JPS6087783A - 固定化増殖微生物による連続発酵法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化増殖微生物を使用して行なわれる連続発
酵法に関する０さらに詳しくは、少なくとも２個のリア
クタを用いて有用物質を連続発酵法により生産する際、
生産活性の低下した少なくとも１個のリアクタ中の固定
化増殖微生物を再活性化し、連続生産と再活性化処理を
同時に行なう方法に関する。

固定化増殖微生物を用いてアルコール１有機酸、アミノ
酸、抗生物質、ステルイド、酵素蛋白質重水素、メタン
などの有用物質を連続発酵法により連続生産する方法が
研究されている。

この方法は、微生物を天然高分子や合成樹脂などの担体
に固定化した固定化微生物をリアクタに充填し、これに
培地を供給して固定化微生物を増殖させつつ有用物質を
連続的に生産させる方法である。どの方法によるときは
、多量の微生物が固定できると共に連続的な微生物の増
殖と一部の漏洩による適度の新陳代謝が行なわれるため
固定化微生物数の減少を抑制し高い酵素活性を維持する
ことができるので、通常の発酵法に比して物質生産速度
が格段に速く、またいわゆるウォッシュアウトの惧れも
ない。したがって発酵時間を大幅に短縮することができ
、さらにリアクタの小型化、効率化を図ることができる
。

しかし生産が長期間にわたるばあい、培地の栄養分の不
足、生産物による阻害、ｐＨの変化などによって固定化
微生物の死滅速度が増殖速度を上廻り、微生物の数が徐
々に減少して全体の生産活性が低下するという現象が生
ずる。そのような状態になった固定化微生物は、増殖に
適した培地で再度培養すると増殖して生産活性が回復さ
れることが知られている。

しかし、そうした西活性化処理は連続生産を一時中断す
る必要があり、生産効率を低下せしめている。

本発明者らは生産を中断することなく再活性化処理を行
なうことのできる方法を開発するべく鋭意研究を重ねた
結果、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、固定化増殖微生物が充填されている
少なくとも２個のリアクタを連結してなる装置を用いて
連続発酵法により有用物質を生産する際、各リアクタの
固定化微生物の生産活性の低下の度合に応じて、常時少
なくとも１個の生産活性の低下したりアクタの再活性化
を行ないながら連続発酵生産を行なうべくリアクタ相互
の連結状態を変更することを特徴とする固定化増殖微生
物による連続発酵法に関する。

このように本発明においては、生産活性の低下した固定
微生物の再活性化処理と連続発酵生産とが並行して行な
われるので、全体として生産の中断は生じない。また使
用するリアクタの数を増せば、長期間にわたって定常的
に生産物をうろことができる。

本発明の方法はリアクタを並列に連結した反応装置にも
直列に連結した反応装置にも適用できる。またリアクタ
としても完全混合槽型、流動層型、充填塔型など従来の
リアクタをそのまま用いることができ、培地の流通方法
も下降流型、上昇流型のいずれでもよい。リアクタの個
数は通常２〜１０個が適当であるが、リアクタの型や固
定化増殖微生物の種類、供給培地の種類、培地の供給速
度、生産物の種類、反応温度、通気量、攪拌数、培地の
ｐｉｉなどによって適正な数にすればよい。

つぎに本発明の方法を多段直列型および多段並列型の連
続発酵装置に適用するばあいの実施態様を説明するが、
本発明はかかる実施態様のみに限定されるものではない
。

多段直列型の連続発酵は、固定化増殖微生物が充填され
ている少なくとも２個のリアクタを直列に連結してなる
装置を用い、少なくとも先頭のリアクタに生産用培地を
連続的に供給して有用物質を生産する際、所定期間経過
後に最終段のリアクタが先頭のりアクタとなるようにリ
アクタ相互の連結状態を順次変更することによって行な
う。

かかる多段直列型の連続発酵法によるときは、生産活性
の低下した最終段のリアクタが所定期間経過後に順次光
”頭のリアクタとなるため、死減化しつつある固定化微
生物を増殖せしめうるだけでなく、そのリアクタをも連
続生産に供することができるので、再活性化時のりアク
タを遊ばせることなく常時再活性化処理と連続生産を同
時に行なうことができ、有用物質の連続生産を長期間に
亘って安定かつ効率的に行なうことができる。

