KR0140306B1 - 케이엔알4 유전자를 불활성화시킴으로써 세포벽을 약화시킨 돌연변이 효모 및 그를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 분자생물학적 방법인 1단계 유전자 파괴법(one step gene disruption method)으로 효모 게놈 DNA 상의 knr4 유전자룰 불활성화시킴으로써 세포벽을 약화시킨 돌연변이 효모와 이를 이용한 유용 재조합 단백질의 개선된 생산 방법에 관한 것이다.

Description

케이엔알(knr)4 유전자를 불활성화시킴으로써 세포벽을 약화시킨 돌연변이 효모 및 그를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법

제1도는 knr4 유전자 를 불활성화하기 위하여 선별용 선택인자로서 ura3 유전자를 knr4 유전자 중간에 삽입시킨 플라스미트 pUC18-knr4-ura3 의 제작 과정을 나타낸 것이고, 제2도는 knr4 유전자내에 ura3 유전자가 삽입되었는지를 점검하기 위한 PCR 결과를 나타낸 것이고, 제3도는 갈락토즈 프로모터(galactose promoter)와 알콜 탈수소효소 제 1 형(alcohol dehydrogenase type I)의 터미네이터(terminator)를 가진 벡터 psp72Sgal의 제작 과정을 나타낸 것이고, 제4도는 갈락토즈 프로모터-허피스 심플렉스 바이러스 제 1 형(Herpes simplex virus type I)의 티미딘 키나제(thymidine kinase) 유전자-알콜 탈수소효소 제 1 형의 터미네이터(TADH)를 가진 벡터 pJG4-5 TK의 제작 과정을 나타낸 것이고, 제5도는 knr4 유전자가 불활성화된 돌연변이형 효모 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) MI01과 야생형 효모 사카로마이세스 세레비지애 EGY48의 5-브로모데옥시유리딘(5-bromodeoxyuridine)에 대한 감수성의 차이를 할로 분석법(halo assay)을 통하여 확인한 것이고, 제6도는 knr4 유전자가 불활성화된 돌연변이형 효모 사카로마이세스 세레비지애 MI01과 야생형 효모 사카로마이세스 세레비지애 EGY48의 성장곡선을 비교하여 나타낸 것이고, 제7도는 knr4 유전자가 불활성화된 돌연변이형 효모 사카로마이세스 세레비지애 MI01과 야생성 효모 사카로마이세스 세레비지애 EGY48의 세포벽 강도차이를 유리구슬로 세포를 강하게 진탕시켰을 때 나타나는 분쇄정도로써 비교하여 나타낸 것이다.

본 발명은 knr4 유전자를 불활성화시킴으로써 세포벽을 약화시킨 돌연변이 효모와 그를 이용한 재조합 단백질의 개선된 생산 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 분자생물학적 방법인 1단계 유전자 파괴법(one step gene disruption method)으로 효모 게놈 DNA상의 knr4 유전자를 불활성화시킴으로써 세포벽을 약화시킨 돌연변이 효모와 이를 이용한유용 재조합 단백질의 개선된 생산 방법에 관한 것이다.

효모는 근래에까지 여러가지 발효식품의 제조에 광범위하게 사용되어온 미생물이다. 최근 15년 동안에는 유용 단백질들을 재조합 DNA 기술로 제조할 때 숙주 세포로서 널리 사용되어 왔다(Nature 298, 347-350(1992); Nature 293, 717-722(1981); Nucleic Acids Research 11, 1819-1837(1983); Biotechnology Bioengineering 35, 339-348(1990); Bio/Technology 12, 494-499(1994)).

또한, 원하는 재조합 단백질의 생산량을 증대시키기 위하여, 발현된 재조합 단백질을 세포밖으로 많이 방출하도록 숙주 세포를 개량하기 위한 연구가 계속 진행되고 있다(Bio/Technology 7, 160-164(1989); Bio/Technology 9, 291-295(1991); Bio/Technology 9, 1067-1072(1991); Gene 105, 205-212(1991); Biotechnology Bioengineering 37, 869-875(1991)).

그중 하나는 동물 세포나 대장균과는 달리 견고한 구조로 되어 있는 효모의 세포벽을 약화시켜 발현된 재조합 단백질을 쉽게 용출시키기 위한 효모 숙주의 개발이다. 세포벽이 약화된 돌연변이 효모를 숙주 세포로 사용하면 유리구슬 분쇄(glass bead mill) 공정에서 상대적으로 적은 물리적인 힘을 가해도 효모세포가 파쇄될 수 있으므로 에너지가 절약될 수 있는 장점이 있고, 또한 약화된 세포벽을 갖는 돌연변이 효모는 삼투압에 민감하게 반응하므로 저장액(hypotonic solution)만으로도 세포벽이 파괴되어 특정 단백질의 용출이 가능하므로 정제과정에서 비용 및 에너지가 많이 소모되는 유리구슬 분쇄 공정을 사용하지 않아도 되는 장점이 있다(Biotechniques 16, 604-610(1994)).

