JPWO2014156998A1 - 化成品の製造方法および製造装置 - Google Patents

Abstract

発酵により原料化合物から化成品を製造する方法において、発酵液を分離して化成品を含む透過液を得る際に、該透過液中に含まれる原料化合物の量を低減することを目的とする。第１の発酵部１で、菌体を含む液に原料化合物および酸素を供給して発酵を行い、発酵により生成された化成品を含む第１の発酵液を得る第１の発酵工程と、第２の発酵部２で、第１の発酵部１から第１の発酵液を取り出し第２の発酵液とし、原料化合物を供給せず酸素を供給して発酵を行い、第２の発酵液における原料化合物の濃度を、第１の発酵液における原料化合物の濃度（Ｘ）よりも低い濃度（Ｙ）とする第２の発酵工程と、分離部３で、原料化合物の濃度が前記濃度（Ｙ）である第２の発酵液を分離し、化成品を含む分離液を得る分離工程と、を有する化成品の製造方法。

Description

本発明は、発酵により原料化合物から化成品を製造する方法および装置に関する。

微生物による発酵工程を経て各種の化成品を製造する方法が提案されている。例えば下記特許文献１には、特定の分裂酵母を用いた発酵により糖類から乳酸を製造する方法が記載されている。
下記特許文献２の実施例には、発酵槽に微生物および培地（原料糖および硫酸アンモニウム）を供給し、培養を行うことによって乳酸を生成し、発酵槽から取り出した発酵液を膜分離して乳酸と微生物とを分離し、該微生物を発酵槽に戻す方法で、連続的に乳酸を製造する方法が記載されている。

国際公開第２０１１／０２１６２９号 国際公開第２０１２／０７７７４２号

しかしながら特許文献２に記載の方法において、発酵槽内の発酵液には一定濃度で原料糖が存在しており、該発酵液を膜分離して得られる透過液（分離液）には化成品だけでなく原料糖も含まれるため、さらに該透過液中の化成品と原料糖を分離するための精製工程が必要である。該透過液に含まれる原料糖が多いほど、原料糖の利用効率が低くなり、精製工程の負担も大きくなる。
本発明は、前記事情に鑑みてなされたもので、発酵により原料化合物から化成品を製造する方法において、発酵液を分離して化成品を含む分離液を得る際に、該分離液中に含まれる原料化合物の量を低減することができる、化成品の製造方法、および該方法に用いられる製造装置を提供することを目的とする。

本発明は、以下の［１］〜［８］である。
［１］ 菌体を含む液に原料化合物および酸素を供給して発酵を行い、発酵により生成された化成品を含む第１の発酵液を得る第１の発酵工程と、
前記第１の発酵液を取り出し第２の発酵液とし、該第２の発酵液に原料化合物を供給せず酸素を供給して発酵を行い、該第２の発酵液における原料化合物の濃度を、前記第１の発酵液における原料化合物の濃度（Ｘ）よりも低い濃度（Ｙ）とする第２の発酵工程と、
前記原料化合物の濃度が前記濃度（Ｙ）である第２の発酵液を取り出し第３の発酵液とし、該第３の発酵液を、前記化成品を含みかつ菌体を含まない分離液と菌体を含む非分離液とに分離し、前記化成品を含む分離液を得る分離工程とを有することを特徴とする化成品の製造方法。

［２］ 前記分離工程で得られる、菌体を含む非分離液を第１の発酵工程に供給する戻り送液工程をさらに有する、［１］に記載の化成品の製造方法。
［３］ 前記第１の発酵液における前記原料化合物の濃度（Ｘ）が５〜５００ｇ／Ｌであり、かつ前記第２の発酵液における前記原料化合物の濃度（Ｙ）が前記濃度（Ｘ）の８０％以下である、［１］または［２］に記載の化成品の製造方法。
［４］ 前記第１の発酵液の溶存酸素濃度が１０〜３００ｐｐｂであり、かつ前記第２の発酵液の溶存酸素濃度が１０〜６０００ｐｐｂである、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の化成品の製造方法。

［５］ 菌体を含む液に原料化合物を供給する手段、および該菌体を含む液に酸素を供給する手段を有し、発酵により生成された化成品を含む第１の発酵液を得る第１の発酵部と；
分離ユニットを有し、分離により前記化成品を含み菌体を含まない分離液と前記菌体を含む非分離液を得る分離部と；
前記第１の発酵部と前記分離部との間に設けられ、
前記第１の発酵液を前記第１の発酵部から取り出し第２の発酵液とし、該第２の発酵液を前記分離部へ送液する流路と、前記第２の発酵液に酸素を供給する手段とを有し、前記第２の発酵液に前記原料化合物を供給せずに発酵を行い、該第２の発酵液における原料化合物の濃度を、前記第１の発酵液における原料化合物の濃度（Ｘ）よりも低い濃度（Ｙ）とする第２の発酵部と；を備えていることを特徴とする化成品の製造装置。

［６］ 前記第１の発酵部が第１の発酵槽を備え、前記第２の発酵部が第２の発酵槽を備える、［５］に記載の化成品の製造装置。
［７］ 前記分離部が、前記分離ユニットから菌体を含む液を取り出し再び分離ユニットに供給する循環路を備える、［５］または［６］に記載の化成品の製造装置。
［８］ 前記分離部から前記第１の発酵部へ、前記菌体を含む非分離液を供給する戻り送液部をさらに有する、［５］〜［７］のいずれか一項に記載の化成品の製造装置。

本発明によれば、発酵により原料化合物から化成品を製造する方法において、発酵液を分離して化成品を含む分離液を得る際に、該分離液中に含まれる原料化合物の量を低減することができる。これにより、原料化合物の利用効率を向上させることができる。また分離液を精製する際に除去すべき原料化合物の量が低減されるため、精製工程の負担が軽減する。

本発明の化成品の製造装置の一実施形態を示す概略構成図である。 本発明の化成品の製造装置の一実施形態を示す概略構成図である。

＜化成品の製造装置＞
本発明の化成品の製造装置は、第１の発酵部、第２の発酵部、および分離部を備える。本発明の化成品の製造装置は、戻り送液部をさらに有することが好ましい。
図１および図２は、本発明の化成品の製造方法を実施するのに好適な化成品の製造装置の一実施形態を示した概略構成図である。以下の製造装置の説明においては、図１（一部図２の場合もある）を用いて説明する。
本実施形態の化成品の製造装置は、第１の発酵槽１０を備えた第１の発酵部１、第２の発酵槽２０を備えた第２の発酵部２、分離ユニット３０を備えた分離部３、および分離部３から第１の発酵部１へ送液する戻り送液部４とから概略構成されている。
本実施形態の装置では、第１の発酵槽１０で得られた発酵液が、第２の発酵槽２０を経た後、分離部３で分離され、菌体を含む非分離液が戻り送液部４を経て第１の発酵槽へ戻る循環系が形成されている。
なお本明細書において、発酵とは菌体を用いて原料化合物を転換し目的とする化成品を得る処理をいう。本明細書における発酵液とは、発酵を経た液を意味し、菌体、および発酵により生成した化成品を含む。また発酵液には原料化合物を含んでいてもよい。
第１の発酵液は、第１の発酵部１の内部に存在する菌体と化成品を含む液を意味する。また第２の発酵液は、第１の発酵部１から取り出されてから、分離部３に至るまでの第２の発酵部２の内部に存在する菌体と化成品を含む液を意味する。また第３の発酵液は、分離部３の内部に存在する菌体と化成品を含む液を意味する。

［第１の発酵部］
本発明にかかる第１の発酵部は、菌体を含む液に原料化合物を供給する手段、および該菌体を含む液に酸素を供給する手段を有し、発酵により生成された化成品を含む第１の発酵液を得る。第１の発酵部は、第１の発酵槽を備えることが好ましい。該菌体を含む液は、少なくとも菌体を含んでいればよく、菌体のほかに、発酵により生成した化成品を含んでいてもよい。また、菌体のほかに原料化合物を含んでいてもよい。
図１に示す実施形態において、第１の発酵部１は、第１の発酵槽１０を備える。第１の発酵槽１０は、原料化合物を槽内に供給する原料供給手段７、菌体を槽内に供給する菌体供給手段８、酸素を槽内に供給する酸素供給手段６を備えている。
本実施形態において、酸素供給手段６は、第２の発酵部２および分離部３にもそれぞれ酸素を供給できるようになっている。すなわち、酸素供給手段６は、第２の発酵部２の酸素供給手段および分離部の酸素供給手段も兼ねている。
また図示していないが、第１の発酵槽１０は、槽内を均一に混合する混合手段、槽内から余剰の気体を排出する気体排出手段、槽内の液温を所定の温度に保持する温度調節手段を備えている。
さらに第１の発酵槽１０は、図示していないが、槽内の液中の酸素濃度、原料化合物の濃度、および菌体の濃度をモニターする装置を備えている。該モニター装置から得られる値が一定に保持されるように、原料供給手段７、菌体供給手段８、および酸素供給手段６を制御する制御手段が設けられている。

