CN105219764A - 一种小鼠组织中结核杆菌dna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，包括以下步骤：步骤(1)将小鼠肺组织匀浆离心后弃上清，加GA缓冲液和蛋白酶K溶液后，水浴后进行组织溶解得到细胞悬液；步骤(2)细胞悬液中加TES缓冲液(含溶菌酶)和SDS溶液后，置于沸水浴60min，在冰上放置得到混悬液；步骤(3)在混悬液中加入醋酸钠溶液和葡萄糖溶液，冰上放置；然后加入苯酚/氯仿/异戊醇溶液提取，离心后取上层水相，上层水相中加入氯仿/异戊醇提取，离心后，取上层水相，加入乙醇，震荡后离心，弃上清，晾干后得到总DNA。本发明提供的提取方法提取率高、操作简便，得到的DNA的纯度和浓度均较高。
Description
技术领域
本发明属于DNA提取技术领域，尤其涉及一种小鼠组织中结核杆菌DNA的提取方法。
背景技术
结核标准菌珠H37Rv感染小鼠后，要得到小鼠体内(如肺组织)中结核杆菌的载量，通过提取其模板DNA，用绝对定量方法得出组织中结核杆菌的拷贝数(copynumber)与组织DNA拷贝数比值。因此，要得到上述结果，必须提取组织总DNA(含小鼠组织DNA和结核杆菌DNA)。目前所知的方法有肺泡灌洗液提取和制作组织石腊切片用二甲苯、丙酮提取法和试剂盒提取法。组织石腊切片用二甲苯、丙酮提取法操作繁琐，DNA的提取率较低；试剂盒提取法：采用市场上购买得到的DNA提取试剂盒，能够进行组织溶解和细胞裂解后提取DNA，虽然该方法操作简便，但是DNA的提取率较低。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种小鼠组织中结核杆菌DNA的提取方法。所述提取方法DNA的提取率高、操作简便。
本发明的技术方案如下：一种小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，包括以下步骤：
步骤(1)将小鼠肺组织匀浆离心后弃上清，加入GA缓冲液和蛋白酶K溶液后，50～56℃水浴3～12h，进行组织溶解得到细胞悬液；
步骤(2)细胞悬液中加入pH为8的TES缓冲液和5％的SDS溶液后，先置于温水浴中40min，再置于沸水浴60min，最后在冰上放置5min，得到混悬液；
步骤(3)在混悬液中加入pH4.8的醋酸钠溶液和0.05mol/L的葡萄糖溶液，冰上放置10～20min；然后加入苯酚/氯仿/异戊醇溶液提取，离心后取上层水相，上层水相中加入氯仿/异戊醇溶液提取，离心后，取上层水相，加入乙醇，充分震荡后，－20℃沉淀30min，离心得到沉淀物，沉淀物即为总DNA，总DNA包括小鼠DNA和结核杆菌DNA，总DNA进行QPCR扩增得到小鼠肺组织中结核杆菌DNA的载量。
步骤(1)所述GA缓冲液、蛋白酶K溶液来源于细菌基因组DNA提取试剂盒,蛋白酶K溶液的浓度为2mg/ml，GA缓冲液用于悬浮细胞，并为蛋白酶K提供适合的反应体系。
TES缓冲液用于裂解细菌的细胞壁，释放DNA，其中含有Tris-HCl、EDTA、SDS和溶菌酶，溶菌酶的浓度为20mg/mL；SDS是一种蛋白变性剂，破坏蛋白质的高级结构。
步骤(2)所述温水浴的温度为36～37℃，溶菌酶在该温度范围下活性最高，从而裂解小鼠肺组织中结核杆菌细胞壁。
步骤(2)沸水浴的目的有两个：第一，在裂解细胞的工作完成后，为了避免溶菌酶继续反应，产生高温使得溶菌酶失活。第二，沸水浴条件下，也可使溶菌酶裂解不充分的结核杆菌细胞壁得到进一步破碎，从而进一步提高DNA得率。
步骤(3)所述苯酚/氯仿/异戊醇溶液中苯酚、氯仿和异戊醇体积比为25：24：1，所述氯仿/异戊醇溶液中氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
作为优选，本发明提供的方法中所述离心条件为12000r/min,离心10min。
作为优选，步骤(3)加入乙醇充分震荡后，在低温条件下可使得DNA更容易沉淀，且可保护DNA不被降解。
提取总DNA后进行QPCR扩增，然后进行琼脂糠凝胶电泳。
QPCR扩增时本发明根据结核杆菌特有基因设计特有的引物序列；QPCR(实时荧光定量PCR)扩增采用的引物序列如下：
前引物：5’－AGAAGGCGTACTCGACCTGA－3’
后引物：5’－CTGAACCGGATCGATGTGTA－3’。