효모의 세포벽은 매우 복잡한 구조로 되어 있고, 세포 모양의 유지, 외부 환경으로부터 세포의 보호 및 세포 접촉을 통한 세포간 신호 전달과 같은 중요한 역할들을 한다. 효모의 세포벽은 만노오즈 중합체(mannose polymer)가 펩티드에 연결된 만노프로틴(mannoprotein), 포도당 중합체(glucose polymer)인 베타 글루칸(β-glucan), 및 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)의 중합체인 키틴(chitin)등 3 종류의 다당류로 구성되어 있다. 만노프로틴은 일반적으로 충전 물질(filling material)로 여겨지고, 베타 글루칸은 세포벽 다당류의 60%를 차지하는 구성요소로서 세포의 형태를 유지하고 삼투압에 견디게 하는 가장 중요한 물질이다. 키틴은 소량으로 존재하고 베타글루칸과 아주 밀접한 관계를 가지고 있으며 효모세포 분열시 막 구성단계(cytokinesis)에서 망상조직의 주요성분이며 베타 글루칸과 함께 세포벽 조성(cell wall assembly)에 관여한다.

세포벽이 약화된 개량된 효모는 상기 세포벽 구성 물질들의 양 또는 조성비가 변화된 돌연변이 효모들로서 야생 효모 또는 돌연변이 유발 화합물(mutagen)로 처리한 효모로부터 선별(screening)함으로써 얻을 수 있다. 그 예로서, 첫째, 키틴 함량이 낮은 세포벽을 가진 돌연변이 효모가 있으며, 이 돌연변이 효모는 종래의 돌연변이 방법에 의해 칼로플루오 화이트(calofluor white)에 저항성이 있는 효모를 선별함으로써 얻을 수 있다(J. Bacteriology 170, 1950-1954(1988); Ann. Rev. Microbiol. 47, 505-534(1993)). 칼로플루오 화이트는 불소화합물(fluorochrome)로서 균류나 효모의 주요한 세포벽 구성성분인 키틴에 흡착하여 베타-1,4글루칸 연쇄사슬(β-1,4-glucan chain)이 키틴과 함께 결정화하는 반응(co-crystalization)을 방해함으로써 세포분열이나 세포유지에 필요한 마이크로필린(microfilin)을 형성하지 못하게 한다. 결국 불규칙적인 키틴의 분포로 인하여 세포벽은 약화되고 그 정도가 심해져서 용해현상으로 세포가 죽게 된다. 따라서 선별 방법은 인위적인 돌연변이 화합물인EMS(ethyl methane sulfate)로 효모를 처리하고 0.1%의 칼로플루오 화이트에서도 죽지 않고 자라는 콜로니를 선별하는 것이다. 이 선별된 콜로니를 분석한 결과 세포전체에 키틴이 골고루 산재되어 있지 않고 보통 효모가 가진 키틴량의 10% 만을 가지고 있어 칼로플루오 화이트에 저항성을 나타내었다. 둘째, 베타-1,6-글루칸의 함량이 낮은 효모(J. Bacteriol. 154, 161-169 (1983))가 있고, 이 돌연변이 효모는 킬러독소(killer toxin)에 저항성이 있는 효모를 종래의 돌연변이 방법에 의해 선별함으로써 얻을 수 있다. 킬러독소 K1은 효모 세포벽의 주성분인 베타-(1,6)-글루칸과 결합하여 세포막에서 음이온 채널을 형성함으로써 세포질 내의 이온들을 용출시켜 결국 효모세포를 죽이게 된다. 따라서 이 독소에 저항성을 보이는 효모를 선별하여 세포벽 성분을 조사한 결과 베타-(1,6)-글루칸의 함량이 감소된 것으로 밝혀졌다. 세째, 세포벽의 주성분인 만노즈의 함량이 감소된 효모인 mnn 돌연변이(Methods in Enzymology 185, 440-470 (1990))가 있으며, 이 돌연변이는 만노즈의 중합체인 만난(mannan) 생합성이 제대로 일어나지 않아 정상적인 150-200 개의 만노즈로 이루어진 만난이 합성되지 않고 10-14개의 만노즈로만 이루어진 만난을 만든다. 결국 세포는 완전한 만노즈가 결핍된 비정상적인 세포벽으로 인해 외부삼투압에 매우 민감하게 된다.

