JPWO2016056566A1 - 形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
アルカリによる中和を必要とせずに高い生産性で乳酸を産生でき、乳酸産生能と増殖能の両方に優れた形質転換体およびその製造方法、ならびに該形質転換体を用いた乳酸の製造方法の提供。シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、ヒト由来の乳酸脱水素酵素遺伝子が３〜５コピー組み込まれ、かつ前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活していることを特徴とする形質転換体、５００ｍＬ容の坂口フラスコに入った、イーストエクストラクト１％、ペプトン２％、およびグルコース６％からなる液体培地１００ｍＬに初発菌体濃度を０．０４ｇ（ｄｃｗ）／Ｌになるように接種し、温度３２℃、１１０ｒｐｍかつ振り幅７ｃｍの振盪条件下で２０時間培養した培養液の菌体濃度が４．０ｇ（ｄｃｗ）／Ｌ以上であり、前記と同じ条件で２０時間培養し得られた菌体を、１１．１％グルコース水溶液に初発菌体濃度が３６ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌになるように接種し、温度３２℃、１１０ｒｐｍかつふり幅７ｃｍの振盪条件下で３時間発酵させた発酵液の乳酸濃度が８０ｇ／Ｌ以上である形質転換体、およびこれら形質転換体を用いた乳酸の製造方法。
Description
本発明は、形質転換体およびその製造方法、ならびに乳酸の製造方法に関する。より詳細には、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）（以下、Ｓ．ポンベともいう）に、乳酸脱水素酵素遺伝子（乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）をコードする遺伝子、以下「ＬＤＨ遺伝子」ともいう。）を組み込み、かつピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部の遺伝子を欠失または失活させた形質転換体、該形質転換体の製造方法、および該形質転換体を培養液中で培養し、該培養液から乳酸を取得する乳酸の製造方法に関する。
乳酸は食品用途、医療、化粧品等の化学原料用途に広く用いられている。また、乳酸を用いて得られるポリ乳酸は、微生物等により最終的に二酸化炭素と水にまで分解される生分解性プラスチックとして注目されている。そのため、乳酸を安価に高い生産性で製造することが必要である。
乳酸の製造方法としては、乳酸菌により糖を発酵させ製造する生物学的方法が知られている。しかし、乳酸菌は耐酸性が低いため、該方法で高い生産性を得るには発酵により産生される乳酸をアルカリにより中和して乳酸塩とする必要がある。このようなアルカリによる中和は、乳酸塩から乳酸に戻す工程が必要となるため、製造工程が煩雑になり製造コストも高くなる。
アルカリによる中和を行わずに乳酸を得る方法としては、酵母にＬＤＨをコードする遺伝子を導入した形質転換体を用いる方法がある。たとえば特許文献１には、Ｓ．ポンベに、ヒト由来等の哺乳動物由来のＬＤＨ遺伝子が組み込まれ、かつＳ．ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部の遺伝子を欠失または失活させた形質転換体を培養することにより、アルカリによる中和工程を行わずに高い生産性で乳酸を製造し得ることが開示されている。また、特許文献２には、培養培地中で培養した際に本質的にエタノールを産生しないサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に、ラクトバチルス・プランタラム(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ)のＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した形質転換体を培養することによりＬ−乳酸が得られることが開示されている。
さらに、特許文献３には、Ｓ．ポンベを宿主とし、ラクトバチルス・ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）のＬＤＨ遺伝子（ＬｐＬＤＨ遺伝子）が組み込まれ、かつ前記Ｓ．ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活している形質転換体も、特許文献１に記載の形質転換体と同程度またはそれ以上の乳酸生産性を有すること、特に、ＬｐＬＤＨ遺伝子とヒト由来のＬＤＨ遺伝子（ＨｓＬＤＨ遺伝子）を組み合わせて組み込むことにより、ＨｓＬＤＨ遺伝子を１コピー組み込んだ形質転換体およびＨｓＬＤＨ遺伝子と他の生物種由来のＬＤＨ遺伝子を１コピーずつ組み込んだ形質転換体よりも、顕著に乳酸産生能が向上することが開示されている。
より効率よく乳酸を産生するためには、乳酸産生能と増殖能の両方が優れた形質転換体が好ましい。しかし、後記例１に示すように、一般的に、外来のＬＤＨ遺伝子を導入した変異株は、乳酸産生能が高い株ほど増殖能が低い傾向がある。
そこで本発明では、アルカリによる中和を必要とせずに高い生産性で乳酸を産生でき、かつ乳酸産生能と増殖能の両方に優れたＳ．ポンベの形質転換体および該形質転換体の製造方法を目的とする。
また、前記形質転換体を用いて、アルカリによる中和工程を行わずに高い生産性で乳酸を製造する方法を目的とする。
なお、本発明において乳酸とは生物学的方法で得られるＬ−乳酸をいう。
また、前記形質転換体を用いて、アルカリによる中和工程を行わずに高い生産性で乳酸を製造する方法を目的とする。
なお、本発明において乳酸とは生物学的方法で得られるＬ−乳酸をいう。
本発明に係る第１の形質転換体は、シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、ヒト由来のＬＤＨ遺伝子が３〜５コピー組み込まれ、かつ前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活していることを特徴とする。