第１の発酵槽１０の材質および形状は、特に限定されず、公知の発酵槽を適宜用いることができる。本発明においては、液中に酸素を導入するため金属の腐食が比較的発生しやすい環境と考えられる。このため装置の材質としては、ガラスまたは耐食鋼を用いることが好ましい。特に目的の化成品が液中で酸性を示す場合には、ガラスまたは耐食鋼を用いることが特に好ましい。ガラスとしては、装置の全体または一部をガラス製としてもよく、ガラスライニング製の鋼を用いてもよい。耐食鋼としては、ステンレス鋼またはニッケル合金を用いることが好ましい。なお材質については、本発明の装置全体について同じ材質を用いることが好ましい。ただし分離部に膜分離ユニットを採用した場合に、膜の材質は後述する通りである。また第１の発酵槽１０は密閉可能で、外部からの雑菌の侵入を防止するために内部を所定の加圧状態に維持できることが好ましい。
本実施形態における第１の発酵槽１０として、例えば気泡塔型発酵槽、撹拌翼付き発酵槽、管型発酵槽等が好適に用いられる。
第１の発酵槽１０の容量は、特に限定されず適宜設定できる。本実施形態において第１の発酵槽１０の容量は、本実施形態の構成による効果が得られやすい点、および化成品の製造効率の点で０．３Ｌ以上が好ましく、１００Ｌ以上がより好ましく、１ｍ^３以上がさらに好ましい。該容量の上限は定期保守・点検を行いやすい点からは１０００ｍ^３以下が好ましく、６００ｍ^３以下がより好ましい。

原料供給手段７は、例えば原料化合物を含有する液（以下原料含有液という）を貯留する原料槽７０と、原料槽７０から第１の発酵槽１０へ原料含有液を送液する原料含有液供給ライン７１と、原料槽７０から第１の発酵槽１０へ原料含有液を送液するポンプ７１ａと、該ポンプ７１ａを調節して供給量を制御する制御手段（図示略）を備えてなる。原料含有液は、第１の発酵槽１０に、制御されながら連続的にまたは断続的に供給される。また原料槽７０は１つのみを設けてもよく、複数を設けてもよい。
ポンプ７１ａの調節方法としては、ポンプの動力（電力または周波数）を直接制御する方法、ポンプの前後に設けられた弁の開度を制御する方法、ポンプの吐出側から吸入側に戻る循環ラインを設けて該循環ラインの流量を制御する方法、およびこれらを組み合わせる方法等が挙げられる。後述のポンプ８１ａ、２１ａ、２２ａ、３１ａおよび４１ａの調節方法も同様である。

菌体供給手段８は、例えば菌体を培養し培養液（菌体を含む液）を得て、該培養液を貯蔵する培養槽８０と、培養槽８０から第１の発酵槽１０へ培養液を送液する培養液供給ライン８１と、培養槽８０から第１の発酵槽１０へ培養液を送液するポンプ８１ａと、該ポンプ８１ａを調節して供給量を制御する制御手段（図示略）を備えてなる。培養液は、第１の発酵槽１０に、制御されながら連続的にまたは断続的に供給される。
培養槽８０は、液体の培地と菌体が供給され、酸素を含む気体が供給され、所定の培養温度に保持される。これらの操作により、菌体を増殖させ、所定の菌体濃度の培養液を得る。菌体の種類に応じて公知の培地および培養条件を用いることができる。
培地には、原料化合物が含まれていてもよい。この場合、菌体供給手段８により槽内に培養液を供給すると、菌体と原料化合物が同時に供給されることになる。

酸素供給手段６は、例えば酸素を含む気体を加圧して貯蔵する気体貯蔵槽６０と、気体貯蔵槽６０から第１の発酵槽１０へ気体を送る気体供給ライン６１と、図示しない弁を調節して供給量を制御する制御手段（図示略）を備えてなる。酸素は、第１の発酵槽１０に、制御されながら連続的にまたは断続的に供給される。酸素は通常気体として供給される。供給される気体は、少なくとも酸素を含み発酵に悪影響のない気体であればよい。例えば、純酸素でもよく、酸素と、酸素以外の気体の１種以上（空気、窒素、二酸化炭素、メタン等）との混合気体でもよく、空気でもよい。入手容易であるため空気を用いることが好ましい。
第１の発酵槽１０の槽内に供給される気体の酸素濃度は、５〜５０体積％が好ましく、１５〜３０体積％がより好ましい。該酸素濃度が上記範囲の下限値以上であると、菌体が利用するために充分な量の酸素が供給しやすい。また該酸素濃度が上記範囲の上限値以下であると酸素濃度を高くする負荷が減るためガスの供給が容易になる。

酸素供給手段６としては、第１の発酵槽１０の下部から気体が供給されることによって、該槽内の液が撹拌されるような構成を有することが好ましい。すなわち第１の発酵槽１０としては、気泡塔型発酵槽が好ましい。また内部にドラフトチューブを設ける構成が撹拌効率が良好な点で好ましい。この構成であれば、大型の発酵槽の構造が簡略化でき、かつ、菌体の損傷が抑制しやすい点で好ましい。
気体を槽内に供給する細部の構造としては、例えば、多孔分散管（スパージャ）、気体噴射装置、気体透過膜型装置等が挙げられる。多孔分散管としては、直線状または環状の管に多数の孔を設けた管型スパージャ、多数の空隙を有する焼結金属を用いる焼結金属型スパージャ等が例示できる。気体噴射装置としては、高圧の気体をノズルから噴射する気体噴射ノズル型噴射装置、高圧の気体と高圧の液体とをそれぞれノズルから噴射し衝突させる二流体ノズル型噴射装置、高速の液体で気体を吸引するアスピレータ型噴射装置等が例示できる。特に気体噴射ノズル型噴射装置においては、ノズル形状を工夫することにより、微細な気泡（いわゆるマイクロバブルやナノバブル）を生成する装置を用いることもできる。気体透過膜型装置としては、槽の壁面や、撹拌のための邪魔板等の一部に気体透過膜を用い、該透過膜を透過する気体により液体に気体を溶存させる装置が例示できる。これらの細部構造は組み合わせて用いてもよい。

また第１の発酵槽１０は、その上部に溜まる気体を、必要に応じて槽外へ排出できる気体排出手段を有していることが好ましい。排出された気体を回収し、再び系内に供給してもよい。
発酵槽内における液中の酸素濃度モニターとしては、一般的な溶存酸素計を用いることができる。原料化合物および目的の化成品の濃度モニターとしては、近赤外センサー、酵素電極等を用いることができる。また試料を抜き出して高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）法等で測定してもよい。菌体の濃度モニターとしては、光学センサー、静電容量センサーを用いることができる。

［第２の発酵部］
本発明にかかる第２の発酵部は、第１の発酵部と分離部との間に設けられ、第１の発酵液を第１の発酵部から取り出し第２の発酵液とし、第２の発酵液を分離部へ送液する流路と、第２の発酵液に酸素を供給する手段とを有し、第２の発酵液に原料化合物を供給せずに発酵を行い、該第２の発酵液における原料化合物の濃度を、第１の発酵液における原料化合物の濃度（Ｘ）よりも低い濃度（Ｙ）とする。第２の発酵部は、第２の発酵槽を備えることが好ましい。
図１に示す実施形態において、第２の発酵部２は、第１の発酵部１から分離部３へ送液する流路（配管）２１、２２と、該流路の途中に設けられた第２の発酵槽２０を備える。図中、符号２１は、第２の発酵槽２０と第１の発酵槽１０とを接続する第１の発酵部側の配管であり、ポンプ２１ａを備えている。図中、符号２２は、第２の発酵槽２０と後述する分離部３の循環路３１とを接続する分離部側の配管であり、ポンプ２２ａを備えている。

第２の発酵槽２０は、酸素を槽内に供給する酸素供給手段６を備えている。また図示していないが、第２の発酵槽２０は、槽内を均一に混合する混合手段、槽内から余剰の気体を排出する気体排出手段、槽内の液温を所定の温度に保持する温度調節手段を備えている。
さらに第２の発酵槽２０は、図示していないが、槽内の液中の酸素濃度、原料化合物の濃度、および菌体の濃度をモニターする装置を備えている。該モニター装置から得られる値が一定に保持されるように、第１の発酵部側の配管２１、および、分離部側の配管２２に設けられたポンプ２１ａ、２２ａをそれぞれ制御する制御手段、および酸素供給手段６を制御する制御手段が設けられている。
その他、例えばｐＨ制御手段、液面レベル制御手段等、一般的な発酵槽において公知の構成を適宜備えることができる。

