TWI432572B

TWI432572B - 多槽式細胞回流連續生產乙醇之方法

Info

Publication number: TWI432572B
Application number: TW100138062A
Authority: TW
Inventors: feng sheng Wang; Wen Chien Lee; Chung Chih Li
Original assignee: Nat Univ Chung Cheng
Priority date: 2011-10-20
Filing date: 2011-10-20
Publication date: 2014-04-01
Also published as: JP5661673B2; TW201317344A; JP2013085552A

Description

多槽式細胞回流連續生產乙醇之方法

本發明係關於一種生產乙醇的方法，特別是關於一種以多槽式細胞回流提高連續生產乙醇效率的方法。

生質酒精，也可叫做生物乙醇，就是利用微生物醱酵把生質(biomass)中的醣分轉化所得到的乙醇。生質為來自生物體而非石化有機物，一般指的是植物藉由光合作用產生的含碳化合物。

近年來，由於全球石油需求劇增，加上國際政治處於不穩定的狀態，使得油價居高不下。以我國能源需求情況，乃大量仰賴石油進口，在經濟上導致工業的製造成本與消費物價大幅上揚，造成民生不穩定，這現象其實已間接影響國家的安全。又世界各國在追求經濟繁榮之過程中，大量使用各種資源同時也汙染環境，造成全球氣候暖化問題日益嚴重。各國為減少溫室氣體排放，無不積極開發各種潔淨能源技術，譬如，生質能、風能、太陽能、氫能與燃料電池，整合性煤氣化複循環電廠(IGCC)等。在此情勢下使得生質能源之市場動能急遽升高，漸有與石油相抗衡之趨勢。生質能源開發具有能源自主、農業發展、環境保護與經濟成長等綜效。我國能源98%以上依賴進口，在國際油、氣市場供應日益吃緊情況下，開發自有能源實特具意義，並可提供農業發展新契機。能源作物在生長過程中可以吸收二氧化碳等溫室氣體，對於環境改善頗有助益。且生質能源產業一旦達到規模經濟之後，對於就業、所得和產出等效果將有鉅大貢獻。因此，我國無論從能源、環境和經濟等層面考量，生質能源是值得大力推動的項目。

早在1970年代石油危機時，巴西、美國就積極投入生質酒精工業的發展，近年來在CO₂ 超量排放、全球氣候暖化、國際原油供需不穩定和價格持續上漲等因素影響下，有越來越多的國家投入。2006年全球的生質酒精產量約4千萬公秉，90%生產於巴西和美國。巴西以甘蔗為原料，美國則以玉米為主生產生質酒精，甘蔗和玉米分別是糖質和澱粉質作物。國內的經濟部已指示國營事業帶頭籌設生質酒精工廠，以甘蔗、甜高粱等為原料生產生質酒精。

生質酒精是一種大宗化學物資，必須大量生產才能符合成本，因此醱酵程序的改善是極為重要的研究主題。生質酒精的醱酵方法常使用批次醱酵、饋料批式與連續式醱酵。批次醱酵較常用在醱酵時間長、產量小或應用於固態醱酵程序上。但是高糖濃度之下醱酵卻會產生基質抑制作用，造成醱酵時間過長大大降低乙醇生產速率。為了改善基質(例如葡萄糖)抑制可以採用饋料批式醱酵，但還是會有乙醇抑制問題，利用連續醱酵是可以降低這些抑制作用並提高產率。連續醱酵可以提升產率，但是醱酵時的稀釋速率(dilution rate)不能大於菌體的生長速率，否則會造成菌體溢流洗出現象。

較早的專利(美國專利號US4443544)利用薄膜過濾的方式將Zymomonas mobilis 醱酵液中的菌體與產物分離，回流到醱酵槽進行連續醱酵，此舉雖然可提高槽內菌體濃度，但使用薄膜過濾方式回收菌體回流使用成本較高，並不經濟。