また、本発明に係る第２の形質転換体は、５００ｍＬ容の坂口フラスコに入った、イーストエクストラクト１％、ペプトン２％、およびグルコース６％からなる液体培地１００ｍＬに初発菌体濃度を０．０４ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌになるように菌体を接種し、温度３２℃、１１０ｒｐｍかつ振り幅７ｃｍの振盪条件下で２０時間培養した培養液の菌体濃度が４．０ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌ以上であり、５００ｍＬ容の坂口フラスコに入った、イーストエクストラクト１％、ペプトン２％、およびグルコース６％からなる液体培地１００ｍＬに初発菌体濃度を０．０４ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌになるように菌体を接種し、温度３２℃、１１０ｒｐｍかつ振り幅７ｃｍの振盪条件下で２０時間培養し得られた菌体を、直径１８ｍｍかつ長さ１５０ｍｍの試験管に入った４．５ｍＬの１１．１％グルコース水溶液に初発菌体濃度が３６ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌになるように接種し、温度３２℃、仰角４３．５°、１１０ｒｐｍ、およびふり幅７ｃｍの振盪条件下で３時間発酵させた発酵液の乳酸濃度が８０ｇ／Ｌ以上であることを特徴とする。
該形質転換体としては、シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、少なくとも１の乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつ前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活しているものが好ましい。
該形質転換体としては、シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、少なくとも１の乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつ前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活しているものが好ましい。
本発明に係る第１および第２の形質転換体においては、前記欠失または失活しているピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子がＰＤＣ２遺伝子であることが好ましい。さらに、前記ＬＤＨ遺伝子はシゾサッカロミセス・ポンベの染色体に組み込まれていることが好ましい。
また、本発明に係る形質転換体の製造方法は、シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、シゾサッカロミセス・ポンベ内で機能するプロモーターとターミネーターとヒト由来の乳酸脱水素酵素遺伝子とを含む発現カセットを、前記宿主の染色体中の３〜５箇所に導入した形質転換体を得ること、および、前記宿主としてピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活した宿主を用いるかまたは前記得られた形質転換体のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部の遺伝子を欠失または失活させることを特徴とする、ヒト由来の乳酸脱水素酵素遺伝子が３〜５コピー組み込まれかつピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活している形質転換体を製造する方法である。
本発明に係る形質転換体の製造方法においては、前記発現カセットを、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のｅｎｏ１０１遺伝子座上流１００００ｂｐから下流１００００ｂｐの領域、ｌｅｕ１遺伝子座上流１００００ｂｐから下流１００００ｂｐの領域、およびｇｐｍ１遺伝子座上流１００００ｂｐから下流１００００ｂｐの領域から選ばれる領域に導入することが好ましい。
また、本発明に係る形質転換体の製造方法においては、前記欠失または失活しているピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子がＰＤＣ２遺伝子であることが好ましい。
本発明に係る形質転換体の製造方法においては、前記発現カセットを、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のｅｎｏ１０１遺伝子座上流１００００ｂｐから下流１００００ｂｐの領域、ｌｅｕ１遺伝子座上流１００００ｂｐから下流１００００ｂｐの領域、およびｇｐｍ１遺伝子座上流１００００ｂｐから下流１００００ｂｐの領域から選ばれる領域に導入することが好ましい。
また、本発明に係る形質転換体の製造方法においては、前記欠失または失活しているピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子がＰＤＣ２遺伝子であることが好ましい。
さらに、本発明に係る乳酸の製造方法は、前記形質転換体を培養液中で培養し、該培養液から乳酸を取得する。
本発明に係る乳酸の製造方法において、濃度１〜５０質量％のグルコースを含む培養液を使用して培養を行うことが好ましい。また、前記形質転換体により産生される乳酸により、前記培養液のｐＨが３．５以下になった後にさらに培養を継続することが好ましい。
さらに、前記形質転換体により産生された培養液中の乳酸を中和することなく培養を継続することが好ましく、また、培養液中の乳酸を中和することなく培養液から乳酸を分離することが好ましい。
本発明に係る乳酸の製造方法において、濃度１〜５０質量％のグルコースを含む培養液を使用して培養を行うことが好ましい。また、前記形質転換体により産生される乳酸により、前記培養液のｐＨが３．５以下になった後にさらに培養を継続することが好ましい。
さらに、前記形質転換体により産生された培養液中の乳酸を中和することなく培養を継続することが好ましく、また、培養液中の乳酸を中和することなく培養液から乳酸を分離することが好ましい。
本発明に係るＳ．ポンベの形質転換体は、増殖能に優れている上に、アルカリによる中和を必要とせずに高い生産性で乳酸を産生できる。また、高濃度の糖、特にグルコース、フルクトース、スクロース、またはマルトースの存在下での乳酸産生に適し、かつ高密度培養にも適している。さらに、高酸素条件下における長期にわたる連続培養における乳酸産生能も高い。