第２の発酵槽２０の材質および形状は、特に限定されず公知の発酵槽を適宜用いることができる。装置の材質については第１の発酵槽１０の場合と同様である。また第２の発酵槽２０は、密閉可能で、外部からの雑菌の侵入を防止するために内部を所定の加圧状態に維持できることが好ましい。
本実施形態における第２の発酵槽２０として、例えば気泡塔型発酵槽、撹拌翼付き発酵槽管型発酵槽等が好適に用いられる。第２の発酵槽２０としては、必ずしも槽として独立の形状を必要としない。すなわち酸素を供給する酸素供給手段と、余分な気体を排気できる手段を有し、発酵液の滞留時間を確保できる構造があればよい。例えば、長い配管、または太い配管に酸素が供給でき、ガス溜りから排気できるという簡素な態様でもよい。ただし第２の発酵槽としては、酸素濃度と温度との制御が必要である点で、一定の容量を有する槽が好ましい。また第２の発酵槽２０は、１個のみ設けてもよく、複数を直列に、または並列に設けてもよい。特に第１の発酵槽１０および第２の発酵槽２０が大型であって、送液に時間が必要な場合には、並列に設けることが好ましい。例えば、並列に３個設けて、（１）第１の槽から原料化合物の濃度が高い第２の発酵液を受け入れる工程、（２）酸素を供給し続け原料化合物の濃度を下げる工程、（３）原料化合物の濃度が下がった第２の発酵液を分離部に送り出す工程の３工程を並行して進められる装置構成が好ましい。

第２の発酵槽２０の容量は、特に限定されず適宜設定できる。本実施形態において第２の発酵槽２０の容量は、本実施形態の構成による効果が得られやすい点、および製造効率の点で０．３Ｌ以上が好ましく、１００Ｌ以上がより好ましく、１ｍ^３以上がさらに好ましい。該容量の上限は、定期保守・点検を行いやすい点からは１０００ｍ^３以下が好ましく、６００ｍ^３以下がより好ましい。また第１の発酵槽１０に対する第２の発酵槽２０の容量（容量比）は、第１の発酵槽を１とした時に０．０１〜２が好ましく、０．０５〜１がより好ましい。該容量比の下限値以上であれば、分離部３における原料化合物の濃度を低くしやすい。また該容量比の上限値以下であれば、装置効率を高くしやすい。
第２の発酵槽２０においては、第２の発酵液における原料化合物を菌体が利用することにより、第２の発酵液中の原料化合物の濃度が低下する。第２の発酵槽２０における平均滞留時間（実効容量／平均体積流速）を長くすることによって、第２の発酵液中の原料化合物の濃度を低下させることができる。なおこの実効容量としては、第２の発酵槽２０の実効容量（実際に液が充填されている容量であって、複数の第２の発酵槽２０が存在する場合にはその合計の容量）と配管２１、２２の容量との合計で考える。また平均体積流速は、第１の発酵槽１０から送り出された液量を基準に考える。
第１の発酵部側配管２１および分離部側配管２２には、管内の液温が所定の発酵温度に保たれるように、必要に応じて温度調節手段（図示せず）が設けられる。

酸素供給手段６は、例えば気体貯蔵槽６０と、気体貯蔵槽６０から第２の発酵槽２０へ気体を送る気体供給ライン６２と、図示しない弁を調節して供給量を制御する制御手段（図示略）を備えてなる。酸素は、第２の発酵槽２０に、制御されながら連続的にまたは断続的に供給される。酸素は通常気体として供給される。供給される気体は、第１の発酵槽１０に供給される記載と同様のものを用いることができる。
第２の発酵槽２０の槽内に供給される気体の酸素濃度は、５〜５０体積％が好ましく、１５〜３０体積％がより好ましい。該酸素濃度が上記範囲の下限値以上であると、菌体が利用するために充分な量の酸素が供給しやすい。また該酸素濃度が上記範囲の上限値以下であると、酸素濃度を高くする負荷が減るためガスの供給が容易になる。
酸素供給手段６としては、第２の発酵槽２０の下部から気体が供給されることによって、該槽内の液が撹拌されるような構成を有することが好ましい。すなわち第２の発酵槽２０としては、気泡塔型発酵槽が好ましい。また内部にドラフトチューブを設ける構成が撹拌効率が良好な点で好ましい。この構成であれば、大型の発酵槽の構造が簡略化でき、かつ、菌体の損傷が抑制しやすい点で好ましい。気体を槽内に供給する細部の構造としては、第１の発酵槽１０の場合と同様のものが例示できる。

また図示していないが、第１の発酵部側配管２１および／または分離部側配管２２内の液中の酸素濃度をモニターする手段と、必要に応じて、第１の発酵部側配管２１および／または分離部側配管２２内に、酸素を含む気体を供給する手段を設けることが好ましい。気体は、第１の発酵槽１０に供給される記載と同様のものを用いることができる。
第１の発酵部側配管２１および／または分離部側配管２２内に供給される気体の酸素濃度は、第２の発酵槽２０の槽内に供給される気体の酸素濃度と同様であることが好ましい。
第１の発酵部側配管２１および／または分離部側配管２２内に気体を供給するには、例えば気体供給ライン６３、６４を用いる。その細部の構造としては、第１の発酵槽１０の場合と同様のもの（例えば、多孔分散管（スパージャ）、気体噴射装置、気体透過膜型装置等）が例示できる。

また第２の発酵槽２０は、その上部に溜まる気体を、必要に応じて槽外へ排出できる気体排出手段を有していることが好ましい。排出された気体を回収し、再び系内に供給してもよい。
また酸素濃度モニター、原料化合物および目的の化成品の濃度モニター、および、菌体の濃度モニターとしては、それぞれ第１の発酵槽１０の場合と同様のものを用いることができる。

［分離部］
本発明にかかる分離部は、分離ユニットを有し、分離により分離液と非分離液とを得る。分離液は化成品を含み、かつ、菌体を含まない。ここにおいて、「菌体を含まない」とは、実質的に含まないことを意味するが、湿重量で２０ｇ／Ｌ以下（好ましくは１０ｇ／Ｌ以下）の菌体（生菌）が含まれてもよい。非分離液は化成品を含み、かつ、菌体を含む。分離部は、分離ユニットから菌体を含む液を取り出し、再び分離ユニットに供給する循環路を備えることが好ましい。
図１に示す実施形態において、分離部３は、分離ユニット３０と、分離ユニット３０の分離で分離されなかった非分離液を再び分離ユニット３０に供給する循環路３１とを備えている。循環路３１には、第２の発酵部２の分離部側配管２２が接続され、該接続位置と分離ユニット３０との間にポンプ３１ａが設けられている。また当該接続位置に図２に示すようにバッファータンク３２を設けることが、ポンプ３１ａの運転が容易になる点で好ましい。
分離ユニット３０としては、得られた発酵液（第３の発酵液：菌体および化成品を含む液）を、化成品を含みかつ菌体を含まない液（分離液）と菌体を含む液（非分離液）とに分離できる装置であればよく、例えば、膜分離装置、遠心分離装置、抽出分離装置等が用いられる。分離ユニット３０は、１個のみ設けてもよく、複数個を直列または並列に設けてもよい。

膜分離装置としては、第３の発酵液中の目的の化成品を透過し、菌体を透過しない分離膜を備えたものであればよく、公知の膜分離装置を適宜用いることができる。分離膜は有機膜であってもよく、無機膜であってもよい。分離膜の材質として、例えばポリフッ化ビニリデン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、セラミックス等が挙げられる。これらのうち比較的安価かつ耐久性が高く、安定供給が可能という点からは、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンが好ましい。
分離膜の形状は、特に限定されず、例えば平膜、中空糸膜などが挙げられる。
分離膜は、平均孔径が０．０１〜３μｍの細孔を有する多孔膜であることが菌体が透過しにくく、比較的高い透過流束（ｆｌｕｘ）を有する点で好ましい。分離膜の平均孔径は、０．１〜０．６５μｍがより好ましい。
膜分離装置の処理能力（透過流束）は、装置の規模によっても異なるが、例えば１〜１００Ｌ／ｍ^２／ｈが好ましく、３〜３０Ｌ／ｍ^２／ｈがより好ましい。

遠心分離装置としては、菌体を遠心沈降させる機構を備えたものであればよく、スクリューデカンタ等が例示できる。遠心分離装置の処理能力は、第１の発酵槽１０の容量等から適宜選定される。
抽出分離装置としては、第３の発酵液中の目的の化成品を、抽出剤を用いて、発酵液から抽出できる装置であればよく、抽出塔等が例示できる。抽出塔としては棚段抽出塔、充填抽出塔等が例示できる。抽出の形式としては、向流抽出、併流抽出が例示できる。抽出剤としては、アルコール、エステル、ケトン、エーテル、アミン等が例示でき、それぞれ炭素数が５〜４０程度の有機化合物を用いることが好ましい。

循環路３１には、管内の液温が所定の発酵温度に保たれるように、必要に応じて温度調節手段（図示せず）が設けられる。
分離ユニット３０は、分離された分離液を排出する排出管５１を備える。該排出管５１にはポンプ（図示略）が設けられる。
また、循環路３１内の液中の酸素濃度をモニターする手段（図示略）と、必要に応じて、循環路３１内に酸素を含む気体を連続的にまたは断続的に供給する酸素供給手段６を設けることが好ましい。酸素供給手段６は、循環路３１の任意の位置の１箇所以上に設けることが好ましい。循環路３１内に気体を供給するには、例えば気体供給ライン６５を用いる。その細部の構造としては、第１の発酵槽１０の場合と同様のものが例示できる。
気体は、第１の発酵槽１０に供給される記載と同様のものを用いることができる。循環路３１に供給される気体の酸素濃度は、第２の発酵槽２０の槽内に供給される気体の酸素濃度と同様であることが好ましい。