최근에는 베타-1,3글루칸의 함량이 줄어들어 외부삼투압에 민감하고 항진균제인 세코스포라미드(cercosporamide)에 의해 잘 죽으며 자이몰레이즈(zymolases)에 저항성을 갖는 돌연변이 효모가 선별되었다(Molecular and Cellular Biology 14, 1017-1025(1994)). 한세눌라 므라키(Hansenula mrakii)에서 생성되는 킬러 9 독소(killer 9 toxin)는 여러 종류의 곰팡이에서 세포벽 합성, 특히 베타-1,3-글루칸 합성효소(β-1,3-glucan synthase)의 활성을 억제하여 결국 세포를 죽인다. 따라서 상기 독소에 저항적인 효모를 선별한 결과 세포벽의 주성분인 베타-(1,3)-글루칸 함량이 줄어들고 대신 다른 세포벽 구성 물질의 구성비가 변하여 세포벽에 손상이 생긴 돌연변이 효모가 선별되었다. 이 효모의 유전자 분석을 통하여 그 원인을 분석한 결과 베타-1,3-글루칸 합성효소의 합성에 연루된 knr4 유전자가 불활성화되어 생긴 결과임이 밝혀졌다.

상기한 것들은 모두 세포벽에 이상이 생겨서 새로운 생리학적 성질을 얻게된 것이며 또한 종래에 일반적으로 많이 사용되어온 돌연변이 유발 방법에 의하거나 천연 효모로부터 선별(screening)하여 얻은 것이다.

그러나 본 발명자들은 1단계 유전자 파괴법(Methods in Enzymology 101, 202-211(1983))을 이용하여 원하는 knr4 유전자만 불활성화되어 세포벽이 약화된 돌연이 효모체를 높은 확률로 제조하였다.

본 발명의 목적은 불활성화된 knr4 유전자를 함유하는 효모발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 세포벽이 약화된 돌연변이 효모를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 돌연변이 효모의 특성을 이용하여, 이러한 효모에서 목적 재조합 단백질은 생산한 후 이를 간편하게 회수하는 개선된 단백질 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따라 1단계 유전자 파괴법(one step gene disruption method)에 의해 knr4 유전자를 불활성화시킨 세포벽이 약화된 돌연변이 효모가 제공된다.

또한, 본 발명에 따라 상기 효모를 목적 재조합 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환시킨 후 적당한 배지상에서 배양함을 포함하는 재조합 단백질의 개선된 제조 방법이 제공된다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용하는 1단계 유전자 파괴법이란 선형 플라스미드의 양쪽 선단이 재조합을 잘 일으키는 성질을 이용하여, 선형 플라스미드로 효모를 형질전환시켜 플라스미드의 양 선단이 효모 게놈상의 상동적인 서열과 직접 재조합하게 함으로써 단 1회의 형질전환으로 목적하는 효모 게놈상의 특정 유전자를 파괴하는 방법을 말한다.

이러한 1단계 유전자 파괴법으로 knr4 유전자를 불활성화시키기 위해서는 먼저 야생형 효모, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지애EGY48(Mat a trp1 ura3 his3 Leu2::plexAop6-Leu2)(R. Brent et al. Cell 72, 223-232(1993))의 게놈 DNA를 주형으로 하고 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 사용하여 중합 효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해 knr4 유전자를 증폭시킨다. 상기 유전자를 적절한 벡터에 클로닝한 후 이를 불활성화하기 위하여 유라실(uracil)합성에 관여하는 ura3 유전자를 knr4 유전자내에 삽입시킴으로써 불활성화된 knr4 유전자를 포함하는 벡터, 예를 들어 pUC18-knr4-ura3를 제작한다.

불활성화된 knr4 유전자를 가진 벡터를 절단하여 선형화(linearization)하고, 이를 이용하여 효모를 형질전환시키면 그 효모가 가지고 있는 기능성의 knr4 유전자와 형질도입된, ura3 유전자 유전자를 함유한 불활성화된 knr4 유전자 절편 사이에서 동형 재조합(homologous recombination)이 높은 확률로 일어나 knr4 유전자가 불활성화된 효모로 형질전환된다. 유라실(uracil)이 없는 고체 배지에서 자란 여러 콜로니들중 형질전환된 효모 균주를 선별하고 불활성화된 knr4 유전자로 인하여 발현되는 새로운 생리학적인 성질을 유전적, 생리학적 수준에서 점검한다.

유전적 수준에서 knr4 유전자가 불활성화되었는지의 여부는 효모의 게놈 DNA를 추출하여 상기와 같이 중합효소 연쇄반응으로 knr4 유전자를 증폭시킨 후, 아가로즈 젤 전기영동으로 전개하여 ura3 유전자의 삽입으로 크기가 증가한 knr4 유전자를 확인함으로써 알 수 있다.