美國專利(US 4567145)即以單一醱酵槽配備沉降式的細胞回流裝置來醱酵葡萄糖得到乙醇，所用之凝聚性酵母菌為呼吸代謝缺陷之Saccharomyces uvarum 變異株(來自Saccharomyces uvarum 26602)，實施例顯示在葡萄糖進料濃度135 g/L，稀釋速率0.129 h^-1 之下連續醱酵，得到的乙醇產率(ethanol productivity)為6.7 g L^-1 h^-1 ，若要提高乙醇產率，稀釋速率需再上升。

最近提出之日本專利(WO 2008120644)，也是利用單一醱酵槽配備沉降式的細胞回流裝置來醱酵高濃度的葡萄糖得到乙醇，所用的凝聚性酵母菌為Saccharomyces cerevisae AM12，進料葡萄糖濃度是200g/L，稀釋速率(D)在0.2≦D≦0.3之間操作，乙醇產率可達15 g L^-1 h^-1 以上。

由於乙醇醱酵因原料來源不同，可醱酵糖不見得是葡萄糖，而且糖類濃度並非都可以控制在高濃度，若以蔗汁為原料製造生質乙醇，蔗汁中的糖類主要是蔗糖，濃度約80 g/L，欲濃縮至高濃度再醱酵不符合經濟效益。近來雖有論文提出利用凝絮性酵母菌作為醱酵菌株，做單一醱酵槽連續式菌體回流醱酵程序之研究，該篇論文是以模擬初榨蔗汁做為營養基質進料，稀釋速率為0.24 h^-1 ，乙醇產率達9.14 g L^-1 h^-1 。說明將進料換成蔗汁後，與前述以葡萄糖進料的醱酵方法比較，利用蔗汁進料的醱酵乙醇產率大幅降低。

故若能研發出不受醱酵原料限制之醱酵方法，亦即可將蔗汁轉化為乙醇且提升轉化效率、產率之醱酵方法，無論從能源、環境和經濟等層面來看，皆為一大益處。

為解決前述問題，本發明之目的在於提供一種生產乙醇的方法，特別是關於一種以多槽式細胞回流提高連續生產乙醇效率的方法。

為達成前述目的，本發明提供一種多槽式細胞回流連續生產乙醇的方法，步驟包含：

(a)　提供一原料，該原料是由糖類、氮源、礦物質及維生素所組成的混合液，該糖類為蔗糖、葡萄糖、果糖或其任一組合，且可用蔗汁作為糖類來源，蔗汁濃度為60g-100g/L之間；

(b)　將該原料以一高稀釋速率進料至一第一醱酵區，其中該第一醱酵區事先接種一凝聚性酵母菌；

(c)　醱酵該原料產生一醱酵液，把該醱酵液和該凝聚性酵母菌從該第一醱酵區溢流至一第一細胞沉降區，並使該凝聚性酵母菌從該第一細胞沉降區回流至該第一醱酵區；以及

(d)　將步驟(c)的該醱酵液作為該原料，利用至少一第二醱酵區與至少一第二細胞沉降區，其中該第二醱酵槽接種該凝聚性酵母菌，重複步驟(b)與步驟(c)至少一次以上，至直到提升該醱酵液中乙醇產率超過每小時13 g/L，

其中步驟(b)之該高稀釋速率為介於0.25~0.48 g/Lh之間。

本發明另提供一種多槽式細胞回流連續生產乙醇之系統，包含一原料槽，儲存一原料，該原料是由糖類、氮源、礦物質及維生素所組成的混合液，且該糖類除了可以是蔗糖、葡萄糖、果糖或其任一組合外，也可用一蔗汁作為糖類來源，蔗汁濃度為60g-100g/L之間；一第一醱酵槽，連通該原料槽，且該原料以一高稀釋速率進料至該第一醱酵槽，並產生一醱酵液，其中該第一醱酵槽接種一凝聚性酵母菌且通有含氧氣體；一第一細胞沉降器，連通該第一醱酵槽，從該第一醱酵槽溢流該醱酵液和該凝聚性酵母菌流至該第一細胞沉降器，且使該凝聚性酵母菌從該第一細胞沉降器回流至該第一醱酵槽；至少一第二醱酵槽，連通該第一細胞沉降器，且從該第一細胞沉降器將該醱酵液進料至該第二醱酵槽，其中該第二醱酵槽接種該凝聚性酵母菌且通有含氧氣體；以及至少一第二細胞沉降器，連通該第二醱酵槽，其中該第一與第二細胞沉降器皆為一直立式容器，從該第二醱酵槽溢流該醱酵液和該凝聚性酵母菌流至該第二細胞沉降器，且使該凝聚性酵母菌從該第二細胞沉降器回流至該第二醱酵槽；其中，其中該高稀釋速度為介於0.25~0.48 g/Lh之間，且該第二細胞沉降器的該醱酵液中乙醇產率超過每小時13 g/L時，則該醱酵液流至一乙醇收集單元。

