TWI257426B - Nucleic acid amplification methods - Google Patents

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TWI257426B
TWI257426B TW091118795A TW91118795A TWI257426B TW I257426 B TWI257426 B TW I257426B TW 091118795 A TW091118795 A TW 091118795A TW 91118795 A TW91118795 A TW 91118795A TW I257426 B TWI257426 B TW I257426B
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TW
Taiwan
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nucleic acid
primer
acid
dna
template
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Application number
TW091118795A
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Inventor
Tatsuji Enoki
Hiroaki Sagawa
Ikunoshin Kato
Original Assignee
Takara Bio Inc
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(i) 1257426 玖、發明說明 (發明說明應敘明：發明所屬之技術領域、先前技術、内容、實施方式及圖式簡單說明) 技術範疇 本發明係關於一種在臨床範疇中有用之標的核酸之檢測 方法及在基因工程範疇中有用之DNA合成方法，本發明亦 關於做為模板之核酸之增幅方法以及藉該方法所增幅之標 的核酸之檢測方法。 背景技術 在遺傳工程範疇之研究中，DNA之合成被用於各種目 的。其中除了短鏈DNA如募核甞酸之合成外，其之大部分 皆是藉由利用DNA聚合酶之酵素方法實施。舉例言之，有 聚合酶連鎖反應法（PCR法），其被詳細記載在美國專利第 4,683，195號，第4,683,202號及第4,800，159號中。再一例為在 (Trends in Biotechnology)第 10 卷，146〜152 頁（1992)記載之方法 以及與反轉錄酵素反應組合之反轉錄PCR法（RT-PCR法）。 藉由上述方法之開發，可增幅來自DNA或RNA之目標區域。 為使目的DNA區域增幅，例如藉由包含將雙股模板〇ΝΑ 解離為單股（變性），使引子與單股DNA黏接以及從引子合 成互補股（伸長）之3步驟反應，或者藉由將上述3步驟反應 中引子之黏接及伸長之步驟在同一溫度進行之2步驟反應（ 被稱為穿梭PCR)(『PCR法最前線』，「蛋白質核酸酵素」 別冊’第41卷，第5號，425頁〜428頁（1996))而實施此等DNA 合成方法。 再者，另外之方法為於1989年6月14日被公開之歐洲專利 申請案第320, 308號記載之連結酶連鎖反應（LCR ; ligase chain 1257426 (2) ρίϊ 酬續 reaction)法。或者 pcr protoc〇ls，Academic Press. Inc.，1990, 245〜252 頁 §己載之轉錄增幅系統（丁AS ; transcription-based amplification system)法。上述4法，為了再生供接下來增幅循環用之單 股標的分子’必須反覆進行從高溫至低溫之反應數次。像 這樣為了藉由溫度制約反應，反應系統必須以不連續相或 循環方式進行。 因此’在上述之方法中，必須使用溫度範圍廣且能歷時 性進行嚴密溫度調整之高價熱循環器。又，該反應由於在 2〜3種之溫度條件下進行，為了設定溫度需要時間，所以 其耗損之時間隨循環數增加而成比例地增大。 因此，為解決上述問題點，已開發可以在等溫狀態下實 施之核酸增幅法，例如特公平7-114718號記載之股置換型 增幅（SDA ; strand displacement amplification)法，自行複製（3SR ;self-sustained sequence replication)法，日本專利第 2650159 號 記載之核酸序列增幅（NASBA ; nucleic acid sequence based amplification)法，轉錄媒介之增巾畐（TMA ; transcription-mediated amplification)法，日本專利第2710159號記載之Qp複製酶法， 以及美國專利第5,824,517號、國際公開公報第99/092 1 1號 、國際公開公報第95/25180或國際公開第99/49081號等記載 之各種改良SDA法。在美國專利第5,916,777號中，記載在等 溫狀態下寡核苷酸之酵素合成方法。在這些等溫核酸增幅 法或寡核：y：酸合成法之反應中，引子之伸長、引子與單股 伸長生成物（或原來之標的序列）之黏接及接續之引子伸長 ’在被保溫於一定溫度之反應混合物中同時發生。 (3) 1257426 發明說明續頁 這些等溫核酸增幅法之中’最坎 取、、，；將DNA增幅之系統（例如 SDA法），係藉由DNA聚合酶及限制护仏 刺核酸内切酶中介之雙股 置換而增幅試料中標的核酸序列「男 ^ 及其之互補股）之方法， 在該方法中’增幅所用之引子必須 肩有4種，其中2種必須構 築成包含限制核酸内切酶之識別邱/ 立。又，在該方法中， DNA合成用之基質，必須大量使用 三磷酸，例如α位之磷酸基之氧原 S)去氧核糖核菩三磷酸，因而 基因檢查等而言，其之流動成 該方法中，被增幅之DNA片段 被修飾之去氧核糖核苷 子被硫原子（S)取代之（α-對於進行反應為例行工作之 本成為嚴重問體。再者，在 中由於包含上述之修飾核茹 酸’例如（α-S)去氧核糖核答酸，因此例如在將增幅後之DNA 片段進行限制酵素片段長度多樣型（RFLP ; restriction enzyme fragment length polymorphism)解析之場合，該片段無法用限制 酵素切斷。 又，美國專利編號第5,824,517號記載之改良SDA法為一種 使用嵌合引子之DNA增幅方法，其中嵌合引子由RNA及DNA 構成且以DNA被配置在至少3,終端之構造為必要條件。又 ，國際公開公報第99/0921 1號記載之改良SDA法，必須使用 能生成3,突出終端之限制酵素。國際公開公報第95/25180號 記載之改良SD A法需要至少2組之引子對。再者’國際公開 公報第99/4908 1號記載之改良SDA法需要至少2組之引子以 及至少1種經修飾之去氧核糖核答三磷酸。另一方面，美 國專利第5,916,777號，為了合成寡核甞酸，使用在3’終端 具有核糖核甞酸之引子合成DNA ’反應終了後藉由核酸内 1257426 發明說明續頁 (4) 切酶在引子伸長鍵中之引子與伸長鍵之間加進缺口而將二 者分離，然後消化模板，再回收及再利用引子。在該方法 中，再利用引子之時，從反應系單離引子後，必須使其再 度與模板黏接。又，國際公開公報第00/28082號記載之LAMP( 環-媒介之等溫增幅）法，增幅時需要4種引子，而且增幅 產物因做為增幅標的之區域重覆，以致為不具一定尺寸之 DNA。 再者，使用嵌合寡核芬酸引子之等溫核酸增幅方法，有 在國際公開公報00/56877號或國際公開公報第02/16639號記 載之ICAN法（核酸之等溫且為嵌合引子發動之增幅）。但是 ，先前之等溫核酸增幅法仍有各種問題，因此希求一種低 運作成本，而且可將結果得到之DNA片段進一步用在遺傳 工程學處理之核酸增幅方法。 發明之目的 本發明之主要目的係提供一種將試料中之標的核酸高感 度及特異性增幅之標的核酸之增幅方法，以及使用此等方 法之醫藥組合物及套組。 發明之概要 本發明者銳意研究之結果，發現在國際公開第00/56877 號或國際公開第02/16639號公報記載之ICAN法中，藉由將 嵌合寡核荅酸引子與可以黏接在模板核酸之該引子黏接位 置之3’側上游之封阻用寡核甞酸加以組合使用，可以使標 的核酸之增幅效率上升以及改善檢測敏感度，本發明至此 於焉完成。 -9- 1257426 _ 發明說明續頁 本發明之第1發明係關於核酸之增幅方法，其特徵為包 含：
(a)將做為模板之核酸，去氧核糖核甞三磷酸，具股置換 活性之DNA聚合酶，至少一種散合寡核嘗酸引子，至少一 種上游封阻用寡核芬酸及RNaseH混合以調製反應混合物之 步驟；其中該嵌合寡核菩酸引子與做為模板之核酸之鹼基 序列實質上互補，並且為至少含有選自去氧核糖核苷酸及 核苷酸類似物中之成員以及核糖核甞酸，同時該核糖核甞 酸被配置在該引子之3f終端或3f終端側之嵌合寡核苷酸引 子；該上游封阻用寡核茹酸，與模板核酸上與嵌合寡核甞 酸引子實質互補之區域之Y側之鹼基序列實質互補，而且 其之3’終端鹼基被修飾成不會發生DNA聚合酶主導之互補 股伸長反應；以及 (b)將反應混合物培育充分時間，以足以生成反應產物之 步驟。
在本發明之第1發明中，使用之反應混合物尚可含具有 與模板核酸之鹼基序列實質相同之序列之第2嵌合寡核苷 酸引子；再者，使用之反應混合物所含之上游封阻用寡核 苷酸，可被修飾成具有與模板核酸中具有與第2嵌合募核 甞酸引子之鹼基序列實質相同之序列之區域之5’侧之鹼基 序列實質相同之序列，而且其之3’終端鹼基被修飾成不會 發生DNA聚合酶主導之互補股伸長反應。 本發明之第2發明係關於一種組合物，其為供本發明之 第1發明之核酸之增幅方法使用之組合物，其含有至少1種 -10 - 1257426 ,_ ⑹ I發明說明續頁 嵌合寡核甞酸引子及上游封阻用寡核荅酸。 本發明之第3發明係關於一種套組，其為供本發明之第1 發明之核酸之增幅方法使用之套組，其含有嵌合寡核茹酸 引子及上游封阻用寡核甞酸各至少1種。 本發明之第4發明係關於一種標的核酸之檢測方法，其 包含下述步驟：
(a) 藉由本發明之第1發明之核酸之增幅方法，增幅標的 核酸之步驟；以及 (b) 檢測上述步驟增幅而得之標的核酸之步驟。 圖式之簡單說明 圖1A及B為顯示藉由本發明方法增幅之增幅DNA片段之 瓊脂糖電泳照片之圖。 發明之詳細說明