생리학적 수준에서 knr4 유전자가 불활성화되었는지의 여부는 약화된 세포벽으로 인하여 야생형보다 약물(drug)이 세포속으로 잘 들어가는지, 발효배지의 성분들(nutrient)이 세포속으로 잘 들어가 결과적으로 세포성장이 빠른지, 그리고 세포벽이 변형되어 결과적으로 물리적인 힘이 가했을 때 잘 파쇄되는지를 확인함으로써 알 수 있다.

본 발명자들은 선별한 돌연변이 효모가 세포벽의 약화로 인해 야생형 효모보다 약물을 세포질 안으로 더 잘 통과시키는지 알아보기 위하여 새로운 음성 선택(negative selection) 방법을 고안하여 사용하였다.

본 발명자들이 사용한 음성 선택 방법은 동물 세포의 선택에 통상적으로 사용되는 티미딘 키나제를 효모 세포에서 발현시키고, 티미딘 키나아제에 의해 인산화되어 DNA에 끼어듦으로써 게놈 DNA의 정상적인 복제를 방해하여 결국 세포를 죽게 만드는 잠재성 약물(prodrug), 예를 들어, 5-BdU (5-bromodeoxyuridine)를 외부 배지에 넣음으로써, 세포벽의 약화로 인해 상기 약물을 세포질내로 잘 통과시키는 효모를 할로분석(halo assay)을 통해 확인하는 것이다.

상기 음성 선택 방법에 의해 선별된 돌연변이 효모 사카로마이세스 세레비지애 MI01는 세포벽이 약화되어 있으므로 성장에 필요한 물질이 잘 유입되어 야생형보다 세포성장 속도가 빠를 것이다. 따라서 발효시 사용된 동일양의 에너지원(보통 글루코즈와 이의 발효산물인 알콜)에 대하여 더 많은 세포량과 대사물질 나아가 유용 재조합 단백질을 생산할 것이라고 추론되므로 돌연변이 효모가 이 성질을 가지고 있는가의 여부를 발효를 통해 조사한다. 예를 들어, B형 간염 표면 항원유전자를 가지고 있는 벡터로 형질전환시킨 야생형 효모와 세포벽이 약화된 돌연변이형 효모를 배양하면서 시간별로 시료를 채취하여 세포농도, 탄소원농도(글루코즈 및 생성된 에탄올) 및 발현된 B형 간염 표면항원의 양 등의 변수들을 조사한다. 그 결과, 돌연변이 효모 사카로마이세스 세레비지애 MI01 의 세포 성장속도, 포도당 소모 속도, 생선된 에탄올을 재사용하는 속도는 모두 야생형의 사카로마이세스 세레비지애 EGY48 보다 더 빠르다. 또한 소비한 탄소원(포도당과 에탄올)에 대한 최종 세포수율과 B형 간염 표면항원(HBsAg)의 단위 세포당 생산성 및 전체 생산성도 돌연변이 효모 사카로마이세스 세레비지애 MI01이 야생형 효모인 사카로마이세스 세레비지애 EGY48 보다 더 높은것으로 나타났다. 이것은 knr4 유전자의 불활성으로 세포벽이 느슨해져 포도당 등이 더 빨리 세포속으로 들어갈 수 있고 또한 베타-1,3-글루칸의 합성에 소요될 에너지가 절약되어 다른 발효생성물을 제조하는데 사용될 수 있으므로 발효생성물의 생산성이 높아짐을 의미한다.

따라서, 분자생물학적 방법으로 세포벽이 약화된 본 발명의 돌연변이 효모는 동일한 야생형 숙주보다 재조합 단백질의 생산성이 높고 세포외 방출량도 증가시키므로 재조합 단백질의 제조공정에 유용한 숙주세포로 사용될 수 있다.

불활성화된 knr4 유전자로 인하여 세포벽이 약화되었는지의 여부는 유리구슬로 효모세포를 강하게 진탕시킴으로써 확인할 수 있다. 즉, 상기의 두가지 효모를 B형 간염 표면 항원 유전자로 형질전환시킨 후 배양하고 동일량의 세포를 취하여 동일량의 유리구슬을 섞은 후 비드 비터(bead beater)로 규정된 시간동안 강하게 진탕하고 세포밖으로 용출된 B형 간염 표면 항원의 양을 비교한 결과, 돌연변이 효모 사카로마이세스 세레비지애 MI01가 짧은 시간에도 더 많이 깨진 것을 알 수 있다.

