재된 프로브, 및 hTERT 유전자를 증폭할 수 있는 서열번호 18 및 19에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 20에 기재된 프로브로 구성된 프라이머쌍 및 프로브를 포함하는 자궁경부암의 진단을 위한 프라이머쌍 및 프로브 조성물을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 쌍 및 프로브 조성물을 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 조성물을 포함하는 자궁경부암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 상기 본 발명의 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이일 수 있으며 보다 바람직하게는 본 발명의 서열번호로 표시되는 신규한 프라이머 쌍 및 형광표지된 프로브를 포함할 수 있다.
그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "암 진단을 위한 정보제공방법"은 진단을 위한 예비적 단계로서 암의 진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
용어 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
용어 "프로브"는 단일 연쇄 핵산 분자이며, 타깃 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
용어 "실시간 역전사 중합효소 반응(realtime RT-PCR)"이라 함은 역전사효소를 이용하여 RNA를 상보적인 DNA(cDNA)로 역전사 시킨 후에 만들어진 cDNA를 주형(template) 으로하여 타겟 프라이머와 표지를 포함하는 타겟 프로브를 이용해 타겟을 증폭함과 동시에 증폭된 타겟에 타겟 프로프의 표지에서 발생하는 신호를 정량적으로 검출해 내는 분자생물학적 중합방법이다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명에서는 세계적으로 자궁경부암과 연관이 있다고 알려진 HPV 16, 18, 31, 33, 45 유전형과 더불어 국내 및 주변국들에서 자궁경부암과 연관이 있다고 알려진 HPV 35, 52, 56, 58, 39, 51, 59, 68, 53, 66, 69 유전형을 표적으로 E6, E7 발암유전자의 mRNA 발현양상을 정확히 측정할 수 있는 국내실정에 맞는 TaqMan 프로브를 이용한 Multiplex real-time RT-PCR검사법과 함께 HPV E6, E7 유전자의 발현을 통해서도 나오지 않는 위음성 샘플에 대하여 telomerae(hTERT) real-time PCR검사법을 추가하여 자궁경부암 진단의 양성률을 높이고 암으로 진행할 수 있는 예후인자로서 치료 및 진단에 도움을 주고자 검사법을 개발하고자 하였다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 진단법의 기술적 측면으로 임상적 치료 및 예방치료가 필요한 환자군을 보다 신속하고 정확하게 제공하여 기존 HPV DNA검사법의 제한점을 극복할 수 있을 것으로 예상되며, 탈락세포로부터의 RNA 추출의 자동화가 가능하고 real-time RT-PCR을 사용함으로써, 결과분석이 소프트웨어에 의해 가능하기 때문에 보다 객관적이고 정확한 결과를 보다 신속하게 제공할 수 있다.
도 1은 임상검체 GAPDH mRNA real-time RT-PCR 결과
도 2-3은 주요 고위험군 16종 HPV의 E6/E7 표준염기서열 분석 및 프라이머와 TaqMan 프로브 위치
도 4-16은 HPV mRNA를 이용한 E6/7에서의 민감도
도 17-18은 multiplex RT-PCR법에 의한 세포병리학적(A)와 조직학적(B)분류에 따른 HPV E6/E7 양성검출 빈도
도 19는 자궁경부액상세포를 이용한 세포병리학적 분류에 따른 hTERT mRNA의 발현양상 (고등급병변(SCC, HSIL, ASC-H)와 저등급병변(LSIL, ASC-US)
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1. 임상검체의 수집 및 확보
연세대학교 원주기독병원 병리과로부터 자궁경부 액상세포검사 (Thin Prep PAP TEST, PreservCyt Solution, Hologic Inc.Marlborough, MA, USA)를 시행한 환자를 대상으로 남아있는 자궁경부의 탈락세포를 가지고 RNA추출을 위해 100% 무수에탄올에 보관하여 수집하여 확보하였다.
실시예2. 임상검체(자궁경부 탈락세포)로부터 전체 RNA추출
임상검체로부터 전체 RNA를 분리하기위해 자동핵산추출장비인 MagNA Pure LC 2.0(Roche)와 MagNA Pure LC RNA Isolation Kit High Performance (Roche)를 사용하였다. 분리한 전체 RNA는 NanoQuant system (TECAN)을 이용하여 정량하였다.
실시예 3. 추출된 전체 RNA로부터 cDNA의 합성
상기 임상검체로부터 분리한 전체 RNA 2 ug, random primer (Invitrogen) 0.2 5 ug, dNTP(Cosmo gene tech) 250 uM, Tris-HCl(pH 8.3) 50 mM, KCl 75 mM, MgCl23mM,DTT8mM와 MMLV 역전사 중합효소 200 units (Invitrogen)을 첨가하고 최종부피를 20 ul가 되도록 DEPC 처리된 DW를 넣고 잘 섞은 후 합성 반응액을 thermocycler (ABI)에서 25℃에서 10 분, 37℃에서 50 분, 70℃에서 15 분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA가 real-time RT-PCR을 수행하기에 적절한지를 확인하기 위해 human gyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)를 endogenous control로 하여 real-time RT-PCR을 수행한 결과 임상검체로부터 추출하여 합성된 cDNA가 본 발명에 사용하기에 적합한 것으로 확인하였다 (도 1).
