CN103038347A - 使用双重实时聚合酶链式反应和解链曲线分析对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的引物，所述引物分别对结核分枝杆菌特异性的IS6110基因和非结核分枝杆菌特异性的16S rRNA基因具有特异性；包含所述引物的结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的检测试剂盒；以及通过使用所述引物的双重实时聚合酶链式反应和通过解链曲线分析检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的方法。因为本发明不使用序列特异性探针，本发明可提供低成本地对结核分枝杆菌和/或非结核分枝杆菌同时且更有效地进行快速检测的临床诊断手段。

Description

使用双重实时聚合酶链式反应和解链曲线分析对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法
技术领域
本发明涉及结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）和非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria）的检测。更具体而言，本发明涉及能够对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的特异性核苷酸序列进行检测的引物组、包含所述引物组的用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒、以及使用所述引物组通过双重实时PCR和解链曲线分析对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌同时进行检测的方法。
背景技术
非结核分枝杆菌广泛分布于环境中，尤其是分布于湿土、沼泽地和河流中，并且在发现其机会致病特征（opportunistic character）前认为其是非致病菌。在20世纪80年代，发现非结核分枝杆菌为获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者中的肺病的机会致病菌。另外，还已知所述细菌导致其他患者中的疾病。随着对非结核分枝杆菌致病机制的报道，已逐渐认识到其临床意义。
近年来，在结核病患病率低的美国和许多欧洲国家可见由非结核分枝杆菌引起的感染发病率的增高。韩国在结核病患病率方面已有所降低，但是在非结核分枝杆菌感染数方面相对增高。多亏韩国于2009年对进行结核病菌液体培养给予医疗保险的政策，设计用来进行液体培养的实验室数目增多。比起固体培养，更常用液体培养来对非结核分枝杆菌进行检测。报道显示，当通过液体培养进行测定时，在约12%的痰涂片阳性结核病病例中检测到了非结核分枝杆菌，而分离自痰中的非结核分枝杆菌占日本、香港和韩国的肺病病例的约10～20%，占美国、加拿大和西欧的肺病病例的约40～50%。
由非结核分枝杆菌引起的肺病类似于结核病，发展缓慢，容易被误诊。然而，由于有效抑制结核分枝杆菌的药物不同于有效抑制非结核分枝杆菌的药物，因此需要快速且准确地分辨结核杆菌（tubercle bacilli）和非结核分枝杆菌，以便可以选择合适的药物。
当前所使用的检测试剂并不仅是非结核分枝杆菌所固有的，而且还利用了结核分枝杆菌的核苷酸序列。传统试剂在检测和诊断的准确度方面有问题。例如，当仅存在一定浓度的结核分枝杆菌时，所述试剂不对用于检测结核分枝杆菌的引物起反应，而是仅对用于非结核分枝杆菌的引物起反应，以致错误地将非结核分枝杆菌鉴定为结核杆菌。另一方面，当非结核分枝杆菌与结核分枝杆菌同时存在时，只有非结核分枝杆菌可通过传统试剂加以检测。因此，需要能够识别在结核分枝杆菌中缺失、但在非结核分枝杆菌中固有的核苷酸序列的引物组，以及使用所述引物组快速且准确地分别对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供对结核分枝杆菌所独有的IS6110基因具有特异性的引物组，以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，二者分别适用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行准确检测和诊断。
本发明的另一目的是提供用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含对结核分枝杆菌所独有的IS6110基因具有特异性的引物组以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，二者分别适用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行准确检测和诊断。
本发明的另一目的是提供用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行准确检测和诊断的方法，所述方法使用基于所述引物组的双重实时聚合酶链式反应及解链曲线。
技术方案
根据本发明的一个方面，本发明提供了对非结核分枝杆菌的16SrRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQ IDNO:3的核苷酸序列的正向引物；选自于由SEQ ID NO:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物；以及具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的反向引物。
根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含：对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向引物；以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQ ID NO:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物和具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的反向引物。
根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法，所述方法包含：由测试对象中分离DNA；通过双重实时PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增：对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组（包含如下引物：具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向引物）和对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组（包含如下引物：具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQ IDNO:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物和具有SEQ IDNO:7的核苷酸序列的反向引物）；将所扩增的DNA产物加热至不同温度，以产生解链曲线；以及对所述解链曲线进行分析，以确定目标DNA的解链温度。
根据本发明的另一方面，本发明提供了对非结核分枝杆菌的16SrRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQ IDNO:20的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物。
根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含：对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQID NO:18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的反向引物；以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物。
根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法，所述方法包含：由测试对象中分离DNA；通过双重实时PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增：对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组（包含如下引物：具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的反向引物）和对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组（包含如下引物：具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ IDNO:21的核苷酸序列的反向引物）；将所扩增的DNA产物加热至不同温度，以产生解链曲线；以及对所述解链曲线进行分析，以确定目标DNA的解链温度。
根据本发明的又一方面，本发明提供了对非结核分枝杆菌的16SrRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：由具有SEQID NO:38-40的核苷酸序列的各引物组成的正向引物；以及具有SEQ IDNO:21的核苷酸序列的反向引物。
根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含：对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQID NO:18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的反向引物；以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：由具有SEQ ID NO:38-40的核苷酸序列的各引物组成的正向引物以及具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物。