前記形質転換体は、本発明に係る形質転換体の製造方法により簡便に得ることができる。
また、本発明に係る乳酸の製造方法は、アルカリによる中和工程を行わずに高い生産性で乳酸を製造できる。
前記形質転換体は、本発明に係る形質転換体の製造方法により簡便に得ることができる。
また、本発明に係る乳酸の製造方法は、アルカリによる中和工程を行わずに高い生産性で乳酸を製造できる。
［形質転換体］
本発明に係る第１の形質転換体は、Ｓ．ポンベを宿主とし、ヒト由来の乳酸脱水素酵素遺伝子が３〜５コピー組み込まれ、かつ前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活していることを特徴とする。本発明に係る第１の形質転換体は、乳酸産生能が高いにもかかわらず、増殖能も充分に高い。このため、工業上の乳酸を量産するための乳酸産生菌として非常に好適である。
上記欠失または失活しているピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子はＰＤＣ２遺伝子であることが好ましい。さらに、上記ＬＤＨ遺伝子はシゾサッカロミセス・ポンベの染色体に組み込まれていることが好ましい。
本発明に係る第１の形質転換体は、Ｓ．ポンベを宿主とし、ヒト由来の乳酸脱水素酵素遺伝子が３〜５コピー組み込まれ、かつ前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活していることを特徴とする。本発明に係る第１の形質転換体は、乳酸産生能が高いにもかかわらず、増殖能も充分に高い。このため、工業上の乳酸を量産するための乳酸産生菌として非常に好適である。
上記欠失または失活しているピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子はＰＤＣ２遺伝子であることが好ましい。さらに、上記ＬＤＨ遺伝子はシゾサッカロミセス・ポンベの染色体に組み込まれていることが好ましい。
本発明に係る第２の形質転換体は、５００ｍＬ容の坂口フラスコに入った、イーストエクストラクト１％、ペプトン２％、およびグルコース６％からなる液体培地１００ｍＬに初発菌体濃度を０．０４ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌになるように菌体を接種し、温度３２℃、１１０ｒｐｍかつ振り幅７ｃｍの振盪条件下で２０時間培養した培養液の菌体濃度が４．０ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌ以上であり、５００ｍＬ容の坂口フラスコに入った、イーストエクストラクト１％、ペプトン２％、およびグルコース６％からなる液体培地１００ｍＬに初発菌体濃度を０．０４ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌになるように菌体を接種し、温度３２℃、１１０ｒｐｍかつ振り幅７ｃｍの振盪条件下で２０時間培養し得られた菌体を、直径１８ｍｍかつ長さ１５０ｍｍの試験管に入った４．５ｍＬの１１．１％グルコース水溶液に初発菌体濃度が３６ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌになるように接種し、温度３２℃、仰角４３．５°、１１０ｒｐｍ、およびふり幅７ｃｍの振盪条件下で３時間発酵させた発酵液の乳酸濃度が８０ｇ／Ｌ以上であることを特徴とする。本発明に係る第２の形質転換体は、上記のように、乳酸産生能が高いにもかかわらず、増殖能も充分に高い。このため、工業上の乳酸を量産するための乳酸産生菌として非常に好適である。
本発明に係る第２の形質転換体としては、Ｓ．ポンベを宿主とし、ＬＤＨ遺伝子が組み込まれ、かつＳ．ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活している、形質転換体が好ましい。このような形質転換体としては、前記第１の形質転換体が特に好ましい。
＜Ｓ．ポンベ＞
宿主であるＳ．ポンベは、シゾサッカロミセス属に属する酵母（分裂酵母）であり、他の酵母に比べて特に耐酸性に優れる微生物である。また、Ｓ．ポンベは、サッカロミセス・セレビシエ等の他の酵母に比べ、高濃度のグルコース下における乳酸の生産性に優れ、高密度培養（大量の酵母を用いた培養）にも適していることがわかった。そのため、Ｓ．ポンベの形質転換体を用いることにより、極めて高い生産性で乳酸を製造できる。
なお、Ｓ．ポンベの染色体の全塩基配列は、データベース「Pombase (http://www.pombase.org/)」に、収録され、公開されている。本明細書記載のＳ．ポンベの遺伝子の配列データは前記データベースから遺伝子名または前記系統名で検索して、入手できる。
宿主であるＳ．ポンベは、シゾサッカロミセス属に属する酵母（分裂酵母）であり、他の酵母に比べて特に耐酸性に優れる微生物である。また、Ｓ．ポンベは、サッカロミセス・セレビシエ等の他の酵母に比べ、高濃度のグルコース下における乳酸の生産性に優れ、高密度培養（大量の酵母を用いた培養）にも適していることがわかった。そのため、Ｓ．ポンベの形質転換体を用いることにより、極めて高い生産性で乳酸を製造できる。
なお、Ｓ．ポンベの染色体の全塩基配列は、データベース「Pombase (http://www.pombase.org/)」に、収録され、公開されている。本明細書記載のＳ．ポンベの遺伝子の配列データは前記データベースから遺伝子名または前記系統名で検索して、入手できる。
＜ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子＞