［戻り送液部］
本発明にかかる戻り送液部は、分離部から第１の発酵部へ、菌体を含む非分離液を供給する。
図１に示す実施形態において、戻り送液部４は、配管４１（流路）を備える。配管４１は、分離部３の循環路３１と、第１の発酵槽１０とを接続する。図２に示す実施形態において戻り送液部４は、さらに、ポンプ４１ａ、配管４２、および排出管４３を備える。配管４２は、配管４１から分岐し、第２の発酵槽２０へ接続されている。排出管４３は、非分離液の一部を連続的にまたは断続的に排出する。配管４１と循環路３１との接続位置は、循環路３１と第２の発酵部２の分離部側配管２２との接続位置と、分離ユニット３０から非分離液が排出される出口との間に設けられる。配管４１には、配管４１と循環路３１との接続位置の近傍に流量制御弁を設けることが好ましい。当該制御弁により循環路３１と配管４１との流量のバランスを調整することができる。戻り送液部４は、分離部３が複数設けられた場合には、１つにまとめられて第１の発酵部に戻る態様であってもよく、それぞれ個別に第１の発酵部に戻る態様であってもよい。

また図示していないが、配管４１内の液中の酸素濃度をモニターする手段と、必要に応じて、該配管４１内に酸素を含む気体を連続的にまたは断続的に供給する酸素供給手段６を設けることが好ましい。酸素供給手段６は、配管４１の任意の位置の１箇所以上に設けることが好ましい。配管４１内に気体を供給するには、例えば気体供給ライン（図示略）を用いる。その細部の構造としては、第１の発酵槽１０の場合と同様のもの（例えば、多孔分散管（スパージャ）、気体噴射装置、気体透過膜型装置等）が例示できる。
気体は、第１の発酵槽１０に供給される記載と同様のものを用いることができる。配管４１に供給される気体の酸素濃度は、第２の発酵槽２０の槽内に供給される気体の酸素濃度と同様であることが好ましい。
なお戻り送液部４においては、分離部３から送液される液の全量を第１の発酵部１に必ずしも戻す必要はない。配管４２を経由して、一部を第２の発酵部２に戻してもよく、全量を第２の発酵部に戻してもよい。さらに排出管４３を経由して一部を排液として排出してもよい。

＜化成品の製造方法＞
本発明の化成品の製造方法は、菌体を用いた発酵により原料化合物から化成品を製造する方法である。
［菌体］
本発明における菌体とは、原料化合物を消費し、目的とする化成品を生産する能力を有する生物である。菌体としては天然に存在するものでもよく、突然変異や遺伝子組み換えによって一部性質が改変されたものでもよい。発酵において公知のものを適宜用いることができる。
菌体の例としては、酵母、大腸菌、乳酸菌、糸状菌、放射菌等が挙げられる。
これらのうち、化成品生産性及び、耐薬品性（アルコール、酸）に優れる点で酵母が好ましい。酵母としては、例えば出芽酵母、分裂酵母等が挙げられる。出芽酵母としては、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ等が挙げられる。分裂酵母としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、シゾサッカロミセス・ジャポニカス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、シゾサッカロミセス・オクトスポラス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ）等が挙げられる。上記分裂酵母のうち、種々の有用な変異株が利用できることから、シゾサッカロミセス・ポンベ（以下、Ｓ．ｐｏｍｂｅともいう）が好ましい。

［原料化合物］
本発明において原料化合物とは、菌体が直接資化できる化合物であり、発酵によって目的の化成品が得られる化合物である。発酵において公知のものを適宜用いることができる。
原料化合物の例としては、糖類（単糖類（五炭糖、六炭糖）、二糖類、多糖類）、アルコール類（グリセロール等）、アミノ酸（アラニン、グリシン、ロイシン等）等が挙げられる。
これらのうち菌体が炭素源として資化しやすい点で糖類が好ましい。糖類の好ましい例としては、リボース、アラビノース、キシロース等の五炭糖；グルコース、フルクトース、ガラクトース等の六炭糖；スクロース、トレハロース、セルビオース、マルトース等の二糖類；セルロース、デンプン等の多糖類等が挙げられる。これらのうち六炭糖がより好ましく、グルコースが特に好ましい。
菌体が原料化合物として単糖類のみを資化できる場合には、二糖類や多糖類を前処理して用いてもよい。例えば原料槽に二糖類や多糖類を含む原料に、糖化酵素を混合し、分解されて得られた単糖類を用いてもよい。またグルコース等の糖類を多く含む原料（サトウキビやビートの搾りかす（モラセス）等）を直接用いてもよい。
［原料含有液］
原料含有液は、原料化合物を含有する液（通常は水溶液）である。原料化合物の他に、例えば、Ｋ、Ｎａ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｆｅ等の金属元素、ミネラル分およびビタミン類を含んでいてもよい。後述する実施形態においては、原料含有液は菌体を含まない。

［化成品］
本発明において化成品とは、発酵液中で菌体によって生成される化合物である。目的とする化成品のほかに、副生成物である化成品も含まれる。
化成品としては、例えばアルコール、有機酸等が挙げられる。
アルコールの例としては、エタノール、２−プロパノール、１，３−ブタンジオール、１、４−ブタンジオール、プロピレングリコール、グリセリン等が挙げられる。
有機酸の例としては、酢酸、マロン酸、コハク酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、ピルビン酸、等が挙げられる。ここでヒドロキシカルボン酸は有機酸として考える。
これらのうち汎用性が高く、市場の発展性（合成繊維用途や車載用途、代替プラスチック用途等）が望める点で有機酸が好ましく、特に乳酸、リンゴ酸、コハク酸、３−ヒドロキシプロピオン酸等が好ましい。

本発明の化成品の製造方法は、中和塩等の沈殿を形成させることで化成品を得る方法にも適用可能である。しかし本発明の製造方法は、化成品を、沈殿を形成させることなく水溶液として得る方法に特に好適である。
また本発明の製造方法は、沸点が水（１００℃）よりも高い化成品の製造方法として特に好適である。本発明の製造方法のうち、菌体を分離して得られる分離液が化成品を含む水溶液（化成品粗液）である場合には、得られた化成品と水を分離する手段として蒸留を適用することが考えられる。しかし一般に原料化合物は、蒸留では高沸成分または残渣として分離されることになる。この際目的とする化成品の沸点が水より低い場合は蒸留での分離が容易である。一方、目的とする化成品の沸点が水よりも高い場合には、目的とする化成品と原料化合物の分離が困難になりやすい。このため分離液（化成品粗液）に含まれる原料化合物の濃度を下げることにより、化成品の精製（特に蒸留精製）の負荷を低減することができる。

以下、図１の構成を有する装置を用い、本発明の製造方法により化成品を連続的に製造する一実施形態を説明する。
［第１の発酵工程］
本発明にかかる化成品の製造方法において、第１の発酵工程では、菌体を含む液に原料化合物および酸素を供給して発酵を行い、発酵により生成された化成品を含む第１の発酵液を得る。
本実施形態において、予め培養槽８０に液状の培地および菌体を供給し、酸素を含む気体を連続的に供給しつつ、所定の培養温度に保持することにより培養液を得る。培養槽８０内の液（培養液）中の酸素濃度および培養温度は、菌体の増殖に適した培養条件に維持されるように制御される。通常、菌体の増殖に適した培養条件と、発酵による化成品の製造に適した発酵条件とでは好ましい酸素濃度条件が異なる。一般に発酵液中の好ましい酸素濃度は、培養に適した酸素濃度条件よりも低い。

第１の発酵槽１０内に、原料供給手段７により原料含有液を所定量供給する。原料供給手段７からの供給は、連続的に行ってもよく、断続的に行ってもよい。また第１の発酵槽１０内に、菌体供給手段８により菌体を含む培養液を所定量供給する。菌体供給手段８からの供給は、連続的に行ってもよく、断続的に行ってもよい。また後述するように、戻り送液部４の配管４１から菌体を含む液（分離ユニットで分離されなかった非分離液）が連続的にまたは断続的に供給される。原料供給手段７からの原料含有液供給量、菌体供給手段８からの菌体を含む培養液の供給量、および戻り送液部４の配管４１からの菌体を含む液の供給量の合計（合計供給量）が一定速度であり、配管２１から送り出される発酵液の送液量（払い出し量）が一定速度であり、かつ、この２者の速度が等しい場合には、第１の発酵槽１０内の液面レベルは一定となる。一方、合計供給量、および払い出し量は、常に定常値とする必要はなく、これらの値は断続的（間欠的）に高低を繰り返してもよい。例えば一定時間、合計供給量をある値とし、同時に払い出し量をゼロにして第１の発酵槽内部の液量を増加させる。合計供給量と払い出し量の両方をゼロにし、必要に応じて一定時間経過させる。その後合計供給量はゼロのまま、払い出し量をある値にする。さらに合計供給量と払い出し量の両方をゼロにし、必要に応じて一定時間経過させる。このような操作を繰り返すことで液面レベルは上下する。このような準回分的運転方法も採用できる。
第１の発酵槽１０内の液温を所定の発酵温度に制御し、酸素供給手段６により、酸素を含む気体を該液中に連続的に供給するとともに、原料供給手段７により原料化合物を連続的にまたは断続的に供給する。これにより、該液中で発酵が進行し、酸素および原料化合物が消費されて化成品（目的とする化成品および副生成した化成品）が生成される。
第１の発酵槽１０内の液は、気体供給手段１３によって気体が連続的に供給されることによる撹拌作用でほぼ均一になっている。第１の発酵槽１０内の第１の発酵液の原料化合物の濃度を濃度（Ｘ）とする。なお、第１の発酵槽１０から第１の発酵槽側配管２１に排出された直後（図中符号Ａで示す場所。以下Ａ点という。）の第２の発酵液には、生成された化成品、原料化合物、菌体、および酸素が第１の発酵槽１０内における濃度とほぼ同じ濃度で含まれる。すなわち、Ａ点における、第２の発酵液の原料化合物の濃度は、第１の発酵槽１０内の第１の発酵液の原料化合物の濃度（Ｘ）と同じである。したがって、Ａ点における液をサンプリングして該濃度（Ｘ）を測定してもよい。