たとえば屋１〜Ａｎのｎ個のリアクタをＡ１のリアクタ
が先頭となりＡｎのリアクタが最終段となるように直列
に連結された装置を用い、先頭のリアクタに生産用培地
を供給し最終段のリアクタから生産物を取り出すばあい
、最終段のリアクタ（Ａ　ｎ　）中の固定化微生物は高
濃度の生産物にさらされているため徐々に死滅し、その
分有用物質の生産活性が低下する。一方、先頭のりアク
タでは基質をはじめ培地中の栄養源が豊富でありかつ生
産物濃度も低いので、微生物は充分増殖できる環境にあ
る。そこで最終段のリアクタ（Ａ　ｎ　）中の固定化微
生物が弱って死滅し始める時期に、培地の供給をＡＩの
リアクタからＡｎのリアクタに切り換えてＡｎのリアク
タを先頭のリアクタとし、他のリアクタの連結状態も順
次１段ずつずらす、すなわち２段目をＡ１．６段目をＡ
２・・・・・・・最終段をＡ　ｎ−１とする。このリア
クタ相互の連結状態の切り換えにより、死滅しつつあっ
たＡｎのリアクタ中の固定化微生物が再び増殖して生産
活性を取り戻すことができる。この切り換え操作を繰り
返すことにより、連続生産を中断することなく長期間安
定して有用物質を生産することができる。

連結状態の切り換え時期は、段数、用いる微生物の増殖
速度と死滅速度、生産活性、培地中の基質濃度などによ
って異なり、生産時の具体的条件に即して決定すればよ
い。たどえば用いる微生物、段数、培地中の基質濃度が
定まると、生産中の最終段のりアクタ内の固定化微生物
の個数および（または）反応終了液中の生産物の濃度を
検出して所定のレベル以下になると切り換え操作を行な
うようにしてもよいし、また別途同一条件で予備実験を
行ない、その結果がら切り換え時期を設定してもよい。

切り換えは定期的に行なってもよいし、不定期的に行な
ってもよい。

段数、すなわちリアクタの個数は２個以上であればとく
に制限されないが１段数が多くなるほど切り換え操作を
頻繁に行なわなければならないが１切り換え直後の反応
終了液中の生産物濃度の低下は少ない。一方、段数が少
ないばあいは切り換え直後の反応終了液中の生産物濃度
の低下が大きいが、切り換えの間隔を長くすることがで
きる。

この多段直列型連続発酵法におけるリアクタとして充填
塔型または流動層型リアクタを用いるばあい、還流管を
付設して培地を循環させると完全混合槽型に近づき、生
産効率を高めることができる。

リアクタの反応液流出口の、下流に、反応流出液中に含
まれる増殖した微生物をＶ＆着保持するために、微生物
を吸着保持する担体が充填された熟成槽を設けてもよい
。用いる担体としては、たとえばスポンジ、目の細がい
金属ネット１サランネツト、ガラスピーズ、合成樹脂ビ
ーズなどがあげられる。熟成槽を設けるときは、流出液
から微生物を除去できるほか、保持された微生物によっ
て基質を生産物へさらに転換することもできる。

リアクタには１ばあいによって微量の空気（酸素）を通
気して微生物の増殖を促進させることもできる。

つぎに多段直列型連続発酵法を図面にもとづいて説明す
る。第１図は１種類の生産用培地を用いる多段直列型生
産装置の概略ブロック図であり、（Ａ）Ｎ　（Ｂ）、（
０）はし）ずれもリアクタであり、それらのリアクタに
生産用培地供給ライン００）が接続されており、先行す
るリアクタの反応液を順次つぎのりアクタに供給する連
結ライン（１υにより相互に連結されている。また各リ
アクタ（Ａ）、（Ｂ）、（Ｇ）には反応終了液排出ライ
ン（ロ）がそれぞれ開閉弁（１３ａ）　、（１３ｂ）　
、（１３ｃ）を介して接続されている。

生産用培地供給ライン叫と各リアクタ（Ｎ１…）、（Ｃ
）との間には開閉弁（１４ａ）、（１４ｂ）　、（１４
０）が配設されており、またリアクタ（Ｎと（Ｊ３）と
の連結ラインには開閉弁（１５ａ）が、リアクタ（Ｂ）
と（０）との連結ラインには開閉弁（１５ｂ）が、リア
クタ（０〕と（８との連結ラインには開閉弁（１５０）
がそれぞれ配設されている。

この装置を用い、生産用培地供給ラインに）の開閉弁（
１４＆）を開は開閉弁（１４１））と（１４０）を閉じ
、連結ライン（ロ）の開閉弁（１５ａ）と（１５に＋）
を開は開閉弁（１５ｃ）を閉じ、反応終了液排出ライン
（ロ）の開閉弁（１３ａ）と（ｚｓｂ　）を閉じ開閉弁
（１３ａ）を開けると、生産用培地がリアクタ（４）に
供給されリアクタ中）を通ってリアクタ（０）から反応
終了液かえられる。