실시예 4. Multiplex RT-qPCR을 위한 고위험군 HPV 주요 16종 유전형의 E6/E7 mRNA 염기서열 분석 및 프라이머 TaqMan 프로브 디자인
자궁경부암에서 가장 많이 발견되는 고위험군 HPV 주요 16종의 E6/E7 mRNA의 NCBI 표준 염기서열을 기초로 확보하였고, 이러한 염기서열들을 multi-align system을 통해 적절한 프라이머와 TaqMan 프로브 위치를 선정하고 이를 디자인하였다(도 2-3).
표 1
Set I검출 type 16, 35, 31, 58, 33, 52 　 　
F1 TTAGATTTRBADCCHGARVCAACTGAYCT(서열번호 1) 10p 　
R1 CYGGTTBTGCTTGTCCAKCTGG(서열번호 2) 10p 　
P1-2 CTGYTATGAGCAATTRNVYGRCAGCTCAGA(서열번호 3) 10p FAM-BHQ1
SetII 검출 type 18, 45, 39, 68, 59 　 　
F2-2 GAMATTGTDTTRSATTTRKRDCC(서열번호 4) 10p 　
F2-3 TGCARGAMATTGTRTTRSAKTT(서열번호 5) 10p 　
F2-4 TGCARGAMATTGTDTTRSAKTTRKRDCC(서열번호 6) 　 　
R2-1 TGTGACGYTGTKGTTCRKCYCGTCKRGCT(서열번호 7) 10p 　
P2-4 TTGACCTKBTRTGYYACGAGCAATT(서열번호 8) 10p Cy5-BHQ2
SetIII 검출 type 53, 56, 66, 51, 69, 26, 30 　 　
F3-1 TRTWTTAGAACTDRYACCDCAAAC(서열번호 9) 10p 　
R3-2 GTCTAYTTCATCCTCATCCTCYTCCTCTG(서열번호 10) 10p 　
P3-3 TTGACCTRCADTGCHATGAGCAATTGRAC(서열번호 11) 10p 　HEX-BHQ1
51-69F GATGTWRTATTRSATTTRRYRCC(서열번호 12) 10p 　
26-51-69R ACGCAYATTATCTRYTTCATCCTCMTC(서열번호 13) 10p 　
51-69-P TTGACYTRCAVTGYTACGARCAATTKGAC(서열번호 14) 10p HEX-BHQ1
GAPDH-F CCATCTTCCAGGAGCGAGATCC(서열번호 15) 10p 　
GAPDH-R ATGGTGGTGAAGACGCCAGTG(서열번호 16) 10p 　
GAPDH-P TCCACGACGTACTCAGCGCCAGCA(서열번호 17) 10p Cy5-BHQ2
hTERT-F TGACGTCCAGACTCCGCTTCAT(서열번호 18) 10p 　
hTERT-R TTCTGGCTCCCACGACGTAGTCC(서열번호 19) 10p 　
hTERT-P ACGGGCTGCGGCCGATTGTGAACAT(서열번호 20) 10p FAM-BHQ1
표 1은 본 발명에 사용된 Primer와 Probe 서열
실시예 5. RT-qPCR 수행
Real-time PCR의 반응물의 조성은 25 mM TAPS (pH 9.3 at 25°C), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2,1mM 2-mercaptoethanol,200μMeach dNTP,1unit Taq polymerase(TAKARA)와 상기 표의 Forward primer와 Reverse primer를 각각 10pmole을 넣어주고, probe 또한 10pmole을 넣어 주고, 합성된 cDNA를 2ul를 넣고 최종 부피를 20ul가 되게 수행하였다. PCR 반응은 CFX 96(BioRad-USA)를 이용하여 변성 온도 94℃에서 5분 동안 1회 수행하고, 변성 온도 95℃에서 30초, 어닐링 온도 55℃에서 20초인 사이클을 40회 반복하여 수행하였다. 또한 각각의 어닐링 과정 후 형광을 측정하는 과정을 추가하여, 각 사이클 별로 증가되는 형광 값을 측정하였다.
실시예 6. 결과의 분석
각 실험의 결과는 CFX Manager software v1.6 (Bio-rad)를 이용하여 분석 하였다. HPV E6/7 mRNA PCR의 경우 Ct 값이 35 이하인 경우 양성으로 판독하였고, Ct값이 35 이상인 경우는 음성으로 판독 하였다. hTERT 마커의 경우 GAPDH의 발현양을 기준으로 하여 환자군의 발현양을 비교 정량하여 발현율을 살펴 보았다.
