CN101168779B - 一种检测结核杆菌的试剂盒及其专用探针与引物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测结核杆菌的试剂盒及其专用探针与引物，本发明所提供的专用探针的碱基序列如SEQ IN NO：3所示，所述专用引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物的碱基序列如SEQ IN NO：1所示，所述反向引物的碱基序列如SEQIN NO：2所示。用本发明的方法检测结核杆菌具有快速简单、灵敏度高、特异性强的优点，解决了现有结核杆菌检测方法中检测周期长、阳性率低的不足，具有重要的实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测细菌的试剂盒及其专用探针与引物，特别是涉及一种检测结核杆菌的试剂盒及其专用探针与引物。
背景技术
结核病是严重危及全球的公共卫生问题之一，自1985年以来结核病疫情在全球范围内急剧上升，据世界卫生组织报道，目前全球有近1/3的人感染了结核杆菌，即20亿人口感染了结核杆菌，其中活动性肺结核病人约2000万，每年新增结核病人约800万-1000万，每年约有300万人死于结核病。结核病已成为导致全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。我国是全球22个结核病高发国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。据2000年全国结核病流行病学抽样调查估计，全国现有活动性肺结核病人450万，其中传染性肺结核病人150万。
临床诊断肺结核的主要依据是检测痰液中结核分枝杆菌(MycobacteriumTuberculosis，TB)，其中，涂片法简单易行，但阳性率较低；罗氏培养法虽然是金标准，但检测周期长，均难以满足临床需要。近年来，作为分枝杆菌种系鉴定及药敏的许多分子生物学方法得到长足发展，这些方法能将诊断的时间从几周缩短到几天，其中实时荧光定量PCR因其技术成熟，具有较高的灵敏性和特异性，已逐步应用到临床中。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测结核杆菌的专用探针和引物。
本发明所提供的专用探针，其碱基序列如SEQ IN NO：3所示；专用引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物的碱基序列如SEQ IN NO：1所示，所述反向引物的碱基序列如SEQ IN NO：2所示。
所述探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。
本发明的第二个目的是提供一种用于结核杆菌检测的试剂盒。
本发明所提供的结核杆菌检测试剂盒包括上述检测结核杆菌的特异性探针及通用引物。
为了方便使用，本发明所提供的结核杆菌检测试剂盒还包括结核杆菌基因PCR扩增试剂，以及结核杆菌标准品。
所述结核杆菌基因PCR扩增试剂为2×Probe-PCR Master Mix。
所述结核杆菌标准品包括阳性定量参考品、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品，其中阳性定量参考品的浓度梯度为108、107、106、105copies/mL。
本发明的第三个目的是提供一种利用上述试剂盒对结核杆菌进行检测的方法。
本发明所提供的检测结核杆菌的方法，是以待测痰液提取的DNA为模板，用上述试剂盒进行荧光定量PCR检测。
本发明针对现有结核杆菌检测方法检测周期长、阳性率低的不足，提供了一种快速简单、特异性较强、灵敏度较高的检测结核杆菌的试剂盒，可广泛用于结核杆菌的诊断，具有重要的实际应用价值。利用本发明方法对疑似结核痰标本50例进行检测，结果表明，阳性检出准确率达98％以上，表明该方法具有较高的检出率。
附图说明
图1为定量曲线
图2为琼脂糖凝胶电泳验证本发明试剂盒的可靠性
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、检测结核杆菌的专用探针和引物的设计
根据对NCBI数据库结核杆菌基因序列分析，以Genbank号分别为CP000717.1，
CP000611.1，AM408590.1，DQ217928.1，AF189827.1，AF189829.1，AF189826.1，AF189824.1，AF189762.1，AF189761.1，AF189757.1，AF189755.1，AF189753.1，AE000516.2，BX248343.1，Z48304.1，AJ879180.1，AJ879179.1，Y15749.1，BX842582.1，BX842581.1，BX842583.1，BX842580.1，BX842579.1，BX842578.1，BX842577.1，BX842576.1，BX842574.1，AF357173.1，AF357166.1，AF390039.1，AF181860.1，X98154.1，AJ242908.1，AJ242907.1，X52471.1，Y14614.1，Y14613.1，X17348.1，X57835.2，Y14048.1，Y14047.1，Y14046.1，Y14045.1，AD000007.1，AD000019.1，Y17220.1，Y17219.1，Y15805.1，AJ345006.1的保守序列，经ClustalW软件对比找出其保守序列区的相同序列，经NCBI-Blast分析，与其他微生物无同源性序列，并在此区域设计探针及相应的引物。
其专用探针的碱基序列如SEQ IN NO：3所示。专用引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物的碱基序列如SEQ IN NO：1所示，所述反向引物的碱基序列如SEQ IN NO：2所示。