根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法，所述方法包含：由测试对象中分离DNA；通过双重实时PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增：对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组（包含如下引物：具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的反向引物）和对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组（包含如下引物：由具有SEQ ID NO:38-40的核苷酸序列的各引物组成的正向引物以及具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物）；将所扩增的DNA产物加热至不同温度，以产生解链曲线；以及对所述解链曲线进行分析，以确定目标DNA的解链温度。
有益效果
如上所述，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的引物组（所述引物组能够检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的特征核苷酸序列）、使用所述引物组对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的检测试剂盒和基于双重实时PCR的方法。因为不采用特异性探针，本发明的方法可成为用于低成本地对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌同时进行检测的更高效的临床诊断手段。
附图说明
图1为根据实施例1针对MTC进行双重实时PCR而获得的扩增子的解链曲线。
图2为根据实施例1针对NTM进行双重实时PCR而获得的扩增子的解链曲线。
图3为根据实施例1针对MTC+NTM进行双重实时PCR而获得的扩增子的解链曲线。
图4为根据实施例2针对MTC进行双重实时PCR而获得的扩增子的解链曲线。
图5为根据实施例2针对NTM进行双重实时PCR而获得的扩增子的解链曲线。
图6为根据实施例2针对MTC+NTM进行双重实时PCR而获得的扩增子的解链曲线。
图7为根据实施例3针对MTC进行双重实时PCR而获得的扩增子的解链曲线。
图8为根据实施例3针对NTM进行双重实时PCR而获得的扩增子的解链曲线。
图9为根据实施例3针对MTC+NTM进行双重实时PCR而获得的扩增子的解链曲线。
具体实施方式
根据本发明的一个方面，本发明提供了对非结核分枝杆菌的16SrRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQ IDNO:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQ ID NO:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物和具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的反向引物。
SEQ ID NO3的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA的特异性正向引物。SEQ ID NO:3的核苷酸序列（5’-ggyrayctgccctgcac-3’）是指包含如下引物的引物组：5’-ggtaatctgccctgcac-3’（SEQ ID NO:8）、5’-ggtaacctgccctgcac-3’（SEQ ID NO:9）、5’-ggcaatctgccctgcac-3’（SEQ IDNO:10）、5’-ggcaacctgccctgcac-3’（SEQ ID NO:11）、5’-ggtgatctgccctgcac-3’（SEQ ID NO:12）、5’-ggtgacctgccctgcac-3’（SEQ ID NO:13）、5’-ggcgatctgccctgcac-3’（SEQ ID NO:14）和5’-ggcgacctgccctgcac-3’（SEQID NO:15）。例如，所述引物组可为将如下引物以约1:1:1:1:1:1:1:1的比例混合的引物组：5’-ggtaatctgccctgcac-3’、5’-ggtaacctgccctgcac-3’、5’-ggcaatctgccctgcac-3’、5’-ggcaacctgccctgcac-3’、5’-ggtgatctgccctgcac-3’、5’-ggtgacctgccctgcac-3’、5’-ggcgatctgccctgcac-3’和5’-ggcgacctgccctgcac-3’。
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的核苷酸序列（NTM-1）均为16S rRNA的特异性反向引物。SEQ ID NO:7的核苷酸序列（NTM-2）也是非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性反向引物。非结核分枝杆菌16S rRNA基因的所有所述反向引物均被设计来检测所有的目标非结核分枝杆菌种。SEQ ID NO:7（5’-catcccacaccgctaccw-3’）的反向引物是指包含5’-catcccacaccgctacct-3’（SEQ ID NO:16）和5’-catcccacaccgctacca-3’（SEQ ID NO:17）的引物组。例如，SEQ ID NO:7的核苷酸序列可为以约1:1的比例将5’-catcccacaccgctacct-3’和5’-catcccacaccgctacca-3’进行混合的引物组。
根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含：对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向引物；以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQ ID NO:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物和具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的反向引物。
用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒包含对结核分枝杆菌的IS6110具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：分别具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的核苷酸序列的正向引物和反向引物。IS6110基因的所述特异性引物组被设计来检测各种目标分枝杆菌种（结核分枝杆菌复合群，MTC）。
用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒包含对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQ IDNO:4-6的核苷酸序列（NTM-1）所组成的组中的至少一个反向引物和具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列（NTM-2）的反向引物。非结核分枝杆菌16S rRNA基因的所述反向引物被设计来检测各种目标非结核分枝杆菌种。
在一个实施方式中，用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒可以1:1的比例包含具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:7的核苷酸序列的反向引物，后者以1:1的比例包含SEQ ID NO:16和SEQ IDNO:17。因此，在试剂盒中，SEQ ID NO:4的引物、5’-catcccacaccgctacct-3’（SEQ ID NO:16）和5’-catcccacaccgctacca-3’（SEQ ID NO:17）可按2:1:1的比例进行混合。
在本发明的另一实施方式中，用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒可以1:1的比例包含具有SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:7的核苷酸序列的反向引物，后者以1:1的比例包含SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17。
在本发明的另一实施方式中，用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒可以1:1的比例包含具有SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7的核苷酸序列的反向引物，后者以1:1的比例包含SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17。
检测试剂盒可进一步包含通过PCR扩增DNA所必需的试剂。这一试剂可包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR缓冲液等。为了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒中，引物能够对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的特征基因进行检测，并可被设计使得能够产生在解链温度方面差异很大的PCR产物。因为PCR产物的解链曲线因多种因素（包括DNA大小和GC比）而异，可在引物组的设计中兼顾这些因素。