在本說明書中所謂「去氧核糖核甞酸」（在本說明書中 亦被記載為dN)係指糖部分係用D-2-去氧核糖構成之核苷酸 ，例如在鹼基部分中具有腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及胸腺 。密σ定者。再者，去氧核糖核答酸類似物諸如具有7 -脫氮鳥 甞等修飾鹼基之去氧核糖核甞酸及去氧核糖肌甞酸亦被包 含在上述去氧核糖核芬酸中。 在本說明書中，所謂「核糖核茹酸」（在本說明書中被 記載為Ν)係指糖部分係用D-核糖構成之核甞酸，例如在鹼 基部分中具有腺σ票吟、胞哺σ定、鳥嗓吟及尿喊σ定者。再者， 在該核糖核茹酸中包含經修飾之核糖核芬酸，例如包含α-位之磷酸基之氧原子被硫原子取代之經修飾核糖核甞酸 -11 - 1257426 _ ΠΛ 發明說明續頁 [亦被記載為（α-S)核糖核茹酸或（a-S)N]及其他之衍生物 等。 本發明所使用之嵌合寡核茹酸引子，在該引子之3’終端 或3’終端侧配置核糖核甞酸，在本發明之方法中，任一可 以使核酸鏈伸長，可用核酸内切酶切斷及進行股置換反應 者，皆被包含在本發明之嵌合寡核苷酸引子内。 在本說明書中所謂「3’終端侧」係指在核酸例如引子中 ，從中央至3f終端之部份。同樣地，所謂「5f終端侧」係 指核酸中從中央至5’終端之部份。 在本說明書中所謂「上游位置」係指比本發明方法使用 之嵌合寡核甞酸引子之5f終端更5’側之任意位置。因此， 若從構成與嵌合寡核芸酸引子黏接之模板之核酸鏈觀之， 為比該引子更3’側之任意位置。 在本說明書中所謂「核酸内切酶」係指會對自黏接於模 板核酸之上述嵌合寡核苷酸引子進行DNA伸長所生成之雙 股DNA加以作用，而將該引子之核糖核茹酸部份特異性切 斷之酵素。 在本說明書中所謂「DNA聚合酶」係指以DNA股為模板 合成新DNA股之酵素，除了天然型DNA聚合酶之外，亦包 含有上述活性之變異體酵素。該酵素例如為具股置換活性 之DNA聚合酶，無3’核酸外切酶活性之DNA聚合酶，以 及同時具有反轉錄酵素活性及核酸内切酶活性之DNA聚合 酶0 在本說明書中所謂「股置換活性」係指依照作為模板之 -12 - 1257426 (8) 明續頁 核酸序列進行DNA複製之時，一面進行置換dna股，一面 使黏接於模板版之互補股游離，亦即所謂能夠置換股之活 性。又，在本說明書中，藉由股置換而從作為模板之核酸 序列游離之DNA股被稱為「置換股」。 下文，將詳細說明本發明。 (1)本發明使用之嵌合寡核苷酸引子 在本發明之方法中使用之引子為至少含有選自去氧核糖 核嘗酸及核甞酸類似物中之成員以及核糖核苷酸之嵌合寡 核答酸引子。該引子亦包含具有未經修飾之核糖核嘗酸及 /或經修飾之核糖核荅酸之寡核糖核荅酸引子。 在本發明之方法中使用之嵌合寡核甞酸引子，係具有與 模板核酸之鹼基序列之一部分實質上互補之鹼基序列及在 所使用之條件下能夠使DNA鏈伸長，而且在其之3,終端或3, 终知側配i有核糖核甘酸之喪合寡核甞酸引子。該引子通 常被設計成與待增幅區域之上游，亦即對應於模板核酸上 之待增幅區域之驗基序列之3,側部分互補。又，在本文中 「實質上互補之鹼基序列」意指在所使用之反應條件下可 與做為模板之DNA黏接之鹼基序列。 在本發明之方法中被使用之嵌合寡核甞酸引子亦可為含 有1個以上經修飾之核糖核苷酸者。亦即，在本說明書中 之核糖核嘗酸，若被配置在該嵌合寡核甞酸引子之3,終端 或3’終端側且可被核酸内切酶識別或切斷，則可為未經修 飾之核糖核：y：酸及/或經修飾之核糖核荅酸之任一者，亦 即如此之未經修飾之核糖核菩酸及/或經修飾之核糖核苷 1257426 發明說明續頁 (9) 酸之任一者皆被包含在本發明之核糖核甞酸中。換言之， 在本發明之嵌合寡核嘗酸引子中5在未失去該引子之功能 之範圍下可以使用未經修飾之核糖核甞酸及經修飾之核糖 核甞酸，亦可以使用彼等之組合。此等修飾之核糖核甞酸 無特殊限定，例如為與磷酸基鍵結之氧原子被硫原子取代 之（α-S)核糖核荅酸及核糖之2位之羥基被曱氧基取代之核 糖校荅酸。含有如此修飾之核糖核苷酸之嵌合寡核甞酸引 子，例如可藉使用美國專利第5,003,097號記載之用硫化反 應試藥（格蘭研究公司製）之方法調製之（a-S)核糖核甞三磷 酸，或2-〇Me-RNA-CE磷醯胺試藥（格蘭研究公司製）製作。 又，可以設計含有對於核酸内切酶之切斷有耐性之修飾 核糖核甞酸，且可用於本發明增幅方法之嵌合寡核甞酸引 子，如此之引子在控制增幅反應步驟中核酸内切酶之切斷 位置上有用。 在本發明方法中使用之嵌合寡核：y：酸引子，視期望增幅 後之DNA片段係以單股或雙股得到，而分別使用1種或2種 。亦即，期望得到單股DNA之場合，可以使用1種嵌合寡 核謀酸引子，而期望得到雙股DNA之場合，可以使用2種 引子。 在本發明方法中使用之嵌合寡核苷酸引子，若於該引子 之3’終端或3’終端側存在核糖核甞酸，且可用於ICAN法者 ，將無特殊限定。 上述嵌合寡核芬酸引子，例如可以使用鏈長在約6個核 甞酸至約100個核甞酸之範圍内，較佳在約10個核芬酸至 -14 - 1257426 發明說明續頁 (10) 約50個核甞酸之範圍内，更佳在約12個核茹酸至約40個核 甞酸之範圍内之引子。其之鹼基序列在所用反應條件下可 與模板核酸黏接，且以與模板核酸實質上互補之序列為較 佳。該引子在3’終端或3’終端側，包含可被在下述階段使 用之核酸内切酶識別之序列。
雖未對本發明做任何限定，但例如可用具下述通式表示 之構造之寡核苷酸引子做為本發明之DNA合成方法中之引 子： 通式：5’-dNa-Nb-dNc-3’ (式中：dN為去氧核糖核苷酸及/或核苷酸類似物；N為 未經修飾之核糖核甞酸及/或經修飾之核糖核苷酸；又，dNa 部位之一部份dN可被N置換，以及3'終端之核茲酸亦可具 有使該終端無法藉由DNA聚合酶而伸長之修飾）。
在上述通式中，雖無特殊限定，但例如a可為5以上之整 數，以6以上之整數為較佳，以8以上之整數為更佳。又， b可為1以上之整數，例如在1〜15之範圍内，以在1〜10之範 圍内為較佳，以在1〜7之範圍内為更佳，以1〜5之範圍為特 佳。再者，c可為0或1以上之整數，以0〜5為較佳，以0〜3為 更佳。 關於在本發明中使用之嵌合寡核甞酸引子之態樣，無特 殊限定，例如在a=8之場合，可以列舉b=l及c=0之後合寡核 芬酸引子，b=2及c=0之嵌合寡核甞酸引子，b=3〜5及c=0之 嵌合寡核荅酸引子，以及b=2〜3及c = 0〜3之嵌合寡核甞酸引 子等為例。亦即，以可做成在本發明方法中使用之嵌合寡 -15 - 1257426 發明說明續頁 (η) 核苷酸引子之方式調整a，b及c之數值。 就本發明方法所使用之嵌合寡核芬酸引子言之，用DNA 聚合酶從該引子伸長之DNA鏈（引子伸長鏈）所包含之核糖 核甞酸含有部位具有可被核酸内切酶識別或切斷之構造， 該核糖核甞酸被配置在引子之3’端或3'端側。雖未對本發 明特別限定，但例如使RNaseH作用在黏接於模板核酸上之 上述通式表示之嵌合寡核甞酸引子進行DNA伸長所生成之 雙股DNA上時，上述嵌合寡核苷酸引子之核糖核苷酸部份 被切斷，生成在上述嵌合寡核甞酸引子與藉伸長而合成之 DNA鏈之間加入缺口之雙股DNA。再者，藉由DNA聚合酶 從該加入缺口之部位發生股置換反應。因此可以使核酸鏈 從引子之終端伸長，可以被核酸内切酶切斷，以及可以 藉由DNA聚合酶進行股置換反應之嵌合寡核苷酸引子皆可 供本發明方法使用。再者，本發明之嵌合寡核茹酸引子， 包含其之3’終端被修飾成無法藉由DNA聚合酶而伸長，但 在用核酸内切酶切斷後可從新生成之3f終端進行DNA伸長 者。 又，在上述嵌合寡核甞酸引子之5’終端側亦可以包含RNA 聚合酶之啟動子序列。作為該RNA聚合酶者，例如為T7 RNA 聚合酶及SP6 RNA聚合酶。 再者，在本發明方法中所使用之嵌合寡核：y：酸引子亦可 為含有核甞酸類似物及其他物質者。亦即，本發明之嵌合 寡核謀酸引子可以在未失去該引子之功能（亦即使DNA聚合 酶自其之3'終端進行聚合酶伸長反應）之範圍内含有1個以 -16- 1257426 發明說明續頁 (12) 上之核甞酸類似物，又該核甞酸類似物可以採用複數種類 之組合。該核甞酸類似物雖無特殊限定，但例如可以使用 去氧核糖肌苷酸、去氧核糖尿甞酸、具修飾基如7 -脫氮鳥 苷之核苷酸類似物或具有核糖衍生物之核苷酸類似物等。 又，本發明所使用之嵌合寡核茹酸引子，在保持上述機能 之範圍内，亦可以含有各種修飾，例如含有附加標識化合 物等之去氧核糖核甞酸、核糖核荅酸及核甞酸類似物。 將核甞酸類似物導入引子，從抑制引子本身形成高次元 構造以及使其與模板之黏接安定化之觀點言之有效。再者 ，基於同樣目的，亦可將核糖核苷酸導入引子中。雖無特 殊限制，但從防止引子被非特異性核酸内切酶（RNase)分解 之觀點言之，宜使用經修飾之核糖核甞酸如（α-S)核糖核苷 酸。 此等嵌合寡核苷酸引子，例如可用應用生物系統公司> (ABI)之394型DNA合成器藉由磷醯胺化法合成具有任意核— 酸序列者。其他方法尚有磷酸三酯法、Η -膦酸酯法及硫代 膦酸酯法等，不過用任何方法合成者皆可。 (2)在本發明中使用之上游封阻用寡核甞酸 在本發明之方法中使用之上游封阻用寡核茹酸，宜至少 使用從去氧核糖核嘗酸或核甞酸類似物中選出者。 在本發明之方法中使用之上游封阻用寡核苷酸，適合使 用具有與模板核酸之鹼基序列之一部分實質上互補之鹼基 序列，且可以黏接在模板核酸上比上述（1)嵌合寡核荅酸引 子之黏接位置更3’側之區域上者。該寡核甞酸通常被設計 -17 - 1257426 _ ΓΓΛ 發明說明續頁 成與待增幅區域之上游（亦即對應於模板核酸上待增幅區 域之鹼基序列之3’侧部分）互補。又，此處所謂「實質上互 補之鹼基序列」意指在使用之反應條件下可與模板DN Α黏 接之驗基序列。 如上述，本發明之上游封阻用寡核甞酸被修飾成其之3’ 終端在DNA聚合酶主導之DNA伸長反應中無法使用。若可 以達成上述目的，則其之修飾手段將無特殊限定，例如將 下列者附加於3’終端：二去氧核甞酸、核糖之3位之羥基被 修飾之核苷酸、或附加有修飾而使DNA聚合酶主導之伸長 會被立體障礙妨害之核甞酸。上述上游封阻用寡核嘗酸之 核糖之3位之羥基之修飾方法，例如可藉由胺基烷化而防 止DNA伸長反應。 在本發明之方法中使用之上游封阻用寡核苷酸，視增幅 後之DNA片段係以單股或雙股之任一形態得到而可分別使 用1種類或2種類。亦即，在期望單股DNA之場合，使用1 種類之嵌合寡核嘗酸引子及上游封阻用寡核甞酸，又，在 期望雙股DNA之場合，使用2種類之上述引子及封阻用寡 核芬酸。 本發明方法使用之上游封阻用寡核苷酸黏接在模板核酸 上之位置，若就標的核酸之鹼基序列、增幅區域之長度以 及組合之嵌合寡核芬酸引子在標的核酸上之黏接位置而言 ，為增幅效率最良好之位置，將無特殊限定，例如其之3’ 終端被設定成定位在從嵌合寡核甞酸引子之5’終端算起1鹼 基以上之範圍内。 -18 - 1257426 (14) 發明說明續頁 本發明方法所使用之上游封阻用寡核苷酸，若可以得到 使目的增幅片段之檢測敏感度提高等效果，則具有任何鏈 長者皆適用。 雖無特殊限定，但可例示在約6個核茹酸至約100個核甞 酸之範圍内，較佳在約10個核芬酸至約5 0個核嘗酸之範圍 内，更佳約12個核嘗酸至約40個核苷酸之範圍内之上游封 阻用寡核苷酸。其之鹼基序列較佳為與模板核酸實質上互 補之序列，以致在使用之反應條件下可以黏接在模板核酸 上。 再者，在本發明方法中使用之上游封阻用寡核甞酸可為 含有核甞酸類似物及其他物質者。在本發明之上游封阻用 寡核苷酸中，可含有1個以上之核苷酸類似物，再者，對 於該核甞酸類似物，可將複數種加以組合使用。做為該核 甞酸類似物者，無特殊限定，例如可為去氧核糖肌甞酸、 去氧核糖尿甞酸、具修飾基如7-脫氮鳥甞之核甞酸類似物 或具有核糖衍生物之核甞酸類似物等。