Ｓ．ポンベにおけるピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子（ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子、以下「ＰＤＣ遺伝子」ともいう。）群には、ピルビン酸脱炭酸酵素１をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ１遺伝子」という。）、ピルビン酸脱炭酸酵素２をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ２遺伝子」という。）、ピルビン酸脱炭酸酵素３をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ３遺伝子」という。）、ピルビン酸脱炭酸酵素４をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ４遺伝子」という。）の４種類がある。なかでも、Ｓ．ポンベにおいては、ＰＤＣ２遺伝子とＰＤＣ４遺伝子が主要な機能を持つＰＤＣ遺伝子である。各ＰＤＣ遺伝子の系統名は以下の通りである。
ＰＤＣ１遺伝子（Ｐｄｃ１）；ＳＰＡＣ１３Ａ１１．０６
ＰＤＣ２遺伝子（Ｐｄｃ２）；ＳＰＡＣ１Ｆ８．０７ｃ
ＰＤＣ３遺伝子（Ｐｄｃ３）；ＳＰＡＣ１８６．０９
ＰＤＣ４遺伝子（Ｐｄｃ４）；ＳＰＡＣ３Ｇ９．１１ｃ
前記ＰＤＣ遺伝子の配列データは、前記Ｓ．ポンベ遺伝子データベースから遺伝子名または系統名で検索して入手できる。
Ｓ．ポンベにおけるピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子（ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子、以下「ＰＤＣ遺伝子」ともいう。）群には、ピルビン酸脱炭酸酵素１をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ１遺伝子」という。）、ピルビン酸脱炭酸酵素２をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ２遺伝子」という。）、ピルビン酸脱炭酸酵素３をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ３遺伝子」という。）、ピルビン酸脱炭酸酵素４をコードする遺伝子（以下、「ＰＤＣ４遺伝子」という。）の４種類がある。なかでも、Ｓ．ポンベにおいては、ＰＤＣ２遺伝子とＰＤＣ４遺伝子が主要な機能を持つＰＤＣ遺伝子である。各ＰＤＣ遺伝子の系統名は以下の通りである。
ＰＤＣ１遺伝子（Ｐｄｃ１）；ＳＰＡＣ１３Ａ１１．０６
ＰＤＣ２遺伝子（Ｐｄｃ２）；ＳＰＡＣ１Ｆ８．０７ｃ
ＰＤＣ３遺伝子（Ｐｄｃ３）；ＳＰＡＣ１８６．０９
ＰＤＣ４遺伝子（Ｐｄｃ４）；ＳＰＡＣ３Ｇ９．１１ｃ
前記ＰＤＣ遺伝子の配列データは、前記Ｓ．ポンベ遺伝子データベースから遺伝子名または系統名で検索して入手できる。
野生型Ｓ．ポンベでは、解糖系によりグルコースをピルビン酸まで代謝し、前述のＰＤＣ遺伝子から発現されるピルビン酸脱炭酸酵素によりピルビン酸がアセトアルデヒドに変換され、次いで該アセトアルデヒドがアルコール脱水素酵素によりエタノールへと変換されることでエタノール発酵が行われる。また、野生型Ｓ．ポンベは機能を持ったＬＤＨ遺伝子を有していないことより、ピルビン酸から乳酸が生成するルートは存在しない。
一方、組み込まれたＬＤＨ遺伝子から発現されるＬＤＨは、ピルビン酸を乳酸に還元することにより乳酸を産生させる。そのため、野生型Ｓ．ポンベにＬＤＨ遺伝子を組み込んで乳酸を産生できるようにしても、そのままではエタノール発酵と乳酸発酵の両方を行うことになるため、乳酸の生産性が充分に高くならない。
一方、組み込まれたＬＤＨ遺伝子から発現されるＬＤＨは、ピルビン酸を乳酸に還元することにより乳酸を産生させる。そのため、野生型Ｓ．ポンベにＬＤＨ遺伝子を組み込んで乳酸を産生できるようにしても、そのままではエタノール発酵と乳酸発酵の両方を行うことになるため、乳酸の生産性が充分に高くならない。
本発明に係る形質転換体は、前記ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群のうち、一部が欠失または失活した染色体を有する。形質転換体のＰＤＣ遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活していることにより、形質転換体のエタノール発酵の効率が低下し、エタノールに変換されるピルビン酸量が少なくなるため、乳酸の生産性が向上する。ただし、ＰＤＣ遺伝子群のすべての遺伝子を欠失または失活させると、エタノール発酵が全く行えなくなって生育が阻害されるため、欠失または失活させるのはＰＤＣ遺伝子群の一部の遺伝子とする。
欠失または失活させるＰＤＣ遺伝子は、ＰＤＣ２遺伝子であることが特に好ましい。ＰＤＣ２遺伝子は、特に主要な機能を持つＰＤＣ遺伝子である。
前述のように、ＰＤＣ遺伝子を全て欠失または失活させてしまうと、その形質転換体はエタノール発酵が行えなくなるために生育が阻害される。そのため、ＰＤＣ遺伝子の欠失または失活は、生育に必要なエタノール発酵能を残して充分な形質転換体量が得られるようにしつつ、エタノール発酵能を低下させて乳酸の発酵効率を向上させられるように行わなければならない。該課題に対して本発明者等が検討を行った結果、ＰＤＣ２遺伝子を欠失または失活させるとＰＤＣ４遺伝子がある程度活性化し、充分な形質転換体量が得られる程度のエタノール発酵能と、高い発酵効率での乳酸の生産が両立できることを見い出した。
前述のように、ＰＤＣ遺伝子を全て欠失または失活させてしまうと、その形質転換体はエタノール発酵が行えなくなるために生育が阻害される。そのため、ＰＤＣ遺伝子の欠失または失活は、生育に必要なエタノール発酵能を残して充分な形質転換体量が得られるようにしつつ、エタノール発酵能を低下させて乳酸の発酵効率を向上させられるように行わなければならない。該課題に対して本発明者等が検討を行った結果、ＰＤＣ２遺伝子を欠失または失活させるとＰＤＣ４遺伝子がある程度活性化し、充分な形質転換体量が得られる程度のエタノール発酵能と、高い発酵効率での乳酸の生産が両立できることを見い出した。
ＰＤＣ遺伝子の欠失または失活は、公知の方法で行うことができる。たとえば、Ｌａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｒｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁、国際公開第２００７／０６３９１９号パンフレット等に記載）を用いることによりＰＤＣ遺伝子を欠失させることができる。
また、ＰＤＣ遺伝子の塩基配列の一部に欠失、挿入、置換、付加を起こすことにより、該ＰＤＣ遺伝子を失活させることもできる。欠失、挿入、置換、付加による変異は、それらのいずれか１つのみを起こしてもよく、２つ以上を起こしてもよい。