在本發明多槽式細胞回流連續生產乙醇之系統之一較佳實施例中，該系統進一步包含一連通管連接至該第一醱酵區與該第二醱酵區，其中該連通管具有一開關。

本發明所使用之技術特徵，係充分利用菌體回流與多槽串聯連續操作兩者加乘的優點，故利用本發明生產乙醇之方法可採高稀釋速率進行醱酵，有避免雜菌生長、維持系統穩定等優點。且本發明生產乙醇之方法不受原料限制，可直接利用蔗汁作為糖類原料進行醱酵，與日本專利(WO 2008120644)比較，本發明可以在較高的稀釋速率之下操作，蔗糖濃度在80 g/L時即有18.0 g L^-1 h^-1 的乙醇產率。反之，該日本專利必須使用非常高的葡萄糖濃度，即200 g/L，乙醇產率才能達到15 g L^-1 h^-1 以上。另外，本發明並利用凝聚性酵母菌之特性將菌體留在醱酵槽，維持醱酵槽內的菌體密度，降低乙醇生產成本，提高生產效率。

以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

本發明係以多槽式菌體回流醱酵方式連續生產乙醇，此醱酵包括二組或二組以上的生物反應器(醱酵槽)與菌體沉降循環回流裝置。在一定濃度的糖類(蔗糖、葡萄糖、果糖或三者之任一組合)進料之下，設定0.8~0.9之菌體回流比率(r)及0.25~0.48 gL^-1 h^-1 之稀釋速率(D)進行連續醱酵，經過一段起始期(start-up)之後，醱酵槽菌體濃度達到一穩定值，此時槽內糖類及產物(乙醇)的濃度皆維持不變。

酵母菌生長需要糖類、氮源、維生素及礦物質等的進料，其中在各種維生素中，尤其需要維生素B群，這部份可以從酵母萃取物及消化蛋白質(peptone)提供。

這裡所提的菌體沉降循環回流裝置構造簡單，任何一直立的容器皆可作為細胞沉降的場所，與醱酵槽出口連接，凝聚性酵母菌即迅速凝聚並因重力而下沉，底部的細胞以泵浦送回醱酵槽，上層澄清之醱酵液則移出進入下一醱酵槽或送至乙醇收集單元。

本發明實施例以Saccharomyces diastaticus LORRE-316酵母菌(普渡大學LORRE實驗室提供，寄存編號為BCRC 920074)作為示例，但本發明於實施上並不局限於此種凝聚性酵母菌，任何具凝聚性之乙醇生產酵母菌皆可應用於此。

本發明實施例使用之醱酵方法以二組醱酵槽作為例示，如第一圖。在第一圖的醱酵系統1中，原料自原料槽14經由第一開關181進入第一醱酵槽121，再由第二開關182進入第一細胞沉降器131，在第一細胞沉降器131中，菌體會凝聚並因重力下沉，使第一細胞沉降器131底部富含酵母菌細胞，再由第四開關184回流至第一醱酵槽121，另外第一細胞沉降器131中上層澄清的醱酵液經由第五開關185流入第二醱酵槽122，再由第六開關186進入第二細胞沉降器132，在第二細胞沉降器132中，菌體會凝聚並因重力下沉，使第二細胞沉降器132底部富含酵母菌細胞，再由第七開關187回流至第二醱酵槽122，另外第二細胞沉降器132中上層澄清的醱酵液經由第八開關188流入乙醇收集單元15。