根据本发明的一个实施方式，用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒可进一步包含荧光染料，如SYTO9、EvaGreen或LCGreen，但不包含SYBR Green，因为当以高浓度使用这种荧光染料时，它不仅抑制聚合酶链式反应，还在产物解链的过程中重新分布，对高分辨率解链曲线产生负面影响，所述高分辨率解链曲线可以帮助确定基因型。即，用于PCR和解链曲线分析的反应混合物可包含荧光染料，如SYTO9、EvaGreen或LCGreen。例如，PCR和解链曲线分析可使用含有EvaGreen的反应混合物。在一个实施方式中，借助Type-it HRM PCR试剂盒（QIAGEN Inc.，Germantown，MD，USA）完成实时PCR。这一试剂盒含有EvaGreen。
根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法，所述方法包含：由测试对象中分离DNA；通过双重实时PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增：对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组（包含如下引物：具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向引物）和对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组（包含如下引物：具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQ IDNO:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物和具有SEQ IDNO:7的核苷酸序列的反向引物）；将所扩增的DNA产物加热至不同温度，以产生解链曲线；以及对所述解链曲线进行分析，以确定目标DNA的解链温度。
在本发明的一个实施方式中，可通过测量510nm处的吸光度进行解链曲线的分析。
根据本发明的另一方面，本发明提供了对非结核分枝杆菌的16SrRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQ IDNO:20的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物。
SEQ ID NO20的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA的特异性正向引物。非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的所述正向引物被设计来检测各种目标非结核分枝杆菌种。SEQ ID NO:20的核苷酸序列是指包含比例为约1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1的如下引物的引物组：5’-catgtcttgtgggggaaagctt-3’（SEQ ID NO:22）、5’-catgttttgtgggggaaagctt-3’（SEQ ID NO:23）、5’-catgtcttctgggggaaagctt-3’（SEQ ID NO:24）、5’-catgtcttgtggtggaaagctt-3’（SEQ ID NO:25）、5’-catgtcttgtggggcaaagctt-3’（SEQ ID NO:26）、5’-catgttttctgggggaaagctt-3’（SEQ ID NO:27）、5’-catgtcttctggtggaaagctt-3’（SEQ ID NO:28）、5’-catgtcttgtggtgcaaagctt-3’（SEQ ID NO:29）、5’-catgttttgtggggcaaagctt-3’（SEQ ID NO:30）、5’-catgtcttctggggcaaagctt-3’（SEQ ID NO:31）、5’-catgttttgtggtggaaagctt-3’（SEQ ID NO:32）、5’-catgttttctggtggaaagctt-3’（SEQ ID NO:33）、5’-catgttttctggggcaaagctt-3’（SEQ ID NO:34）、5’-catgttttgtggtgcaaagctt-3’（SEQ ID NO:35）、5’-catgtcttctggtgcaaagctt-3’（SEQ ID NO:36）和5’-catgttttctggtgcaaagctt-3’（SEQ ID NO:37）。
SEQ ID NO:21的核苷酸序列用作非结核分枝杆菌的16S rRNA的特异性反向引物。
根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含：对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQID NO:18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的反向引物；以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物。
在用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒中，结核分枝杆菌的IS6110基因的特异性引物组被设计来检测各种目标分枝杆菌种（结核分枝杆菌复合群，MTC），所述引物组包含如下引物：具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的反向引物。
在用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒中，非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性引物组被设计来检测各种目标非结核分枝杆菌，所述引物组包含如下引物：分别具有SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的核苷酸序列的正向引物和反向引物。
检测试剂盒可进一步包含通过PCR扩增DNA所必需的试剂。这一试剂可包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR缓冲液等。为了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒中，引物能够对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的特征基因进行检测，并可被设计使得能够产生在解链温度方面差异很大的PCR产物。因为PCR产物的解链曲线因多种因素（包括DNA大小和GC比）而异，可在引物组的设计中兼顾这些因素。
根据本发明的一个实施方式，用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒可进一步包含荧光染料，如SYTO9、EvaGreen或LCGreen，但不包含SYBR Green，因为当以高浓度使用这种荧光染料时，它不仅抑制聚合酶链式反应，还在产物解链的过程中重新分布，对高分辨率解链曲线产生负面影响，所述高分辨率解链曲线可以帮助确定基因型。即，用于PCR和解链曲线分析的反应混合物可包含荧光染料，如SYTO9、EvaGreen或LCGreen。例如，PCR和解链曲线分析可使用含有EvaGreen的反应混合物。在一个实施方式中，借助Type-it HRM PCR试剂盒（QIAGEN Inc.，Germantown，MD，USA）完成实时PCR。这一试剂盒含有EvaGreen。
根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法，所述方法包含：由测试对象中分离DNA；通过双重实时PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增：对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组（包含如下引物：具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的反向引物）和对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组（包含如下引物：具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ IDNO:21的核苷酸序列的反向引物）；将所扩增的DNA产物加热至不同温度，以产生解链曲线；以及对所述解链曲线进行分析，以确定目标DNA的解链温度。
根据本发明的又一方面，本发明提供了对非结核分枝杆菌的16SrRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：由具有SEQID NO:38-40的核苷酸序列的各引物组成的正向引物；以及具有SEQ IDNO:21的核苷酸序列的反向引物。
SEQ ID NO:38（NTM-1）、SEQ ID NO:39（NTM-2）和SEQ ID NO:40（NTM-3）的核苷酸序列均为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物。非结核分枝杆菌的16S rRNA的所述特异性正向引物被设计来检测各种非结核分枝杆菌。
所述正向引物可形成以约1:1的比例将5’-tgtggtggaaagcttttgc-3’（SEQID NO:41）和5’-tttggtggaaagcttttgc-3’（SEQ ID NO:42）混合的引物组。
或者，所述正向引物可形成包含比例为约1:1的5’-ggtgagtggtgcaaagctt-3’（SEQ ID NO:43）和5’-ggtgtgtggtgcaaagctt-3’（SEQ ID NO:44）的引物组。
SEQ ID NO:21的核苷酸序列用作非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性反向引物。