また、ＰＤＣ遺伝子の塩基配列の一部に欠失、挿入、置換、付加を起こすことにより、該ＰＤＣ遺伝子を失活させることもできる。欠失、挿入、置換、付加による変異は、それらのいずれか１つのみを起こしてもよく、２つ以上を起こしてもよい。
ＰＤＣ遺伝子の一部に前記変異を導入する方法は、公知の方法を用いることができる。たとえば、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用したランダム変異法（ピーシーアール・メソッズ・アプリケーション（ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．）、１９９２年、第２巻、ｐ．２８−３３．）が挙げられる。
また、一部に変異が導入されたＰＤＣ遺伝子は、温度感受性の変異型ピルビン酸脱炭酸酵素を発現するものであってもよい。温度感受性の変異型ピルビン酸脱炭酸酵素とは、ある培養温度においては野生型のピルビン酸脱炭酸酵素と同等の活性を示すが、特定の培養温度以上になると活性の消失または低下が見られる酵素である。
該変異型ピルビン酸脱炭酸酵素を発現する突然変異株は、温度により活性が制限されない条件下では野生型酵母と同等の生育速度を示し、活性が制限される特定の温度条件下において生育速度が著しく低下するものを選択することで得ることができる。
該変異型ピルビン酸脱炭酸酵素を発現する突然変異株は、温度により活性が制限されない条件下では野生型酵母と同等の生育速度を示し、活性が制限される特定の温度条件下において生育速度が著しく低下するものを選択することで得ることができる。
＜ＬＤＨ遺伝子＞
本発明に係る形質転換体は、少なくとも１のＬＤＨ遺伝子を有する。前記のように、Ｓ．ポンベは本来強い酵素活性を示すＬＤＨ遺伝子を有していない。したがって、Ｓ．ポンベ以外の生物のＬＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法でＳ．ポンベに導入して形質転換体を得る。
本発明に係る形質転換体は、少なくとも１のＬＤＨ遺伝子を有する。前記のように、Ｓ．ポンベは本来強い酵素活性を示すＬＤＨ遺伝子を有していない。したがって、Ｓ．ポンベ以外の生物のＬＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法でＳ．ポンベに導入して形質転換体を得る。
本発明に係る第２の形質転換体に組み込まれるＬＤＨ遺伝子の生物種は特に限定されない。また、本発明に係る第２の形質転換体に組み込まれるＬＤＨ遺伝子は、１つであってもよく、２以上であってもよい。宿主に複数のＬＤＨ遺伝子を導入する場合、同じ生物種由来のＬＤＨ遺伝子を複数導入しもよく、異種の生物種由来のＬＤＨ遺伝子を適宜組み合わせて導入してもよい。宿主であるＳ．ポンベに導入するＬＤＨ遺伝子の生物種およびコピー数を適宜調整することにより、増殖能を過度に損なうことなく、乳酸産生能の高い形質転換体を得ることができる。
本発明に係る形質転換体としては、Ｓ．ポンベを宿主とし、ＨｓＬＤＨ遺伝子（GenBank accession number：X02152.1）が３〜５コピー組み込まれ、かつ前記Ｓ．ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活しているもの（すなわち、前記第１の形質転換体）が好ましい。本発明に係る形質転換体が有するＨｓＬＤＨ遺伝子は、３〜４コピーがより好ましく、３コピーが最も好ましい。後記例１に示すように、ピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活しているＳ．ポンベ宿主にさらにＨｓＬＤＨ遺伝子を２コピー導入した形質転換体は、該Ｓ．ポンベ宿主にＨｓＬＤＨ遺伝子を１コピー導入した形質転換体よりも、乳酸産生能が向上している一方で、増殖能はやや低下する。にもかかわらず、該Ｓ．ポンベ宿主にＨｓＬＤＨ遺伝子を３コピー導入した形質転換体では、増殖能はＨｓＬＤＨ遺伝子１コピー導入した形質転換体とほぼ変わらないが、乳酸産生能は顕著に高い。
［形質転換体の製造］
本発明に係る形質転換体は、ＰＤＣ遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、これにＬＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法でＳ．ポンベに導入して得られる。また、ＰＤＣ遺伝子群が欠失も失活もしていないＳ．ポンベを宿主とし、該Ｓ．ポンベにＬＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法で導入して形質転換体を得て、その後得られた形質転換体のＰＤＣ遺伝子群の一部の遺伝子を欠失または失活させて、本発明に係る形質転換体を得ることもできる。後述の実施例では、前者の方法で目的の形質転換体を製造したが、後者の方法でもほぼ同等の形質転換体を製造できる。
本発明に係る形質転換体は、ＰＤＣ遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、これにＬＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法でＳ．ポンベに導入して得られる。また、ＰＤＣ遺伝子群が欠失も失活もしていないＳ．ポンベを宿主とし、該Ｓ．ポンベにＬＤＨ遺伝子を遺伝子工学的方法で導入して形質転換体を得て、その後得られた形質転換体のＰＤＣ遺伝子群の一部の遺伝子を欠失または失活させて、本発明に係る形質転換体を得ることもできる。後述の実施例では、前者の方法で目的の形質転換体を製造したが、後者の方法でもほぼ同等の形質転換体を製造できる。
以下、ＰＤＣ遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、これにＨｓＬＤＨ遺伝子３コピーを遺伝子工学的方法で導入する方法を例に、形質転換体の製造方法を説明する。
＜宿主＞