실시예 7. Software 분석을 통한 증폭여부 확인 및 증폭된 산물의 정량
qRT-PCR의 특정유전자 발현량을 정량하는 방법 중 하나인 Comparative Ct Method를 이용하여 하기 관계식에 의거하여 측정하였고 이 공식은 Bio-Rad CFX Manager Software에 내재되어 있어 자동으로 계산되어 나온다.
[관계식 1]
ΔΔCt= ΔCt(sample) - ΔCt(reference gene)
여기에서 Ct값이란 PCR과정 중 증폭이 뚜렷하게 증가되기 시작한 Cycle의 수치를 나타낸다.
ΔΔCt는 하기 도 4에서 세로축의 수치(mRNA expression ratio)를 의미한다.
[관계식 2]
양성대조군에서 hTERT의 발현량 분석 관계식
SKBR3의 ΔCt 값 = SKBR3에서 HER2의 Ct 값 SKBR3에서 reference gene (GAPDH)의 Ct 값
THP-1의 ΔCt 값 = THP-1에서 HER2의 Ct 값 - THP-1에서 reference (GAPDH) gene의 Ct 값
R (발현량) = SKBR3의 ΔCt값 - THP-1의 ΔCt값
[관계식 3]
자궁경부암 환자 조직 샘플에 대한 hTERT의 발현량 분석 관계식
자궁경부암 환자 조직에서의 ΔCt 값 = 자궁경부암 환자 조직에서 hTERT의 Ct 값 - 조직에서 reference(GAPDH) gene 의 Ct 값
THP-1의 ΔCt 값 = THP-1에서 HER2의 Ct 값 - THP-1에서 reference (GAPDH) gene의 Ct 값
R (발현량) = 자궁경부암 환자 조직에서 ΔCt값 - THP-1에서의 ΔCt값
본 실험에서 사용된 reference gene의 Ct 값은 GAPDH에 대한 Ct값을 나타내며, reference gene이란 본 실험에 사용된 GAPDH이외에도 다른 house keeping gene이 포함될 수 있다.
SKBR3 : positive control 로써 실제로 hTERT의 발현이 과발현 되었는지를 확인할 수 있다.
위에서 나온 hTERT의 발현량을 이용하여 GraphPad Prisim 프로그램에 넣어 음성대조군과 세포병리학적 분리에 따라 분석한 결과로 “발현 양 기준으로 10 이상은 양성, 10 아래는 음성”으로 구분하였다. 실제로 세포병리학적으로 SCC-HSIL의 고등급병변 환자군과 정상인 환자 군의 hTERT mRNA의 발현양을 비교한 결과 이 두 그룹에서는 10배 이상의 발현율을 나타내는 것을 확인 할 수 있었다. 따라서 10이하의 hTERT 발현을 나타내는 환자는 SCC-HSIL의 고등급병변 환자군에서는 보여지 않았으며 ASCUS이하 낮은 병변의 환자군 특히 normal-high이하 그룹에서는 hTERT의 발현이 0의 음성으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 17-18). 이와 같이 hTERT mRNA qRT-PCR을 사용하게 되면 낮은 병변에서 높은 발현율을 보일 경우는 암으로 진행할 가능성을 보이는 예측인자로 고등급 병변에서는 정확한 진단으로 결과를 얻게 됨으로써 환자의 진단과 처방에 더 수치화된 객관적인 자료를 제시할 수 있을 것이라고 사료된다.
상기 실시예의 결과는 다음과 같다.
1. 각 타입별 민감도
각 타입별 민감도를 확인해 본 결과 100~10fg에서 검출됨을 확인할 수 있었다(도 4-16).
2. Multiplex real-time PCR을 이용한 16종의 HPV검출
Set I은 FAM dye를 이용하여 HPV type 16, 31, 33, 35, 52, 58이 검출 확인하였으며
Set II은 Cy5 dye를 이용하여 HPV type 18, 39, 45, 59, 68을 검출하였으며
Set III는 HEX dye를 이용하여 HPV type 53, 56, 66, 51, 69이 검출 확인됨을 알 수 있었다(표 2).