根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含：对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQID NO:18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的反向引物；以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：由具有SEQ ID NO:38-40的核苷酸序列的各引物组成的正向引物以及具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物。
在用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒中，结核分枝杆菌的IS6110基因的特异性引物组被设计来检测各种目标分枝杆菌种（结核分枝杆菌复合群，MTC），所述引物组包含如下引物：具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的反向引物。
在用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒中，非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性引物组被设计来检测各种目标非结核分枝杆菌，所述引物组包含如下引物：由具有SEQ ID NO:38-40的核苷酸序列的各引物组成的正向引物；以及具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物。
检测试剂盒可进一步包含通过PCR扩增DNA所必需的试剂。这一试剂可包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR缓冲液等。为了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒中，引物能够对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的特征基因进行检测，并可被设计使得能够产生在解链温度方面差异很大的PCR产物。因为PCR产物的解链曲线因多种因素（包括DNA大小和GC比）而异，可在引物组的设计中兼顾这些因素。
根据本发明的一个实施方式，用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒可进一步包含荧光染料，如SYTO9、EvaGreen或LCGreen，但不包含SYBR Green，因为当以高浓度使用这种荧光染料时，它不仅抑制聚合酶链式反应，还在产物解链的过程中重新分布，对高分辨率解链曲线产生负面影响，所述高分辨率解链曲线可以帮助确定基因型。即，用于PCR和解链曲线分析的反应混合物可包含荧光染料，如SYTO9、EvaGreen或LCGreen。例如，PCR和解链曲线分析可使用含有EvaGreen的反应混合物。在一个实施方式中，借助Type-it HRM PCR试剂盒（QIAGEN Inc.，Germantown，MD，USA）完成实时PCR。这一试剂盒含有EvaGreen。
根据本发明的又一方面，本发明提供了用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法，所述方法包含：由测试对象中分离DNA；通过双重实时PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增：对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组（包含如下引物：具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的反向引物）和对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组（包含如下引物：由具有SEQ ID NO:38-40的核苷酸序列的各引物组成的正向引物；以及具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物）；将所扩增的DNA产物加热至不同温度，以产生解链曲线；以及对所述解链曲线进行分析，以确定目标DNA的解链温度。
根据本发明的一个实施方式，可通过测量510nm处的吸光度进行解链曲线的分析。
实施例
通过下述实施例将更好地理解本发明，所述实施例用来对本发明进行说明，而不应被解释为对本发明进行限定。
参考例：寻找结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的特征核苷酸序列
1.目标和基因位点
将下列分枝杆菌的16S核糖体RNA基因数据用于寻找结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的特征核苷酸序列中：
脓肿分枝杆菌（M.abscessus）（AJ419970.1、AJ416940.1、AJ536038）、阿加普尔分枝杆菌（M.acapulcensis）（AF480575.1）、非洲分枝杆菌（M.africanum）（AF480605.1）、田野分枝杆菌（M.agri）（AJ429045.1）、爱知分枝杆菌（M.aichiense）（X55598.1）、河床分枝杆菌（M.alvei）（NR_024859.1）、亚洲分枝杆菌（M.asiaticum）（X55604.1）、金色分枝杆菌（M.aurum）（FJ172298.1）、南非分枝杆菌（M.austroafricanum）（GU121552.1）、鸟分枝杆菌（M.avium）（NR_025584.1、AJ536037.1、EF521892.1）、波希米亚分枝杆菌（M.bohemicum）（NR_026054.1）、波特尼分枝杆菌（M.botniense）（NR_028878.1）、牛分枝杆菌（M.bovis）（GU142937.1）、布氏分枝杆菌（M.branderi）（AF480574.1）、雾分枝杆菌（M.brumae）（NR_025233.1）、隐藏分枝杆菌（M.celatum）（L08169.1）、龟分枝杆菌（M.chelonae）（AM884324.1、AJ419969.1）、千田分枝杆菌（M.chitae）（NR_029220.1）、氯酚分枝杆菌（M.chlorophenolicum）（NR_026173.1）、楚布分枝杆菌（M.chubuense）（X55596.1）、汇合分枝杆菌（M.confluentis）（AJ634379.1）、炫耀分枝杆菌（M.conspicuum）（X029298.1）、库氏分枝杆菌（M.cookii）（X53896.1）、迪氏分枝杆菌（M.diernhoferi）（AF480599.1）、M.doricum（NR_025099.1）、杜氏分枝杆菌（M.duvalii）（NR_026073.1）、M.engbaekii（AF480577.1）、诡诈分枝杆菌（M.fallax）（AF480600.1）、产鼻疽分枝杆菌（M.farcinogenes）（X55592.1）、转黄分枝杆菌（M.flavescens）（AY734993.1）、偶发分枝杆菌（M.fortuitum）（AY457066.1、AF480580.1、GU142933.1）、加地斯分枝杆菌（M.gadium）（NR_026087.1）、胃分枝杆菌（M.gastri）（GU142918.1）、日内瓦分枝杆菌（M.genavense）（NR_029223.1）、浅黄分枝杆菌（M.gilvum）（AB491971.1）、戈地分枝杆菌（M.goodii）（AY457079.1）、戈氏分枝杆菌（M.gordonae）（GU142923.1）、嗜血分枝杆菌（M.haemophilum）（V06638.1）、M.hassiacum（NR_026011.1）、海德堡分枝杆菌（M.heidelbergense）（NR_025268.1）、爱尔兰分枝杆菌（M.hiberniae）（NR_026092.1）、霍德勤分枝杆菌（M.hodleri）（NR_026286.1）、免疫原分枝杆菌（M.immunogen）（AJ011771.1）、居间分枝杆菌（M.interjectum）（X70961.1）、中间分枝杆菌（M.intermedium）（X67847.1）、胞内分枝杆菌（M.intracellulare）（AY652958.1、AJ536036.1、X52927.1、M61684.1）、堪萨斯分枝杆菌（M.kansasii）（M29575.1、X15916.1）、缓黄分枝杆菌（M.lentiflavum）（AF480583.1）、M.mageritense（AY457076.1）、玛尔摩分枝杆菌（M.malmoense）（GQ153278.1）、海分枝杆菌（M.marinum）（AF456238.1、AY513243.1）、田鼠分枝杆菌（M.microti）（NR_025234.1）、M.monacense（GU142931.1）、莫里奥卡分枝杆菌（M.moriokaense）（AY859686.1）、产粘液分枝杆菌（M.mucogenicum）（AF480585.1）、新金色分枝杆菌（M.neoaurum）（FJ172306.1）、不产色分枝杆菌（M.nonchromogenicum）（DQ058406.1）、奥布分枝杆菌（M.obuense）（X55597.1）、石蜡分枝杆菌（M.paraffinicum）（GQ153282.1）、副偶然分枝杆菌（M.parafortuitum)(NR_026285.1)、外来分枝杆菌(M.peregrinum)(AY457069.1)、草分枝杆菌(M.phlei)（AF480603.1）、猪分枝杆菌（M.porcinum）（AY457077.1）、海绵分枝杆菌（M.poriferae）（NR_025235.1）、灰尘分枝杆菌（M.pulveris）（NR_025528.1）、罗得西亚分枝杆菌（M.rhodesiae）（NR_025529.1）、瘰疠分枝杆菌（M.scrofulaceum）（GQ153271.1）、M.senuense（DQ536409.1）、脓毒性分枝杆菌（M.septicum）（AY457070.1）、施氏分枝杆菌（M.shimoidei）（X82459.1）、猿分枝杆菌（M.simiae）（GQ153280.1）、耻垢分枝杆菌（M.smegmatis）（NR_025311.1）、泥炭藓分枝杆菌（M.sphagni）（X55590.1）、苏加分枝杆菌（M.szulgai）（X52926.1）、地分枝杆菌（M.terrae）（NR_029168.1）、耐热分枝杆菌（M.thermoresistibile）（GU142928.1）、M.tilburgii（AJ580826.1）、三重分枝杆菌（M.triplex）（GQ153279.1）、次要分枝杆菌(M.triviale）（DQ058405.1）、结核分枝杆菌（M.tuberculosis）（GU142936.1、GU142935.1、AY53603.1、X55588.1、X52917.1）、托斯卡分枝杆菌（M.tusciae）（NR_024903.1）、溃疡分枝杆菌（M.ulcerans）（Z13990.1）、母牛分枝杆菌（M.vaccae）（X55601.1）、沃林斯基分枝杆菌（M.wolinskyi）（AY457083.1）和蟾分枝杆菌（M.xenopi）（X52929.1）。从NCBI（美国国家生物技术信息中心）数据库中获得16S核糖体RNA基因的数据。