其中第一醱酵槽121與第二醱酵槽122之容量為5L，第一細胞沉降器131及第二細胞沉降器132為圓柱型玻璃管，直徑為4 cm、高42.5 cm。另外，第一醱酵槽121與第二醱酵槽122各自接有一通氣裝置，該通氣裝置包含氣體控制裝置111與氣體過濾裝置112，以對第一醱酵槽121與第二醱酵槽122內通入氣體，該氣體為含氧氣體，可為空氣或氧氣。且第一醱酵槽121與第二醱酵槽122連接一個人電腦17，控制第一醱酵槽121與第二醱酵槽122內之pH值、溫度以及溶氧量，其中pH值為5~6，常用醱酵溫度為30~40℃，通氣量為1 vvm。

為了讓第一醱酵槽121之後的醱酵槽能在起始期有比較高的基質濃度，方便槽內菌體濃度比較快速提高，本發明建議在醱酵初期將醱酵槽與醱酵槽之間的管線(於第一圖中為第三開關181所控制之管線)開啟，但到達穩定之連續操作期，這個連通原則上是關閉狀態。這個使醱酵槽濃度較快達到連續操作期動作，在低濃度的糖類，如80g/L的蔗糖溶液進料時，效果較不明顯，但發明人在另一實施例中(文中未顯示)，在高濃度的糖類，如超過150g/L進料時，可顯著縮短醱酵槽之菌體濃度達連續操作期的時間。

實施例1-1 二醱酵槽分隔之醱酵試驗

本發明實施例之雙槽連續式菌體回流模組的醱酵系統如第一圖所示。以80g/L的蔗糖溶液做為基質進料，醱酵液組成如下表所示。將溫度設為35℃，pH值設為5，以氣體控制裝置111與氣體過濾裝置112通氣的空氣流量為1 vvm，攪拌器16之轉速設為100 rpm進行連續式菌體回流之醱酵。

在菌體回流比r=0.8及稀釋速率D=0.42 h^-1 之下操作，經過8~9小時可達穩定的連續醱酵狀態，而且兩槽之間的直接連通(即第一圖中的第三開關183)是關閉的。此時起第二醱酵槽122內細胞濃度25.8 g/L，出口乙醇濃度37 g/L，殘留蔗糖濃度0.8 g/L，無任何葡萄糖與果糖殘留，乙醇產率為15.5 gL^-1 h^-1 。乙醇產率的定義是：乙醇產率=稀釋率(D)×出口乙醇濃度。從起始期到穩定之連續醱酵，第二醱酵槽122出口之細胞濃度、乙醇濃度、蔗糖濃度、葡萄糖濃度、及果糖濃度等隨時間的變化如第二圖。

實施例1-2 二醱酵槽分隔且提高稀釋速率之醱酵試驗

兩組5L醱酵槽和兩組細胞沉降器串聯之細胞回流醱酵，醱酵液組成及醱酵條件與實施例1-1相同。

在菌體回流比r=0.8及稀釋速率D=0.48 h^-1 之下操作，經過10小時可達穩定的連續醱酵狀態，而且兩槽之間的直接連通(第三開關183)是關閉的。此時起第二醱酵槽122內細胞濃度維持在25-26 g/L，出口乙醇濃度37.5 g/L，殘留蔗糖濃度2.6 g/L，無任何葡萄糖與果糖殘留，乙醇產率為18.0 gL^-1 h^-1 。

實施例1-3 實施例1-2之二醱酵槽連通對照試驗

兩組5L醱酵槽和兩組細胞沉降器串聯之細胞回流醱酵，醱酵液組成及醱酵條件與實施例1-1相同。在菌體回流比r=0.8及稀釋速率D=0.48 h^-1 之下操作，經過10小時可達穩定的連續醱酵狀態，但兩槽之間的直接連通(第三開關183)為開啟。此時起第二醱酵槽122內細胞濃度30 g/L，出口乙醇濃度37 g/L，殘留蔗糖濃度6.7 g/L，無任何葡萄糖與果糖殘留，乙醇產率高達17.8 g L^-1 h^-1 。