QPCR扩增条件为：94℃预变性3s，94℃变性1min，52℃退火30s，72℃末次延伸30s，变性与退火循环35次。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供的提取方法提取率高、操作简便，得到的DNA的纯度和浓度均较高。
附图说明
图1为提取不同感染时间的小鼠肺组织DNA后进行QPCR扩增后的电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
GA缓冲液和蛋白酶K溶液来源于细菌基因组DNA提取试剂盒，该细菌基因组DNA提取试剂盒购买于天根生化科技有限公司，目录号为DP302-02；PCR试剂盒购买于TaKaRa公司；本发明根据结核杆菌特有基因X52471设计引物序列，由上海生工科技公司合成；所述的小鼠为结核标准菌珠H37Rv感染的km小鼠(雌)。
实施例1
小鼠肺组织(80mg)
↓匀浆，10000rpm，1min
弃上清，向沉淀中加入GA(组织溶解液)200μl和蛋白酶K溶液20μl
↓56℃水浴3.0h，得到细胞悬液
加TES(细胞裂解液PH为8，含溶菌酶浓度为20mg/ml)200μl和
5％(W/V)SDS(沉淀剂)120μl
↓36℃水浴40min,沸水浴60min，冰上放置5min，
得到混悬液
加500μlPH4.8的NaAc(醋酸钠)和100μl0.05mol/LG(葡萄糖)
↓颠倒混匀，冰上放置15min分装成两管
每管加入600μl苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)
↓颠倒混匀，12000rpm，10min
取上层水相至新的离心管
↓
加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)
↓12000rpm，10mim
取上层水相至另一离心管
↓
加入1ml无水乙醇充分震荡，－20℃沉淀30min
↓12000rpm，10min
倒去上清晾干3～5min，得到总DNA，加入50μlTE溶解DNA，将总DNA进行QPCR扩增，然后进行凝胶电泳。
实施例2
小鼠肺组织(80mg)
↓匀浆，10000rpm，1min
弃上清，向沉淀中加入GA(组织溶解液)200μl和蛋白酶K溶液20μl
↓56℃水浴12h，得到细胞悬液
加TES(细胞裂解液PH为8，含溶菌酶浓度为20mg/ml)200μl和
5％(W/V)SDS(沉淀剂)120μl
↓37℃水浴40min,沸水浴60min，冰上放置7min，得到混悬液
加500μlPH4.8的NaAc(醋酸钠)和100μl0.05mol/L(葡萄糖)
↓颠倒混匀，冰上放置20min分装成两管
每管加入600μl苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)
↓颠倒混匀，12000rpm，10min
取上层水相至新的离心管
↓
加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)
↓12000rpm，10mim
取上层水相至另一离心管
↓
加入1ml无水乙醇充分震荡，－15℃沉淀40min
↓12000rpm，10min
倒去上清晾干3～5min，得到总DNA，加入50μlTE溶解DNA，将总DNA进行QPCR扩增，然后进行凝胶电泳。
QPCR(实时荧光定量PCR)
根据结核杆菌特有基因设计引物序列：
引物序列：前引物：5’－AGAAGGCGTACTCGACCTGA－3’
后引物：5’－CTGAACCGGATCGATGTGTA－3’
QPCR反应体系：
目的基因扩增条件：94℃预变性3s
解剖感染时间分别为6周和8周的小鼠，得到其肺组织，分别按照实施例1的实验方案操作，得到总DNA后进行QPCR，然后在3％琼脂糠凝胶上进行电泳，电泳图如图1所示。QPCR扩增得到结核杆菌DNA的载量：小鼠感染6周的平均拷贝数为105.23；小鼠感染8周的平均拷贝数为105.08。
图1中1、10泳道为Maker；2～5泳道为结核杆菌感染6周的小鼠提取肺组织的总DNA用结核杆菌特有序列设计引物扩增目的基因所得产物的泳带；6～9泳道为结核杆菌感染8周的小鼠提取肺组织的总DNA用结核杆菌特有序列设计引物扩增目的基因所得产物的泳带；11～12泳道为液体培养的纯的结核杆菌提取的DNA用结核杆菌特有序列设计引物扩增目的基因所得产物的泳带；13泳道为正常小鼠提取肺组织的DNA，用结核杆菌特有序列设计引物扩增目的基因的泳带，未发现目的基因产物。从图1可看出，采用本发明提供的提取方法，能够将小鼠肺组织中的结核杆菌提取出来，且提取率较高。