实施例2、用本发明的试剂盒对待测样品进行荧光定量检测
一、样品来源
深圳出入境检验检疫局疑似结核痰标本50例。
二、痰液中结核杆菌DNA的提取
1、痰液样品的预处理
1)吸取待测痰液200uL放入1.5mL的eppendo管中，加入5mol/L NaOH 500uL，混匀，室温中摇动20分钟。
2)加入1mol/L NaH2PO4 700uL，混匀(起中和作用)，10,000rmp离心5分钟。
3)去上清液，补加TE至100uL，混匀，加入20uL浓度为50mg/mL的溶菌酶。
4)置37℃消化30分钟。
2、DNA的提取
1)细胞复合裂解液置65℃水浴中，使其中的结晶溶解。
2)将300uL结晶已溶解的细胞复合裂解液加入到上述预处理好的痰液样品中，混璇器震荡混匀20秒，置65℃水浴中反应20分钟。
3)加入200uL蛋白沉淀液，上下颠倒5-6次使两者混匀。
4)13000-16000rmp离心3-5分钟。
5)将上清液(约500uL)转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，此时可见透明的絮状物，混匀后13000-16000rmp离心3-5分钟，倾去上清。
6)加入200uL 70％的乙醇溶液，来回倒置，清洗管壁，13000-16000rmp离心3-5分钟。
7)吸去70％乙醇，倒置离心管于干净的滤纸上，自然干燥15分钟左右，加入30uL DNA溶解液，快速漩涡震荡1-2秒，使沉淀的DNA完全溶解。
三、标准品的制备及曲线的绘制
1、标准品的制备
标准品包括：阳性定量参考品、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品。可以用本发明试剂盒中提供的标准品，也可以按照如下方法配制。
以结核杆菌阳性DNA样品2uL做为PCR反应的模板，加入PCR反应液23uL，PCR反应液中含有10X PCR Buffer3uL、25mmol/L MgCl21.2uL、10mmol/L dNTPs 3uL、4U/uL Taq DNA聚合酶0.5uL及10pmol/μl上、下游引物各1uL，灭菌双蒸水13.3μl。于PT-200 PCR扩增仪进行如下循环：先94℃预变性4min；然后94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物经1.5％琼脂糖电泳，凝胶回收试剂盒回收PCR电泳产物，与线性化后的pMD18-T载体(Invitrogen公司)4℃下连接12h-16h，连接反应体系中含有PCR凝胶回收产物3uL、连接缓冲液5uL、线性化后的pMD18-T载体1uL和T4连接酶1uL，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，转化后的细胞涂布于含有氨苄青霉素抗性的1.5％琼脂固体LB培养基上，37℃倒置培养12h-16h，用灭菌牙签挑取单克隆，接种于含50mg/mL氨苄青霉素的5mL液体LB培养基中，200rpm摇床37℃震摇过夜；取1.6mL过夜培养物，抽提质粒，经PCR初步鉴定，对阳性克隆进行测序分析，将筛选出的阳性菌株进一步扩增，抽提质粒DNA，用核酸蛋白紫外分析仪准确定量(连续测定4次，每次重复4管，取均值)，并进行10倍系列稀释，得到浓度分别为108、107、106、105copies/mL的4个标准品，既为阳性定量参考品。
阴性质控品以生理盐水制备，强阳性质控品和临界阳性质控品根据浓度和拷贝数以标准品经灭菌水稀释后制得。
2、曲线的绘制
反应液总体系为20uL，每份反应液中含有2×Probe-PCR Master Mix 10uL，上、下游引物(10umol/uL)各0.5uL，探针(10umol/uL)0.2uL，高压灭菌水6.8uL，结核杆菌阳性DNA样品2uL。
反应条件为：95℃15min(×1)，94℃ 10s→60℃ 20s→72℃ 30s(×40)。
按照上述反应体系及反应条件，随着PCR体系在每一个循环结束后测定吸光值，就得到了以循环数为横坐标、吸光值为纵坐标的定量曲线和以标准品浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标的标准曲线。
定量曲线结果如图1所示，从图1中可以看出，各个稀释度标准阳性株在第一个循环结束后测到一个基础吸光值，接下来一直到第15个循环结束时都没有明显变化。从第16个循环开始其中一个反应的吸光值增大，定量曲线开始抬头；20个循环(Ct值)后，曲线迅速上扬，至第33个循环前后达到峰值，随后进入平台期，一直到反应结束。阴性对照未出现扩增曲线。
四、实时荧光定量PCR检测
1、待测样品的检测及其检测结果
按照步骤三中2的反应体系和反应条件对待测样品进行检测，并与标准曲线进行比较。结果表明，经本发明试剂盒检测，在50例疑似结核痰标本中，结核杆菌阳性有49例，阳性率为98％。
2、重复性实验
重复测定阳性DNA五次，分别得到五个Ct值，Ct值分别是15.68、20.81、25.74、28.47、32.38，标准差分别是0.11、0.07、0.65、0.22、0.27，变异系数分别是0.67％、0.32％、2.52％、0.76％、0.83％，计算平均Ct值、标准差和变异系数。结果表明，随着拷贝数的降低，Ct值增大，标准差和变异系数也呈逐渐增大的趋势。
3、本发明试剂盒检测结果可靠性验证
为了验证本发明试剂盒检测结果的可靠性，对实时荧光定量PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。其中，1、2为反应产物，3为124bp的阳性对照，N为阴性对照，M为100bp Marker。检测结果与目的片段大小一致，对PCR反应产物测序，经NCBI-Blast分析，结果表明，产物序列为结核杆菌基因序列。
利用本发明试剂盒进行的检测过程可以用罗氏LightCycler仪器来完成，软件版本是3.5，具体操作过程如下：