又，本發明所使用 之上游封阻用寡核菩酸亦可以含有各種修飾，例如附加標 識化合物等之去氧核糖核甞酸、核糖核甞酸及核甞酸類似 物。 在該上游封阻用寡核甞酸中核甞酸類似物之導入，從抑 制寡核苷酸本身形成高次元構造以及使其與模板之黏接安 定化之觀點言之，亦有效。 此等上游封阻用寡核甞酸，例如可用應用生物系統公司 (ABI)之394型DNA合成器藉由磷醯胺化法合成具有任意核 -19 - 1257426 發明說明續頁 (15) 酸序列者。其他方法尚有磷酸三酯法、Η -膦酸酯法及硫代 膦酸酯法等，不過用任何方法合成者皆可。 (3)本發明所使用之核酸内切酶 本發明所使用之核酸内切酶，若能作用於黏接在模板核 酸上之嵌合寡核嘗酸引子（如上文（1)記載者）經由DNA伸長 所生成之雙股DNA，並切斷伸長鏈及引起股置換反應者， 則皆適用。亦即，其為在上述雙股DNA中之嵌合寡核茹酸 引子部分上生成缺口之酵素。在本發明中，核酸内切酶無 特殊限定，例如可以使用核糖核酸酶，尤其適合使用作用 於DNA與RNA形成之雙股核酸之RNA部分之核糖核酸内切 酶H (RNaseH)。又，在該核糖核酸酶中，若為具有上述作 用者，則從常溫性至耐熱性之任一種核糖核酸酶皆適用於 本發明。舉例言之，在本發明方法之一態樣中，於約50 °C 〜約70 °C反應之場合，可以使用來自大腸菌之RNaseH。做. 為該耐熱性核糖核酸酶者，雖無特殊限定，但可列舉市售 之 Hybridase™ 熱安定性 RNaseH(Epicenter Technology 公司製）為 例，此外，來自嗜熱性桿菌屬細菌、棲熱菌屬（Thermas)細 菌、嗜高熱球菌屬（Pyrococcus)細菌、棲熱孢菌屬（Thermotoga) 細菌及球狀太古菌屬（Archaeoglobus)細菌等之RNaseH等亦適 用。再者，該核糖核酸酶，適合使用天然體及變異體之任 一者。又，在本案說明書中記載之RNaseH之酵素單位，係 根據實施例中之參考例所示之酵素單位測定方法所表示之 數值。 又，關於上述RNaseH，若可供本發明方法使用則無特殊 -20- 1257426 發明說明續頁 (16) 限制，例如來自各種病毒、噬菌體、原核生物及真核生物 之任一者之RNaseH。舉例言之，上述細胞性RNaseH例如為 大腸菌RNaseHI，病毒性RNaseH例如為來自HIV-1之RNaseH。 在本發明之方法中，RNaseH可採用I型、II型及III型之任一 者。雖無特殊限定，但以來自大腸菌之RNaseHI，以及來自 嗜高熱球菌屬細菌或來自球狀太古菌屬細菌之RNaseHII為 較佳。 又，在本發明方法中使用之核酸内切酶例如RNaseH之切 斷反應之效率受上述引子之3’終端近旁之鹼基序列左右； 既然RNaseH之切斷反應效率會影響期望之DNA增幅效率， 因此當然應設計對所用RNaseH而言最適合之引子。 在本說明書中所使用之術語「導入缺口」或「加缺口」 意指切斷雙股核酸之一股之内部。舉例言之，RNaseH作用 於DNA與含核糖核苷酸之DNA所形成之雜合雙股核酸時， 藉由選擇性切斷雙股中含核糖核苷酸之股之核糖核甞酸部 份，而在該雜合雙股核酸中導入缺口。 (4)本發明所使用之DNA聚合酶 在本發明中可以使用具DNA股置換活性之DNA聚合酶。 又特別適合使用實質上無3’核酸外切酶活性者。 在本發明中所使用之DNA聚合酶，若為具有上述具股置 換活性者，將無特殊限制；例如可使用來自耐高溫芽孢桿 菌（Bacillus caldotenax，以下稱做B. ca)及嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus，以下稱做B. st)等嗜熱性芽孢桿菌 屬細菌之DNA聚合酶之5’—3f核酸外切酶缺損性突變體，以 -21 - 1257426 (17) 發明說明續頁 及來自大腸菌之DNA聚合酶I之大片段[克蘭勞（Klenow)片段] 等。又，本發明所使用之DNA聚合酶可以使用常溫性至耐 熱性中之任一者。 B. ca為最適繁殖溫度為約70 °C之嗜熱性細菌，已知來自 該細菌之Bca DNA聚合酶具DNA依存性DNA聚合酶活性、 RNA依存性DNA聚合酶活性（反轉錄活性）、5’— 3’核酸外切 酶活性及3’— 5'核酸外切酶活性。上述酵素，可從其本來之 起源精製而取得，或可為藉遺傳工程之方法生產之重組蛋 白質。又，該酵素可為藉由遺傳工程或其他方法進行置換 、刪除、附加及插入而得者，此等酵素例如為欠缺3’核 酸夕卜切S每活性之Bca DNA聚合酶，即Bca BEST DNA聚合酶（ 寶酒造公司製）等。 再者，DNA聚合酶之中，已知在特定條件下具有核酸内 切S；!活性例如RNaseH活性者。可將如此之DNA聚合酶用於、 本發明之方法中。亦即在RNaseH活性可被表現之條件下， 例如Mn2+存在下，使用該DNA聚合酶之態樣。在該態樣中 ，可以在未添加上述RNaseH下實施本發明之方法。亦即上 述之Bca DNA聚合酶在含有Mn2+之缓衝液中可以顯示RNaseH 活性。又，在上述態樣中，不限於使用Bca DNA聚合酶， 已知同時具有RNaseH活性之公知DNA聚合酶，例如來自嗜 高溫棲熱菌（Thermus thermophilus)之Tth DNA聚合酶亦可供本 發明使用。 (5)本發明之標的核酸之增幅方法 本發明之方法，係將上述（1)所示之嵌合寡核甞酸引子及 -22 - 1257426 (18) 發明說明續頁 上述（2)所示之上游封阻用寡核芬酸各至少一種，以及 (3)所示之核酸内切酶及上述（4)所示之DNA聚合酶加以 而實施。又，可以將如上述之具RNaseH活性之DNA聚 在可表現RNaseH活性之條件下使用。 在該方法中，作為伸長反應之基質之核甞三磷酸， 用 PCR 法所用之 dNTP，即 dATP、dCTP、dGTP 及 dTTP 之 物。又，亦可將dUTP做為基質。再者，該dNTP，就作 用DNA聚合酶之基質言之，亦可以包含dNTP (去氧核 甞三磷酸）之類似物，例如7-去氮-dGTP及dITP之三磷 。又，亦可以使用dNTP或dNTP類似物之衍生物，有官 之衍生物例如可以包含有胺基之dUTP。在該方法中使 合寡核菩酸引子，該引子例如可用DNA合成器以通常 成方法同樣地製備。 在本發明之方法中使用之嵌合寡核苷酸引子及上游 用寡核茹酸之使用量，可以依據標的核酸之鹼基序列 的增幅片段長度及使用之反應系組成而調整，例如以 產物量為目標而調整。亦即，在本發明之方法中，只 以得到目的之增幅產物，則上述嵌合寡核答酸引子及 封阻用寡核：y：酸之使用量沒有限定。 在本發明中，所使用之嵌合寡核甞酸引子與上游封 寡核嘗酸之莫耳比，若可以得到目的之增幅產物，其 耳比將無限定。 在本發明方法之一態樣中，嵌合寡核茹酸引子與上 阻用寡核嘗酸之莫耳比，例如在1 : 0.1〜1 : 10之範圍内， 上述 組合 合酶 宜使 混合 為所 糖核 酸等 能基 用嵌 之合 封阻> ，@ 增幅 要可 上述 阻用 之莫 游封 較佳 -23 - 1257426 發明說明續頁 (19) 在1:0.2〜1:5之範圍内，更佳在1:0.25〜1:4之範圍内。 在本發明之方法中，於所用酵素之活性在反應中有降低 可能性之場合，可於反應途中再添加該酵素。添加之酵素 ，可為於反應開始時與反應液中所含之酵素相同者，亦可 為顯示相同作用之不同種類之酵素。亦即，若藉由在反應 途中之添加，可以得到檢測敏感度上升或增幅產物量增大 等效果，則所添加酵素之種類及該酵素之性質將無任何限 定。 在本發明之方法中做為模板之核酸，亦即DNA或RNA， 可為從可能包含該核酸之所有試料製備或單離而得者。再 者，亦可將上述試料直接用於本發明之核酸增幅反應。對 於此等含有核酸之試料雖無特殊限定，但可列舉出下列例 子：來自身體諸如全血、血清、血塊黃層、尿、糞便、腦 脊趙液、精液、唾液、組織（例如癌組織及淋巴結等）、細 胞培養物（例如哺乳動物細胞培養物及細菌培養物等）之試 料，核酸含有試料諸如類病毒、病毒、細菌、黴菌、酵母 、植物及動物，有被微生物諸如病毒或細菌混入或感染可 能性之試料（食品及生物學製劑等），或者可能含有生物之 試料如土壤及排水。又，亦可為將上述試料等用公知之方 法處理而得之含核酸製備物。作為該製備物者，例如有細 胞破碎物或將其分劃而得之試料，以及將該試料中之核酸 或者特定之核酸分子群（例如mRNA)富化而得之試料等。再 者，上述試料中所含之核酸，宜使用以公知方法增幅之DNA 或RNA等核酸。 -24 - 1257426 (2〇) 發明說明 從此等材料製備含核酸製備物之方法無特殊限定，例如 可以藉由用界面活性劑之溶劑處理、超音波處理、使用玻 璃珠之振i搜拌及法國壓製機之使用等而進行。在幾個例 子中’加入進一步操作以精製核酸為有利（例如存在内在 性核酸酶之時）。在此等例子中，核酸之精製藉由酚萃取 、層析、離子交換、凝膠電泳或密度梯度離心等公知之方 法實施。
在增幅具有來自RNA之序列之核酸之場合，用藉由以該 RNA為模板之反轉錄反應合成之cDna做為模板而實施本發 明。關於適用於本發明方法之rNA，若為可以製作反轉錄 反應所用之引子者，則無特殊限制，除了試料中之全RNA 之外’其之例子尚有mRNA、tRNA及rRNA等RNA分子群， 或特疋之RNA分子種類。 上述反轉錄反應所用之引子，在所用之反應條件下，若 為能與模板RNA黏接者，將無特殊限定。該引子除了可為 具有與特定模板RNA互補之鹼基序列之引子（特異性引子） 之外，亦可為寡dT (去氧胸腺嘧啶）引子及具有隨機序列之 引子（隨機引子）。反轉錄用引子之長度，從進行特異性黏 接之觀點§之，以6個核苷酸為較佳，以9個核苷酸為更佳 ’從寡核答酸之合成之觀點言之，以1〇〇個核茹酸以下為 較佳，以30個核苷酸以下為更佳。再者，做為反轉錄用引 子者，可以使用以反轉錄後之〇1^八做為模板進行本發明之 核酸增幅方法時，可以作為股置換反應用引子之具有上述 (1)圯載之性質之肷合募核：y：酸引子。亦即，若可用於從κνΙ -25- 1257426 發明說明續頁 (21) 反轉錄之反應，將無特殊限定。