このようにリアクタを直列に連結するとＳ１段目のりア
クタ仏）では培地中の栄養源が豊富であって基質濃度も
低いため、固定化微生物の増殖が充分に行なわれる環境
にある。一方１最終段のりアクタ（０）中の固定化微生
物は高濃度の生産物にさらされているため微生物の増殖
が阻害され、その結果死滅速度が増殖速度を上廻って固
定化微生物の数が減少し、生産活性の低下が生ずる。

生産活性が所定のレベルを下廻ると、開閉弁（１３Ｑ）
、（１４ａ）、（１５ｂ）を閏じ１開閉弁（１３ｂ）、
（１４ｃ）。

（１５Ｑ）を開ければよい。この切り換えによりリアク
タ（ａ）が先頭となり、リアクタ（Ｂ）が最終段となる
。前記のごとく先頭のリアクタ中の固定化微生物は増殖
に適した環境にあり、再活性化される。こうした最終段
のリアクタを先頭のリアクタとする切り換えを順次行な
うことにより、固定化微生物の再活性化を連続生産と同
時に行なうことができる。このように多段直列型連続発
酵法では、とくに再活性化用の増殖用培地を必・要とせ
ず−また再活性化状態にある固定化微生物は同時に生産
にも関与しているので、きわめて生産効率が高くなる。

前記の生産物阻害だけでなく基質阻害も同時にみられる
ような発酵では、１段目に低基質濃度の培地を供給して
より一層増殖が促進されるような環境にし、基質が消費
されたのち高基質濃度の培地を適量ずつ供給する多点培
地俳給方式を採用すればよい。かかる方式に本発明の方
法を適用するばあいの一層ｍ態様を第２図に基づいて説
明する。なお、第２図中第１図と同じ符号の部分は第１
図と同じものを示す。

低基質濃度の培地は供給ラインα０）から供給され、高
基質濃度の培地は供給ライン０６）から供給される。供
給ライン０６）は各リアクタ（勾、ＣＢ）、（０）とそ
れぞれ開閉弁（１７ａ）、（１７ｋｌ）、（１７０）を
介して連結されている。

生産開始時に低基質濃度培地をリアクタ（Ｎに供給し、
高基質濃度培地をリアクタ（Ｂ）に供給し、反応終了液
をリアクタ（０）から取り出すように各開閉弁を開閉す
る。すなわち開閉弁（１３ａ）、（１３１））、（１４
ｂ）、（１４０）　、（１５０）、（１７ａ）、（１７
ｃ）を閉じ、開閉弁（１３０）、（１４ａ）、（１５ａ
）、（１５ｂ）、（１７ｂ）を開く。

リアクタ（０）中の固定化微生物の生産活性が所定のレ
ベル以下になったとき、リアクタ＜ａ＞を先頭のりアク
タとするべく開閉弁を切り換える。

すなわち開閉弁（１３０）、（１４＆）、（１５ｂ）、
（１’７ｂ）を閉じ、開閉弁（１：Ｔｈ）、（１４ａ）
、（１５ｏ　）、（ｌｅａ）を開く。このような連結状
態の変更、すなわち先頭のリアクタを（Ｎ→（０）→（
Ｂ）→（ト）・・・・・・・、２段目のリアクタをＣＢ
）→（Ａｌ→（ａ）→（Ｂ）・・・・・・・、最終段の
リアクタを（０）→（Ｂ）→（Ａ）→（Ｃ）・・・・・
・・とする切り換えを最終段のリアクタにおける固定化
微生物の生産活性の低下の度合に応じて行なうときは、
生産物阻害と基質阻害が問題となる微生物の再活性化処
理を効率的に行なうことができる。

つぎに本発明の方法を多段並列型連続発酵法に適用する
ばあいの一実施例を図面に基づいて説明する。

第６図に多段並列型の連続発酵装置の概略プルツク図を
示す。＋Ａ）、（Ｂ）および（０）はいずれもリアクタ
であり、生産用培地供給ラインやりおよび反応液排出ラ
インに）によって並列に連結されている。各リアクタ（
Ａ）、（Ｂ）、（０）にはさらに増殖用培地供給ライン
に）が接続されており、また増殖用培地排出ラインに）
も接続されている。生産用培地供給ラインに）と増殖用
培地ラインに）はそれぞれ開閉弁（２５ａ）、（２５ｂ
）、（２５ａ）および（２６ａ）、（２６ｂ）、（２６
ｃ）が配設されており、それらにより、各リアクタへの
培地の供給を任意に切り換えることができる。