(1)加样
取提取物样品(包括待测样品、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品)上清液2uL以及阳性定量参考品2uL，分别加入专用毛细管中，盖上PCR反应盖(注意：盖反应盖时，手用力方向要垂直，以免毛细管断裂)4000rpm离心3分钟，按顺序插入圆形卡盘倒置20秒钟后放入仪器。
(2)结果分析
反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光记数值(Fluorescence)为F1/F2，点击Quantification进入分析界面。在Analysis栏选择Fit Points，Baseline Adjustment栏选择Proportional，调节噪声容限至基线噪声以上，要求在Step3：Analysis下r数值介于-1.0～-0.97。
记录Calculated Concentration下面仪器自动分析计算出的未知标本数值(C)。
(3)质量控制
阴性质控品：Ct值为空白；
阳性质控品：增长曲线呈S型曲线，且强阳性质控品定量参考值在5.0×105IU/mL-5.0×107IU/mL范围，临界阳性质控品定量参考值在2.0×102IU/mL-5.0×104IU/mL范围；(参考值为仪器自动分析计算出的数值)
阳性定量参考品：增长曲线呈S型曲线，Ct值＜37，且0.97≤|r|≤1；
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
(4)结果判定
Ct值＜33为阳性，且Ct值＜33时定量值有参考意义；Ct值＞33时，定量值无参考意义。
五、本发明试剂盒检测灵敏度、线性范围和特异性的确定
1、本发明试剂盒检测灵敏度的确定
对阳性样本以10倍梯度进行稀释，最低浓度为1.0×10IU/mL，然后以各浓度稀释液为模板进行实时PCR检测。结果表明，荧光信号随样本浓度下降而降低，1.0×103IU/mL浓度以上的可以检测到荧光信号，因此确定本发明试剂盒对处理后样品检测的灵敏度为1.0×103IU/mL。
2、本发明试剂盒检测线性范围的确定
对DNA浓度为1.0×10-1.0×1010IU/mL的标准品进行检测，发现浓度小于1.0×103IU/mL和大于1.0×108IU/mL的增长曲线不呈S型曲线，不在检测的线性范围之内，可见，本发明试剂盒检测的线性范围为1.0×103-1.0×108IU/mL。
(1)如果增长曲线不呈S型曲线、Ct值为空白或Ct＞33则样品的结核杆菌DNA总含量小于检测极限。
(2)如果增长曲线呈S型曲线且Ct值＜33，则按以下方法判断：
若样品的C＜1.000E+03，则样品的结核杆菌DNA总含量＜1.0×103IU/mL；
若样品的1.000E+03≤C≤1.000E+08，则样品的结核杆菌DNA总含量＝C IU/mL；
若样品的C＞1.000E+08，则样品的结核杆菌DNA总含量＞1.0×108IU/mL。
当样品的C＞1.000E+08时，若需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。
3、本发明试剂盒特异性实验
分别用结核杆菌DNA提取物、金黄色葡萄球菌DNA提取物、肺炎链球菌DNA提取物、肺炎克雷伯杆菌DNA提取物为模板进行实时PCR检测。结果只有以结核杆菌DNA为模板的样品检测到荧光信号，以金黄色葡萄球菌DNA提取物、肺炎链球菌DNA提取物、肺炎克雷伯杆菌DNA提取物为模板的PCR反应，均未检测到荧光信号。
实施例3、用痰涂片和影像学诊断结果为阳性的样品对本发明试剂盒的检验结果进行验证
一、样品来源
深圳出入境检验检疫局提供的痰涂片和影像学诊断结果为结核杆菌阳性的患者痰液共109例。
二、检测方法、步骤和结果
检测方法和步骤同实施例2。
结果表明，经本发明试剂盒检测，结核杆菌阳性有108例，阳性率为99％。
序列表
<160>3
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cggtcttgtataggccgttgat 22
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
cagtacacatcgatccggttca 22
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ttgtcataggagcttccgaccgc 23
Claims (4)
1.一种检测结核杆菌的试剂盒，包括用于检测结核杆菌的专用引物和用于检测结核杆菌的专用探针；
所述用于检测结核杆菌的专用引物，由正向引物和反向引物组成，所述正向引物的碱基序列如SEQ IN NO：1所示，所述反向引物的碱基序列如SEQ IN NO：2所示；
所述用于检测结核杆菌的专用探针，其碱基序列如SEQ IN NO：3所示；
所述用于检测结核杆菌的专用探针的3’端连接有一个淬灭荧光基团TAMRA，5’端连接有一个报告荧光基团FAM。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括结核杆菌基因PCR扩增试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增试剂为2×Probe-PCR Master Mix。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括结核杆菌标准品，该标准品包括阳性定量参考品、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品，其中阳性定量参考品的浓度梯度为108、107、106、105copies/mL。
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