上述反轉錄反應使用之酵素，若具有以RNA為模板合成 cDNA之活性，將無特殊限制，例如來自鳥骨髓芽球症病毒 之反轉錄酵素（AMV RTase)、來自莫羅尼鼠白血病病毒之反 轉錄酵素（MMLV RTase)、勞斯相關病毒2反轉錄酵素（RAV-2 RTase)等各種來源之反轉錄酵素。在此方面，可以使用同 時具有反轉錄活性之DNA聚合酶。又，為達成本發明目的 ，宜使用在高溫有反轉錄活性之酵素，例如來自棲熱菌屬 (Thermus)之DNA聚合酶（Tth DNA聚合酶等）及來自嗜熱性芽 孢桿菌屬細菌之DNA聚合酶等。雖無特殊限定，但例如以 來自嗜熱性芽孢桿菌屬細菌之DNA聚合酶為較佳，以來自 B· st之DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶）為較佳，以Bca DNA聚合 酶為更佳。舉例言之，Bca DNA聚合酶在反轉錄反應中不 需要錳離子，而且在高溫條件下一面可抑制模板RN A形成 二次元構造，一方面可以合成cDNA。具有上述反轉錄酵素 活性之酵素，可以使用在具該活性之範圍内之天然體及變 異體中之任一種。 又，在其他態樣中，亦可以先將含有待增幅之鹼基序列 之DNA或RNA複製後，做為本發明方法中之模板核酸。關 於該複製之方法，沒有特殊限定，例如可以使用下述方法 :將插入含有待增幅之鹼基序列之核酸片段之載體轉形適 當宿主後，培養得到之轉形體，然後萃取出插入含有待增 幅之驗基序列之核酸片段之載體。該載體’若在宿主内安 定且可被複製，將無特殊限制，例如可以使用pUC系、 -26- 1257426 (22) 發明說明續頁 pBluescript系、pGEM系、宇宙體系及嗤菌體系中之任一種 。又，宿主，若能保持所使用之載體，將無特殊限制，例 如易於培養之大腸菌等。 再者，在上述複製方法之其他態樣中，以含有待增幅之 鹼基序列之核酸片段做為模板，用RNA聚合酶將具有該鹼 基序列之RNA轉錄後，該RNA本身或藉反轉錄反應做成之 cDNA亦可作為本發明方法中之模板。上述含有待增幅之鹼 基序列之核酸片段，只要具有RNA聚合酶之啟動子序列， 將無特殊限制，其可為被插在具有RNA聚合酶之啟動子序 列之載體中者，或為連結於終端具有RNA聚合酶之啟動子 序列之轉接子或功能性區段（cassette)者，其亦可為使用具 有RNA聚合酶之啟動子序列之引子以及適當的模板藉由酵 素方法而合成者。亦即，將上述含有待增幅之鹼基序列之 核酸片段，用如上述被配置之RNA聚合酶之啟動子序列， 以RNA形式複製及增幅。上述載體，只要具有RNA聚合酶 之啟動子序列，將無特殊限制，例如為pUC系、pBluescript 系、pGEM系、宇宙體系及噬菌體系中之任一種。又，該 載體可以採用環狀或處理成直鏈狀者中之任一種。再者， 上述複製及增幅方法所使用之RNA聚合酶雖無特殊限制， 但以使用SP6 RNA聚合8每、T7 RNA聚合S每或T3 RNA聚合S每等 為佳。 雙股DNA (如藉由上述方法單離之染色體組DNA及PCR片 段）以及單股DNA(如用反轉錄反應從全RNA或mRNA調製之 cDNA)中之任一者，在本發明中均適合做為模板DNA。在 -27- 1257426 發明說明續頁 (23) 使用上述雙股DNA之場合，可以實施變性為單股DNA之步 驟（變性步驟），亦可不實施變性為單股DNA之步驟。 亦即，在本發明之方法中，可以進行或不進行上述變性 步驟。 在本發明之一態樣中，在以增幅具有來自RNA之序列之 核酸為目的之場合，將藉以RNA為模板之反轉錄反應所得 之RNA-cDNA雙股核酸加至含有RNaseH之本發明增幅用反應 液中，藉此一方面分解RNA股，一方面開始增幅單股cDNA 之反應。再者，在本發明之DNA合成方法中，藉由使用具 有反轉錄酵素活性及股置換活性之DNA聚合酶，將可用單 一種DNA聚合酶進行以RNA為模板之反轉錄反應，以及以 該反應生成之cDNA做為模板之DNA增幅反應。 上述將雙股變性為單股DNA之步驟之後，或模板為RNA 之場合藉由反轉錄反應調製cDNA(單股DNA)之步驟之後， 可在等溫條件下連續進行核酸之增幅。 在此處所謂「連續地」意指在未伴隨反應溫度及反應液 組成之變更下進行反應。又，在本說明書中，所謂「等溫 」意指可使酵素及核酸鏈在上述各步驟中發揮機能之實質 定溫條件。 本發明之核酸增幅反應，雖然藉由使用例如常溫性DNA 聚合酶諸如Klenow片段而可在常溫（例如37 °C )下實施，但 也可以使用具耐熱性之酵素（核酸内切酶、DNA聚合酶）在 高溫例如50 °C以上實施。在該場合，藉由抑制引子之非特 異性黏接，提高DNA增幅之特異性及解消模板DNA之二次 -28- (24) Ϊ257426 發明說明續頁 構造’亦可提高DNA聚合酶之伸長性。再者，— ， ^ 在該方法中 亦可為連續進行反轉錄反應及核酸增幅 田心怨樣，藉由與 述反應中之反轉錄酵素組合，或使用具有 、π久轉錄活性之 DNA聚合酶，可以將具有來自RNA之序列之DNa增巾5。 在本發明中雖無限定，但在本發明之各態 ^ ^ ^ & τ，較佳先 使模板DNA與和其互補之嵌合寡核：y：酸引子 〜工鮮封阻用 寡核茹酸黏接。繼而藉由具有股置換活性之DNa聚合酶之 作用，從該嵌合寡核甞酸引子之3,終端沿著模板dna之殘 餘序列’使與模板DNA互補之DNA (引子伸長鏈）伸長。此 ^ ’藉由上游封阻用寡核甞酸（其與模板核酸中與該嵌合 寡核苷酸引子實質互補之區域之3,侧鹼基序列實質互補）與 模板核酸黏接，嵌合寡核甞酸引子之伸長鏈被封阻。因此 ’在本發明方法之初期階段中，與嵌合寡核苷酸引子黏接 之待非線性增幅之模板被增幅。藉由該初期反應，本發明 方法之增幅效率穩定地上升。亦即，使標的核酸之檢測敏 感度提高。 在本發明之一態樣中，核酸内切酶係以在上述雙股DNA 中加入缺口之加缺口酵素方式作用，或使欲合募核嘗酸引 子與模板DNA組成之雙股DNA構造改變，不過本發明不受 此理論限制。再者，具股置換活性之DNA聚合酶使DNA鏈 從加入缺口之雙股DNA之缺口之3,端再伸長’生成新穎的 引子伸長鏈，同時游離缺口之3,終端下游之DNA。以致先 合成之引子伸長鏈被新的引子伸長鏈置換° 本發明之核酸增幅方法，可以藉由使用一組引子及一組 -29- 1257426 (25) 發明說明續頁 上游封阻用寡核甞酸而實施，亦即藉由使用與模板核酸 補之嵌合寡核甞酸引子與上游封阻用寡核茹酸，以及與 換股互補之另一種嵌合寡核荅酸引子與上游封阻用寡核 酸而實施。在該場合，首先使嵌合寡核荅酸引子黏接於 股DNA並合成各個之互補股，然後使上游封阻用寡核苷 黏接於各個互補股，以在上游封阻用寡核苷酸黏接之位 封阻各個互補股彼此之黏接。又，在該伸長反應中，同 進行模板交換反應。若使用該態樣，各反應產物顯然有 為其他引子之模板之機能。如此藉由增加模板量，增幅 物可以非線性地增加。 在使用雙股DNA做為模板實施本發明之核酸增幅方法 場合，藉由使用黏接於雙股之各股之嵌合寡核苷酸引子 上游封阻用寡核嘗酸，可將該二股作為增幅反應之模板 在將雙股DNA做為模板而開始反應之場合，可以將嵌合 核苷酸引子，上游封阻用寡核苷酸，4種去氧核糖核甞 磷酸（dNTP)，DNA聚合酶及核酸内切酶添加至反應液中 藉由熱處理變性雙股DNA ;在未使用耐熱性酵素之場合 較佳在變性後添加酵素。 在使用雙股之模板DNA及2種嵌合寡核芬酸引子及上 封阻用寡核：y：酸之本發明核酸增幅方法之態樣中，視反 之條件，在從各引子伸長之反應中，有時各個模板-伸 鏈中間體之間會發生模板交換，而產生被合成之引子伸 鏈彼此黏接而成之雙股核酸。該雙股核酸在兩端具有嵌 寡核甞酸引子，繼而從其兩端再度開始藉由股置換之互 互 置 -y- 雙 酸 置 時 做 產 之 及 0 寡 游 應 長 長 合 補 -30- 1257426 發明說明續頁 (26) 股伸長反應。該反應之結果為生成一端有引子序列之增幅 產物。再者，在該反應中發生模板交換之場合，將再度生 成與上述同樣之雙股核酸。 依照本發明，提供一種包含使用具股置換活性之DNA聚 合酶及進行模板交換反應之步驟之核酸增幅方法。在該模 板交換反應中，於做為模板之雙股核酸，與各股之鹼基序 列實質互補之2種嵌合寡核甞酸引子，上游封阻用寡核菩 酸，以及具股置換活性之DNA聚合酶存在下，合成與該模 板互補之2種引子伸長鏈。在該引子伸長鏈之合成途中， 會發生從引子伸長鏈之各模板交換為另一引子伸長鏈之模 板。 此處所謂「模板交換反應」，係指從雙股核酸之兩侧藉 由股置換反應進行互補股合成之時，DNA聚合酶變換其之 模板，以新合成之各互補股做為模板進行接續之互補股合I 成。換言之，在做為模板之雙股核酸用各個引子及具股置 換活性之DNA聚合酶處理以生成與該模板互補之伸長鏈之 反應中，於合成該伸長鏈之時，DNA聚合酶使引子伸長鏈 轉換為另一引子伸長鏈之可動模板以替代其之當初模板。 在本發明中，於股置換反應中宜用具有進行上述模板交 換反應之能力之DNA聚合酶，例如特別適合使用欠缺5f— 3’ 核酸外切酶活性之Bca DNA聚合酶（一種突變體酵素）。該酵 素以BcaBest DNA聚合酶之名稱被販售。 在本發明之增幅方法中，嵌合寡核嘗酸引子伸長鏈之含 核糖核荅酸部位被切斷之時，藉由該切斷生成之5’側片段（ -31 - 1257426 發明說明續頁 (27) 引子部分）有時被切成不含核糖核甞酸。從如此生成之引 子部分伸長而得之引子伸長鏈亦將不會被核酸内切酶切斷 ，結果生成在終端具有引子序列之增幅產物。 如上述，在本發明之核酸增幅方法中，未含引子序列之 增幅產物之外，亦會生成一端或二端具有引子序列之產物 。此等產物亦被包含在本發明之增幅產物中。
在使用嵌合寡核荅酸之本發明之核酸增幅方法中，有時 會生成增幅區域連續之聚合體。此等聚合體有複數個增幅 區域，任一個皆同向相連。藉由電泳解析增幅產物，確認 有尾羽狀帶。該聚合體之生成被認為受到被增幅之區域、 該區域之尺寸、其之鄰接區域、所使用之嵌合寡核芬酸引 子之鹼基序列或反應之條件等影響。
上述聚合體為包含複數個增幅區域者。該聚合體，例如 與適當之探針雜合時，會與多個探針雜合，以致該聚合體 產生強烈之信號，因此在以檢測包含增幅區域之核酸為目 的之場合中有用。又，與限制酵素消化等組合時，亦可以 從聚合體得到為單體形式之增幅區域或其之一部分。 由於從引子部分之Y終端下游進行伸長鏈合成時，必然 伴隨置換先前伸長之DNA鏈，所以本發明使用之DNA聚合 酶不得顯示具分解置換股可能性之y-^3f核酸外切酶活性。 此等DNA聚合酶，例如有來自大腸菌之DNA聚合酶I且為核 酸外切S每缺損性突變體之克蘭勞（Klenow)片段、來自BstDNA 聚合酶之同樣片段（New England Biolabs製）及來自Β· ca之 BcaBEST DNA聚合酶（寶酒造公司製）。亦可以使用序列酶1.0 -32- 1257426 (28) 發明說明續頁 及序列酶2.0(美國生物化學公司製），以及 頁（1991)記載之T5 DNA聚合酶及φ29 DNA聚 有5’—3’核酸外切酶活性之聚合酶，若該活 當的抑制劑而被抑制，則仍可被用於本發 法中。 本發明之核酸之增幅方法可在變溫下進 下進行。此處所謂「變溫」意指在不妨礙 範圍内，變化各步驟之反應溫度。亦即， 變化為適於引子之黏接，互補股之合成反 缺口，以及適合各個置換反應之溫度。 所謂「等溫」則係指不變化各步驟之反 實質上係在定溫下進行。在任一場合中， 為最適反應條件之溫度。 本發明之核酸增幅方法之一特徵為在核 無需將溫度調高調低。亦即本發明提供一 酸合成方法。以前多種核酸增幅方法，必 高調低才能從合成股解離標的物，例如需 特別反應裝置，但在本發明方法中，可以 度之裝置中實施。藉此，本發明之方法可 施。較佳將反應溫度設定成能使引子之非 而且能使引子與做為模板之核酸特異性黏 雖未特別限定，但如上述，可以使用耐熱 件下進行本發明之方法。再者，從保持高 言之，本發明之方法較佳在能使酵素之活