표 2
　No. 　 　F2-2(3)mix/R2-1　 F2-4/R2 F2-4/R2-1
　 　 set 1 set 2 set 3 set 1 set 2 set 3 set 1 set 2 set 3
1 HPV-16 19.35 N/A N/A 20.45 24.89 N/A 20.73 N/A N/A
2 HPV-18 N/A 25.29 N/A 22.46 22.57 N/A N/A 22.07 N/A
3 HPV-31 19.13 13.84 N/A 18.4 N/A N/A 20.43 N/A N/A
4 HPV-33 19.98 N/A N/A 19.85 N/A N/A 19.82 N/A N/A
5 HPV-35 19.62 N/A N/A 19.36 N/A N/A 21.48 N/A N/A
6 HPV-39 N/A 28.98 N/A N/A 24.72 N/A N/A 26.06 N/A
7 HPV-45 N/A 26.28 N/A N/A 23.46 N/A N/A 24.36 N/A
8 HPV-51 N/A N/A 28.82 N/A N/A 34.89 N/A N/A 29.56
9 HPV-52 17.57 N/A N/A 18.97 N/A 1.84 16.81 N/A 1.93
10 HPV-53 N/A N/A 23.72 N/A N/A 22.71 N/A N/A 22.8
11 HPV-54 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
12 HPV-56 N/A N/A 22.78 N/A N/A 23.21 N/A N/A 22.77
13 HPV-58 19.77 N/A N/A 19.39 N/A N/A 20.74 N/A N/A
14 HPV-59 N/A 30.26 N/A N/A 25.22 N/A N/A 26.48 N/A
15 HPV-66 N/A N/A 22.27 N/A N/A 19.49 N/A N/A 20.2
16 HPV-68 N/A 26.5 N/A N/A 25.86 N/A N/A 26.58 N/A
17 HPV-69 12.55 N/A 25.4 N/A N/A 26.24 N/A N/A 26.56
18 HPV-06 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
19 HPV-11 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
20 HPV-84 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
21 HPV-87 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
표 2는 HPV 타입에 따른 Multiplex real-time PCR의 검출
3. 임상에서 기존방법(Real-time NASBA)과의 검출 비교 민감도 확인
기존 DNA chip의 결과가 있는 임상검체 68검체와 특이도 검사를 위한 정상인 검체 49의 총 117검체를 대상으로 기존에 나와 있는 Real-time NASBA와의 비교테스트를 진행하였다.
그 결과 정상인 검체에서는 모두 나오지 않음을 확인할 수 있었고, 세포병리학적으로 고등급 병변을 나타내는 총 68개의 임상검체에서 Real-time NASBA(Biometriux, HPV 16, 18, 31, 33, 45의 5개 타입만 검출이 가능)를 수행하였다. Real-time NASBA는 Internal control (IC)에서 양성이 나온 검체에서 각 타겟 유전형별 E6/E7 mRNA를 검출할 수 있다. 68개의 임상검체 중 38검체에서 real-time NASBA의 IC 양성이 나와 각 타겟 유전형별 E6/E7 mRNA를 검출해 본 결과 28/38 (73.7%)의 양성률을 보였으며, 음성이 나온 10개의 검체 중 Real-time NASBA에서 검출할 수 없는 유전형에 대한 검체는 5/38 (13.2%)였으며, Real-time NASBA에서 검출 할 수 있으나 검출되지 않은 경우는 5/38(13.2%)로 나타났다. 반면에 Multiplex Real-time PCR의 경우에서는 real-time NASBA에서 양성이 나온 38개의 검체에서 38/38 (100%)의 양성률을 확인하였다. 또한, Real-time NASBA에서 IC가 음성이 나와 HPV E6/E7 mRNA를 검출하지 하지 못했던 30검체에 대해서도 동일하게 Real-time PCR을 수행한 결과 24/30 (80%)에서 양성이 나옴을 확인할 수 있었다. 이와 같이 Multiplex real-time PCR (62/68, 91.2%)을 수행할 경우 Real-time NASBA (28/68, 41.2%)를 수행하였을 때 보다 50% (34/68) 의 민감도가 높아짐을 확인 할 수 있었다(표 3).
표 3
세포학 결과 DNA chip (Goodgen) Sample No. Real-time NASBA (biomeriux)U1A, 16, 18, 31, 33, 45 type Real time E6-7 PCRPositive rate (%)
Positive rate (%) Negative rate (%)
SCC &ADC High risk 15 11 (73.3%) 4 (26.7%) 15 (100%)
HSIL High risk 23 17 (73.9%) 6 (26.1%) 23 (100%)
SCC* High risk 9 9 (100%) 9 (100%)
HSIL* High risk 21 21 (100%) 15 (71.4%)
Normal Normal 60 0 (0.0%) 60 (100.0%)　 0 (0%)
표 3은 HPV mRNA를 이용한 Real-time NASBA와 Multiplex Real-time PCR의 검출 비교, * Real-time NASBA Internal control 음성인 검체
4. 임상검체를 이용한 HPV E6/7 mRNA Multiplex Real-time PCR의 양성율과 음성율
세포병리학적 검사에서 고등급 병변을 나타내면서 DNA 유전형 검사(DNA chip)에서 HPV 고위험군이 감염된 75개의 검체를 이용해 Multiplex Real-time PCR를 수행한 결과 양성율이 98.7%, 음성율이 1.3% 였다. 또한 세포병리학적 검사에서 정상을 나타내면서 DNA 유전형 검사(DNA chip)에서 HPV에 감염되지 않은 110개의 검체를 이용해 Multiplex Real-time PCR를 수행한 결과 양성율이 0%, 음성율이 100% 였다. 이 결과 검사의 특이도는 100%, 민감도는 98.7%로 기존의 검사법에 비해 매우 높음을 확인할 수 있었다(표 4).