宿主とするＳ．ポンベは、野生型であってもよく、用途に応じて特定の遺伝子を欠失または失活させた変異型であってもよい。特定の遺伝子を欠失または失活させる方法としては、公知の方法を用いられる。具体的には、Latour法（Nucleic Acids Research誌、第34巻、e11ページ、2006年；国際公開第２００７／０６３９１９号パンフレット等に記載）を用いることにより遺伝子を欠失させられる。また、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用したランダム変異法（PCR Methods Application誌、第2巻、28-33ページ、1992年）等により遺伝子の一部に変異を導入することにより該遺伝子を失活させられる。特定遺伝子を欠失または失活させたシゾサッカロミセス属酵母宿主としては、たとえば、国際公開第２００２／１０１０３８号、国際公開第２００７／０１５４７０号等に記載されている。
また、特定の遺伝子の削除または不活性化を行う部分はＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）部分であってもよく、発現調節配列部分であってもよい。特に好ましい方法は、構造遺伝子のＯＲＦ部分をマーカー遺伝子に置換するＰＣＲ媒介相同組換え法（Yeast誌、第14巻、943-951ページ、1998年）による削除または不活性化の方法である。
宿主とするＳ．ポンベは、野生型であってもよく、用途に応じて特定の遺伝子を欠失または失活させた変異型であってもよい。特定の遺伝子を欠失または失活させる方法としては、公知の方法を用いられる。具体的には、Latour法（Nucleic Acids Research誌、第34巻、e11ページ、2006年；国際公開第２００７／０６３９１９号パンフレット等に記載）を用いることにより遺伝子を欠失させられる。また、変異剤を用いた突然変異分離法（酵母分子遺伝学実験法、１９９６年、学会出版センター）、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を利用したランダム変異法（PCR Methods Application誌、第2巻、28-33ページ、1992年）等により遺伝子の一部に変異を導入することにより該遺伝子を失活させられる。特定遺伝子を欠失または失活させたシゾサッカロミセス属酵母宿主としては、たとえば、国際公開第２００２／１０１０３８号、国際公開第２００７／０１５４７０号等に記載されている。
また、特定の遺伝子の削除または不活性化を行う部分はＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）部分であってもよく、発現調節配列部分であってもよい。特に好ましい方法は、構造遺伝子のＯＲＦ部分をマーカー遺伝子に置換するＰＣＲ媒介相同組換え法（Yeast誌、第14巻、943-951ページ、1998年）による削除または不活性化の方法である。
ＰＤＣ遺伝子が欠失または失活した変異体は、本発明に係る形質転換体を製造するための宿主として好ましく使用できる。さらに、ＰＤＣ遺伝子以外にさらにＰＤＣ遺伝子以外の特定遺伝子を欠失または失活させたＳ．ポンベを宿主とすることもできる。プロテアーゼ遺伝子等を欠失または失活させることにより異種蛋白質の発現効率を高めることができ、本発明における宿主に適用することにより乳酸の生産効率の向上が期待できる。
さらに宿主として使用するＳ．ポンベには、形質転換体を選択するためのマーカーを有するものを用いることが好ましい。たとえば、ある遺伝子が欠落していることにより特定の栄養成分が生育に必須である宿主を使用することが好ましい。目的遺伝子配列を含むベクターにより形質転換をして形質転換体を作製する場合、ベクターに該欠落している遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を組み込んでおくことにより、形質転換体では宿主の栄養要求性が消失する。該宿主と形質転換体の栄養要求性の相違により、両者を区別して形質転換体を得ることができる。
たとえば、オロチジンリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ４遺伝子）が欠失または失活してウラシル要求性となっているＳ．ポンベを宿主とし、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を有するベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、ベクターが組み込まれた形質転換体を得ることができる。宿主において欠落により栄養要求性となる遺伝子は、形質転換体の選択に用いられるものであればｕｒａ４遺伝子には限定されず、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）等であってもよい。
たとえば、オロチジンリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ４遺伝子）が欠失または失活してウラシル要求性となっているＳ．ポンベを宿主とし、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）を有するベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、ベクターが組み込まれた形質転換体を得ることができる。宿主において欠落により栄養要求性となる遺伝子は、形質転換体の選択に用いられるものであればｕｒａ４遺伝子には限定されず、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）等であってもよい。
また、ＰＤＣ遺伝子群が欠失も失活もしていないＳ．ポンベを形質転換体製造のための宿主として使用することもできる。この場合の宿主としては、ＰＤＣ遺伝子以外の前記のような遺伝子（栄養要求性マーカーおよびプロテアーゼ遺伝子など）が欠失または失活しているものを使用できる。該宿主を用いて形質転換体を製造した後、得られた形質転換体のＰＤＣ遺伝子群の一部の遺伝子を欠失または失活させて、本発明に係る形質転換体を得ることができる。
＜ＨｓＬＤＨ遺伝子導入方法＞
遺伝子工学的方法で宿主にＨｓＬＤＨ遺伝子を導入する方法としては、公知の方法を使用できる。Ｓ．ポンベを宿主としてこれに異種蛋白質の構造遺伝子を導入する方法としては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、国際公開第９５／０９９１４号、特開平１０−２３４３７５号公報、特開２０００−２６２２８４号公報、特開２００５−１９８６１２号公報、国際公開第２０１１／０２１６２９号などに記載の方法を使用できる。