Gene 第 97 卷 13〜19 合酶。通常縱使 性可藉由添加適 明之DNA合成方 行，亦可在等溫 各步驟之反應之 舉例言之，分別 應，互補股之加 應溫度，各步驟 當然設定為能成 酸之合成方法中 種在等溫下之核 須藉由將溫度調 要如熱循環器之 只在保持一定溫 在單一溫度下實 特異性黏接減低 接之嚴苛程度。 性酵素在高溫條 反應效率之觀點 性被充分保持之 -33 - 1257426 (29) 發明說明續頁 適當溫度下進行。因此，視使用之酵素，車交佳之反應溫度 為約20t〜約8(TC ，以約30t：〜約75。〇為更佳，以約咒它〜約 0 C為特佳尤其在於而溫條件下進行反應之場合，較佳 使用鍵長比在常溫下進行反應之場合所用者長之引子。例 如在本發明之方法中，反應溫度設定為551至60 π或65它 之場合，該法使用之引子之長度，雖無特殊限定，但例如 可以使用長度為6個核:酸〜丨00個核：y：酸，較佳丨〇個核苷 酸〜50個核苷酸，更佳12個核荅酸〜4〇個核苷酸之引子。像 這樣提高反應溫度，可以例如解消模板DNA之二次構造， 即使在使用GC含量高之模板核酸之場合，期望之核酸亦 "T被增幅。又，在將鏈長相當長之區域增幅之場合中亦有 同樣之效果。該效果在約60 bp〜約20 kbp之範圍内，更佳在 約60 bp〜約4.3 kbp之範圍内，尤其在約60 bp〜約15〇〇 bp之範 圍内可被見到。 又’在本發明之方法中，在使用具有反轉錄酵素活性之 DNA聚合酶（例如BcaBEST DNA聚合酶）之場合，可以簡便地 實施包含從RNA調製cDNA之步驟（反轉錄反應）之來自rna 之核酸之增幅。又’可以獨立進行從RNa調製cDNa之步驟 ’以及其之生成物（cDNA)可做為本發明方法中之模板dna 〇 在任一 ％合，於本發明之方法中，反覆進行至藉由適當 方法（例如一面使酵素失活’一面將反應溫度降低）使反應 停止，或基質中之任一者被用盡為止。 本發明之核酸增幅方法可供利用核酸增幅之各種實驗操 -34- 1257426 發明說明續頁 (30) 作使用，例如核酸之檢測、標識及鹼基序列之決定。 又，本發明之核酸之增幅方法可以應用在原位核酸增幅 方法，在如DNA片之固相載體上之核酸增幅方法或同時增 幅多種區域之多倍核酸增幅方法。 又，本發明之上游封阻用寡核芬酸，亦可用在所謂之不 對稱核酸增幅方法（亦即在一方引子量相對於另一方為過 量下進行增幅反應）中。 依照本發明之核酸之增幅方法，可以調製實質上不含互 補股之單股DNA，舉例言之，供製作核酸固定物諸如DNA 片（chip)之單股DNA、標的核酸檢測用之單股DNA探針、或 供長鏈PCR法用之巨型引子均可在短時間内容易地製作。 又，藉由使用本發明之方法，可以只選擇增殖有意義序列 或只選擇增殖反義序列。因此，本發明在做為具有意義序 列或反義序列之核酸之製造方法上有用。 又，本發明之方法，藉由在必辛（bicine)、麥黃S (tricin) 、海派斯（Hepes)、磷酸鹽或Tris緩衝液中進行，縱使從微 量之模板核酸亦可以增幅期望之核酸序列區域。 再者，在本發明之核酸增幅方法中，由於無需使用可以 隨時間調節溫度之反應裝置，以致可以使用大容量之反應 液實施增幅反應。因此，可以工業規模大量製造被用於醫 藥用途等之核酸。 又，本發明之核酸增幅方法，可以生成對做為模板之核 酸之鹼基序列忠實對應之增幅產物。在本發明方法中DNA 合成之誤差頻率藉由解析所得增幅產物之鹼基序列而確認 -35 - 1257426 發明說明續頁 (31) 時，可以發現本發明方法個別得到之增幅產物中所見到之 誤差頻率與已知能以高忠實度增幅核酸之LA-PCR法中所見 到者為同等。亦即，本發明方法具有可與LA-PCR法匹敵之 忠實度。 (6)本發明之套組 本發明提供在上述本發明之核酸增幅方法中使用之套組 。在一實施態樣中，該套組，在被包裝之形態中，包含股 置換反應中之DNA聚合酶、核酸内切酶、嵌合寡核甞酸引 子及上游封阻用寡核甞酸之使用說明書。再者，包含具股 置換活性之DNA聚合酶、核酸内切酶以及股置換反應用之 緩衝液之套組適合供本發明之方法使用。或者亦可以依照 說明書選擇及使用市售之具股置換活性之DNA聚合酶及/或 核酸内切酶。再者，亦可以包含以RNA為模板之場合之反 轉錄反應用試藥。DNA聚合酶可以從上述（4)記載之供本發、 明使用之DNA聚合酶選擇。又，核酸内切酶可以從上述（3) 記載之核酸内切酶選擇。 上述所謂「說明書」係記載該套組之使用方法例如股置 換反應用試藥液之調製方法以及被推薦之反應條件等之印 刷物，除了以小冊子或傳單之形式使用之說明書之外，還 包括被附加在套組上之標籤及被記載在收納套組之包裝等 上者。再者，亦包含經由電子媒體如網路揭示及提供之資 料。 再者，在本發明之套組中，亦可以包含含有必辛、麥黃 S同、海派斯、礎酸鹽或Tris緩衝成分之緩衝液以及黏接溶 -36- 發明說明續頁 1257426 (32) 液。另外，亦可以包含具有股置換能力之DNA聚合酶 RNaseH。再者，亦可以含有被修飾之去氧核糖核甞酸或 氧核糖核甘二填酸之類似物。 又，在標的核酸之檢測方法中使用之套組，除了包含 述說明書及供增幅反應用之試藥類之外，亦可包含適於 的核酸增幅用之嵌合寡核苷酸引子、上游封阻用寡核甞 以及供檢測被增幅之標的核酸用之試藥，例如探針等。 再者，本發明之套組包含含有上述本發明使用之嵌合 核苷酸引子、上游封阻用寡核甞酸及/或本發明之探針 套組。 (7)本發明之組合物 本發明提供上述本發明之核酸增幅方法或本發明之核 之檢測方法使用之組合物。做為該組合物者，例如為含 上述（1)記載之嵌合寡核苷酸引子，上述（2)記載之上游封 用寡核苷酸，上述（3)記載之核酸内切酶及上述（4)記載 DNA聚合酶者。再者，供進行增幅反應之成分亦可包含 衝成分、鎂鹽及dNTP等。亦可以含有被修飾之去氧核糖 謀酸或去氧核糖核甞三磷酸之類似物。再者亦可以使用 衝成分及其他添加物。 特別適合之態樣例如為含有上述各種成分且具適合本 明之核酸增幅方法用之組成之組合物。該組合物可以在 添加適當的模板，嵌合寡核嘗酸引子及上游封阻用寡核 酸下實施增幅反應。再者，在增幅對象為事先已知之場 ，以含有適於該增幅對象之增幅之嵌合寡核答酸引子之 及 去 上 標 酸 寡 之 酸 有 阻 之 緩 核 緩 發 只 合 組 -37- 1257426 (33) 發明說明續頁 合物為宜。 (8)本發明之標的核酸之檢測方法 藉由使用本發明之核酸之增幅方法，可以進行試料 的核酸之檢測。該檢測方法包含： (a) 藉由上述之本發明之核酸之增幅方法，增幅標的 之步驟；以及 (b) 檢測藉由上述步驟增幅之標的核酸之步驟。 在上述（a)步驟中，以RNA為模板之場合，可將反轉 應與核酸增幅反應以一段式進行。雖無特殊限定，但 用反轉錄酵素與股置換型DNA聚合酶之組合，例如 RTase、MMLV RTase 或 RAV-2 RTase 與 Bca DNA 聚合酶之 〇 上述方法能夠用於檢測及定量試料中存在之特定基 亦即能夠從所謂可能含有DNA或RNA等核酸之試料中 出特定基因並加以定量。做為上述試料者無特殊限定 如可以從來自身體之試料諸如全血、血清、血塊黃層 coat)、尿、糞便、腦脊體液、精液、唾液、組織（例如 織及淋巴結等）及細胞培養物（例如哺乳動物細胞培養 細菌培養物等），含核酸之試料諸如類病毒、病毒、 、黴菌、酵母菌、植物及動物，可能混入或感染病毒 菌等微生物之試料（食品及生物學製劑等），或者可能 生物之試料諸如土壤及排水等，檢測及定量特定基因 者藉由偵測來自類病毒、病毒、黴菌、細菌或其他微 之特定基因，以及依據該基因是否存在，可被用於檢 中標 核酸 錄反 宜使 AMV 組合 因。 檢測I ，例 (buffy 癌組 物及 細菌 或細 含有 〇再 生物 測及 -38 - 1257426 (34) 定量上述微生物之存在。尤其病原性微生 衛生及環境區域中有用。再者，在生物基 查基因之表現狀態上，可以使用本發明之 基因例如與細胞之癌化相關之基因寺之檢 確認在醫療區域特別有用。供上述檢測方 之核酸，可以使用RNA及DNA中之任一種。 又，本發明之標的核酸之檢測方法亦可 基因多型之定型方法。 雖無特殊限定，但舉例言之，所使用之 子之3f終端部分可被設計成定位在做為標 待判別特定鹼基之附近，並使該鹼基與引 基形成氫鍵。使用如此之嵌合寡核甞酸引 之場合，若引子之Υ終端部分之鹼基序列 列之間存在錯配，則不會發生標的核酸之 見到增幅產物生成。藉由該方法可以得到 鹼基之資料諸如點突變及單鹼基置賴 polymorphysm，SNP) 0 同樣地，本發明之方法亦可做為基因多 及插入突變之定型方法。 又，本發明之上游封阻用寡核荅酸，亦 請案PCT/JP02/01222號說明書中記載之基因 方法中使用。 將基因多型予以定型之方法之一態樣為 基因多型予以定型之方法，其特徵為包含 發明說明續頁 物之檢測方法在 因型之判別及調 方法。疾病相關 測及表現狀態之 法用之做為模板 做為標的核酸中 嵌合寡核甞酸引 的之驗基序列之 子之3’終端之鹼 子實施增幅反應 與模板之鹼基序 增幅，以及無法* 基因上有關特定 ：(single nucleotide 型諸如缺失突變 可以在將國際申 多型予以定型之 將標的核酸中之 下列步驟：
-39- 1257426 (35) 發明說明續頁 (1) 將含有標的核酸之試料與核嘗酸混合之步驟，其中該 核茹酸為： A) 其之3’終端被修飾成該終端不會發生DNA聚合酶主導 之伸長； B) 具有能黏接在含有標的核酸之上述特定鹼基之區域上 之驗基序列， C) 含有之序列，為在該核菩酸與標的核酸形成之複合體 中，若於上述特定鹼基與對應於該鹼基之核甞酸上之鹼基 間存在錯配時，能使該核茹酸不會被核酸酶切斷，且若於 上述特定鹼基與對應於該鹼基之核甞酸上之鹼基間不存在 錯配時，會使該核茹酸被核酸酶切斷而生成新的3’終端者； (2) 將上述混合物用核酸酶及DNA聚合酶處理之步驟；以 及 (3) 檢測核甞酸是否被核酸酶切斷之步驟；在該將標的核 酸中之基因多型予以定型之步驟中，可以將上述核甞酸與 本發明之上游封阻用寡核甞酸組合使用。 另一態樣為將標的核酸中之基因多型予以定型之方法， 其特徵為包含下列步驟： (1)將含有標的核酸之試料與核謀酸混合之步驟：其中該 核4酸為· A) 其之3’終端被修飾成該終端不會發生DNA聚合酶主導 之伸長； B) 具有能黏接在含有標的核酸之上述特定驗基之區域上 之驗基序列， -40- 1257426 (36) 發明說明續頁 C)所含之序列，為在該核甞酸與標的核酸形成之複合體 中，若於上述特定鹼基與對應於該鹼基之核荅酸上之鹼基 間不存在錯配時，能使該核苷酸不會被核酸酶切斷，且若 於上述特定鹼基與對應於該鹼基之核苷酸上之鹼基間存在 錯配時，能使該核荅酸被核酸酶切斷而生成新3’終端者； (2) 將上述混合物用核酸酶及DNA聚合酶處理之步驟；以 以及 (3) 檢測核甞酸是否被核酸酶切斷之步驟；在該將標的核 酸中之基因多型予以定型之方法中，可以組合使用本發明 之上游封阻用寡核嘗酸。 上述「基因多型」意指在同一生物集團内所含之個體間 基因之驗基序列有差異。構成「基因多型」之驗基差異〃 不限於特定之形式，包含「鹼基取代」、「缺失突變」及「 插入突變」等各種類型。該基因情報之差異亦被稱為「變 異」（variation) 〇 上述「鹼基取代」表示在核酸上之特定部位上，其之一 部分鹼基被其他鹼基取代。上述「鹼基取代」亦包含「單 鹼基取代多型（SNP)」。 又，所謂「缺失突變」表示在核酸上之特定部位上，其 之一部分或全部鹼基序列缺失。 再者，所謂「插入突變」表示在核酸上之特定部位上， 插入任意鏈長之驗基序列。 在上述之態樣中，使本發明之封阻用寡核荅酸黏接在標 的核酸之上述核荅酸之上游位置。結果，在標的核酸上之 -41 - 1257426 發明說明續頁 (37) 基因多型之定型之場合，與本發明之標的核酸之增幅方法 之場合同樣，其之檢測敏感度可以提高。