連続発酵は生産用培地をライン参りからりアクタ（Ａ）
、（Ｂ）、（０）に供給することにより開始される〇各
すアクタ中の固定化微生物はある程度の期間生産活性を
一定レベル以上に維持するが、その抜栓々に生産活性が
低下してくる。リアクタ全体またはいずれか１個のリア
クタ中の固定化微生物の生産活性が所定のレベルを下廻
ったとき、生産活性のもつとも低下した固定化微生物が
充填されたリアクタを再活性化処理に切り換える。

ここで、そのリアクタがリアクタ囚であるとすると、開
の状態になっている開閉弁（２５ａ）　、（ｇ５ｂ）　
Ｎ（ｇ５ａ　）のうち開閉弁（２５ａ）を閉じてリアク
タ（Ｎへの生産用培地の供給を停止すると共に、閉の状
態となっている開閉弁（２６ａ）、（２６ｂ）、（２６
ｃ）のうち開閉弁（２ａａ）を開けてリアクタ（４）に
増殖用培地を供給し、リアクタ（Ａ）中の固定化微生物
の再活性を行なう。増殖用培地排液はライン（財）から
排出される。この状態において、リアクタ伯）、（ａ）
はそのまま連続生産に用いられている。

リアクタ（Ｎ中の固定化微生物の再活性化処理が終了す
ると、開閉弁（２６ａ）を閉じ開閉弁（２５８）を開け
て生産を再開する。一方、その時点で生産活性が低下し
ているリアクタ、たとえばリアクタ俤）の開閉弁（ｚ５
ｂ）を閉じ開閉弁（２６ｂ）を開けてリアクタ（Ｂ）を
再活性化処理する。

このように生産用培地供給ラインＩＩ）の開閉弁（２５
ａ）、（２５ｂ）、（，２５ｏ　）と増殖用培地供給ラ
イ＞（Ｉ）の開閉弁（２６＋１Ｌ）、（ｇ６ｂ）、（２
６ｃ）をリアクタ中の固定化微生物の生産活性の低下の
度合に応じて開閉し、常に少なくとも１個のりアクタを
順次再活性化処理し残りのりアクタを連続生産に供する
ことにより、安定でかつ長期間の連続生産が可能となる
。

増殖用培地は用いる固定化微生物によって異なり、その
微生物の増殖に最適の条件の培地を選定すればよい。そ
のような条件としては、たとえば栄養成分濃度１溶存酸
素濃度、ｐＨ１温度などがあげられる。

連続生産から再活性化処理およびその逆の切り換えは、
固定化微生物の数および（または）生成物濃度を測定す
ることによって行なえばよい。生産活性の度合は用いる
固定化微生物の種類、供給培地の種類、培地の供給速度
、生産物の種類、反応温度１通気量、攪拌数、培地の蓼
などによって異なり、それぞれ具体的な系におし、１て
適宜切り換えの時期を設定すればよい。また予備実験に
よって最適の切り換え時期を決め、その切り換え間隔で
定期的または不定期的に各リアクタの再活性化を順次行
なってもよい。

本発明の方法において使用されうる固定化微生物として
は、連続発酵に使用できるものであればいずれも採用で
きる。好ましい固定化増殖微生物としては、たとえば寒
天ゲル、カラギーナンゲル、フアーセレランゲルなどの
硫酸根含有多糖類ゲル、アルギン酸アルカリ土類金属塩
ゲル（たとえばアルギン酸力〃シウム）、ポリビニルア
ルコールゲル、ポリアクリル酸アミドゲル（たとえばＮ
、Ｎ’−低級アルキレン−ビス（アクリルアミ）″）、
ビス（アクリルアミドメチル）エーテルおよびアクリル
アミドから選ばれる１〜２種の七ツマ−の重合体または
共重合体）、セルロースサクシネートゲル、カゼインゲ
ルなどのゲル担体に包括された各種微生物があげられ、
とりわけカラギーナンゲルまたはアルギン酸カルシウム
ゲルに包括されたものが好適である。ゲル内に包括され
る微生物の量はとくに制限されないが、一般的にはゲ〃
１００９（湿瓜量）に対して０．０１〜１０白金耳相当
量であるのが好ましく、またゲルの形状は厚さ１ｍｍ〜
５ｃｍの粒状、立方体状、糸状または膜状に成形したも
のが好ましい。