通过Sequencher4.9对分枝杆菌种的16S rRNA基因序列的数据进行分析得到特征核苷酸序列，即，结核分枝杆菌复合群的特征核苷酸以及在结核分枝杆菌复合群中缺失、但在非结核分枝杆菌中固有的核苷酸。
实施例1：结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌1的分离和检测
1.检测目标和引物设计
待通过PCR和解链曲线分析进行检测的目标基因为结核分枝杆菌复合群（结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌）的IS6110基因和非结核分枝杆菌的16S rRNA基因。将通用引物用作正向引物来扩增分枝杆菌的16S rRNA基因。将非结核分枝杆菌特征性的NTM-1和NTM-2用作反向引物。使用Primer3程序设计用于目标基因检测的这些引物。
（1）结核分枝杆菌复合群（MTC）
1）目标基因：IS6110
2）引物
a.正向引物：5’-cgaactcaaggagcacatca-3’（SEQ ID NO:1）
b.反向引物：5’-agtttggtcatcagccgttc-3’（SEQ ID NO:2）
3）PCR产物大小：135bp
4）PCR产物的平均解链温度（Tm）：约86.18±0.16℃（各批次的Tm稍有不同）
（2）非结核分枝杆菌（NTM）
1）目标基因：16S rRNA
2）引物
a.正向引物：5’-ggyrayctgccctgcac-3’（SEQ ID NO:3）
b.反向引物
NTM-1：5’-cccacaccgcaaaagctt-3’（SEQ ID NO:4）、5’-cccacaccgcaaaagct-3’（SEQ ID NO:5）或5’-tcccacaccgcaaaagct-3’（SEQID NO:6）
NTM-2：5’-catcccacaccgctaccw-3’（SEQ ID NO:7）
3）PCR产物大小：104bp
4）PCR产物的平均解链温度（Tm）：约80.10℃-82.10℃（Tm因非结核分枝杆菌种的不同而不同，但是均在约80℃-82℃的范围内）。
<实施例1-1.将SEQ ID NO:4的核苷酸序列用作对NTM进行检测的反向引物NTM-1的双重实时PCR和解链曲线分析>
（1）DNA的分离
DNA分离自186个分枝杆菌种和78个非结核分枝杆菌种（均为在临床受试者中鉴定的），以及7个标准ATCC分枝杆菌种（包括结核分枝杆菌（ATCC 25177）、胞内分枝杆菌（ATCC 13950）、瘰疠分枝杆菌（ATCC19981）、堪萨斯分枝杆菌（ATCC 12478）、偶发分枝杆菌（ATCC 6841）、脓肿分枝杆菌（ATCC 19977）和鸟分枝杆菌（ATCC 25291））。
将在临床受试者中鉴定的种（包括186个分枝杆菌种和78个非结核分枝杆菌种）在液体培养基（MGIT分枝杆菌培养基）或固体培养基（Ogawa培养基）中进行检测，或者直接从痰样本中分离。将ATCC标准种在肉汤中培养。
依照如下方式，从在肉汤中培养的分枝杆菌中分离DNA。向1.5mL管中移入500μL培养有分枝杆菌的MGIT肉汤，并以14,000rpm离心5min。去除上清液，将沉淀溶于300μL无菌蒸馏水中，并在沸水浴中加热10min。在以14,000rpm离心5min后，将上清液用作PCR中的模板。
依照如下方式，从在琼脂平板上培养的分枝杆菌中分离DNA。用白金环（platinum loop）从琼脂平板上取样并溶于1.5mL管中的500μL无菌蒸馏水中，并在沸水浴中加热10min。接着以14,000rpm离心5min。将上清液用作PCR中的模板。
依照如下方式处理痰样本。向15mL管或50mL管中的痰中加入1体积的1N NaOH，然后静置10min以使痰液化。接着以14,000rpm离心2min后，在1mL无菌蒸馏水中将沉淀充分混匀10秒。再次将混合物以14,000rpm离心2min，并在1mL无菌蒸馏水中将沉淀充分混匀10秒。以14,000rpm离心2min，并将沉淀与100μL的5%chelex树脂（BioRad，USA）和1μL的10mg/mL蛋白酶K充分混匀。在56℃静置15min后，将混合物在沸水浴中加热10min。以14,000rpm离心5min后，取上清液用作PCR中的模板。
（2）双重PCR和解链曲线分析
使用Type-it HRM PCR试剂盒（QIAGEN Inc.，Germantown，MD，USA）在Rotor-Gene6000（QIAGEN Inc.，Germantown，MD，USA）上进行，双重实时PCR从在约95℃下变性5min开始；再以如下条件运行40个循环：在约95℃下变性10秒，在60℃下退火30秒并延伸。这一试剂盒含有荧光染料EvaGreen。PCR完成后，在以0.2℃/秒的升温速度将PCR产物从约77℃加热至约91.5℃的同时，通过测量510nm处的吸光度进行解链曲线分析。因为PCR取决于各种因素（包括引物的浓度以及退火和延伸步骤的温度和时间），综合考虑所述因素来确定对两种目标基因进行检测的最优PCR条件。下表1总结了所述双重实时PCR的组成。
在引物混合物中，以相同的量（10pmole/μL）包含正向引物和反向引物。因此，对于MTC，1.75μL引物混合物包含含量各自为17.5pmole的正向引物和反向引物。由于PCR混合物的总体积为25μL，所以其以0.7μM（17.5pmole/25μL）的浓度含有引物。对于NTM，正向引物和反向引物各自的含量为10pmole/1μL，终浓度为0.4μM（10pmole/25μL）。在这一背景下，NTM正向引物为如下引物的组：5’-ggtaatctgccctgcac-3’（SEQ ID NO:8）、5’-ggtaacctgccctgcac-3’（SEQ ID NO:9）、5’-ggcaatctgccctgcac-3’（SEQ ID NO:10）、5’-ggcaacctgccctgcac-3’（SEQID NO:11）、5’-ggtgatctgccctgcac-3’（SEQ ID NO:12）、5’-ggtgacctgccctgcac-3’（SEQ ID NO:13）、5’-ggcgatctgccctgcac-3’（SEQID NO:14）和5’-ggcgacctgccctgcac-3’（SEQ ID NO:15）。在所述引物组中，SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的引物以约1:1:1:1:1:1:1:1的比例使用。即，所述引物组含有含量各自为1.25pmole的如下引物：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。另一方面，当NTM-2反向引物由5pmole的5’-catcccacaccgctacct-3’（SEQID NO:16）和5pmole的5’-catcccacaccgctacca-3’（SEQ ID NO:17）组成时，NTM-1反向引物（SEQ ID NO:4）和NTM-2反向引物（SEQ ID NO:7）各自以10pmole的量使用。
表1
<实施例1-2.将SEQ ID NO:5的核苷酸序列用作对NTM进行检测的反向引物NTM-1的双重实时PCR和解链曲线分析>
除将SEQ ID NO:5的核苷酸序列用作反向引物NTM-1外，以与实施例1-1中相同的方式进行双重实时PCR和解链曲线分析。
<实施例1-3.将SEQ ID NO:6的核苷酸序列用作对NTM进行检测的反向引物NTM-1的双重实时PCR和解链曲线分析>
除将SEQ ID NO:6的核苷酸序列用作反向引物NTM-1外，以与实施例1-1中相同的方式进行双重实时PCR和解链曲线分析。
2.双重实时PCR和解链曲线分析的结果
图1-图3为从所述菌（分别为MTC、NTM和MTC+NTM）的DNA中扩增的双重实时PCR产物（扩增子）的解链曲线。在所述曲线中，温度（℃）设置在X-轴上，而Y-轴上设置的为每单位时间荧光强度（F）的变化（dF/dT）。
测得MTC扩增子的平均解链温度（Tm）为约86.18±0.16℃，而NTM扩增子的Tm范围为约80.10℃-82.10℃。对于MTC+NTM，读出了两个单独的Tm峰。
因此，发现本发明的双重实时PCR和解链曲线分析确保了同时以高可靠性对临床受试者中的MTC和NTM进行检测。
实施例2：结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌2的分离和检测
1.检测目标和引物设计
待通过PCR和解链曲线分析进行检测的目标基因为结核分枝杆菌复合群（结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌）的IS6110基因和非结核分枝杆菌的16S rRNA基因。用于对非结核分枝杆菌进行检测的正向引物对非结核分枝杆菌的特征目标基因具有特异性，而将通用引物用作反向引物。使用Primer3程序设计用于目标基因检测的这些引物。
（1）结核分枝杆菌复合群（MTC）
1）目标基因：IS6110
2）引物
a.正向引物：5’-agaaggcgtactcgacctga-3’（SEQ ID NO:18）