實施例2-1 二醱酵槽連通之醱酵試驗

為了讓第一槽之後的醱酵槽能在起始期有比較高的基質濃度，方便槽內菌體濃度比較快速提高，將第一醱酵槽121與第二醱酵槽122之間之直通的第三開關183打開，但到達穩定之連續操作期，這個連通原則上是關閉狀態。

在菌體回流比r=0.8及稀釋速率D=0.36 h^-1 之下操作，經過10小時可達穩定的連續醱酵狀態。此時起第二醱酵槽122內細胞濃度30 g/L，出口乙醇濃度36 g/L，殘留蔗糖濃度1.3 g/L，無任何葡萄糖與果糖殘留，乙醇產率為13.3 gL^-1 h^-1 。

實施例2-2 二醱酵槽連通並提高菌體回流比之醱酵試驗

兩組5L醱酵槽和兩組細胞沉降器串聯之細胞回流醱酵，醱酵液組成及醱酵條件與實施例1-1同。

在菌體回流比r=0.9及稀釋速率D=0.36 h^-1 之下操作，經過10小時可達穩定的連續醱酵狀態，但兩槽之間的直接連通(第三開關183)為開啟。此時起第二醱酵槽122內細胞濃度32.3 g/L，出口乙醇濃度38.3 g/L，殘留蔗糖濃度0.62 g/L，無任何葡萄糖與果糖殘留，乙醇產率為13.8 gL^-1 h^-1 。

實施例3 提高蔗糖濃度之醱酵試驗

兩組5L醱酵槽和兩組細胞沉降器串聯之細胞回流醱酵，醱酵液組成及醱酵條件與實施例1-1相同。但醱酵液組成中的蔗糖濃度改為160 g/L。

在菌體回流比r=0.9及稀釋速率D=0.2 h^-1 之下操作，經過15小時可達穩定的連續醱酵狀態，但兩槽之間直接連通之第三開關183為開啟。此時起第二醱酵槽122內細胞濃度40 g/L，出口乙醇濃度72 g/L，殘留蔗糖濃度0.92 g/L，無任何葡萄糖與果糖殘留，乙醇產率為14.4 gL^-1 h^-1 。

根據上述實施例可知，本發明的多槽式醱酵系統，可降低基質及產物的抑制作用，前面的醱酵槽產物(乙醇)濃度低因此產物抑制作用小，後面的醱酵槽基質(糖類)濃度低基質抑制作用小。而且，本發明之方法不受糖類原料之限制，可直接將蔗汁(濃度約80 g/L)醱酵得到乙醇，並有高的乙醇產率，不需為了得到較高的乙醇產率而預先將糖類原料進一步濃縮。

另外，本發明之方法可以在高稀釋速率之下操作，高稀釋速率有避免雜菌生長、維持系統穩定等優點。而影響連續醱酵製造乙醇效率的因素，除了進料糖類濃度之外，稀釋速率是主要的操作變因，當連續醱酵達穩定狀態(steady state)時，稀釋速率等於醱酵槽內菌體的生長速率，故較低的稀釋速率比較容易達成，進料糖類可完全被消化而無殘留糖存在。

綜合而言，本發明充分利用細胞回流與多槽串聯連續操作兩者優點的加成作用，提出與過去不同的乙醇醱酵程序，使本發明之方法不受糖類原料的限制，亦可於高稀釋速率下操作，達到節省成本、避免雜菌生長以及系統穩定等優點。

1．．．醱酵系統

111．．．氣體控制裝置

112．．．氣體過濾裝置

121．．．第一醱酵槽

122．．．第二醱酵槽

131．．．第一細胞沉降器

132．．．第二細胞沉降器

14．．．原料槽

15．．．乙醇收集單元

16．．．攪拌器

17．．．個人電腦

181．．．第一開關

182．．．第二開關

183．．．第三開關

184．．．第四開關

185．．．第五開關

186．．．第六開關

187．．．第七開關

188．．．第八開關

第一圖係為本發明實施例之醱酵系統架構圖。

第二圖係為醱酵槽第二槽出口之細胞濃度、乙醇濃度、蔗糖濃度、葡萄糖濃度、及果糖濃度等隨時間的變化圖。圖中「生物量」係指Saccharomyces diastaticus LORRE-316酵母菌之重量。