본 발명을 하기 실시예에 의거하여 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

[실시예 1]

돌연변이 효모의 제조

(단계 1) knr4 유전자의 증폭

효모 세포로부터 knr4 유전자(GenBank accession number L13164)를 증폭시키기 위하여 하기 프라이며knr. eco. for 및 knr. bam. rev 를 고안하여 DNA 합성기(Applied Biosystem, 모델 380B, U.S.A)로 합성하였다:

프라이머 knr. eco. for:

5'-GC GAA TTC ATG GAT CTA TTC AAA AGA AAA-3'

프라이머 knr. bam. rev:

5'-GC GGA TCC TCA TAA AGC TAT ATT TTC AAA-3'

야생형 효모 사카로마이세스 세레비지애 EGY48(Mat a trp1 ura3 his3 Leu2::plexAop6-Leu2)(R. Brent et al., Cell 72, 223-232(1993); 입수처: 매사추세츠 제너럴 하스피털, 미국)를 YEPD 한천 배지(효모추출물 1%, 효모 펩톤 2%, 포도당 2%)에서 배양한 후 단일 콜로니를 얻고 효모 게놈 DNA 추출 방법(Frederic M. Ausubel et al.(Ed.), Short Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., p13-42∼13-43, Harvard medical school, John Wiley Sons)에 따라 효모 게놈 DNA를 제조하였다. 10x PCR 완충액(Perkin Elmer Cetus, U.S.A.) 5㎕, 효모 게놈 DNA 1ng, 프라이머 knr. eco. for 1㎕(1㎍/1㎕), 프라이머 knr. bam. rev 1㎕(1㎍/㎕), 증류수 36㎕, 5㎕의 dNTP's 혼합액(dGTP, dATP, TTP, dCTP가 각각 2mM) 및 2 단위의 Taq DNA 중합효소를 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)내에서 잘 혼합하고, 온도순환기 (ROBOT, Fine PCR precision Ind. Co. 대한민국)를 이용하여 92℃, 1분; 45℃, 1분: 72℃ 1분의 사이클을 30회 반복하여 1.5kb 정도의 knr4 유전자를 증폭하였다. 반응액내의 중합효소 활성을 없이개 위하여 동일 부피의 페놀:클로로포름(1:1) 용액을 첨가하여 잘 섞고 원심분리한 후, 상층액을 새 튜브로 옮기고 동일 부피의 클로로포름을 첨가하여 잘 섞고 원심분리하였다. 상층액을 다시 새로운 튜브로 옮기고 3M 아세트산 나트륨 5㎕ 및 무수 알콜 125㎕를 첨가하고 -70℃에서 30분간 정치시킨 다음 4℃에서 원심분리하였다. 침전물을 무수 에탄올로 씻은 다음 건조하여 40㎕의 TE 완충액(10mM 트리스, 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) pH8.0)에 녹였다.

(단계 2) 발현 벡터의 제조

상기 PCR 반응으로 얻은 DNA를 H 완충액(Boeringer Mannheim, Cat. No. 1417-991, Germany)에서 제한효소 EcoRI/BamHI으로 이중절단한 다음 pUC18 벡터의 EcoRI/BamHI 자리에 클로닝시켜 pUC18-knr4 벡터를 만들었다. 다음 ura3 유전자를 knr4 유전자의 EcoRI/BalII 자리에 삽입시키기 위하여 먼저 pYEUra3 벡터(Clontech Cat. No. 6195-1, U.S.A.)를 제한효소 HindIII로 처리하여 1.2kb 정도의 ura3 유전자를 얻고 psp72 벡터(Promega, Cat. No. p2191, U.S.A.)의 HindIII 부위에 클로닝하여 플라스미드 psp72-ura3 을 얻었다. 상기 플라스미드를 PvuII/BamHI으로 절단하고 EcoRV/BalII 로 절단된 puc18-knr4 벡터에 클로닝하여 ura3 유전자가 삽입되어 불활성화된 knr4 유전자를 가진 플라스미드 pUC18-knr4-ura3을 제작하였다(제1도).

(단계 3) 효모의 형질전환

상기 (단계 2)에서 얻은 플라스미드 pUC18-knr4-ura3을 제한효소 EcoRI/BamHI 으로 절단하여 2.5kb 정도의 knr4-ura3 DNA 절편을 얻고, 이를 이용하여 리튬 아세테이트(lithium acetate) 방법 (Nucleic Acids Research 19, 5791(1991))으로 사카로마이세스 세레비지애 EGY48 을 형질전환시켰다. 유라실이 없는 고체 배지(CM-U, U=유라실)(오수벨(Ausubel)등의 상기 문헌 p13-42∼13-43 참조)에서 자라나는 콜로니 10개를 선별하여 knr4 유전자가 불활성화되었는지 PCR 방법으로 확인하였다. 선별된 효모의 DNA를 상기 (단계 1)에서와 같은 방법으로 추출한 후 (단계 1)에서와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다(제2도). 상기 PCR의 결과, 10개중 1개를 제외하고는 모두 2.5kb 의 불활성화된 knr4 유전자를 가지고 있는 변이된 사카로마이세스 세레비지애를 얻었다. 상기 돌연변이 효모들을 사카로마이세스 세레비지애MI01 로 명명하고 1994년 12월 6일자 한국과학기술연구원 유전공학연구소 부설 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 제 KCTC 0134BP호로서 기탁하였다.