これら固定化増殖微生物の調製法としては、従来公知の
方法を採用することができ、たとえば硫酸根含有多糖類
ゲルおよびアルギン融塩固定化微生物は特公［５６−２
９５１６〜７号および特公昭５７−１８８６７号各公報
に記載されている方法によす、ポリビニルアルコールゲ
ルはＰａｐｅｒ　ａｔ　ｓｔｈ工ｎｔ、　Ｆ’ｅｒｍｅ
ｎｔ、　Ｓｙ＋ｎｐ、Ｉ　Ｂｅｒｌｉｎ　（１９７６）
に記載されている方法により、アクリルアミドゲル固定
化微生物はたとえば特公昭５５−１８５１号公報、Ａｐ
ｐｌ・Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２７　＋　８７８　（１
９７４）などに記載されている方法により、またセルロ
ースサクシネートゲルまたはカゼインゲル固定化微生物
はＪ、　５ｏｌｉｄ　−ＰｈａＳｅ　ｎｉｏｃｈｅｍ、
　２−　＋　２２５　（１９７７）に記載されている方
法によって好適に調製することができる。本発明におい
て用いる生産用培地および（または）増殖用培地として
は、微生物の生育に必要な栄養源と基質とを含むもので
あればとくに制限はなく、それ自体公知の炭素源、窒素
源、無機質、ビタミンを使用する微生物の種類に応じ適
宜組合せて用いればよい。

つぎに本発明の方法を実施例をあげて説明するが、本発
明はががる実施例のみに限定されるものではない。

なお、各実施例において用いるリアクタを特定するため
、便宜的に最初の連結状態における先頭のリアクタを轟
１とし、以下Ａ２、Ａ６・・・・・・・・個ｉと番号を
付しである。

実施例１ ７０ｍ１容の充填塔型リアクタ（直径４ｃｍ　、高さ５
．５ｃｍの円筒形）を２１１直列（連結状態は第１図参
照）に連結した多段直列型エタノール生産装置を用いて
エタノールを連続生産した。

固定化微生物としては、協会７号酵母の一白金耳を６７
°Ｃにて５％カラギーナン水溶液１００ｎＪに加えて混
合し、この混合液を２％塩化カリウム水溶液５００ｍｊ
中にノズルから滴下して直径４ｍｍの球状ゲルとしたも
のを用いた。

この球状ゲル２０ｍ７を２個のリアクタにそレソれ充填
し、１０％の還元糖を含む糖蜜水溶液（ｐ）（５，０）
を６０°Ｃにて４０ｍ１／ｈｒの流速で４８Ｒ１１Ｉ供
給して予備増殖を行なった。その間空気を４７／ｈｒの
流速で通気した。

予備増殖後２個のりアクタを直列に連結し、先頭のりア
クタ（Ａ１）に２０％の還元糖を含む１ＪＩＥ’Ｍ水？
Ｉ液（ｐＨ５，０）　ヲ５０ｏａ１１３ｍφｒ＋７）流
速で供給し、Ａ２のリアクタから反応終了液をえた。生
産開始５日後にリアクタの連結状Ｍヲ９Ｊり換え、屋２
のリアクタに糖蜜水溶液を供給し、Ａ１のリアクタから
反応終了液をえた。この切り換えを５日毎に繰り返した
ところ、８０〜８５ｍ９／ｍｊのエタノール濃度の反応
終了液が６力月以上安定してえられ′た。

なお、各カラムは６００ｍｊ　／　ｈｒの流速で反応液
を還流させた。

切り換え時期は、予備実験の結果から約１透間で８Ｑｍ
ｐ／ｍノ以下になることがわかったので、余裕をみて５
日を基準として決定した。

実施例２ ７０ｍ／容の流動層型リアクタ（下底５．２ｃｍ、上底
４．８ｃｍ　、高さ５．５ｃｍの逆円錐形）を４個直列
に連結した装置（連結状態は第２図参照）を用いエタノ
ールを連続生産した。固定化微生物は実施例１と同じも
のを用い、各リアクタに２０ｍ１ずつ充填して実施例１
と同様に予備増殖したのち４個のリアクタを直列に連結
した。

培地の供給は、先頭のリアクタに１０％還元糖を含む糖
蜜水溶液（ｐＨ５，０）を２０＋ｎｌ／ｈｒの流速で供
給し、２段目のリアクタに４０％の還元糖を含む糖蜜水
溶液（ｐＨ５，０）を５ｍノ／ｈｒの流速で供給し、４
段目のリアクタから反応終了液をうるという多点培地供
給方式を採用した。なお、先頭のリアクタと２段目のリ
アクタは３００ｍｔ／　ｈ、ｒの流速で反応液を還流さ
せた。