b.反向引物:5’-ctgaaccggatcgatgtgta-3’（SEQ ID NO:19）
3）PCR产物大小：75bp
4）PCR产物的平均解链温度（Tm）：78.0±0.20℃
（2）非结核分枝杆菌（NTM）
1）目标基因：16S rRNA
2）引物
a.正向引物：5’-catgtyttstggkgsaaagctt-3’（SEQ ID NO:20）
b.反向引物：5’-cgtaggagtctgggccgta-3’（SEQ ID NO:21）
3）PCR产物大小：152bp
4）PCR产物的平均解链温度（Tm）：约86.7℃-88.24℃（Tm因非结核分枝杆菌种的不同而不同，但是均在约86.5℃-88.5℃的范围内）。
2.双重PCR和解链曲线分析
（1）DNA的分离
DNA分离自186个分枝杆菌种和78个非结核分枝杆菌种（均为在临床受试者中鉴定的），以及68个标准ATCC分枝杆菌种（包括脓肿分枝杆菌ATCC19977、阿加普尔分枝杆菌KCTC9501、非洲分枝杆菌ATCC25420、田野分枝杆菌KCTC9502、河床分枝杆菌KCTC19709、亚洲分枝杆菌KCTC9503、金色分枝杆菌KCTC19457、南非分枝杆菌KCTC9504、鸟分枝杆菌ATCC25291、博氏分枝杆菌（M.bolletii）KCTC19281、波特尼分枝杆菌KCTC19646、牛分枝杆菌ATCC19210、雾分枝杆菌KCTC19711、隐藏分枝杆菌ATCC51131、龟分枝杆菌龟型亚种（M.chelonae subsp chelonae）KCTC9505、氯酚分枝杆菌KCTC19089、楚布分枝杆菌KCTC19712、迪氏分枝杆菌KCTC9506、诡诈分枝杆菌KCTC9508、转黄分枝杆菌ATCC14474、偶发分枝杆菌ATCC6841、腓特烈斯堡分枝杆菌（M.frederiksbergense）KCTC19100、加地斯分枝杆菌ATCC27726、胃分枝杆菌ATCC15754、浅黄分枝杆菌KCTC19423、戈地分枝杆菌ATCCBAA-955、戈氏分枝杆菌KCTC9513、嗜血分枝杆菌ATCC29548、M.hassiacum ATCC700660、居间分枝杆菌ATCC51457、中间分枝杆菌ATCC51848、胞内分枝杆菌ATCC13950、胞内分枝杆菌KCTC9514、堪萨斯分枝杆菌ATCC12478、缓黄分枝杆菌KMRC70087、玛尔摩分枝杆菌ATCC29571、M.mantobense KCTC9977、海分枝杆菌ATCC927、马赛分枝杆菌（M.massiliense）KCTC19086、田鼠分枝杆菌ATCC19422、莫里奥卡分枝杆菌KCTC9516、产粘液分枝杆菌KCTC19088、新金色分枝杆菌KCTC19096、不产色分枝杆菌ATCC19530、奥布分枝杆菌KCTC19097、副瘰疠分枝杆菌（M. parascrofulaceum）KCTC9979、外来分枝杆菌KCTC9615、KMRC75002、草分枝杆菌KCTC9689、猪分枝杆菌KCTC9517、灰尘分枝杆菌KCTC9518、瘰疠分枝杆菌ATCC19981、脓毒性分枝杆菌ATCC700731、猿分枝杆菌ATCC25275、施氏分枝杆菌ATCC27962、耻垢分枝杆菌KCTC9108、苏加分枝杆菌KCTC9520、KMRC31125、地分枝杆菌KCTC9614、三重分枝杆菌ATCC700071、次要分枝杆菌KMRC70093、结核分枝杆菌ATCC25177、ATCC27294、溃疡分枝杆菌ATCC19423、母牛分枝杆菌KCTC19087、M.vanbaalenii KCTC9966、沃林斯基分枝杆菌ATCC700010和蟾分枝杆菌KMRC42001）。
将在临床受试者中鉴定的种（包括186个分枝杆菌种和78个非结核分枝杆菌种）在液体培养基（MGIT分枝杆菌培养基）或固体培养基（Ogawa培养基）中进行检测，或者直接从痰样本中分离。ATCC和KCTC标准种在肉汤中培养，而KMRC种在琼脂平板上生长。
依照如下方式，从在肉汤中培养的分枝杆菌中分离DNA。向1.5mL管中移入500μL培养有分枝杆菌的MGIT肉汤，并以14,000rpm离心5min。去除上清液，将沉淀溶于300μL无菌蒸馏水中，并在沸水浴中加热10min。在以14,000rpm离心5min后，将上清液用作PCR中的模板。
依照如下方式，从在琼脂平板上培养的分枝杆菌中分离DNA。用白金环从琼脂平板上取样并溶于1.5mL管中的500μL无菌蒸馏水中，并在沸水浴中加热10min。接着以14,000rpm离心5min。将上清液用作PCR中的模板。
依照如下方式处理痰样本。向15mL管或50mL管中的痰中加入1体积的1N NaOH，然后静置10min以使痰液化。接着以14,000rpm离心2min后，在1mL无菌蒸馏水中将沉淀充分混匀10秒。再次将混合物以14,000rpm离心2min，并在1mL无菌蒸馏水中将沉淀充分混匀10秒。以14,000rpm离心2min，并将沉淀与100μL的5%chelex树脂（BioRad，USA）和1μL的10mg/mL蛋白酶K充分混匀。在56℃静置15min后，将混合物在沸水浴中加热10min。以14,000rpm离心5min后，取上清液用作PCR中的模板。
（2）双重PCR和解链曲线分析
使用Type-it HRM PCR试剂盒（QIAGEN Inc.，Germantown，MD，USA）在Rotor-Gene Q（QIAGEN Inc.，Germantown，MD，USA）上进行，双重实时PCR从在约95℃下变性5min开始；再以如下条件运行40个循环：在约95℃下变性10秒，在50℃下退火30秒，以及在63℃下延伸5秒。这一试剂盒含有荧光染料EvaGreen。PCR完成后，在以0.2℃/秒的升温速度将PCR产物从约75℃加热到约93.5℃的同时，通过测量510nm处的吸光度进行解链曲线分析。因为PCR取决于各种因素（包括引物的浓度以及退火和延伸步骤的温度和时间），综合考虑所述因素来确定对两种目标基因进行检测的最优PCR条件。下表2总结了所述双重实时PCR的组成。
在引物混合物中，以相同的量（10pmole/μL）包含正向引物和反向引物。因此，对于MTC，1.25μL引物混合物包含含量各自为12.5pmole的正向引物和反向引物。由于PCR混合物的总体积为25μL，所以其以0.5μM（12.5pmole/25μL）的浓度含有引物。对于NTM，正向引物和反向引物各自的含量为15pmole/1.5μL，终浓度为0.6μM（15pmole/25μL）。在这一背景下，NTM正向引物为如下引物以约1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1的比例进行混合的组：5’-catgtcttgtgggggaaagctt-3’（SEQ ID NO:22）、5’-catgttttgtgggggaaagctt-3’（SEQ ID NO:23）、5’-catgtcttctgggggaaagctt-3’（SEQ ID NO:24）、5’-catgtcttgtggtggaaagctt-3’（SEQ ID NO:25）、5’-catgtcttgtggggcaaagctt-3’（SEQ ID NO:26）、5’-catgttttctgggggaaagctt-3’（SEQ ID NO:27）、5’-catgtcttctggtggaaagctt-3’（SEQ ID NO:28）、5’-catgtcttgtggtgcaaagctt-3’（SEQ ID NO:29）、5’-catgttttgtggggcaaagctt-3’（SEQ ID NO:30）、5’-catgtcttctggggcaaagctt-3’（SEQ ID NO:31）、5’-catgttttgtggtggaaagctt-3’（SEQ ID NO:32）、5’-catgttttctggtggaaagctt-3’（SEQ ID NO:33）、5’-catgttttctggggcaaagctt-3’（SEQ ID NO:34）、5’-catgttttgtggtgcaaagctt-3’（SEQ ID NO:35）、5’-catgtcttctggtgcaaagctt-3’（SEQ ID NO:36）和5’-catgttttctggtgcaaagctt-3’（SEQ ID NO:37）。
表2
3.双重实时PCR和解链曲线分析的结果
图4-图6为从所述菌（分别为MTC、NTM和MTC+NTM）的DNA中扩增的双重实时PCR产物（扩增子）的解链曲线。在所述曲线中，温度（℃）设置在X-轴上，而Y-轴上设置的为每单位时间荧光强度（F）的变化（dF/dT）。
测得MTC扩增子的平均解链温度（Tm）为约78.0±0.20℃，而NTM扩增子的Tm范围为约86.5℃-88.5℃。对于MTC+NTM，读出了两个单独的Tm峰。
因此，发现本发明的双重实时PCR和解链曲线分析确保了同时以高可靠性对临床受试者中的MTC和NTM进行检测。
实施例3：结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌3的分离和检测
1.检测目标和引物设计
待通过PCR和解链曲线分析进行检测的目标基因为结核分枝杆菌复合群（结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌）的IS6110基因和非结核分枝杆菌的16S rRNA基因。用于对非结核分枝杆菌进行检测的正向引物对非结核分枝杆菌的特征目标基因具有特异性，而将通用引物用作反向引物。使用Primer3程序设计用于目标基因检测的这些引物。
（1）结核分枝杆菌复合群（MTC）
1）目标基因：IS6110
2）引物
a.正向引物：5’-agaaggcgtactcgacctga-3’（SEQ ID NO:18）
b.反向引物：5’-ctgaaccggatcgatgtgta-3’（SEQ ID NO:19）
3）PCR产物大小：75bp
4）PCR产物的平均解链温度（Tm）：78.0±0.20℃
（2）非结核分枝杆菌（NTM）
1）目标基因：16S rRNA
2）引物
a.正向引物
NTM-1：5’-tktggtggaaagcttttgc-3’（SEQ ID NO:38）
NTM-2：5’-ggtgwgtggtgcaaagctt-3’（SEQ ID NO:39）