제2도에서, 제1열은 사카로마이세스 세레비지애 MI01 의 DNA 이고, 제2열은 사카로마이세스 세레비지애 EGY48 의 DNA 이며, 제3열은 λDNA/BstE2 표지(mark

er)이다.

[실시예2]

음성 선택(negative selection) 방법을 응용한 효모의 약물 감수성(drug sensitivity) 조사

PCR 방법으로 확인된 효모 사카로마이세스 세레비지애 MI01이 불활성화된 knr4 유전자로 인해 세포벽 구조에 이상이 생겨 새로운 생리학적 성질을 가졌는지 약물 감수성으로 확인하였다. 이는 약화된 세포벽으로 인하여 기존 야생형보다 약물침투가 용이해지는가의 여부를 점검함으로써 이루어진다. 즉, 동물세포에서 통상적으로 사용되는 티미딘 키나제 효소를 효모 세포에서 발현시키고 잠재성 약물(prodrug)인 5-BdU를 외부 배지에 넣어준다. 만약 효모가 상기 물질을 세포질내로 잘 통과시키면 핵산 계열인 5-BdU는 세포질 안에서 이미 발현된 티미딘 키나제에 의하여 인산화되고 결국 효모의 게놈 DNA에 정상 핵산을 대신하여 끼어들게 된다. 이러한 게놈 DNA는 정상적인 복제를 할 수 없어 결국 세포가 죽게된다. 한편 5-BdU를 통과시키지 않는 효모는 살게 된다.

티미딘 키나제를 효모에서 발현시키기 위하여 유도성 프로모터(inducible promoter)인 갈락토즈 프로모터(Pgal)를 가진 플라스미드pJG4-5(R. Brent et al. Cell 72, 223-232(1993); 입수처: 메사추세츠 제너럴 하스피털, 미국)를 제한효소 KpnI/EcoRI 으로 절단하여 갈락토즈 프로모터를 가진 부위만을 클로닝 벡터인 psp72S 의 KpnI/EcoRI 부위로 옮겨 psp72Sgal 벡터를 제조하였다(제3도).

허피스 심플렉스 바이러스 제 1 형(ATCC VR-733)으로부터 오수벨 등의 방법(Frederic M. Ausubel et al.(Ed.), Short Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., p1-41∼1-44, Harvard medical school, John Wiley Sons)에 의해 DNA를 추출한 후, 이를 주형으로 하고 하기 프라이머 tk. hind. for 및 tk. eco. rev를 사용하여 실시예1과 동일한 방법으로 PCR을 수행함으로써 약 1.1kb의 티미딘 키나제 유전자(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 78, 791-803(1981))를 증폭시켰다.

프라이머 tk. hind. for:

5'-GGC CAA GCT TAT GGC TTC GTA CCC CTG CCA T-3'

프라이머 tk. eco. rev:

5'-GAG AAT TCT CAG TTA GCC TCC CCC ATC TC-3'

상기 유전자를 HindIII/EcoRI 으로 절단하고 psp72Sgal의 HindIII/EcoRI 부위에 삽입서켜 갈락토즈 프로모터 뒤에 티미딘 키나제 유전자가 융합된 플라스미드 psp72SgalTK 를 얻었다. 상기 벡터를 KpnI/EcoRI 으로 절단하여 갈락토즈 프로모터 뒤에 TK 유전자가 연결된 DN 절편을 얻고, Trpl 유전자를 함유하고 있는 플라스미드 pJG4-5 를 KpnI/EcoRI 으로 절단한 절편과 접합시켜 pJG4-5 TK 벡터를 제조하였다(제4도. 플라스미드 pJG4-5 TK로 형질전환된 대장균 MC1061은 1994년 12월 6일자로 KCTC 에 기탁번호 제 KCTC 0135BP 호로서 기탁되었다.

상기 벡터를 이용하여 실시예1에서와 같이 야생형 사카로마이세스 EGY48 과 세포벽이 변형된 사카로마이세스 MI01 을 형질전환시킨 후 티미딘 키나제 유전자(TK gene)를 형질전환시킨 야생형 및 세포벽이 변형된 knr4-돌연변이형에서 핵산계열 유도체 5-BdU의 침투정도를 알아보기 위하여 할로 분석(halo assay)을 수행하였다.