표 4
HPV mRNA Multiplex Real-time PCR
Clinical Specimens Positive Negative 전체
Cytologic Test HPV DNA Chip Test
SCC &HSIL HPV High-risk Positive 74 (98.7 %) 1 (1.3%) 75 (100%)
Normal HPV Negative 0 (0%) 110 (100%) 110 (100%)
표 4는 임상검체로부터 분리한 HPV mRNA를 이용한 Multiplex Real-time PCR의 결과
5. DNA 유전형 검사 (DNA chip)과 HPV E6/7 mRNA Multiplex Real-time PCR의 특이도 비교
정상인의 자궁경부에서도 HPV DNA 양성률이 매우 높게 나오고 있기 때문에 mRNA를 표적으로 한 검사의 유용성을 확인하고자 세포병리학적 검사에서 정상으로 나왔으나 DNA 유전형 검사(DNA chip)에서 HPV 고위험군으로 감염된 66개의 검체를 이용해 Multiplex Real-time PCR를 수행하였으며 그 결과 6.3%(6/95)가 검출되어 DNA chip에 대한 위양성 문제를 줄일 수 있음을 확인하였다 (표 5)
표 5
No. Molecular No. Cytology Result (Goodgen kit) Multiplex
1 M-11-1392 - 16 28.95
2 M-11-150 - 52 30.14
3 M-11-917 - 31 32.88
4 M-11-551 - 58 undetermined
5 M-11-672 - 16, 33 undetermined
6 M-10-1708 - 16 undetermined
7 M-11-152 - 16 undetermined
8 M-11-106 - 52 undetermined
9 M-10-1578 - 16 undetermined
10 M-11-149 - 16 undetermined
11 M-10-1299 - 58 undetermined
12 M-11-119 - 35, 66 32.54
13 M-10-993 - 33 undetermined
14 M-10-1170 - 16 undetermined
15 M-10-1517 - 58 undetermined
16 M-11-52 - 16 undetermined
17 M-11-94 - 31 undetermined
18 M-11-104 - 33, 58 undetermined
19 M-11-253 - 16 undetermined
20 M-11-286 - 16 undetermined
21 M-11-287 - 16 undetermined
22 M-11-327 - 16 undetermined
23 M-11-389 - 33, 58 undetermined
24 M-11-466 - 16, 18 undetermined
25 M-11-467 - 16, 18, 39, 58, 68 undetermined
26 M-11-486 - 16 undetermined
27 M-11-605 - 18, 58 undetermined
28 M-11-617 - 16, 18 undetermined
29 M-11-623 - 33 undetermined
30 M-11-633 - 16, 18 undetermined
31 M-11-696 - 33 undetermined
32 M-11-742 - 18, 35 undetermined
33 M-11-925 - 16 undetermined
34 M-11-858 - 58, 68 undetermined
35 M-11-948 - 16 undetermined
36 M-11-964 - 16 undetermined
37 M-11-986 - 58 undetermined
38 M-11-993 - 16, 58 undetermined
39 M-11-1027 - 16 undetermined
40 M-11-1038 - 58 undetermined
41 M-11-1042 - 16 undetermined
42 M-11-1043 - 16 undetermined
43 M-11-1057 - 16, 68 undetermined
44 M-11-1059 - 58 undetermined
45 M-11-1083 - 16, 18, 56 undetermined
46 M-11-1084 - 16 undetermined
47 M-11-1087 - 16, 18 undetermined
48 M-11-1088 - 16 undetermined
49 M-11-1416 - 16, 58 undetermined
50 M-11-1454 - 16, 18 undetermined
51 M-11-1497 - 52 undetermined
52 M-11-1536 - 16, 18, 33 undetermined
53 M-11-1543 - 16, 39, 66 undetermined
54 M-11-1562 - 16 undetermined
55 M-11-1563 - 33 undetermined
56 M-11-1637 - 16 undetermined
57 M-11-1658 - 16, 18, 39 undetermined
58 M-11-1663 - 52 undetermined
59 M-11-1669 - 16 undetermined
60 M-11-1747 - 18, 58 26.52
61 M-11-1748 - 16 undetermined
62 M-11-1798 - 16 undetermined
63 M-11-1799 - 33 undetermined
64 M-11-1812 - 16 undetermined
65 M-11-1897 - 18, 58 undetermined
66 M-11-1932 - 16 undetermined
67 M-11-47 - 18 undetermined
68 M-10-1056 - 66 33.3
69 M-10-1542 - 56 undetermined
70 M-10-1651 - 45 undetermined
71 M-11-69 - 45 undetermined
72 M-11-73 - 56 undetermined
73 M-11-239 - 59 undetermined
74 M-11-241 - 18 undetermined
75 M-11-328 - 18 undetermined
76 M-11-460 - 68 undetermined