第１の発酵槽１０の液中の菌体（生菌）の量、および第１の発酵槽１０内での滞留時間が一定である場合、該液中の酸素濃度および原料化合物の濃度によって目的の化成品の収率が変化する。
したがって、第１の発酵槽１０の液中の菌体（生菌）の量、酸素濃度および原料化合物の濃度が、化成品の良好な収率が得られる範囲に保たれるように、酸素の供給速度および原料化合物の供給速度を制御するとともに、必要に応じて菌体を含む培養液を供給する。
本明細書における収率は、対原料化合物収率とする。対原料化合物収率は、得られた化成品の質量を消費された原料化合物の質量で除した値である。例えば１ｇのグルコースを消費して、０．９ｇの乳酸が得られた場合には、収率は９０％となる。
本明細書において、発酵槽内での平均滞留時間は、発酵槽の実効容量を平均体積流速で除した値である。実効容量は実際に液が充填されている容量とする。また平均体積流速は発酵槽から送り出された単位時間当たりの発酵液容量とする。第１の発酵槽の場合には、連続運転においては、単位時間当たりに、発酵槽に供給された液（原料含有液、培養液および戻り送液）の合計量と、発酵槽から送り出された発酵液容量とは等しくなるように運転される。

発酵槽１０内での生菌の量は、事前の発酵試験により好適な範囲を求める。すなわち好適な生菌の菌体密度を試験により求め、発酵槽１０の実効容量を乗じて生菌量とする。菌体密度は、菌体の種類や培養条件にもよるが、発酵槽１０の容量を小さく抑えるために、ある程度高密度での発酵を行うことが好ましい。
発酵槽１０内の酸素濃度は、事前の発酵試験により好適な範囲を求める。特に本発明の場合には、発酵において酸素の供給を必須とする。しかし一般に酸素濃度を高くすると原料化合物の消費速度は速くなるが、目的とする化成品の生産速度が速くなる代りに、菌体の増殖が優先して進むようになる。したがって発酵槽１０内の酸素濃度は、比較的低めに制御することが好ましい。

発酵槽１０内での平均滞留時間は、発酵速度を元に算出される。発酵速度は、単位時間当たり、単位菌体量当たりの原料化合物の消費速度とする。原料化合物の消費速度は、事前の発酵試験により好適な範囲を求める。消費速度が原料化合物濃度の影響を受ける場合には、目標とする原料化合物濃度領域における消費速度を求める。
発酵槽１０内での原料化合物濃度は、消費速度が極端に低下しない程度に低くなるように定める。該原料化合物濃度を低く設定しすぎると発酵速度が低下しやすい。また該原料化合物濃度を高く設定しすぎると原料化合物の利用効率が低下することになる。
以上のような条件を考慮して、それぞれの値を設定することにより、目的とする化成品の生産速度を速くすることができる。特に単位時間当たり、発酵槽の単位体積当たりの化成品の生産速度を速くすることが好ましい。ただし個々の制御要素（原料化合物の供給速度、酸素の供給速度、温度、ｐＨおよび発酵槽からの発酵液の送り出しの速度等）は、互いに干渉し合うので、最終的には当該発酵槽における最適値は、実際の運転により適宜調整されるべきものである。

例えば、酵母を用いて、グルコースを原料化合物とし、乳酸を目的の化成品とする場合、第１の発酵槽１０の液中の生菌の量（菌体密度）は、乾燥重量換算で１２〜７２ｇ／Ｌが好ましく、２４〜４８ｇ／Ｌがより好ましい。該生菌の量が上記範囲の下限値以上であると発酵槽の単位体積当たりの化成品の生産速度を高くできる。また、上限値以下あると菌体にかかるストレスが低く抑制できる点で、また酸素および原料化合物を菌体に充分にかつ平均的に行き渡らせることがしやすい点で好ましい。
なお、後述の実施例等で示す菌体濃度（以下「菌体濃度ＯＤ６６０」と記載する。）は、日本分光社製可視紫外分光器Ｖ５５０によって測定した波長６６０ｎｍの光の吸光度（ＯＤ６６０）から換算した値である。６６０ｎｍにおけるＯＤ＝１は、酵母乾燥重量の０．２ｇ／Ｌ、湿重量の０．８ｇ／Ｌに相当する。

第１の発酵槽１０の液中の酸素濃度、すなわち溶存酸素濃度は、１０〜３００ｐｐｂが好ましく、２０〜１５０ｐｐｂがより好ましい。該溶存酸素濃度が上記範囲の下限値以上であると化成品の生産速度の低下を抑制でき、上記範囲の上限値以下であると収率の低下を抑制できる点で好ましい。
第１の発酵槽１０の液中の原料化合物の濃度（Ｘ）は、５〜５００ｇ／Ｌが好ましく、１０〜２００ｇ／Ｌがより好ましい。該原料化合物の濃度が上記範囲の下限値以上であると化成品の生産効率の低下（菌体の原料化合物消費速度の低下）を抑制しやすい点で、また得られる化成品の濃度を高くしやすい点で好ましい。該原料化合物の濃度が上限値以下あると、生菌の菌体密度を高く維持しやすい点で、また発酵槽内を均一に撹拌しやすい点で好ましい。
第１の発酵槽１０内での平均滞留時間は、０．１〜１２０時間が好ましく、１〜６０時間がより好ましい。
第１の発酵槽１０の液中の目的の化成品の濃度は、５〜２００ｇ／Ｌが好ましく、１０〜１５０ｇ／Ｌがより好ましい。該目的の化成品の濃度が上記範囲の下限値以上であると化成品の精製コストを抑制しやすく、上限値以下あると化成品の生産効率の低下を抑制しやすい点で好ましい。
第１の発酵槽１０における圧力（気相部の圧力であって、大気圧との差圧）は、特に制限はないが、常圧（大気圧）以上、１００ｋＰａ以下が好ましい。

［第２の発酵工程］
本発明にかかる化成品の製造方法において、第２の発酵工程では、第１の発酵液を取り出し第２の発酵液とし、第２の発酵液に原料化合物を供給せず酸素を供給して発酵を行い、該第２の発酵液における原料化合物の濃度を、前記第１の発酵液における原料化合物の濃度（Ｘ）よりも低い濃度（Ｙ）とする。
本実施形態において、第１の発酵槽１０から排出された第２の発酵液は、第１の発酵部側配管２１を経て第２の発酵槽２０に連続的にまたは断続的に供給され、第２の発酵槽２０で一定時間滞留した後、分離部側配管２２を経て、分離部３の循環路３１を流れる液に合流される。
第２の発酵槽２０内の液温を所定の発酵温度に制御し、酸素供給手段６により、酸素を含む気体を該液中に連続的に供給することにより、該液中で発酵が進行し、原料化合物および酸素が消費されて化成品（目的とする化成品および副生成した化成品）が生成される。第２の発酵槽２０内の液は、酸素供給手段６によって気体が連続的に供給されることによる撹拌作用でほぼ均一になっている。

第２の発酵液が第１の発酵部側配管２１を通過する間、液中の菌体の生存が維持されるように、必要に応じて第１の発酵部側配管２１内の液に対して酸素を含む気体を供給する。また本実施形態では、第１の発酵部側配管２１内の液温が所定の発酵温度に保持されるようになっている。したがって、第１の発酵部側配管２１内でも発酵が継続され、原料化合物および酸素が消費されて化成品が生成される。

第２の発酵槽２０から排出される発酵液が分離部側配管２２を通過する間、液中の菌体の生存が維持されるように、必要に応じて分離部側配管２２内の液に対して酸素を含む気体を供給する。また本実施形態では、分離部側配管２２内の液温が所定の発酵温度に保持されるようになっている。したがって、第２の発酵槽２０から排出される発酵液中に原料化合物が残存している場合は、分離部側配管２２内でも発酵が継続し、発酵液に含まれていた原料化合物、および酸素が消費されて化成品が生成される。