NTM-3：5’-tggtggaaagcgtttggt-3’（SEQ ID NO:40）
b.反向引物：5’-cgtaggagtctgggccgta-3’（SEQ ID NO:21）
3）PCR产物大小：152bp
4）PCR产物的平均解链温度（Tm）：86.6±0.26℃
2.双重PCR和解链曲线分析
（1）DNA的分离
DNA分离自186个分枝杆菌种和78个非结核分枝杆菌种（均为在临床受试者中鉴定的），以及68个标准ATCC分枝杆菌种（包括脓肿分枝杆菌ATCC19977、阿加普尔分枝杆菌KCTC9501、非洲分枝杆菌ATCC25420、田野分枝杆菌KCTC9502、河床分枝杆菌KCTC19709、亚洲分枝杆菌KCTC9503、金色分枝杆菌KCTC19457、南非分枝杆菌KCTC9504、鸟分枝杆菌ATCC25291、博氏分枝杆菌KCTC19281、波特尼分枝杆菌KCTC19646、牛分枝杆菌ATCC19210、雾分枝杆菌KCTC19711、隐藏分枝杆菌ATCC51131、龟分枝杆菌龟型亚种KCTC9505、氯酚分枝杆菌KCTC19089、楚布分枝杆菌KCTC19712、迪氏分枝杆菌KCTC9506、诡诈分枝杆菌KCTC9508、转黄分枝杆菌ATCC14474、偶发分枝杆菌ATCC6841、腓特烈斯堡分枝杆菌KCTC19100、加地斯分枝杆菌ATCC27726、胃分枝杆菌ATCC15754、浅黄分枝杆菌KCTC19423、戈地分枝杆菌ATCC BAA-955、戈氏分枝杆菌KCTC9513、嗜血分枝杆菌ATCC29548、M.hassiacum ATCC700660、居间分枝杆菌ATCC51457、中间分枝杆菌ATCC51848、胞内分枝杆菌ATCC13950、胞内分枝杆菌KCTC9514、堪萨斯分枝杆菌ATCC12478、缓黄分枝杆菌KMRC70087、玛尔摩分枝杆菌ATCC29571、M.mantobense KCTC9977、海分枝杆菌ATCC927、马赛分枝杆菌KCTC19086、田鼠分枝杆菌ATCC19422、莫里奥卡分枝杆菌KCTC9516、产粘液分枝杆菌KCTC19088、新金色分枝杆菌KCTC19096、不产色分枝杆菌ATCC19530、奥布分枝杆菌KCTC19097、副瘰疠分枝杆菌KCTC9979、外来分枝杆菌KCTC9615、KMRC75002、草分枝杆菌KCTC9689、猪分枝杆菌KCTC9517、灰尘分枝杆菌KCTC9518、瘰疠分枝杆菌ATCC19981、脓毒性分枝杆菌ATCC700731、猿分枝杆菌ATCC25275、施氏分枝杆菌ATCC27962、耻垢分枝杆菌KCTC9108、苏加分枝杆菌KCTC9520、KMRC31125、地分枝杆菌KCTC9614、三重分枝杆菌ATCC700071、次要分枝杆菌KMRC70093、结核分枝杆菌ATCC25177、ATCC27294、溃疡分枝杆菌ATCC19423、母牛分枝杆菌KCTC19087、M.vanbaalenii KCTC9966、沃林斯基分枝杆菌ATCC700010和蟾分枝杆菌KMRC42001）。
将在临床受试者中鉴定的种（包括186个分枝杆菌种和78个非结核分枝杆菌种）在液体培养基（MGIT分枝杆菌培养基）或固体培养基（Ogawa培养基）中进行检测，或者直接从痰样本中分离。ATCC和KCTC标准种在肉汤中培养，而KMRC种在琼脂平板上生长。
依照如下方式，从在肉汤中培养的分枝杆菌中分离DNA。向1.5mL管中移入500μL培养有分枝杆菌的MGIT肉汤，并以14,000rpm离心5min。去除上清液，将沉淀溶于300μL无菌蒸馏水中，并在沸水浴中加热10min。在以14,000rpm离心5min后，将上清液用作PCR中的模板。
依照如下方式，从在琼脂平板上培养的分枝杆菌中分离DNA。用白金环从琼脂平板上取样并溶于1.5mL管中的500μL无菌蒸馏水中，并在沸水浴中加热10min。接着以14,000rpm离心5min。将上清液用作PCR中的模板。
依照如下方式处理痰样本。向15mL管或50mL管中的痰中加入1体积的1N NaOH，然后静置10min以使痰液化。接着以14,000rpm离心2min后，在1mL无菌蒸馏水中将沉淀充分混匀10秒。再次将混合物以14,000rpm离心2min，并在1mL无菌蒸馏水中将沉淀充分混匀10秒。以14,000rpm离心2min，并将沉淀与100μL的5%chelex树脂（BioRad，USA）和1μL的10mg/mL蛋白酶K充分混匀。在56℃静置15min后，将混合物在沸水浴中加热10min。以14,000rpm离心5min后，取上清液用作PCR中的模板。
（2）双重PCR和解链曲线分析
使用Type-it HRM PCR试剂盒（QIAGEN Inc.，Germantown，MD，USA）在Rotor-Gene Q（QIAGEN Inc.，Germantown，MD，USA）上进行，双重实时PCR从在约95℃下变性5min开始；再以如下条件运行40个循环：在约95℃下变性10秒，在61℃下退火并延伸30秒。这一试剂盒含有荧光染料EvaGreen。PCR完成后，在以0.2℃/秒的升温速度将PCR产物从约72℃加热至约93℃的同时，通过测量510nm处的吸光度进行解链曲线分析。因为PCR取决于各种因素（包括引物的浓度以及退火和延伸步骤的温度和时间），综合考虑所述因素来确定对两种目标基因进行检测的最优PCR条件。下表3总结了所述双重实时PCR的组成。在引物混合物中，以相同的量（10pmole/μL）包含正向引物和反向引物。因此，对于MTC，1.875μL引物混合物包含含量各自为18.75pmole的正向引物和反向引物。由于PCR混合物的总体积为25μL，所以其以0.75μM（18.75pmole/25μL）的浓度含有引物。对于NTM，正向引物和反向引物各自的含量为12.5pmole/1.25μL，终浓度为0.5μM（12.5pmole/25μL）。在这一背景下，NTM-1正向引物（SEQ ID NO:38）、NTM-2正向引物（SEQ ID NO:39）和NTM-3正向引物（SEQ ID NO:40）以基本上相同的量使用。在NTM-1正向引物（SEQ ID NO:38）中，5’-tgtggtggaaagcttttgc-3’（SEQ ID NO:41）和5’-tttggtggaaagcttttgc-3’（SEQID NO:42）以约1:1的比例存在，而NTM-2正向引物（SEQ ID NO:39）包含比例为约1:1的5’-ggtgagtggtgcaaagctt-3’（SEQ ID NO:43）和5’-ggtgtgtggtgcaaagctt-3’（SEQ ID NO:44）。
表3
3.双重实时PCR和解链曲线分析的结果
图7-图9为从所述菌（分别为MTC、NTM和MTC+NTM）的DNA中扩增的双重实时PCR产物（扩增子）的解链曲线。在所述曲线中，温度（℃）设置在X-轴上，而Y-轴上设置的为每单位时间荧光强度（F）的变化（dF/dT）。
测得MTC扩增子的平均解链温度（Tm）为约78.0±0.20℃，而NTM扩增子的Tm为约86.6±0.26℃。对于MTC+NTM，读出了两个单独的Tm峰。
因此，发现本发明的双重实时PCR和解链曲线分析确保了同时以高可靠性对临床受试者中的MTC和NTM进行检测。
如实施例所证实的，双重PCR和解链曲线分析与检测试剂盒相结合可用于以高可靠度对MTC和NTM进行检测，所述试剂盒包含基于MTC的特征核苷酸序列或MTC缺失但NTM所固有的核苷酸序列设计的正向引物和反向引物。因此，本发明提供了有效地对MTC和NTM进行检测的手段。
如上所述，当将本发明的引物组（能够检测出MTC和NTM的特征核苷酸序列）用于检测时，所述引物组对MTC和NTM具有高灵敏度和高选择性。此外，使用本发明引物的双重PCR和本发明的解链曲线分析为确保对目标受试者中的MTC和NTM非常高效且同时进行检测的临床诊断手段。
工业实用性
如本文所述，可将用于对MTC和NTM的特征基因进行检测的本发明的引物组、检测试剂盒和检测方法用作MTC和NTM所引起的疾病的临床诊断，由此发现了在包括医院、研究所等的医学领域中的用途。
序列表文本
SEQ ID NO:1的核苷酸序列为结核分枝杆菌复合群的IS6100基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:2的核苷酸序列为结核分枝杆菌复合群的IS6100基因的特异性反向引物；
SEQ ID NO:3的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:4的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性反向引物（NTM-1）；
SEQ ID NO:5的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性反向引物（NTM-1）；
SEQ ID NO:6的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性反向引物（NTM-1）；
SEQ ID NO:7的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性反向引物（NTM-2）；
SEQ ID NO:8的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:9的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:10的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:11的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:12的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:13的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:14的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:15的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:16的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性反向引物（NTM-2）；