遺伝子工学的方法で宿主にＨｓＬＤＨ遺伝子を導入する方法としては、公知の方法を使用できる。Ｓ．ポンベを宿主としてこれに異種蛋白質の構造遺伝子を導入する方法としては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、国際公開第９５／０９９１４号、特開平１０−２３４３７５号公報、特開２０００−２６２２８４号公報、特開２００５−１９８６１２号公報、国際公開第２０１１／０２１６２９号などに記載の方法を使用できる。
＜発現カセット＞
発現カセットとは、目的の蛋白質を発現するために必要なＤＮＡの組み合わせであり、目的の蛋白質をコードする構造遺伝子と宿主内で機能するプロモーターとターミネーターを含む。本発明に係る形質転換体の製造において、ＨｓＬＤＨ遺伝子の発現カセットは、ＨｓＬＤＨ遺伝子とＳ．ポンベ内で機能するプロモーターとＳ．ポンベ内で機能するターミネーターを含む。該発現カセットは、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。さらに、前記栄養要求性相補マーカーが含まれていてもよい。好ましい発現カセットは、ＨｓＬＤＨ遺伝子、プロモーター、ターミネーター、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、栄養要求性相補マーカーを含む発現カセットである。１の発現カセットには複数のＨｓＬＤＨ遺伝子が存在していてもよい。たとえば、１の発現カセット中に２〜５個のＨｓＬＤＨ遺伝子を含んでいてもよい。
発現カセットとは、目的の蛋白質を発現するために必要なＤＮＡの組み合わせであり、目的の蛋白質をコードする構造遺伝子と宿主内で機能するプロモーターとターミネーターを含む。本発明に係る形質転換体の製造において、ＨｓＬＤＨ遺伝子の発現カセットは、ＨｓＬＤＨ遺伝子とＳ．ポンベ内で機能するプロモーターとＳ．ポンベ内で機能するターミネーターを含む。該発現カセットは、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域のいずれか１つ以上が含まれていてもよい。さらに、前記栄養要求性相補マーカーが含まれていてもよい。好ましい発現カセットは、ＨｓＬＤＨ遺伝子、プロモーター、ターミネーター、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、栄養要求性相補マーカーを含む発現カセットである。１の発現カセットには複数のＨｓＬＤＨ遺伝子が存在していてもよい。たとえば、１の発現カセット中に２〜５個のＨｓＬＤＨ遺伝子を含んでいてもよい。
発現カセットに含めるＨｓＬＤＨ遺伝子の遺伝子配列としては、野生型がコードする遺伝子をそのまま用いてもよいが、宿主として用いるＳ．ポンベ内での発現量を増大させるために、野生型の遺伝子配列を、Ｓ．ポンベにおいて使用頻度の高いコドンに改変してもよい。
Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとターミネーターは、本発明に係る形質転換体により乳酸が蓄積して酸性になっても（ｐＨ６以下になっても）、形質転換体内で機能してＬＤＨの発現を維持できるものであればよい。Ｓ．ポンベ内で機能するプロモーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するプロモーター（転写開始活性が高いものが好ましい）またはＳ．ポンベが本来有しないプロモーター（ウイルス由来のプロモーターなど）を使用できる。なお、プロモーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
Ｓ．ポンベが本来有するプロモーターとしては、たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、チアミンの代謝に関与するｎｍｔ１遺伝子プロモーター、グルコースの代謝に関与するフルクトース−１、６−ビスホスファターゼ遺伝子プロモーター、カタボライト抑制に関与するインベルターゼ遺伝子のプロモーター（国際公開第９９／２３２２３号パンフレット参照）、熱ショック蛋白質遺伝子プロモーター（国際公開第２００７／２６６１７号パンフレット参照）などが挙げられる。
Ｓ．ポンベが本来有しないプロモーターとしては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられ、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが好ましい。
Ｓ．ポンベが本来有しないプロモーターとしては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられ、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターが好ましい。
Ｓ．ポンベ内で機能するターミネーターとしては、Ｓ．ポンベが本来有するターミネーターおよびＳ．ポンベが本来有しないターミネーターを使用できる。なお、ターミネーターはベクター内に２種以上存在していてもよい。
ターミネーターとしては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されているヒト由来のターミネーターが挙げられ、ヒト由来リポコルチンＩのターミネーターが好ましい。
ターミネーターとしては、たとえば、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、特開平１０−２３４３７５号公報に記載されているヒト由来のターミネーターが挙げられ、ヒト由来リポコルチンＩのターミネーターが好ましい。
＜ベクター＞
本発明に係る形質転換体は、ＨｓＬＤＨ遺伝子を含む発現カセットを、染色体中に有するか、または染色体外遺伝子として有する。発現カセットを染色体中に有するとは、宿主細胞の染色体中の１箇所以上に発現カセットが組み込まれていることであり、染色体外遺伝子として有するとは、発現カセットを含むプラスミドを細胞内に有することである。ＨｓＬＤＨ遺伝子を含む発現カセットを含む形質転換体は、ＨｓＬＤＨ遺伝子の発現カセットを含むベクターを用いて宿主であるＳ．ポンベを形質転換することにより得られる。