リアクタの連結状態を２日毎にＡ　Ｉ　（先頭）→Ａ２
→Ａ６→Ａ　４　、應４（先頭）→應１→ｊ６２→Ａ５
　、Ａ　５　（先頭）→Ａ４→Ｉａ　１→Ａ２、・・・
・・・・のように切り換えたところ、反応温度６０°Ｏ
で８ｏ　〜ｓ５ｍｒｐ／ｍノのｘ　タ／　−ｈβ度’（
ＤＪｉｕ５終了液が４段目のリアクタから３力月以上安
定してえられた。

なお、切り換え時期は、予備実験の結果から最後段のリ
アクタ中の固定化微生物の生菌数が低下しない限度であ
る２日を基準にして決定した。

なお、この実施例において、切り換えを行なわなかった
ばあい、エタノール温度は１週間で７５町ノｍ１ｚ２週
間で７０ｍｇ／ｍｔ　％　１力月で４０ｍ９／ｍノにま
で低下した。

実施例６ 実施例２と同型の流動層型リアクタを４個用いたはかは
実施例１と同様にして固定化微生物の調製、予備増殖お
よびリアクタの連結を行なった。

培地の供給は、先頭のリアクタのみに２０％の還元糖を
含む糖蜜水溶液（ｐＨ５，０）を６０°０にて２５ｍ１
／ｈｒの流速で供給することにより行ない、４段目から
反応終了液をえた。

リアクタの連結状態の切り換えは、実施例２の要領で１
日毎に行なった。また先頭のりアクタのみに２５０ｍｊ
　／　ｈｒで空気を供給した。

その結果、８０〜８５ｍｇ／ｍｌのエタノール濃度の反
応終了液が３力月以上安定してえられた。

なお、切り換え時期は予備実験の結果から最後段のりア
クタ中の固定化微生物の生菌数が低下しない限度である
１日を基準として決定した。

実施例４ 実施例１と同様にして調製した協会７号酵母が固定化さ
れたカラギーナンゲル１註 ネットのカゴに入れ、これを６０ｍ１容の完全混合槽型
リアクタ（直径３ｃｍ　ｓ高さ４．２ｃｍの円筒形）８
個にそれぞれ充填した。各リアクタに１０％の還元糖を
含む糖蜜水溶液（　ｐＨ５．０　）を３０°０１２０ｍ
４／ｈｒの流速で４８時間供給し、マグネテイツクスタ
ーラーで攪拌しつつ予備増殖を行なった。

予備増殖後８個のリアクタを直列に連結しく連結状態は
第２図参照）、先頭のリアクタに１５％の還元糖を含む
糖蜜水溶液（　ｐＨ５．（］　）を１２ｍ／／ｈｒで、
２段目および６段目に４０％の還元糖を含む糖蜜水溶液
（　ｐＨ５．０　）を１　、　１ｋｌ／ｈｒで、さらに
４段目および５段目に４０％の還元糖を含む糖蜜水溶液
（　ｐＨ５．０　）を２．２ｋｌ／ｈｒで供給した。

リアクタ相互の連結状態を１日毎に最終段のリアクタが
先頭のリアクタになるように切り換えたところ、反応温
度２７’ｌ：にて９５　〜１００ｍ９７ｍ１のエタノー
ル濃度の反応終了液が６力月以上安定してえられた。

なお、切り換え時期は予備実験の結果から１〜２日で９
５ｍ　ｙ／ｍｌ以下になることがわかったので１日を基
準として決定した。

実施例５ 協会７号酵母をグルコース２％、ペプトン０．５％、酵
母エキス０．３％、マルトエキスを含みｐＨ５．０調整
された培地２１中で６０°Ｃにて２４時間前培養した。

えられた前培養液を５％カラギーナン水溶液２０ノを４
６〜４４°Ｃにて混合し、この混合液を２％塩化カリウ
ム水溶液１００！中へノズルから滴下して直径４ｍｍの
球状ゲルを調製した。この操作を繰り返してえられたゲ
ルを２００１ずっＺＯＯ！．容の充填塔型リアクタ（直
径Ｏ　ａ　７ｍ　ｓ高さ１．８ｍの円筒形）２個にそれ
ぞれ充填し、１５％の還元糖を含む糖蜜水溶液（　１）
Ｈ５．０　）を２７°ａ、１５０１／ｈｒの流速で４８
時間供給すると共に空気を１　、　５ｋｌ／ｈｒで通気
し、反応液を２０口１／ｈｒで還流させて予備増殖を行
なった。

予備増殖後２個のリアクタを直列（第１図参照）に連結
し、先頭のリアクタに０．１９：の（ＮＨ４）２ｓｏ，
および１９％の還元糖を含む糖蜜水溶液（　ｐ）１５．
０　）を２７°ｔ３　１１５０ｚ／ｈｒの流速で供給し
た。