本發明之標的核酸之檢測方法藉由從含有核酸之試料直 接增幅標的核酸而實施。在該場合，被增幅之標的核酸之 鏈長雖無特殊限定，但從檢測標的核酸之敏感度較佳之觀 點言之，以在例如200 bp以下，較佳150 bp以下之區域為有 效。將本發明之嵌合寡核甞酸引子設定成該增幅鏈長，將 可以高敏感度檢測出試料中之標的核酸。
再者，在本發明之檢測方法中，藉由使用含有必辛（bicine) 、麥黃酮（tricin)、海派斯（Hepes)、叾粦酸鹽或Tris緩衝成分之 反應緩衝液，可以從微量之核酸試料以高敏感度檢測出標 的核酸。在該場合，使用之核酸内切酶及DNA聚合酶雖無 特殊限定，但較佳使用來自Afu之RNaseH與BcaBEST DNA聚 合酶之組合。上述核酸内切酶及DNA聚合酶合用時，可以 預見所使用之單位數將隨其之種類而有所不同，此時可以 檢測敏感度提高或增幅產物量增加為指標，調整該緩衝液 之組成及酵素之添加量。 在本發明之檢測方法中，增幅標的核酸之時，可納入dUTP 以做為基質。因此，在用dUTP做為基質之場合，可以利用 尿嘧啶N-糖甞酶（UNG)分解增幅產物，而防止因增幅產物 傳遞污染而造成之偽陽性。 在上述之（b)步驟中公知之核酸檢測方法，可以使用例如 藉由電泳檢測具特定尺寸之反應產物之方法，以及藉由與 探針雜合之檢測方法等。又，適合使用與磁性珠粒等組合 -42 - 1257426 (38) 之檢測方法 ^'——-_ 發明說明續頁 化乙鍵等鸯^由上述電泳之檢射，通常可以使用漠 針除了可藉& $ ’亦可與探針之雜合加以組合。又，探 標識諸如生^ Μ同位素標識之外’亦可使用非放射性 ⑷步驟中使用栌及螢光物質進行標識。此外，藉由在檢測 幅產物中，/識之核答酸，可使標識之核答酸被納入增 信號；亦可以：払測變得容易以及利用該標識增強檢測用 檢測。再者，f由螢光偏光法及利用螢光能量轉移等進行 的核酸或進行^構築適#的檢測t统，可以自動檢測標 法之肉眼撿剛、去的核齩之疋里。X ’亦適合使用藉由雜合 用2種以上 間之距離能達光物質標識且此等螢光物質被配置成彼此 核糖核苷s曼與成消光狀態之核糖核苷酸（RNA)探針，或者 本發明之檢、目丨氧核糖核甘酸構成之嵌合募核茹酸探針在 但在與來自與其/中均可以使用。該探針雖未發出螢光，
會分解該探針、互補之標的核酸之增幅DNA黏接時，RNaseH 得螢光得r; & 、、告果，探針上螢光物質間之距離增大，使
下實施本發日 藉此了知彳示的核酸之存在。在使用RNaseH 液中苏力 /核酸增幅方法之場合，僅藉由在其之反應 η、、刀ϋ上述探 一 你m ’十就可檢測出標的核酸。該探針之標識所 使用之螢光物
貝例如為6-FAM(6-敌基螢光素）與TAMRA (N，N，N，，N，-四甲其 & % # T暴‘羧基若丹明）之組合。 再者本發明提供在上述標的核酸之檢測方法中使用之 "十本發明之棟針’在通常可雜合於藉由上述本發明之 核酸增幅方法增幅之核酸之條件T，若可與標的核酸雜合 -43 - 1257426 發明說明續頁 (39) ，將無特殊限定，不過，從特異性檢測增幅產物之觀點言 之，較佳可在本技藝人士已知之嚴密條件下進行雜合。上 述嚴密的雜合條件’例如被記載在1989年，c〇ld Spnng Harb〇r Laboratory發行 ’ T，Mamatis 編集，M〇lecularC1〇讓g: a Lab〇rat〇ry Manual 2nd ed·中。具體的嚴密條件例如為下述之條件。亦 即’在包含 0.5% SDS，5xDenhardt’s [0.1%牛血清白蛋白（BSA) ，0.1%聚乙烯晚咯啶酮及〇.1〇/0 Fic〇U 4〇〇] 及1〇〇 jag/mi鮭魚精 子 DNA之 6xSSC (lxSSC : 0·15 M NaCl，0.015 Μ檸檬酸鈉，pH 7.0) 中，在比所用探針之Tm值低約25 °C之溫度下進行4小時〜一 夜之保溫。為了容易檢測出標的核酸，上述探針可以附加 上述之標識。 在本發明之方法中，沒有必要使用諸如熱循環器之裝置 。又，在本發明之方法中，藉由將嵌合寡核甞酸引子與上 游封阻用募核菩酸加以組合，可以使標的核酸之檢測敏感、 度提高。又，dNTP等試藥可以延用在PCR等中使用者。基 於此，適合用在例行基因檢查等之區域。再者，本發明之 方法由於可以在比PCR法短之時間内得到更多之增幅產物 ，所以可被利用做為簡便、迅速及高敏感度之基因檢測方 法。 在染色體組層次之基因解析中，為了解析大量之鹼基序 列，正嘗試將反應系統微量化，以進一步提高密集度。該 手段之一為開發利用最先端之超微細加工技術，將染色體 組解析之基本步驟（例如從細胞萃取DNA，DNA之增幅反應 ，電泳、雜合及目標DNA之檢測等步驟）密集化在數cm角〜 -44- 1257426 (40) 發明說明續頁 指尖大小之微量片材上。該系統被稱為”顯微片”（microchip) 或”超微片"（nanochip)。
在此等系統中，雖然現在使用之PCR法被考慮用於基因 增幅反應，但由於該法需要隨著時間反覆進行溫度上升及 下降之溫度控制，所以使得該系統變得複雜。相對於此， 可以在等溫條件下增幅核酸之本發明方法可將系統單純化 ，所以非常適合用在如上述被密集化之系統。再者，利用 本發明之技術可以構築更高密集度之系統。 實施例 藉由實施例詳細說明本發明，但本發明不限於此等實施 例0 參考例1 來自火焰色球狀太古菌（Archaeoglobus fulgidus)之 RNaseHII基因之選殖 (1)火焰色球狀太古菌染色體組DNA之調製
收集相當於8 ml份之火焰色球狀太古菌（從Deutsche Sammlung von Microorganismen GmbH購入：DSM4139)之菌體， 懸浮於 100 μΐ 之 25% 蔗糖及 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)中，力口入 20 μΐ 之0.5 M EDTA及10 μΐ之10 mg/ml氯化溶菌酶（半井化學藥品公 司製）水溶液，並於20 °C反應1小時。反應終了後，在該反 應液中力口入 800 μΐ 之 150 mM NaCl，1 mM EDTA，20 mM Tris-HCl (pH 8·0)，10 μΐ之20 mg/ml蛋白酶K(寶酒造公司製）及50 μΐ之 1 〇%十二基硫酸鈉水溶液加至並於3 7 °C保溫1小時。反應終 了後，用酚-氣仿萃取，用乙醇沉澱及風乾後，溶於50 μΐ 之ΤΕ，得到染色體組DNA溶液。 -45 - 1257426 (41) 發明說明續頁 (2)RNaseHII基因之選殖 火焰色球狀太古囷之全部染色體組序列已被公開[Nature ，第390卷’第364-370頁（1997)]，以及已明白存在丄個編碼 RNaseHII之同類物之基因（AF0621)(序列表之序列編號1， http://www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage. html)
因此合成該AF0621基因（序列表之序列編號1)之序列，以 及弓丨子AfuNde(序列表之序列編號2)及AfuBam(序列表之序 列編號3)。 以上述（1)得到之火焰色球狀太古菌染色體組DNA 30 ng 為模板，使用 20 pmol 之 AfuNde 及 20 pmol 之 AfuBam，並以 1〇〇 μΐ 之容量進行PCR。PCR中之DNA聚合酶，係依照隨附之規程 使用Pyrro Best DNA聚合酶（寶酒造公司製）；PCR係以94°C /30
秒，55 °C /30秒及72 °C /1分鐘為一循環，進行40循環。將增 幅之約0.6 kb之DNA片段用Ndel及BamHI (皆為寶酒造公司製）. 消化，將得到之DNA片段插入質體pTV119Nd(將pTVll9N之 Ncol部位變換為Ndel部位者）之Ndel與BamHI之間，以製作 pAFU204 〇 (3)包含RNaseHII基因之DNA片段之鹼基序列之決定 將上述（2)得到之pAFU204之插入DNA片段之鹼基序列藉 由二去氧法決定。 解析得到之鹼基序列之結果時，發現被認為係編碼 RNaseHII之開放譯碼區。將該開放譯碼區之鹼基序列示於 序列表之序列編號4中。又，從該鹼基序列推定之RNaseHII 之胺基酸序列示於序列表之序列編號5中。 -46- 1257426 _ (42) 發明說明續頁 又，將用質體pAFU204轉形之大腸菌JM109命名為大腸菌 JM109/pAFU204，從平成13年2月22曰（原寄存曰）寄存於曰本 茨城縣市東1 丁目1番地1中央第6(郵遞區號305-8566)獨立行 政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心，寄存編號 為FERM P-18221，又，以寄存編號FERM BP-7691寄存在上述 獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心[移 管至國際寄存之申請曰：平成13年8月2曰]。於2001年8月15 曰寄存於中華民國（台灣）食品工業發展研究所，寄存編號 為 CCRC 940366。 (4)精製RNaseHII標準品之調製. 用上述（2)得到之pAFU204轉形大腸菌JM109，將得到之包 含PAFU204之大腸菌JM109植菌在含100 pg/ml胺苄青黴素之2 公升LB培養基中，然後於37 °C下振盪培養16小時。培養終 了後，將藉由離心收集之菌體懸浮在37.1 ml之超音波用緩 衝液[50 mM Tris-HCl (pH 8.0)，1 mM EDTA，2 mM苯基甲磺醯 氟]中，並置於超音波破碎機中。將該破碎液於12000 rpm進 行10分鐘之離心，將得到之上清液於70 °C加熱處理15分鐘 。其後於12000 rpm再次進行10分鐘之離心，收集上清液， 得到40.3 ml之熱處理上清液。 將該溶液供給至用緩衝液A[50 mM Tris-HCl (pH 8.0)，1 mM EDTA]平衡化之 RESOURSE Q管柱（Amersham Pharmacia Biotech 公司製）中，用 FPLC 系統（Amersham Pharmacia Biotech公司製） 進行層析。結果，RNaseHII順利通過RESOURSE Q管柱。 然後供給至用緩衝液A平衡化之RESOURSE S管柱 -47- 1257426 (43) 發明說明續頁 (Amersham Pharmacia Biotech公司製），使用 FPLC 系統（Amersham Pharmacia Biotech公司製）進行溶析，結果RNaseHII順利通過 RESOURSE S 管柱。