SEQ ID NO:17的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性反向引物（NTM-2）；
SEQ ID NO:18的核苷酸序列为结核分枝杆菌复合群的IS6100基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:19的核苷酸序列为结核分枝杆菌复合群的IS6100基因的特异性反向引物；
SEQ ID NO:20的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:21的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性反向引物；
SEQ ID NO:22的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:23的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:24的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:25的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:26的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:27的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:28的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:29的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:30的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:31的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:32的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:33的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:34的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:35的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:36的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:37的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物；
SEQ ID NO:38的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物（NTM-1）；
SEQ ID NO:39的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物（NTM-2）；
SEQ ID NO:40的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物（NTM-3）；
SEQ ID NO:41的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物（NTM-1）；
SEQ ID NO:42的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物（NTM-1）；
SEQ ID NO:43的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物（NTM-2）；
SEQ ID NO:44的核苷酸序列为非结核分枝杆菌的16S rRNA基因的特异性正向引物（NTM-2）。
Figure IDA00002780217500011
Figure IDA00002780217500021
Figure IDA00002780217500031
Figure IDA00002780217500041
Figure IDA00002780217500051
Figure IDA00002780217500061
Figure IDA00002780217500071
Figure IDA00002780217500081

Claims (9)

1.一种对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：
具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的正向引物；
选自于由SEQ ID NO:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物；以及
具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的反向引物。
2.用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含：
对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ IDNO:2的核苷酸序列的反向引物；以及
对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQ ID NO:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物和具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的反向引物。
3.用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法，所述方法包含：
由测试对象中分离DNA；
通过双重实时PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增：对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的反向引物；以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列的正向引物、选自于由SEQ ID NO:4-6的核苷酸序列所组成的组中的至少一个反向引物和具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的反向引物；
将所扩增的DNA产物加热至不同温度，以产生解链曲线；以及
对所述解链曲线进行分析，以确定目标DNA的解链温度。
4.一种对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物。
5.用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含：
对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO:19的核苷酸序列的反向引物；以及
对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物。
6.用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法，所述方法包含：
由测试对象中分离DNA；
通过双重实时PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增：对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的反向引物；以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物；
将所扩增的DNA产物加热至不同温度，以产生解链曲线；以及
对所述解链曲线进行分析，以确定目标DNA的解链温度。
7.一种对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：
由具有SEQ ID NO:38-40的核苷酸序列的各引物组成的正向引物；以及
具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物。
8.用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包含：
对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQID NO:19的核苷酸序列的反向引物；以及
对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：由具有SEQ ID NO:38-40的核苷酸序列的各引物组成的正向引物；以及具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物。
9.用于对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法，所述方法包含：
由测试对象中分离DNA；
通过双重实时PCR使用如下引物组对所述DNA进行扩增：对结核分枝杆菌的IS6110基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的反向引物；以及对非结核分枝杆菌的16S rRNA基因具有特异性的引物组，所述引物组包含如下引物：由具有SEQ ID NO:38-40的核苷酸序列的各引物组成的正向引物以及具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列的反向引物；
将所扩增的DNA产物加热至不同温度，以产生解链曲线；以及
对所述解链曲线进行分析，以确定目标DNA的解链温度。
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