상기 두 균주의 단일 콜로니를 2㎖의 트립토판 결핍 배지(CM-W, W=트립토판, 글루코즈 2%)(오수벨 등, 상기 문헌 p13-1∼13-8 참조)에서 30℃로 밤새 배양하고, 200㎕의 배양액을 2㎖의 유도용 배지인 아데닌, 트립토판 결핍 배지(CM-AW, A=아데닌, W=트립토판, 갈락토즈 2%)(오수벨 등, 상기 문헌 P13-1∼13-8 참조)에 옮기고 30℃로 24시간 동안 배양하여 티미딘 키나제를 발현시켰다. 배양된 200㎕ 효모액과 3㎖의 테스트용 아데닌, 트립토판 결핍 상층 한천 배지(CM-AW, 0.7% 한천, 2% 갈락토즈)와 섞은 후 테스트용 아데닌, 트립토판 결핍 하층 한천 배지 평판(CM-AW plate, 2% 한천, 2% 갈락토즈)에 부었다. 200㎍의 5-브로모데옥시유리딘을 함유한 지름 9㎜의 종이 원반(Schleicher Schuell , Cat. No. 321261, 독일)을 평판의 중앙에 놓고 3일간 30℃에서 배양시켰다.

제5도에 그 결과를 나타내었는데 야생형 효모인 사카로마이세스 세레비지애 EGY48 에서는 죽은 세포의 테(zone, 사진상 검은색)가 거의 나타나지 않았고, 선별된 돌연변이 효모인 사카로마이세스 세레비지애 MI01에서만 죽은 세포의 테가 나타났다. 따라서 야생형 효모에서는 약물의 유입이 전혀 일어나지 않고 돌연변이 효모에서만 동일 농도에서 유입이 일어난 것을 알 수 있다. 따라서 이 돌연변이 효모 사카로마이세스 세레비지애 MI01은 세포벽이 손상되어서 약품을 잘 유입시키는 새로운 생리학적 성질을 가지며 더 나아가서는 5-BdU와 TK를 이용한 음성 선택에서뿐만 아니라 효모세포 내에 들어가 발색하는 여러 분석 반응에서 야생형 효모보다 훨씬 감수성이 좋은 숙주세포로써 사용될 수 있다.

[실시예3]

돌연변이 효모를 이용한 재조합 단백질의 생산

상기 실시예1에서 선별된 사카로마이세스 세레비지애 MI01은 세포벽이 약화되어 있으므로 성장에 필요한 물질이 잘 유입되어 야생형보다 세포성장이 빠르며, 세포 구성 물질을 덜 만들게 되므로 에너지가 절약될 것이다. 따라서 발효시 사용된 동일양의 에너지원에 대하여 더 많은 세포량과 대사물질 나아가 유용 재조합 단백질을 생산할 것이라고 추론되므로 돌연변이 효모가 이 성질을 가지고 있는가의 여부를 발효를 통해 조사하였다.

B형 간염 유전자(pYSAG101, 대한민국 특허공고 제 90-5959호 참조)를 사용하여 실시예1의 (단계 3)에서와 같이 야생형 효모 사카로마이세스 세레비지애 EGY48 과 돌연변이 효모 사카로마이세스 세레비지애 MI01 을 각각 형질전환시킨 후 루이신 결핍 한천 배지(CM-L, L=루이신, 글루코즈 2%, 한천 2%)(오수벨 등, 상기 문헌 p13-1∼13-8 참조)에서 배양하였다. 단일 콜로니를 분리한 후 루이신 결핍배지 2㎖에서 30℃로 밤새 배양하고 이를 다시 200㎖의 루이신 결핍배지에서 30℃로 밤새 배양하였다. 상기 종배양물을 다시 2.5ℓ의 YEPD 배지(효모 추출물 1%, 효모 펩톤 2%, 포도당 1.6%)를 포함하는 5ℓ 발효기(한국발효기주식회사, 대한민국)에 5%(v/v) 비율로 접종하여 30℃, 500rpm, pH 4.5-5.5의 조건으로 48시간 동안 배양하면서 시간별로 시료를 채취하여 세포성장 및 영양분 이용정도를 글루코즈 및 이의 발효산물인 에탄올의 소비에 대한 세포 생산성 및 B형 간염 표면 항원의 생산성으로 확인하였다. 그 결과를 제6도 및 하기 표1에 나타내었다.