本実施形態において、第１の発酵槽１０から排出された第２の発酵液は、第１の発酵部側配管２１、第２の発酵槽２０、および分離部側配管２２を通過する間に、第２の発酵液中に含まれていた原料化合物が消費される。したがって、第２の発酵部２で得られる第２の発酵液、すなわち分離部３の循環路３１に導入される直前（図中符号Ｂで示す場所。以下Ｂ点という。）の第２の発酵液中の原料化合物の濃度は、第１の発酵槽１０から排出された第２の発酵液よりも低減されている。
本発明において、濃度（Ｙ）は、第２の発酵部２から取り出されて第３の発酵液として分離部３に供給される液における原料化合物の濃度である。
本実施形態において、第２の発酵槽２０内の液は、酸素供給手段６によって気体が連続的に供給されることによる撹拌作用でほぼ均一になっている。また、Ｂ点の第２の発酵液には、生成された化成品および原料化合物が第２の発酵槽２０内における濃度とほぼ同じ濃度で含まれる。すなわち本実施形態において、第２の発酵槽２０内の第２の発酵液の原料化合物の濃度とＢ点における第２の発酵液の原料化合物の濃度は同じであり、濃度（Ｙ）である。
そして、第２の発酵部２における平均滞留時間、すなわち第１の発酵槽１０から排出された直後から、分離部３の循環路３１に導入される直前までの平均滞留時間を制御することにより、第２の発酵液の原料化合物の濃度（Ｙ）を所望する程度に低減することができる。
該第２の発酵部２における平均滞留時間は、第１の発酵部側配管２１における通過時間と、第２の発酵槽２０における平均滞留時間と、分離部側配管２２における通過時間の合計である。
好ましくは、第１の発酵部側配管２１および分離部側配管２２における流量をそれぞれ所定の値で一定とし、第２の発酵槽２０における平均滞留時間を調整することによって、第２の発酵液の原料化合物の濃度（Ｙ）を制御する方法が、操作が複雑化しにくい点で好ましい。

本実施形態において、Ｂ点における第２の発酵液中の原料化合物の濃度（すなわち、濃度Ｙ）は、第１の発酵液における前記原料化合物の濃度（Ｘ）、すなわち第１の発酵槽１０から第１の発酵槽側配管２１に排出された直後のＡ点における第２の発酵液中の原料化合物の濃度（すなわち、濃度Ｘ）に対して８０％以下が好ましく、５０％以下がより好ましい。
Ｂ点における原料化合物の濃度（Ｙ）は、１０ｇ／Ｌ以下が好ましく、８ｇ／Ｌ以下がより好ましく、５ｇ／Ｌ以下がさらに好ましく、２ｇ／Ｌ以下が特に好ましく、化成品の精製負荷の観点から理想的にはゼロである。
Ｂ点における第２の発酵液中の原料化合物の濃度が上記範囲の上限値以下であると、分離部３の分離ユニット３０に導入される直前（図中符号Ｃで示す場所。以下Ｃ点という。）の第３の発酵液における原料化合物の濃度を充分に低くすることができる。これにより分離部３の分離液中に含まれる原料化合物の量を良好に低減することができる。

本実施形態において好気性の発酵（酸素を必要とする発酵）が行われる場合に、第１の発酵液における濃度の原料化合物を消費する時間より、第１の発酵液における濃度の酸素を消費する時間の方が短い傾向にある。このため第２の発酵部を設けて、原料化合物を供給せずに酸素を供給することにより、発酵を進行させ原料化合物の消費を進行させる。このような方法により原料化合物の利用効率が高くなり、目的とする化成品の収率も向上する。また同時に、得られた化成品の粗液（分離液）中の原料化合物の濃度を下げることができ、化成品の精製負荷を軽減することができる。

第２の発酵槽２０内の液中の酸素濃度、すなわち溶存酸素濃度は、事前の発酵試験により好適な範囲を求める。第２の発酵槽２０内の液中の溶存酸素濃度の下限は、第２の発酵槽２０内の発酵速度が極端に遅くならないように設定される。一方の上限は、基本的には飽和酸素濃度としてもよい。原料化合物を消費し、分離部３における原料化合物の濃度を下げるためである。ただし目的とする化成品の生産効率も考慮すると、第２の発酵槽２０内の液中の溶存酸素濃度は、第１の発酵槽１０内の液の溶存酸素濃度と同じ範囲であることが好ましい。第１の発酵部側配管２１内の液中、および分離部側配管２２内の液中の溶存酸素濃度は、第２の発酵槽２０内の液中の溶存酸素濃度と同じ範囲であることが好ましい。
第２の発酵部における平均滞留時間（平均体積流速の逆数と同じ意味を有する）は、第２の発酵液に含まれる原料化合物の濃度を所定濃度以下に下げるように設定される。平均滞留時間が短すぎると原料化合物の濃度が下がりにくくなる。また平均滞留時間が極端に長すぎると装置が大型化しやすく好ましくない。
第２の発酵部２における温度は、第１の発酵槽１０における温度と同じか、多少高いことが好ましい。ただし温度の条件は菌体により異なる。
以上のような条件を考慮して、それぞれの値を設定することにより、原料化合物の濃度を下げ、目的とする化成品の生産速度を速くすることができる。特に単位時間当たり、発酵槽の単位体積当たりの原料化合物の消費速度を速くすることが好ましい。ただし個々の制御要素（酸素の供給速度、温度、ｐＨおよび第１の発酵槽からの発酵液の送り出しの速度等）は、互いに干渉し合うので、最終的には当該発酵槽における最適値は実際の運転により適宜調整されるべきものである。

第２の発酵槽２０の液中の溶存酸素濃度は、１０〜６０００ｐｐｂが好ましく、２０〜５００ｐｐｂがより好ましい。該溶存酸素濃度が上記範囲の下限値以上であると、原料化合物の消費速度の低下を抑制できる点で好ましい。該溶存酸素濃度の上限は、目的とする化成品の収率を向上させる観点からは５００ｐｐｂ以下がより好ましく、２００ｐｐｂ以下がさらに好ましい。配管２１、２２の液中の溶存酸素濃度についても第２の発酵槽２０の液中の酸素濃度と同様である。
第２の発酵部２における平均滞留時間は、５分〜２０時間が好ましく、２０分〜５時間がより好ましい。第２の発酵部２における平均滞留時間は、第１の発酵槽１０における平均滞留時間を１とした場合に、０．００１〜１が好ましく、０．０１〜０．８がより好ましい。

［分離工程］
分離部３において、分離ユニット３０で分離されなかった非分離液は、循環路３１を通って再び分離ユニット３０に導入されるようになっており、第２の発酵部２で得られた第２の発酵液は、該循環路３１を流れる非分離液と合流した後、分離ユニット３０に供給される。
かかる循環路３１を設けることにより、分離ユニット３０に供給される液の流量を、第２の発酵部２の分離部側配管２２における流量よりも大きくすることができ、これによって第２の発酵部２の分離部側配管２２における流速を変化させずに、分離ユニット３０に供給される液の線速度を大きくすることができる。特に分離ユニット３０として膜分離装置を採用した場合に、分離膜の表面を流れる液の線速度を大きくすることによって、分離膜の目詰まりを起きにくくすることができる。

循環路３１を流れる液中の菌体の生存が維持されるように、酸素供給手段６により、循環路３１内の液に対して酸素を含む気体を供給する（循環路３１内の液に対して酸素を含む気体を供給する配管は、図示を省略している）。酸素供給手段６の設置位置および数は適宜変更可能である。
また本実施形態では、循環路３１内の液温が所定の温度に保持されるようになっている。したがって、Ｂ点における第２の発酵液中に原料化合物が残存している場合は、分離部側の配管２２と循環路３１との合流位置から分離ユニット３０に導入される直前までの流路内においても発酵は継続されるが、循環路３１内の流量が大きいため、該流路内での通過時間は短く、ここでの発酵は無視できる程度に小さい。

本実施形態において、Ｃ点における第３の発酵液中の原料化合物の濃度は、８ｇ／Ｌ以下が好ましく、５ｇ／Ｌ以下がより好ましく、理想的にはゼロである。
Ｃ点における第３の発酵液は、Ｂ点における第２の発酵液と循環路３１内を流れる非分離液の混合液である。したがって該Ｃ点における第３の発酵液中の原料化合物の濃度は、Ｂ点における第２の発酵液中の原料化合物の濃度、および循環路３１内を流れる非分離液と合流した際の希釈倍率（該非分離液の流量とＢ点における第２の発酵液の流量によって決まる）によって制御できる。

分離ユニット３０では、化成品を含みかつ菌体を含まない分離液と、残存する原料化合物と菌体とを含む非分離液が得られる。分離液は、排出管５１を経て取り出される。排出管５１から排出される分離液（図中符号Ｄで示す場所。以下Ｄ点という。）における、原料化合物の濃度は、１０ｇ／Ｌ以下が好ましく、８ｇ／Ｌ以下がより好ましく、５ｇ／Ｌ以下がさらに好ましく、２ｇ／Ｌ以下が特に好ましく、理想的にはゼロである。目的とする化成品の濃度は、１０〜２００ｇ／Ｌが好ましく、５０〜１５０ｇ／Ｌがより好ましい。
また収率は、４０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましい。