また先頭のりアクタには７．　５に／／ｈｒ　、　’１
段目のリアクタには１　、　５ｋｌ／ｈｒで空気を通気
し、各リアクタにおいて反応液を２００１／ｈｒで還流
させた。なお反応終了後の流出口の下流に、１０ａｍ角
のウレタンスポンジ２００ノが充填された７００！容の
熟成槽を設けた。

リアクタ相互の連結状態を１〜６日毎に切り換えたとこ
ろ、反応温度２７°Ｃで１３Ｑｍ９／＋ｎノのエタノー
ル濃度の反応終了液が６力月以上安定してえられた。

なお、切り換え時期は予備実験の結果から流出液中のエ
タノール濃度および固定化微生物の生菌数の低下に応じ
て１〜６日を基準として決定した。

実施例６ 第６因に示す６個のリアクタを並列に連結した連続発酵
装置を用いてＬ−アルギニンを連続生産した。リアクタ
としては７０ｍ１容の気泡塔型リアクタ（下底５．２０
ｆｆｌφ、上底４．８ｃｍφ、高さ５．５ｃｍの逆円錐
形）を用いた。

固定化微生物としては、セラチア・マルセツセスＡＴ−
５，！１１（微工研菌寄第６０５１号）の−白金耳を４
０°０で３％カラギーナン水溶液１００ｍ１に加えて混
合し、この混合液を２％塩化カリウム水溶液５００ｍ１
中にノズルから滴下して直径４ｍｍの球状ゲルとしたも
のを用い、球状ゲル２０ｍｊを各リアクタに充填した。

各リアクタ１Ｑｊ／ｈｒで酸素ガスを通気しつつ、予備
増殖を３個のリアクタに連軸６％、７マール藪アンモ；
ラム１％、尿素０．６％、酵母エキス０．１％、コーン
ステイープリカー０．１％、リン酸二カリ−ラム０．１
％、硫酸マグネシウム０．０３５％を含む増殖用培地（
ｐＨ７−０）を５０”０にて１５ｍ１／ｈｒの流速で２
４時間供給することにより行なった。

ついで開閉弁を切り換えてリアクタ（４）にはそのまま
増殖用培地を供給し、リアクタ（Ｂ）、（０）にはｍＷ
５％、７マール酸アンモニウム饅、尿素１．５％、酵母
エキス０．１％、コーンステイープリカー０．１％、リ
ン酸二カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５５
％を含む生産用培地（ｐＨ７，０）を６０００にて７ｍ
／／ｈｒの流速で２４時間供給した。２４時間後に開閉
弁を切り換えてリアクタＣＢ）に増殖用培地を、リアク
タ（Ａ）、（Ｃりに生産用培地を供給した。

各リアクタには１０１／ｈｒで酸素ガスを通気した。

以後４８時間毎に開閉弁を切り換え、増殖用培地を（０
）→（〜→（Ｂ）の順で供給して再活性化処理を行なっ
た。その結果、生産用培地を１４ｍ１／ｈｒの速度で供
給することによって１０ｍｐ／ｍｊのＬ−アルギニンが
１力月間安定してえられた。

なお、再活性化処理への切り換えの時期は、予備実験の
結果から反応終了液中のＬ−アルギニンの量が１０ｍ９
／ｍ７以下になったときを基準とした。

実施例７ ７０　ｍｌ容の充填塔、Ｉリアクタ（直径４ｃｍ　、高
さ５．５ｃｍの円筒形）を５個直列（連結状態は第２図
参照）に連結した多段直列個連続発酵装置を用いてエタ
ノールを連続生産した。

固定化微生物としては、協会７号酵母の一白金耳を６７
°Ｏで２％アルギン酸ナトリウム水溶液１００ｍ／に加
えて混合し、この混合液を０．１Ｍ塩化カルシウム水溶
液５００ｍｊ！中にノズルから滴下して直径１〜５ｍｍ
の球状ゲルとしたものを用いた。

この球状ゲル２０ｍｊを５個の充填塔型リアクタにそれ
ぞれ充填し、１０％の還元糖を含む糖蜜水溶液（ｐＨ５
−０３を３０°０にて４０ｍｊ／ｈｒの流速で４８時間
供給して予備増殖を行なったのちリアクタを直列に連結
した〇 ついで先頭のりアクタには１０％の還元ｔｆｔを含む糖
蜜水溶液（ｐＨ５，０）を２４ｍ／／ｈｒの流速で供給
し、２段目および６段目のリアクタにはそれぞれ４０％
の還元糖を含む糖蜜水溶液（ｐＨ５，０）ヲ３ｍノ／ｈ
ｒの流速で供給し、５段目のリアクタから反応終了液を
えた。