將通過之RNaseHII部分40.0 ml，以含50 mM NaCl之緩衝液 B[50 mM Tris-HCl (pH 7.0)，0.1 mM EDTA] 2公升為外液，進行 2小時之透析3次。將透析後之酵素液40.2 ml供給至含50 mM NaCl之缓衝液B平衡化之HiTrap-肝素管柱（Amersham Pharmacia Biotech公司製）中，使用FPLC系統以50〜550 mM NaCl線性梯 度溶析，結果得到被約240 mM NaCl溶出之RNaseHII部分。 將該 RNaseHII 部分 7.8 ml 用 Centricon-10(Amicon 公司製）藉由 限外過濾法濃縮，將約600 μΐ濃縮液分4次供給至用含100 mM NaCl及 0.1 mM EDTA之 50 mM Tris-HCl (pH 7.0)平衡化之 Superose 6凝膠過；慮管柱（Amersham Pharmacia Biotech公司製）中，用相 同緩衝液進行溶析，結果RNaseHII在相當於30.0千道爾頓分 子量之位置被溶出。該分子量，相當於RNaseHII以單體存 在之場合。
將如此被溶出之RNaseHII做為Afu RNaseHII標準品。 使用上述得到之Afu RNaseHII標準品，藉由下述方法測定 酵素活性。 在Afu RNaseHII標準品1 μΐ中，於40 °C事先加入培育反應 液[20 mM海派斯-氫氧化鉀（pH 7.8)，0.01 %牛血清白蛋白（寶 酒造公司製），1%二甲基亞颯，4 mM乙酸鎂，20 pg/ml聚 (dT) (Amersham Pharmacia Biotech 公司製）及 30 pg/ml 聚 (rA) ( Amersham Pharmacia Biotech 公司製）]100 μΐ，於 40 °C 反應 10 -48 - 1257426 (44) 發明說明續頁 分鐘後，用10·5 M EDTA (pH 8.0) 10 μΐ停止反應，並測定於260 nm之吸收。結果確認Afu RNaseHII標準品具有RNaseH活性。 藉由下述方法計算出耐熱性RNaseH之單位數。 將聚（rA)及聚（dT)(皆為 Amersham Pharmacia Biotech 公司製） 各1 mg分別溶解於含1 mM EDTA之40 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7) 1 ml中，以調製聚（rA)及聚（dT)溶液。 繼而，在含 4 mM MgCl2、1 mM DTT、0.003% BSA 及 4% 甘油 之40 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.7)中，力σ入聚（rA)溶液並使其 最終濃度為20 pg /ml，以及加入聚（dT)溶液並使其最終濃度 為30 pg/ml，於37°C反應10分鐘後，冷卻至4。(：，而調製得 聚（rA)及聚（dT)溶液。在該聚（rA)及聚（dT)溶液100 μΐ中加入 經任思稀釋之酵素液1 μΐ，於40 C反應10分鐘，繼而加入 〇·5 M EDTA 10 μΐ以使反應停止後，測定於260 nm之吸光度。 做為對照組者，係將〇·5 M EDTA 10 μΐ加入上述反應液後， 於40 °C反應10分鐘，然後測定吸光度。其後，從EDTA不存 在下反應所求得之吸光度減去對照組之吸光度，而得到吸 光度差。亦即從吸光度差可以算出藉由酵素反應而從聚 (rA)-聚（dT)雜合體游離出之核嘗g茭之濃度。RNaseH之1單位 ’為10分鐘期間使A26Q增加量相當於1 nmol核糖核甞酸游離 所需之酵素量，其係從下式算出。 單位=[吸光度差X反應液量（ml)]/〇.〇152x(ll〇/l〇〇)x稀釋率 實施例1 (1)引子及上游封阻用寡核：y：酸之設計 現檢討嵌合寡核甞酸引子與可黏接在模板核酸中引子黏 -49 - 1257426 發明說明續頁 (45)
接位置之3’側之任意位置之上游封阻用寡核甞酸之組合。 首先依照基因庫登錄編號X06707記載之砂眼衣原體質體之 鹼基序列，用DNA合成機合成檢測來自砂眼衣原體之質體 DNA用之引子CT-BF19-3及CT-BR23-2，其具有序列表之序列 編號6及7記載之鹼基序列。再者，分別合成序列表之序列 編號8及9記載之上游封阻用寡核甞酸CR-FBK及CR-RBK，其 具有來自砂眼衣原體之質體DNA基因之鹼基序列，且可黏 接在模板核酸中上述討嵌合寡核甞酸引子黏接位置之Y侧 之任意位置上。該上游封阻用寡核甞酸藉由將3’終端胺基 化，可以封阻DNA聚合酶主導之伸長反應之進行。又，上 游封阻用寡核甞酸CR-FBK為有意義方向之寡核甞酸，而 CR-RBK為反義方向之寡核甞酸。 (2) 衣原體陽性對照組之調製
將為序列表之序列編號10所示之衣原體基因之一部分之 560 bp用PCR增幅後精製，將該增幅片段用DNA黏接套組第 2版（寶酒造公司製）插入pT7 Blue T載體中，然後轉形大腸 菌JM109，以調製衣原體陽性對照組質體。 (3) ICAN 反應 在上述（2)調製之102〜105個陽性對照組DNA 1 μΐ或做為陰 性對照組之水中，加入包含各50 pmol之嵌合寡核甞酸引子 及各100 pmol之在上述（1)中合成之上游封阻用寡核嘗酸， 各0.5 mM dNTP混合液，32 mM之海派斯-氫氧化鉀緩衝液（PH 7.8)，100 mM乙酸鉀，4.0 mM之乙酸鎂，0.01%牛血清白蛋 白，1.0%二甲基亞颯，4.375U來自Afu之RNaseH及2.64U之 -50- 1257426 (46) 1發明說明續i
BcaBEST DNA聚合酶且全液量為25 μΐ之反應液，在熱循環 為中於60 C保溫1小時。又設定未添加上游封阻用暮核每 酸之區洗以做為對照。反應終了後，將該反應液5 μ1藉由 3.0%缓脂糖凝膠電泳而分析。將其結果示於圖1中。圖认 為未添加上游封阻用寡核謀酸之反應系，其中第1行1〇〇如 弟z ^W π ·丄珥把、（不），乐j仃為木 103個，第5行為模板104個，第6行） 板10個 第4订為模板ιυι回，乐钓模扳1〇4個，第6行 模板1〇。個’以及第7行為模板⑼個。又，圖1B為添加上
封阻用券核：y：酸之反庫 φ Μ 1 - 人馬系，其中弟1仃為100 bp之DNA分 量標吕己’第2行為陰性料 锋 對知、（水）’弟3行為模板1 〇2個， 行為模板1 〇3個，n s , .. 弟5仃為模板⑼個，第6行為模板105個 以及第7行為模板106個。 小 牡木添加上游
戈口圓 ί尸IJ -7、W甘敗之區塊中 當模板！達⑼個日寺，可以確 71 万面，在添^ 游封阻用寡m之區塊中，當模板量物個時，即可 確認增幅，與未添加區塊相較敏感 朴 可^硬。從上；十、
以確認藉由將嵌合寡核莽酸引子與 ^ ^ ^ ^ ^ ?要在柄板核酸φ
子黏接位置之3,側之任音仿¥夕μ y & 夂T 〜位置之上耜封阻用寡核 組合，可以使敏感度提高。 加 產業上利用之可能性 幅方法，其特徵為 用寡核苷酸之DNA 列中適於特異性增 測方法，其特徵為 依照本發明，提供一種標的核酸之增 藉由使用嵌合寡核：y：酸弓丨子及上游封阻 合成反應，可以增幅標的核酸之鹼基序 幅之區域。又，提供一種標的核酸之檢 -51 - 1257426 發明說明續頁 (47) 包含檢測以該標的核酸之增幅方法得到之標的核酸之增幅 片段之步驟。 序列一覽表 序列編號2 :供選殖編碼來自火焰色球狀太古菌 (Archaeoglobus fulgidus)且具有RNaseHII活性之多肽之基因之 PCR 引子 AfuNde。
序列編號3 :供選殖編碼來自火焰色球狀太古菌 (Archaeoglobus fulgidus)且具有RNaseHII活性之多肽之基因之 PCR 弓1 子 AfuBam。 序列編號6 :被設計用於增幅砂眼衣原體質體DNA之一 部分且被命名為CT-BF19-3之嵌合寡核甞酸引子。'’核芬酸20 至22為核糖核甞酸以及其他核甞酸為去氧核糖核嘗酸。” 序列編號7 :被設計用於擴增砂眼衣原體質體DNA之一 部分且被命名為CT-BR23-2之嵌合寡核甞酸引子。π核甞酸21 至23為核糖核甞酸以及其他核甞酸為去氧核糖核苷酸。’’ 序列編號8 :被命名為CR-FBK之寡核苷酸。
序列編號9 :被命名為CR-RBK之寡核答酸。 -52 - 1257426 序列表 <110>TAKARA BIO INC. <120>核酸之增幅方法 <130> <150>JP 2001-249497 <151>2001-08-20 <160〉10 <210〉1 <211>626
<212>DNA <213〉火焰色球狀太古菌 <400>1 atgaaggcag gcatcgatga ggctggaaag ggctgcgtca ggagtggctt gcagcgatga ggataggctg agaaagcttg ctaagtcagg ggaggagaga ggaactagcc gaggaaataa gttttgaaag tttctcccga aaatctcgac gaaaggatgg attttgaagg agtgctacgc tgaaataatt ctcaggctga gacagtcctg atgtgattcc cgagagactt tcgagggagc agagttgtgg ccgagcacaa ggcggacgag aagtatcccc tcggcccact ggttgttgca 60 gtgtgaaaga ctccaaaaag 120 ggaaaatctg cagaacggag 180 ctgctaaaac cataaacgag 240 agccggaaat tgcttatgtt 300 ttgaggagat tacggggttg 360 tggtagctgc ggcttcaatc 420
1257426 序列表續頁 atcgcaaagg tggaaaggga gcgggagatt gagaggctga aagaaaaatt cggggatttc 480 ggcagcggct atgcgagcga tccgaggaca agagaagtgc tgaaggagtg gatagcttca 540 ggcagaattc cgagctgcgt gagaatgcgc tggaagacgg tgtcaaatct gaggcagaag 600 acgcttgacg atttctaaac gaaacc 626 <210>2 <211>30 <212>DNA <213〉人造序列 <220> <223〉供選殖編碼來自火焰色球狀太古菌（Archaeoglobus fulgidus)且具有RNaseHII活性之多肽之基因之PCR引子 AfuNde。 <400>2 aagctgggtt tcatatgaag gcaggcatcg 30 <210>3 <211>30 <212>DNA <213>人造序列 <220> 1257426 序列表續頁 <223〉供選殖編碼來自火焰色球狀太古菌（Archaeoglobus fulgidus)且具有RNaseHII活性之多肽之基因之PCR引子 AfuBam 〇 <400>3 tggtaataac ggatccgttt agaaatcgtc 30 <210>4 <211>638