77 M-11-472 - 18, 56 undetermined
78 M-11-523 - 18 undetermined
79 M-11-729 - 18 undetermined
80 M-11-738 - 18 undetermined
81 M-11-846 - 18 undetermined
82 M-11-919 - 18 undetermined
83 M-11-1089 - 39 undetermined
84 M-11-1154 - 18 undetermined
85 M-11-1535 - 45 undetermined
86 M-11-1654 - 69 undetermined
87 M-11-1661 - 18 undetermined
88 M-11-1718 - 66 undetermined
89 M-11-1728 - 18 undetermined
90 M-11-1793 - 66 undetermined
91 M-11-1808 - 68 undetermined
92 M-11-1809 - 56, 69 undetermined
93 M-11-1894 - 18 undetermined
94 M-11-320 - 66 undetermined
95 M-11-1880 - 56 undetermined
표 5는 DNA를 이용한 DNA chip 결과와 mRNA를 이용한 Multiplex real-time PCR의 결과 비교
6. multiplex real-time PCR을 이용한 HPV E6/E7 mRNA의 검출빈도
세포병리학적으로 분리된 총 545의 샘플과 49 조직학적샘플을 이용하여 multiplex real-time PCR을 이용하여 HPV E6/E7 mRNA의 검출빈도를 각각 확인해봤다. 그 결과 세포병리학적분류에 따라 SCC에서 17/18(94.4), HSIL에서 20/21(95.2%), ASC-H에서 14/17(82.4%), LSIL에서 49/101(48.5%), ASC-US에서 21/100(21%), Normal high에서 3/98(3.1%), Normal 샘플에서 0/198(0%) 양성을 보여줬다(도 17-18). 또한 조직학적 분류에 따라 SCC에서 22/20(91%), CIN3+에서 14/16(88%), CIN2+에서 6/7(86%), 그리고 CIN1에서 2/4(50%) 각각 양성을 나타냈다(도 17-18).
7. hTERT real-time PCR을 이용한 발현양 비교
세포병리학적), 조직학적 검사에서 나온 검체를 대상으로 hTERT 발현여부를 확인하였다(표 6). hTERT 발현양을 확인한 결과 정상인에서는 모두 상대적 발현양이 10이상을 나타낸 사람이 없는 반면 SCC, HSIL과 ASC-H의 고등급병변에서 모두 10이상의 높은 발현율을 보였으며, ASCUS에서는 40% (40/100)와 LSIL에서는 35.6%(36/101)의 환자가 10이상의 발현양을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 19).
표 6
세포학적 진단 샘플 수 조직학적 진단 샘플 수
SCC 18(3.3%) Sqaumouscarcinoma 16 (33%)
Adenocarcinoma 1 (2%)
HSIL 21(3.9%) Sqaumouscarcinoma 4 (8%)
CIN3 13 (27%)
CIN2 3 (6%)
ASC-H 17(3.1%) Sqaumous carcinoma 1 (2%)
CIN3 3 (6%)
CIN2 4 (8%)
CIN1 4(8%)
LSIL 101(18.5%) - -
ASCUS 100(18.3%) - -
Normal-High 90(16.5%)
Normal 198(36.3%) 　 　
전체 545(100%) 　 49(100%)
표 6은 hTERT real-time PCR의 발현양 비교에 사용된 세포학적, 조직학적 검체
8. HPV E6/7 mRNA multiplex real-time PCR 과 hTERT real-time PCR의 양성율 비교
hTERT real-time PCR을 이용하여 발현양상을 비교한 동일 검체를 이용하여 HPV E6/7 mRNA multiplex real-time PCR를 진행하였으며 두 가지 방법의 양성율을 비교하였다. 그 결과 세포학적 분류를 통해 SCC에서 총 18검체 중 16검체(88.9%)가 모두 양성발현을 보였으며 나머지 두 검체 중 한 검체는 HPV E6/7 mRNA PCR에서, 다른 한 검체는 hTERT real-time PCR에서 양성율을 보였다. 그리고 HSIL에서는 21검체 중 20(95.2%) 검체가 두 가지 방법에서 모두 양성을 보였으나 한 검체에서는 hTERT real-time PCR에서만 양성을 나타냈다. ASCUS-High의 경우 17검체 중 14(82.4%)검체가 두 방법에서 모두 양성을 보였으며 나머지 3검체에서는 hTERT real-time PCR에서만 양성을 나타냈고, ASCUS에서 총 100검체 중 6(6%)검체에서만 두 가지 방법에서 양성을 보였으며 34검체에서는 hTERT real-time PCR에서만 양성 발현율을 보였고, 15검체에서는 HPV E6/7 mRNA multiplex real-time PCR에서만 양성을 나타냈고 나머지 45검체에서는 모두 음성을 나타냈다. LSIL의 경우 101검체 중 16(15.8%)검체가 두 가지 방법에서 양성을 보였으며 18검체에서는 hTERT real-time PCR에서만 양성발현율을 보였고 33검체에서는 HPV E6/7 mRNA multiplex real-time PCR에서만 양성을 나타냈고 나머지 34검체에서는 모두 음성을 나타냈다(표 7). 또한 조직학적 분류를 통해 SCC에서 총 22 검체 중 20검체(90.9%)가 두 방법 모두에서 양성발현을 보였으며 나머지 두 검체는 hTERT 발현에만 양성을 보였다. 그리고 CIN3에서는 16검체중 14검체(87.5%)가 두 가지 방법에서 모두 양성을 보였고 나머지 두 검체(12.5%)에서는 hTERT 발현에만 양성을 보였고 CIN2에서는 총 7검체 중 6검체(85.7%)가 두 가지 방법에서 양성을 나타냈고 나머지 한검체(14.3%)에서는 hTERT에만 양성을 보였다. 또한 CIN1에서 총 4 검체 중 2검체(50%)가 두 방법에서 모두 양성을 보였으며 나머지 2검체(50%)는 hTERT에서만 양성을 나타냈다(표 8).