本发明的技术方案在以下基金项目的支持下完成，基金项目：国家自然科学基金资助项目(No:81060134；81371835；31560051；81560596)；云南省自然基金项目(No.2010CD221，2011FB244，2012FB011，2013FZ057，2014FA011,2014FB001)。
Claims (8)
1.一种小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)将小鼠肺组织匀浆离心后弃上清，加入GA缓冲液和蛋白酶K溶液后，50～56℃水浴3～12h，进行组织溶解得到细胞悬液；
步骤(2)细胞悬液中加入pH为8的TES缓冲液和5％的SDS溶液后，先置于温水浴中40min，再置于沸水浴60min，最后在冰上放置5min，得到混悬液；
步骤(3)在混悬液中加入pH4.8的醋酸钠溶液和0.05mol/L的葡萄糖溶液，冰上放置10～20min；然后加入苯酚/氯仿/异戊醇溶液提取，离心后取上层水相，上层水相中加入氯仿/异戊醇提取，离心后，取上层水相，加入乙醇，充分震荡后，－20℃沉淀30min，离心得到沉淀物，沉淀物即为总DNA，总DNA进行PCR扩增得到小鼠肺组织中结核杆菌DNA的载量。
2.如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述GA缓冲液、蛋白酶K溶液来源于细菌基因组DNA提取试剂盒，蛋白酶K溶液的浓度为2mg/ml。
3.如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，pH为8的TES缓冲液中含有溶菌酶，溶菌酶的浓度为20mg/mL。
4.如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，步骤(2)所述温水浴的温度为36～37℃。
5.如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，步骤(3)所述苯酚/氯仿/异戊醇溶液中苯酚、氯仿和异戊醇体积比为25：24：1，所述氯仿/异戊醇溶液中氯仿和异戊醇的体积比为24：1。
6.如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，所述离心的转速为12000r/min,离心时间为10min。
7.如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，所述QPCR扩增采用的引物序列为：
前引物：5’－AGAAGGCGTACTCGACCTGA－3’
后引物：5’－CTGAACCGGATCGATGTGTA－3’。
8.如权利要求1所述的小鼠肺组织中结核杆菌DNA的提取方法，其特征在于，QPCR扩增条件为：94℃预变性3s，94℃变性1min，52℃退火30s，72℃末次延伸30s，变性与退火循环35次。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105296663A (zh) * | 2015-12-02 | 2016-02-03 | 昆明医科大学 | 基于荧光染料法数字微滴pcr检测血液中结核杆菌的方法 |
| CN117487796A (zh) * | 2023-11-06 | 2024-02-02 | 江苏伟禾生物科技有限公司 | 一种细胞dna快提取试剂盒及其使用方法 |
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| CN103038347A (zh) * | 2010-05-27 | 2013-04-10 | 蔚山大学校产学协力团 | 使用双重实时聚合酶链式反应和解链曲线分析对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行检测的方法 |
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2015
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