<212>DNA <213〉火焰色球狀太古菌 <400>4 catatgaagg caggcatcga tgaggctgga aagggctgcg tcatcggccc actggttgtt 60 gcaggagtgg cttgcagcga tgaggatagg ctgagaaagc ttggtgtgaa agactccaaa 120 aagctaagtc aggggaggag agaggaacta gccgaggaaa taaggaaaat ctgcagaacg 180 gaggttttga aagtttctcc cgaaaatctc gacgaaagga tggctgctaa aaccataaac 240 gagattttga aggagtgcta cgctgaaata attctcaggc tgaagccgga aattgcttat 300 gttgacagtc ctgatgtgat tcccgagaga ctttcgaggg agcttgagga gattacgggg 360 ttgagagttg tggccgagca caaggcggac gagaagtatc ccctggtagc tgcggcttca 420 atcatcgcaa aggtggaaag ggagcgggag attgagaggc tgaaagaaaa attcggggat 480 ttcggcagcg gctatgcgag cgatccgagg acaagagaag tgctgaagga gtggatagct 540 tcaggcagaa ttccgagctg cgtgagaatg cgctggaaga cggtgtcaaa tctgaggcag 600 aagacgcttg acgatttcta aacggatccc cgggtacc 638 <210>5 1257426 序列表續頁 <211>205
<212>PRT <213〉火焰色球狀太古菌 <400>5
Met Lys Ala Gly lie Asp Glu Ala Gly Lys Gly Cys Val lie Gly 1 5 10 15
Pro Leu Val Val Ala Gly Val Ala Cys Ser Asp Glu Asp Arg Leu
20 25 30
Arg Lys Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Ser Gin Gly Arg 35 40 45
Arg Glu Glu Leu Ala Glu Glu lie Arg Lys lie Cys Arg Thr Glu 50 55 60
Val Leu Lys Val Ser Pro Glu Asn Leu Asp Glu Arg Met Ala Ala 65 70 75
Lys Thr lie Asn Glu lie Leu Lys Glu Cys Tyr Ala Glu lie lie 80 85 90
Leu Arg Leu Lys Pro Glu lie Ala Tyr Val Asp Ser Pro Asp Val 95 100 105 lie Pro Glu Arg Leu Ser Arg Glu Leu Glu Glu lie Thr Gly Leu 110 115 120
Arg Val Val Ala Glu HisLys Ala Asp Glu Lys Tyr Pro Leu Val 125 130 135
Ala Ala Ala Ser lie lie Ala Lys Val Glu Arg Glu Arg Glu lie 140 145 150
Glu Arg Leu Lys Glu Lys Phe Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Ala 155 160 165 -4 - 1257426 序列表續頁
Ser Asp Pro Arg Thr Arg Glu Val Leu Lys Glu Trp lie Ala Ser 170 175 180
Gly Arg lie Pro Ser Cys Val Arg Met Arg Trp Lys Thr Val.Ser 185 190 195
Asn Leu Arg Gin Lys Thr Leu Asp Asp Phe 200 205 <210>6 <211>22 <212>DNA <213〉人造序列 <220〉 <223>被設計用於擴增砂眼衣原體質體DNA之一部分且被命 名為CT-BF19-3之嵌合寡核甞酸引子。π核苷酸20至22為核 糖核甞酸以及其他為去氧核糖核苷酸。” <400>6 catacggttt tcctcgatga uu 22 <210>7 <211>23 <212>DNA <213〉人造序列 1257426 序列表續頁 <220> <223>被設計用於擴增砂眼衣原體質體DNA之一部分且被命 名為CT-BR23-2之嵌合寡核芬酸引子。”核茹酸21至23為核 糖核茹酸以及其他為去氧核糖核苷酸。 <400>7 gatctacgca atggattttc auu 23 <210>8 <211>20 <212>DNA <213>人造序列 <220> <223>被命名為CR-FBK之寡核菩酸。 <400>8 gacaagctta gatccgtttc 20 <210〉9 <211>20 <212>DNA <213〉人造序列 1257426 序列表續頁 <220> <223>被命名為CR-RBK之寡核荅酸。 <400>9 cgctcaagca atagaaacgg 20 <210>10 <211>560 <212>DNA <213>砂眼衣原體 <400>10 atgcgttgtt ttgctaatta taaaagacaa gtatcaaaga acaagcttag aagaaaattt gtagatctcc agactttttc aaattggagt aggtaaagct ctgatatttg aagactctac tgagtatatt ctgaggcagc 60 tgagtttaag tgttctcatc ataaaaacat attcatagta tttaaatact 120 tggattacct ataactgtag actcggcttg ggaagagctt ttgcggcgtc 180 tatggacaaa tcgtatctcg ggttaatgtt gcatgatgct ttatcaaatg 240 atccgtttct catacggttt tcctcgatga tttgagcgtg tgtagcgctg 300 gagtaatttc attttccgct cgtttaatga gtacaatgaa aatccattgc 360 gtttctattg cttgagcgta taaagggaag gcttgacagt gctatagcaa 420 tattcgcagc gctagaggcc ggtctattta tgatatattc tcacagtcag 480 gctggctcgt ataaaaaaaa gacgagcaac gttctctgag aatcaaaatt 540 560 ctttctttga tgccttccca

Claims (1)

  1. Τ257#2?θ118795號專利申請案 $文、請專利範圍替換本(95年1月）
    拾、申請專利範圍 1. 一種核酸之增幅 (a) 將做為模板 換活性之DNA聚, 少一種上游封阻 合物之步驟；其 酸之鹼基序列係 糖核茹酸及核甞 糖核嘗酸係配置. 阻用寡核：y：酸與. 互補之區域之3WI 驗基被修飾成不 長反應，該上游 苷酸所黏接之模: (b) 在可進行將 異性黏接至模板 反應及股置換反 之一定的溫度條 足以生成增幅產 2，如申請專利範圍 尚含第2喪合募；j 核嘗酸引子具有 3 ’侧之鹼基序列 核糖核菩酸及核 之核酸、去氧核糖核誓三碟酸、具股置 合酶、至少一種嵌合寡核苷酸引子、至 用寡m及RNaseH混合以調製反應混 中該喪合寡核芬酸引子與做為模板之核 實質互補，並且為至少含有選自去氧核 酸類似物者以及核嫉仿#於 极糠核甘酸，同時該核 在該引子之3|終端或3,終端側；該上游封 模板核酸上之與嵌合寡核#酸引子實質 •J之鹼基序列實質互；^= 貝立補而且其之3,終端 會發生利用DNA聚合酶丰道λ 姆芏導之互補股伸 封阻用养核嘗酸為可點技 ^彳鄉接上述嵌合募核 板核酸之3 ’側區域者；以及 嵌合募核苷酸及上游封阳m u 于#阻用募核$:酸特 核酸、由DNA聚合酶引4p # 51起之伸長股合成 應、由RNaseH引起之伸長股之切斷反應 件下’將反應混合物培育充分時間，以 物之步驟。 第丄項之㈣之增幅方法，其中可以使用 :"酸引子之反應混合物，該第2栽合寡 與模板核酸之互補以欲增幅之區域的 實質互補之序列，並至少含有選自去氧 菩酸類似物者以及核棒核普酸，同時該
    1257426 核糠核甞酸係配置在該引子之3,終端或3’終鈿侧 3·如申請專利範圍第2項之核酸之增幅方法’其中使用含有 第2上游封卩旦用寡核苷酸之反應混合物，忒第2上游封阻 用核甞酸具有與模板核酸之互補股中之第2嵌合寡核菩 酸引子之鹼基序列實質互補之區域之3,侧之驗基序列實 質上互補之序列，而且其之3,終端鹼基被修飾成不會發 生DNA聚合酶主導之互補股伸長反應。 4. 一種組合物，其為申請專利範圍第1項之核酸之增幅方法 使用之組合物，其含有嵌合募核苷酸引子及上游封阻用 寡核茹酸各至少1種，其中 該嵌合寡核替酸引子與做為模板之核酸之鹼基序列係實 質互補，並且為至少含有選自去氧核糖核甞酸及核苷酸 類似物者以及核糖核甞酸，同時該核糖核茹酸係配置在 該引子之3'終端或3’終端側； 該上游封阻用寡核甞酸與模板核酸上之與該嵌合募核荅 酸引子實質互補之區域之3’侧之鹼基序列實質互補，而 且其之3f終端鹼基被修飾成不會發生利用DNA聚合酶主 導之互補股伸長反應，戎上游封阻用寡核甞酸為可黏接 上述欲合寡核嘗酸所黏接之模板核酸之3，側區域者。 5. —種套組，其為申請專利範圍第1項之核酸之增幅方法使 用之套組，其含有嵌合寡核甞酸引子及上游封阻用募核 嘗酸各至少1種，其中 該嵌合寡核替酸引子與做為模板之核酸之驗基序列係實 質互補，並且為至少含有選自去氧核糖核甞酸及核菩酸 -2-
    1257426 類似物者以及核糖核苷酸，同時該核糖核甞酸係配置在 該引子之;T終端或3’終端側； 該上游封阻用寡核茹酸與模板核酸上之與該嵌合寡核苷 酸引子實質互補之區域之3f側之鹼基序列實質互補，而 且其之3’終端鹼基被修飾成不會發生利用DNA聚合酶主 導之互補股伸長反應，該上游封阻用寡核甞酸為可黏接 上述嵌合寡核甞酸所黏接之模板核酸之Γ側區域者。 6. —種標的核酸之檢測方法，其包含下述步驟： (a) 藉由申請專利範圍第1項之核酸之增幅方法增幅標 的核酸之步驟；以及 (b) 檢測上述步驟增幅所得之標的核酸之步驟。
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