제6도의 성장곡선에서 알 수 있듯이 돌연변이 효모 사카로마이세스 세레비지애 MI01 의 세포 성장속도, 포도당 소모 속도, 생성된 에탄올을 재사용하는 속도는 모두 야생형의 효모 사카로마이세스 세레비지애 EGY48 보다 더 빠르다. 즉, 본배양시 동일 부피, 동일 세포 농도의 종균배양물을 사용했을 때 빠른 시간에 글루코즈가 소모되고 세포도 빨리 자랐다. 또한, 하기 표1에서 알 수 있는 바와 같이 사용한 탄소원(포도당과 에탄올)에 대한 최종 세포수율과 B형 간염 표면항원(HBsAg)의 단위 세포당 (O.D.600㎚ 10기준) 생산성 및 전체 생산성도 돌연변이 효모 사카로마이세스 세레비지애 MI01 이 야생형 효모인 사카로마이세스 세레비지애 EGY48 보다 더 높다. 이것은 knr4 유전자의 불활성으로 세포벽이 느슨해져 포도당등이 더 빨리 세포속으로 들어갈 수 있고 베타-1,3-글루칸의 생산에 소모될 에너지가 절약되어 다른 발효 생성물을 제조하는데 사용될 수 있으므로 생산성이 높아짐을 의미한다.

[실시예4]

세포벽이 변형된 효모 사카로마이세스 세레비지애 MI01의 세포벽 파쇄 용이도 조사

-knr4 유전자에 의하여 세포벽이 변형되어 약하게 되면 외부 물리적인 힘에 의하여 파괴되기 쉽다. 즉 세포벽이 망상구조의 주성분인 베타-1,3-클루칸의 함량이 줄어들게 되면 삼투압은 견디게 되나 망상구조자체가 느슨해져서 유리구슬 분쇄 등과 같은 것으로 세포를 파괴했을 때 그렇지 않은 야생형의 효모보다 쉽게 깨진다. 이는 재조합 단백질 제조공정의 첫 단계인 세포파괴 공정이 쉬워진다는 것을 의미한다. 공장스케일에서는 그만큼 에너지가 절약되므로 생산단가가 낮아지는 장점이 있다. 본 실험에서는 선별된 효모 사카로마이세스 세레비지애 MI01의 세포벽이 약화된 정도를 알아보기 위하여 유리구슬(glass bead)로 효모세포를 시간별로 강하게 진탕시켜 깨보았다. 세포벽이 약화된 정도가 야생형 효모에 비해 심할수록 짧은 시간의 진탕에서도 효모가 쉽게 깨지며 또한 많은 양의 효모가 깨져 발현물질도 많이 세포밖으로 용출되게 된다. 이렇게 유출된 B형 간염 표면항원의 양을 아보트사 오스자임 II 키트(Abbot, Auszyme II kit, U.S.A.)로 측정하게 되면 B형 간염 표면항원량이 많을수록 세포가 많이 깨진 것으로 유추하여 상대적으로 얼마만큼의 세포가 깨졌는지 알 수 있게 된다. 본 실험을 위하여 실시예3에서 48시간 발효시킨 효모를 O.D. 600㎚ 10기준으로 1㎖씩 에펜도르프 미량 원심분리 튜브에 분취하였다. 원심분리를 한 다음 각 에펜도르프 튜브의 부유물을 버리고 200㎕의 TE 완충액(10mM 트리스, 1mM EDTA pH8.0)과 0.4g의 직경 0.45㎚ 유리구슬(6N HC1로 세척된 것, Thomas Scientific, U.S.A.)을 넣고 각각 10초, 20초, 30초, 40초, 50초, 60초 동안 비드 비터(bead beater, Bioseptic, U.S.A.)로 세포를 분쇄하였다. 적당히 희석한 후 유출된 B형 간염 표면항원의 양을 오스자임 II 키트로 측정하였다. 그 결과를 제7도에 나타내었으며 돌연변이 효모 사카로마이세스 세레비지애 MI01가 짧은 시간에도 더 많이 깨진 것을 알 수 있다.

Claims (6)

1. 임의의 유전자 또는 DNA 단편의 삽입에 의해 불활성화된 knr4 유전자를 함유하는 플라스미드를 이용한 1 단계 유전자 파괴법(one step gene disruption method)에 의해 knr4 유전자를 불활성화시킨 세포벽이 약화된 돌연변이 효모.
2. 제1항에 있어서, 상기 플라스미드에서 knr4 유전자는 ura3 유전자의 삽입에 의해 불활성화된 돌연변이 효모.
3. 제2항에 있어서, 상기 플라스미드가 pUC18-knr4-rua3인 돌연변이 효모.
4. 제1항에 있어서, 효모 사카로마이세스 세레비지애 EGY48의 knr4 유전자를 불활성화시킨 돌연변이 효모.
5. 제4항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애 MI01(KCTC 0134BP).
6. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항의 효모를 목적 재조합 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환시킨 후 적당한 배지상에서 배양하여 상기 유전자를 발현시킨 다음, 상기 목적 재조합 단백질을 분리 및 정제함을 포함하는 재조합 단백질의 생산 방법.