分離ユニット３０内の液中の酸素濃度、すなわち溶存酸素濃度は、事前の発酵試験により好適な範囲を求める。分離ユニット３０内の液中の溶存酸素濃度の下限は、菌体の生菌率が極端に低下しないように設定される。一方の上限は、基本的には飽和酸素濃度としてもよい。
分離ユニット３０における分離液と非分離液の比は、分離ユニットの性能による。特に分離ユニット３０として膜分離装置を採用した場合には、膜表面における線速度を一定範囲に保つことが、目詰まりを抑制する観点から好ましい。膜表面における線速度は、１）第２の発酵部２から受け入れる液の体積流速、２）分離液として排出される液の体積流速、３）循環路３１における液の体積流速、および、４）戻り送液部に送り出される液の体積流速のバランスで決定される。一般的にはＢ点における体積流速よりもＣ点における体積流速はある程度大きく設定される。

分離ユニット３０内の液中の溶存酸素濃度は、１０〜６０００ｐｐｂが好ましく、２０〜５００ｐｐｂがより好ましい。
分離ユニットとして膜分離装置を用いた場合には、その膜表面における線速度は、０．１〜３ｍ／ｓが好ましく、０．３〜２ｍ／ｓがより好ましい。

［戻り送液工程］
分離部３の循環路３１を流れる液の一部は、戻り送液部４の配管４１を経て、第１の発酵槽１０に連続的にまたは断続的に供給される。
戻り送液工程を設けることにより連続発酵が可能となる。すなわち第１の発酵部に原料化合物を供給し、この原料化合物が発酵により目的の化成品に転換され、分離部で目的の化成品を得るという一連の流れが連続的に行えるようになる。本発明の化成品の製造方法は、バッチ式の発酵を行う場合にも効果的に適用可能である。しかし本発明の化成品の製造方法は、連続発酵を行う場合であっても安定して原料化合物の利用効率を高めることができ、非常に効果的である。
配管４１内を流れる液中の菌体の生存が維持されるように、必要に応じて酸素を含む気体を供給する。
本実施形態において、第１の発酵槽１０に導入される直前（図中符号Ｅで示す場所。以下Ｅ点という。）における液中の菌体の濃度は、Ａ点における発酵液中の菌体濃度の８０％以上であることが好ましく、９０％以上がより好ましい。

配管４１内の液中の酸素濃度、すなわち溶存酸素濃度は、分離ユニット３０内の液中の溶存酸素濃度と同様である。
また配管４１内の体積流速は、分離ユニット３０における液の体積流速のバランスから定められる。
配管４１内の液中の溶存酸素濃度は、１０〜６０００ｐｐｂが好ましく、２０〜５００ｐｐｂがより好ましい。
本実施形態においては、図２に示す排出管４３を経由して、非分離液の一部を排出してもよい。この排出を行うことで、菌体の一部が製造装置から排出される。第１の発酵部で減少する菌体については、菌体供給手段８により補充される。この操作により、発酵に用いられる菌体は、一定時間（平均滞留時間）が経過した時点で抜き出されることになる。菌体供給手段８から供給される菌体の量と排出管４３から排出される菌体の量とを等しくすれば、第１の発酵部または第２の発酵部で菌体があまり増殖しないと仮定すれば、第１の発酵部と第２の発酵部との双方に存在する菌体の量の合計は、ほぼ一定に保たれることになる。なお菌体の平均滞留時間は、第１の発酵部、第２の発酵部、分離部および戻り送液部の合計の総容量（実際に運転される際の液量）から算出される総菌体量を、単位時間当たりで実際に排出された菌体量で除することで算出できる。菌体の平均滞留時間は、１００〜２０００時間が好ましく、２００〜８００時間がより好ましい。

本実施形態によれば、第１の発酵槽１０から排出される第２の発酵液が分離ユニット３０に到達するまでの間、酸素を供給して菌体の生存を維持しつつ、原料化合物を供給せずに液温を発酵温度に保持することにより、該第２の発酵液中の原料化合物を消費することができる。
これにより、分離ユニット３０に供給されるＣ点における液は、Ａ点における液よりも原料化合物の濃度が低減され、分離ユニット３０の分離液中に含まれる原料化合物の量が低減される。
したがって、第１の発酵槽で供給された原料化合物の利用効率を向上させることができる。また透過液を精製する際に除去すべき原料化合物の量が低減されるため、精製工程の負担が軽減する。

以下、実験例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の記載によっては限定されない。本実施例において、含有量の単位「％」は、特に断りのない限り「質量％」を意味する。
［菌体］
国際公開番号ＷＯ２０１２／１１４９７９の明細書に記載された実施例中の方法にて、乳酸発酵能を有する分裂酵母を作製した。すなわちピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（ＰＤＣ２）を欠失し、ヒト由来のＬ乳酸脱水素酵素遺伝子（Ｌ−ＬＤＨ）が染色体に組み込まれた分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベの形質転換体（ＡＳＰ３０５４株）を得た。このＡＳＰ３０５４株を菌体として、以下の試験に使用した。
［培養液］
菌体を、ＹＥＳ培地（０．５％のＤｉｆｃｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、３０ｇ／Ｌのグルコース、および、２０倍濃縮サプリメントの５０ｍＬ／Ｌを含み、ｐＨが４．５に調整された培地）の１５０ｍＬに植菌し培養を行った。続いて、小松川化工機社製３Ｌガラスベッセル培養装置を用いて、１／１０量となるように植菌し培養（ｐＨを３．９、および、溶存酸素濃度（以下、「ＤＯ」と省略。）を２ｐｐｍに制御した。）を行った。なお、培地は半合成培地（２０ｇ／ＬのＹｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１５ｇ／Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２２ｇ／Ｌのグルコース、８ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、５．３４ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０４ｇ／ＬのＮａ_２ＨＰＯ_４、０．２ｇ／ＬのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、微量金属、および、微量ビタミン含み、ｐＨを４．５に調整した培地）を用い、徐々に追加していく追加用培地としては（５０ｇ／ＬのＹｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、５００ｇ／Ｌのグルコース、９ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、４．４５ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、３．５ｇ／ＬのＫ_２ＳＯ_４、０．１４ｇ／ＬのＮａ_２ＳＯ_４、０．０４ｇ／ＬのＮａ_２ＨＰＯ_４、０．２ｇ／ＬのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、微量金属、および、微量ビタミン含み、ｐＨを４．５に調整した培地）を用いた。最終的に菌体濃度ＯＤ６６０が１８０（酵母乾燥重量換算で３６ｇ／Ｌ）の酵母含有液（培養液）を得た。

［原料含有液］
８７．４ｇ／Ｌのグルコース、０．５％のＤｉｆｃｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、２．２ｇ／ＬのＮａ_２ＨＰＯ_４、１．０５ｇ／ＬのＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．０１５ｇ／ＬのＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、１．０ｇ／ＬのＫＣｌ、０．０４ｇ／ＬのＮａ_２ＳＯ_４、３．０ｇ／Ｌのフタル酸水素カリウム、微量金属成分、ビタミン、およびビオチンを含む液を用意し、原料含有液とした。

［製造装置］
図１に示す装置に準じて製造装置を準備した。小松川化工機社製１Ｌガラスベッセル培養装置を２基用意し、第１の発酵槽１０および第２の発酵槽２０とした。なおそれぞれの発酵槽には気体（空気）を供給するために、上部から管を、その端部が底面付近となるように挿入した。すなわち気体の供給は発酵槽底部から液中に行うようにした。空気の供給にはエアコンプレッサーで加圧した圧縮空気をフィルターでろ過して用いた。また発酵槽には、槽内を撹拌するための撹拌翼を備えている。送液用のポンプ（２１ａ、２２ａ、３１ａ、および、７１ａ）としては、カセットチューブポンプ（東京理科社製、ＳＭＰ−２１）を用いた。分離ユニット３０としては、膜分離装置（平均孔径：０．２μｍ、ポリスルホン製中空糸膜、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、Ｘａｍｐｌｅｒ ＣＦＰ−２−Ｅ−３ＭＡ、膜面積は１１０ｃｍ^２。）を用いた。ＤＯの測定にはメトラートレド社製のＩｎＰｒｏ６９００を用いた。グルコース、乳酸、および、エタノールの測定には、王子計測機器社製の酵素電極法バイオセンサＢＦ−５及びＢＦ−７を用いた。これらを用いて図１に示す化成品の製造装置を用意した。