hTERT mRNA는 정상인 그룹샘플과 비교하여 ASC-H(P=0.928)와 HSIL/SCC(P=0.817) 환자의 고등급 병변 그룹샘플에서 발현이 증가되는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 LSIL과 ASC-US와 같은 저등급병변에서 CIN2+이상의 양성률을 Real-time PCR법을 비교해 본 결과 HPV E6/E7 와 hTERT mRNA법에서 동시에 양성을 보인 검체는 9/43(20.9%)이었으며, HPV E6/E7 mRNA PCR법에서 20/43(46.5%)와 hTERT mRNA PCR법에서 12/43(27.9%)에서 각각 단독으로 양성을 보였다. 또한 3가지 방법 모두를 포함한 Real-time PCR법과 HPV DNA test법을 비교해 본 결과 각각 41/43(95.3%)와 30/43(69.8%)의 양성률을 나타내 HPV E6/E7 mRNA PCR법과 hTERT mRNA PCR법을 동시에 진행할 때 HPV DNA법보다 높은 민감도를 보이는 것을 확인할 수 있었다(표 9). 본 결과에서 HPV DNA법과 HPV mRNA E6/E7법을 세포병리학적분류에서 정상으로 나온 98검체를 이용하여 비교실험한 결과 HPV DNA법(HPV DNA genotype(Goodgene, Seoul, Korea)에서는 98/98(100%), REBA HPV-ID(M&D, Wonju, Korea)에서는 61/98(62.2%)에서 양성을 보였으나, HPV mRNA E6/E7법은 3/98(3.1%)만이 양성을 보여줬다. 따라서 HPV DNA법은 민감도는 우수하나 특이도가 나쁘기 때문에 암을 포함한 고등급병변(암을 일으킬 수 있는)에 대한 진단법으로는 사용할 수 없음을 다시한번 확인 할 수 있었으며 이를 대체할 수 있는 다른 진단법(HPV mRNA E6/E7법과 HPV hTERT mRNA법)이 필요한 것으로 보여진다. SCC와 HSIL, 그리고 ASCUS-High등의 고등급병변에서 각각 단독의 real-time PCR 보다는 두 가지 방법을 동시에 진행하였을때 100%의 양성율을 보였으며, LSIL이나 ASC-US등의 저등급병변에서도 95%이상의 양성률을 보여줬다. 또한 세포병기가 낮아질수록 hTERT real-time PCR보다는 HPV E6/7 mRNA multiplex real-time PCR에서 양성율을 나타내어 hTERT mRNA법이 암에 대해 과발현을 일으키는 중요한 마커로 다시한번 확인되었고, 따라서 hTERT real-time PCR을 추가로 진단함으로써 암으로 진행할 가능성을 예측할 수 있는 예측인자로서 자궁경부암 진단에 유용함을 확인할 수 있었다.