リアクタの連結状態の切り換えは、２４時間毎につぎの
ように行なった。すなわち５個のりアクタ番号を１６１
〜Ａ５とすると、最初の連結はＡ１（１段目）→Ａ２→
Ａ６→Ａ４→轟５であり、ついでＡ５（１段目）→Ａ１
→Ａ２→轟６→Ｉａ４、Ａ４　（１段目）→Ａ５　Ａｌ
→Ａ２→Ａ３・・・・・・・と変更した。

その結果、反応温度６０°Ｃでａｏ　〜Ｂ５ｍｐ／ｍｌ
のエタノールが６力月以上安定してえられた。

なお切り換え時期は、予備実験の結果から、エタノール
濃度が８０ｍｙ／ｍｌ以下にならないように設定した。

なお、切り換えを行なわなかったばあい、エタノール濃
度は１週間後に７５ｍｙ／ｍｌ　、２週間後に７０ｍ９
／ｍｊにまで低下し、１力月後では４０ｍｊ／ｍ！以下
になった。

実施例８ 実施例７に用いたリアクタと同型の充填塔型リアクタ４
個を第１図に示すような連結状態で直列に連結した直列
型連続発酵装置を用い、Ｌ−乳酸を連続生産した。

固定化微生物としては、ストレプトコッカス・ラクテイ
スＡＩＩＩＵ　１１９２の一白金耳を４０°Ｏで５％カ
ラギーナン水溶液１００ｍ１に加えて混合し、この混合
液を２％塩化カリウム水溶赦５００ｍ１中にノズルから
滴下して直径４ｍＢの球状ゲルとしたものを用い、各リ
アクタに２０ｍ１ずつ充填した。

予備増殖は、乳［５％、酵母エキス２％、ペプトン１％
およびリン酸二カリワム０．５％を含む培地（ｐＨ７，
０）を６７８０にて１５ｍ１／ｈｒの流速で７２時間供
給することによって行なった。

ついで直列に連結した４個のリアクタ（ＪＫ＆１〜Ａ４
）のうちＡ１（１段目）のリアクタに前記培地を４５°
Ｃにて７ｍｌ／ｈｒの流速で供給し、屋５（４段目）の
リアクタから反応終了液をえた。

以後２４時間毎につぎのようにリアクタ相互の連結を切
り換えた。すなわちＡ４（１段目）→ｊ６１→Ａ２→Ａ
３、Ａ６（１段目）→Ａ４→Ａ１→Ａ　２　、・・・・
・・・。

その結果、反応温度４５００で２０〜２５ｍｇ／ｍｌの
Ｌ−乳酸が１力月以上安定してえられた。

なお切り換え時期は、予備実験の結果から、反応流出液
の乳酸が２０町／ｍｌ以下にならないように設定した。

【図面の簡単な説明】

第１〜６図はいずれも本発明の方法を実施するために用
いる連続見酵装置の実施態様の概略ブ四ツク図である。 （図面の主要符号） （ｌｄｌ、＠υ：生産用培地供給ライン（Ｕ）：連結ラ
イン に）、に）：反応終了液排出ライン θ６）：高基質濃度培地供給ライン に）：増殖用培地供給ツイン （ハ）：増殖用培地排出ライン （Ａ）、（Ｂ）、（０）　？リアクタ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　固定化増殖微生物を用いる連続発酵法により有用物
   質を２個以上のりアクタを使用して生産する際、各リア
   クタの固定化微生物の生産活性の低下の度合に応じて常
   時少なくとも１個の生産活性の低下したリアクタの再活
   性を行ないながら連続発酵生産を行なうべくリアクタ相
   互の連結状態を変更することを特徴とする固定化増殖微
   生物による連続発酵法。 ２　固定化増殖微生物が充填されている少なくとも２個
   のリアクタを直列に連結し、少なくとも先頭のリアクタ
   に生産用培地が連続的に供給されるようにしてなる装置
   を用い、かつ所定期間経過後に最終段のリアクタが先頭
   のリアクタとなるようにリアクタ相互の連結状態を順次
   変更することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ３　培地を少なくとも２個のりアクタに供給する特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ４　リアクタが充填塔型、流動層型または完全混合槽型
   リアクタである特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５　リアクタの反応液の流出口の下流に微生物を吸着保
   持可能な担体が充填されでいる熟成槽が設けられてなる
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６　生産活性の低下の度合が固定化増殖微生物の死滅速
   度を基準として決定される特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ７　生産活性の低下の度合が生成物の濃度を基準として
   決定される特許請求の範囲第１項記載の方法。