（実施例１）
以下の条件でグルコースを原料化合物とし、目的とする化成品である乳酸を製造した。
第１の発酵槽１０の液量が５００ｍＬ、および第２の発酵槽の液量が４００ｍＬとなるように培養液をそれぞれの槽に入れた。ただし第２の発酵槽の液量としては、前後の接続用チューブの容量を含む。原料含有液の第１の発酵槽１０への供給速度（ポンプ７１ａの送液速度）、および、分離ユニット３０からの分離液の排出の送液速度を、それぞれ３３ｍＬ／時とした。第１の発酵槽１０から第２の発酵槽２０への送液速度（ポンプ２１ａの送液速度）、および、第２の発酵槽２０から分離ユニット３０への送液速度（ポンプ２２ａの送液速度）を、それぞれ１００ｍＬ／時とした。すなわち第１の発酵槽１０における平均滞留時間は、５時間、および第２の発酵槽２０における平均滞留時間は、４時間とした。また分離ユニット３０の入り口における送液速度（ポンプ３１ａの送液速度）は、３００ｍＬ／分とした。これにより膜の一次側（菌体が存在する側）の膜表面における線速度は、０．５ｍ／秒とした。また透過流束は、３Ｌ／ｍ^２／Ｈｒであった。

第１の発酵槽１０および第２の発酵槽２０の槽内の温度は、２８℃に調節した。また第１の発酵槽１０および第２の発酵槽２０の槽内の圧力は、ほぼ常圧とした。第１の発酵槽１０への空気（酸素濃度２１体積％、以下同様。）の供給量は、０．２５Ｌ／分、および第２の発酵槽２０への空気の供給量は、０．２Ｌ／分とした。撹拌翼の回転数を調節し、第１の発酵槽１０の槽内および第２の発酵槽２０における液中のＤＯ（すなわち、第１の発酵液の溶存酸素濃度および第２の発酵槽の溶存酸素濃度）を７０〜１００ｐｐｂ（設定目標は８０ｐｐｂ）とした。ＤＯの振れは、原料含有液の供給が断続的であるために、グルコースの消費速度が必ずしも一定にならないためと考えられる。第１の発酵槽１０の槽内のグルコース濃度は、発酵開始（液の循環を開始した時点をゼロとする。）１００時間後にはほぼ一定となった。またこの時点での第１の発酵槽１０の槽内および第２の発酵槽２０の槽内における菌体濃度ＯＤ６６０は、１８０であった。この条件で１０００時間の連続運転を行った。第１の発酵槽１０の槽内における菌体濃度ＯＤ６６０が１８０程度に維持されるように、必要に応じて培養液を第１の発酵槽１０に供給した。また同時に総液量を一定とするように分離ユニット３０から第１の発酵槽への送液の一部を分岐し排出した。
１０００時間後における、第１の発酵液（第１の発酵槽１０内の液）中のグルコースおよび乳酸の濃度；第２の発酵液（第２の発酵槽２０内の液）中のグルコースおよび乳酸の濃度；ならびに、分離液（Ｄ点における液）中の、グルコース、乳酸、およびエタノールの濃度、ならびに分離液中での乳酸の収率を表１に示す。なお、また同じタイミングにおける発酵槽１０の槽内の発酵液をサンプリングし生菌率を求めた。その結果を表１に示す。ただし生菌率の測定は以下の方法により行った。なお、Ｃ点における第３の発酵液中のそれぞれの原料化合物の濃度の測定値については、表１に示されていないが、本実施例に用いた装置においては、分離液（Ｄ点における液）中の、グルコース、乳酸、およびエタノールの濃度と同等の値を示す。
発酵液を１０μＬサンプリングし、遠心分離（３３００Ｇ、１０分）を行った。上澄みを除去した後の沈殿に、トリパンブルー染色液（ＴＲＹＰＡＮ ＢＬＵＥ ０．４％ ＳＯＬＵＴＩＯＮ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）の１０μＬを添加した。顕微鏡観察を行い、全数３００個程度について染色の有無を確認した。判定は、白色の菌体を生菌、青色の菌体を死菌とした。

（実施例２）
第１の発酵槽１０における液量を６００ｍＬとし、平均滞留時間を６時間とし、第１の発酵槽１０への空気の供給量を０．３Ｌ／分とし、第２の発酵槽２０における液量を３００ｍＬとし、平均滞留時間を３時間とし、第２の発酵槽２０への空気の供給量は０．１５Ｌ／分とした以外は、実施例１と同様にして乳酸を製造した。その結果を表１に示す。

（実施例３）
第２の発酵槽における空気の供給量を１Ｌ／分とし、第２の発酵槽２０における液中のＤＯを４０００ｐｐｂとした以外は、実施例１と同様にして乳酸を製造した。その結果を表１に示す。

（比較例１）
第２の発酵槽２０および気体供給ライン６２、６３、６４を設けず、第１の発酵槽と分離ユニット３０の循環ラインをポンプ２１ａを介して接続した以外は、実施例１と同様にして乳酸を製造した。その結果を表１に示す。

（比較例２）
第２の発酵槽２０における空気の供給の代りに窒素ガスを０．２Ｌ／分で供給した以外は、実施例１と同様にして乳酸を製造した。その結果を表１に示す。

表１の結果に示されるように、第２の発酵槽２０に空気を供給して発酵を行うことによって、分離ユニット３０の透過液中に含まれる原料化合物の量を良好に低減させることができた。

本発明によれば、発酵液を分離して化成品を含む分離液を得る際に、該分離液中に含まれる原料化合物の量を低減することができ、これにより、原料化合物の利用効率を向上させることができ、また分離液を精製する際に除去すべき原料化合物の量が低減されるため、精製工程の負担が軽減することができ、発酵により原料化合物から化成品を製造する方法において有用である。
なお、２０１３年３月２８日に出願された日本特許出願２０１３−０７０３２３号の明細書、特許請求の範囲、図面および要約書の全内容をここに引用し、本発明の開示として取り入れるものである。

１ 第１の発酵部
２ 第２の発酵部
３ 分離部
４ 戻り送液部
６ 酸素供給手段
７ 原料供給手段
８ 菌体供給手段
１０ 第１の発酵槽
２０ 第２の発酵槽
２１ 第１の発酵部側の配管
２１ａ ポンプ
２２ 分離部側の配管
２２ａ ポンプ
３０ 分離ユニット
３１ 循環路
３１ａ ポンプ
３２ バッファータンク
４１、４２ 配管
４３ 排出管
５１ 排出管
６０ 気体貯蔵槽
６１、６２、６３、６４、６５ 気体供給ライン
７０ 原料槽
７１ 原料含有液供給ライン
７１ａ ポンプ
８０ 培養槽
８１ 培養液供給ライン
８１ａ ポンプ

Claims (8)

1. 菌体を含む液に原料化合物および酸素を供給して発酵を行い、発酵により生成された化成品を含む第１の発酵液を得る第１の発酵工程と、
   前記第１の発酵液を取り出し第２の発酵液とし、該第２の発酵液に原料化合物を供給せず酸素を供給して発酵を行い、該第２の発酵液における原料化合物の濃度を、前記第１の発酵液における原料化合物の濃度（Ｘ）よりも低い濃度（Ｙ）とする第２の発酵工程と、
   前記原料化合物の濃度が前記濃度（Ｙ）である第２の発酵液を取り出し第３の発酵液とし、該第３の発酵液を、前記化成品を含みかつ菌体を含まない分離液と菌体を含む非分離液とに分離し、前記化成品を含む分離液を得る分離工程とを有することを特徴とする化成品の製造方法。
2. 前記分離工程で得られる、菌体を含む非分離液を第１の発酵工程に供給する戻り送液工程をさらに有する、請求項１に記載の化成品の製造方法。
3. 前記第１の発酵液における前記原料化合物の濃度（Ｘ）が５〜５００ｇ／Ｌであり、かつ前記第２の発酵液における前記原料化合物の濃度（Ｙ）が前記濃度（Ｘ）の８０％以下である、請求項１または２に記載の化成品の製造方法。
4. 前記第１の発酵液の溶存酸素濃度が１０〜３００ｐｐｂであり、かつ前記第２の発酵液の溶存酸素濃度が１０〜６０００ｐｐｂである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化成品の製造方法。
5. 菌体を含む液に原料化合物を供給する手段、および該菌体を含む液に酸素を供給する手段を有し、発酵により生成された化成品を含む第１の発酵液を得る第１の発酵部と；
   分離ユニットを有し、分離により前記化成品を含みかつ菌体を含まない分離液と前記菌体を含む非分離液を得る分離部と；
   前記第１の発酵部と前記分離部との間に設けられ、
   前記第１の発酵液を前記第１の発酵部から取り出し第２の発酵液とし、該第２の発酵液を前記分離部へ送液する流路と、前記第２の発酵液に酸素を供給する手段とを有し、前記第２の発酵液に前記原料化合物を供給せずに発酵を行い、該第２の発酵液における原料化合物の濃度を、前記第１の発酵液における原料化合物の濃度（Ｘ）よりも低い濃度（Ｙ）とする第２の発酵部と；を備えていることを特徴とする化成品の製造装置。
6. 前記第１の発酵部が第１の発酵槽を備え、前記第２の発酵部が第２の発酵槽を備える、請求項５に記載の化成品の製造装置。
7. 前記分離部が、分離ユニットと、該分離ユニットの非分離液を再び分離ユニットに供給する循環路を備える、請求項５または６に記載の化成品の製造装置。
8. 前記分離部から前記第１の発酵部へ、前記菌体を含む非分離液を送液する流路を有する戻り送液部をさらに備える、請求項５〜７のいずれか一項に記載の化成品の製造装置。

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