표 7
hTERT positive hTERT negative
　 HPV E6/7 positive HPV E6/7 negative HPV E6/7 positive HPV E6/7 negative
SCC 16/18 (88.9%) 1/18 (5.6%) 1/18 (5.6%) 　
HSIL 20/21 (95.2%) 1/21 (4.8%) 　 　
ASCUS-H 14/17(82.4%) 3/17(17.6%) 　 　
LSIL 16/101(15.8%) 18/101(17.8%) 33/101 (32.7%) 34/101 (33.7%)
ASCUS 6/100(6%) 34/100 (34%) 15/100 (15%) 45/100 (45%)
전체 74/256 (28.9%) 55/218 (25.2%) 48/201 (23.9%) 79/201 (39.3%)
표 7은 세포학적 분류에 따른 HPV E6/7 mRNA multiplex real-time PCR과 hTERT real-time PCR의 양성율 비교
표 8
　 hTERT positive hTERT negative
HPVE6/E7positive HPV E6/E7 negative HPV E6/E7 positive HPVE6/E7 negative
SCC 20/22(90.9%) 2/22(9.1%) 0/0(0) 0/0(0)
CIN3 14/16(87.5%) 2/16(12.5%) 0/0(0) 0/0(0)
CIN2 6/7(85.7%) 1/7(14.3%) 0/0(0) 0/0(0)
CIN1 2/4(50%) 2/4(50%) 0/0(0) 0/0(0)
표 8은 조직학적 분류에 따른 HPV E6/7 mRNA multiplex real-time PCR과 hTERT real-time PCR의 양성율 비교
표 9
세포학 조직학 Real-time PCR HPV DNA test
All + HPV E6/7 +hTERT+ hTERT + HPV E6/7+
LSIL SCC (n=10) 9 (90%) 2 (20%) 3 (30%) 4 (40%) 8 (80%)
CIN3 (n=8) 8 (100%) 3 (37.5%) 1 (12.5%) 4 (50%) 6 (75%)
CIN2 (n=7) 6 (85.7%) 2 (28.6%) 1 (14.3%) 3 (42.9%) 6 (85.7%)
CIN1 (n=27) 27 (100%) 7 (25.9%) 10 (37%) 10 (37%) 23 (85.2%)
ND (n=17) 17 (100%) 3 (17.6%) 4 (23.5%) 10 (58.8%) 14 (82.4%)
ASC-US SCC (n=9) 9 (100%) 2 (22.2%) 4 (44.4%) 3 (33.3%) 4 (44.4%)
CIN3 (n=7) 7 (100%) 0 3 (42.9%) 4 (57.1%) 5 (71.4%)
CIN2 (n=2) 2 (100%) 2 (100%) 1 (50%)
CIN1 (n=11) 11 (100%) 4 (36.4%) 5 (45.5%) 2 (18.2%) 9 (81.8%)
ND (n=27) 27 (100%) 3 (11.1%) 19 (70.4%) 5 (18.5%) 20 (74.1%)
Total 125 123 (98.4%) 26 (18.4%) 50 (40%) 47 (37.6%) 96 (76.8%)
표 9는 저등급병변(LSIL과 ASC-US)에서 Real-time PCR법과 HPV DNA 법을 이용하여 세포병리학과 조직학적 분류에 따른 양성률 비교

Claims (8)

  1. a) 환자의 혈액에서 얻은 세포로부터 전장 RNA를 분리하는 단계;
    b) 상기 분리된 전장 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계;
    c) 상기 합성된 cDNA를 HPV 타입 16, 35, 31, 58, 33, 및 52를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브;
    HPV 타입 18, 45, 39, 68, 및 59를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브;
    HPV 타입 53, 56, 66, 51, 69, 26, 및 30을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍 및 프로브; 및
    GAPDH(gyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 및 hTERT(human telomerase reverse transcriptase) 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 프로브를 이용하여 실시간-PCR을 수행하는 단계; 및
    d) 상기 발현된 양을 정상인에 대해 발현된 양과 비교하는 단계;를 포함하는 자궁경부암의 진단을 위한 정보제공방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 HPV 타입 16, 35, 31, 58, 33, 및 52를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 1 및 2에 기재되고, 프로브는 서열번호 3에 기재된 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 정보제공방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 HPV 타입 18, 45, 39, 68, 및 59를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 4 내지 7에 기재되고, 프로브는 서열번호 8에 기재된 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 정보제공방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 HPV 타입 53, 56, 66, 51, 69, 26, 및 30을 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 9 및 10, 또는 12 및 13에 기재되고, 프로브는 서열번호 11 또는 14에 기재된 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 암의 진단을 위한 정보제공방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 GAPDH 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 15 및 16에 기재되고, 프로브는 서열번호 17에 기재되며, 상기 hTERT 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 18 및 19에 기재되고, 프로브는 서열번호 20에 기재된 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 암의 진단을 위한 정보제공방법.
  6. HPV 타입 16, 35, 31, 58, 33, 및 52를 증폭할 수 있는 서열번호 1 및 2에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 3에 기재된 염기서열을 가지는 프로브;
    HPV 타입 18, 45, 39, 68, 및 59를 증폭할 수 있는 서열번호 4 내지 7에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 8에 기재된 프로브;
    HPV 타입 53, 56, 66, 51, 69, 26, 및 30을 증폭할 수 있는 서열번호 9 및 10 또는 12 및 13에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 11 또는 14에 기재된 프로브; 및
    GAPDH 유전자를 증폭할 수 있는 서열번호 15 및 16에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 17에 기재된 프로브, 및 hTERT 유전자를 증폭할 수 있는 서열번호 18 및 19에 기재된 프라이머쌍과 서열번호 20에 기재된 프로브로 구성된 프라이머쌍 및 프로브를 포함하는 자궁경부암의 진단을 위한 프라이머쌍 및 프로브 조성물.
  7. 제 6항의 프라이머 쌍 및 프로브 조성물을 유효성분으로 포함하는 자궁경부암 진단용 조성물.
  8. 제6항의 조성물을 포함하는 자궁경부암 진단용 키트.
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