本発明に係る形質転換体は、ＨｓＬＤＨ遺伝子を含む発現カセットを、染色体中に有するか、または染色体外遺伝子として有する。発現カセットを染色体中に有するとは、宿主細胞の染色体中の１箇所以上に発現カセットが組み込まれていることであり、染色体外遺伝子として有するとは、発現カセットを含むプラスミドを細胞内に有することである。ＨｓＬＤＨ遺伝子を含む発現カセットを含む形質転換体は、ＨｓＬＤＨ遺伝子の発現カセットを含むベクターを用いて宿主であるＳ．ポンベを形質転換することにより得られる。
該ベクターは、環状ＤＮＡ構造または線状ＤＮＡ構造を有するベクターに、該発現カセットを組み込むことにより製造できる。該発現カセットが、宿主の細胞内で染色体外遺伝子として保持される形質転換体を作製する場合には、該ベクターは、宿主細胞内で複製されるための配列、即ち、自律複製配列（Autonomously Replicating Sequence:ARS）を含むプラスミドであることが好ましい。一方で、該発現カセットが、宿主細胞の染色体中に組み込まれた形質転換体を作製する場合には、該ベクターは、線状ＤＮＡ構造であり、かつＡＲＳを有していないものとして、宿主細胞へ導入されることが好ましい。たとえば、該ベクターは、線状ＤＮＡからなるベクターであってもよく、宿主への導入時に、線状ＤＮＡに切り開くための制限酵素認識配列を備える環状ＤＮＡ構造のベクターであってもよい。該ベクターがＡＲＳを有するプラスミドの場合、ＡＲＳ部分を削除して線状ＤＮＡ構造、またはＡＲＳ部分を開裂させることによりＡＲＳの機能を失活させた線状ＤＮＡ構造とした後、宿主へ導入できる。
該ベクターは、形質転換体を選択するためのマーカーを有することが好ましい。該マーカーとしては、たとえば、ｕｒａ４遺伝子（栄養要求性相補マーカー）、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｅｕ１遺伝子）が挙げられる。
ＨｓＬＤＨ遺伝子はＳ．ポンベの染色体に導入することが好ましい。染色体にＨｓＬＤＨ遺伝子を導入することにより継代の維持安定性に優れた形質転換体が得られる。本発明に係る形質転換体のうち、ＨｓＬＤＨ遺伝子３〜５コピーを有するものとしては、染色体中の１箇所に３〜５個のＨｓＬＤＨ遺伝子が導入されたものであってもよく、３〜５箇所にそれぞれ１個ずつＨｓＬＤＨ遺伝子が導入されたものであってもよい。
染色体にＨｓＬＤＨ遺伝子を導入する方法としては、公知の方法を使用できる。たとえば、前記特開２０００−２６２２８４号公報に記載の方法で染色体にＨｓＬＤＨ遺伝子を複数導入できる。また、該方法で染色体にＨｓＬＤＨ遺伝子を１個導入することもできる。また、後述のように、染色体の複数の箇所に１個または複数のＬＤＨ遺伝子を導入することもできる。
ＨｓＬＤＨ遺伝子をＳ．ポンベの染色体に導入する方法としては、ＨｓＬＤＨ遺伝子を有する発現カセットと組換え部位とを有するベクターを用い、相同組換え法により導入する方法が好ましい。
ＨｓＬＤＨ遺伝子をＳ．ポンベの染色体に導入する方法としては、ＨｓＬＤＨ遺伝子を有する発現カセットと組換え部位とを有するベクターを用い、相同組換え法により導入する方法が好ましい。
ベクターの組換え部位は、Ｓ．ポンベの染色体における相同組換えの標的部位に対して相同組換えを行わせることのできる塩基配列を有する部位である。また、標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体内で発現カセットを組み込む標的となる部位である。標的部位は、ベクターの組換え部位を該標的部位に対して相同組換えを行わせる塩基配列とすることにより自由に設定できる。
前記組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は７０％以上とすることが必要である。また、組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は、相同組換えが起きやすくなる点から、９０％以上とすることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。該組換え部位を有するベクターを用いることにより、発現カセットが相同組換えにより標的部位に組み込まれる。
組換え部位の長さ（塩基数）は、２０〜２０００ｂｐであることが好ましい。組換え部位の長さが２０ｂｐ以上であれば、相同組換えが起きやすくなる。また、組換え部位の長さが２０００ｂｐ以下であれば、ベクターが長くなりすぎて相同組換えが起き難くなることを防ぎやすい。組換え部位の長さは１００ｂｐ以上であることがより好ましく、２００ｂｐ以上であることがさらに好ましい。また、組換え部位の長さは８００ｂｐ以下であることがより好ましく、４００ｂｐ以下であることがさらに好ましい。
前記組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は７０％以上とすることが必要である。また、組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は、相同組換えが起きやすくなる点から、９０％以上とすることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。該組換え部位を有するベクターを用いることにより、発現カセットが相同組換えにより標的部位に組み込まれる。
組換え部位の長さ（塩基数）は、２０〜２０００ｂｐであることが好ましい。組換え部位の長さが２０ｂｐ以上であれば、相同組換えが起きやすくなる。また、組換え部位の長さが２０００ｂｐ以下であれば、ベクターが長くなりすぎて相同組換えが起き難くなることを防ぎやすい。組換え部位の長さは１００ｂｐ以上であることがより好ましく、２００ｂｐ以上であることがさらに好ましい。また、組換え部位の長さは８００ｂｐ以下であることがより好ましく、４００ｂｐ以下であることがさらに好ましい。
ベクターは、前記発現カセットと組換え部位以外に他のＤＮＡ領域を有していてもよい。たとえば、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域、抗生物質耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）が挙げられる。これらは大腸菌を使用してベクターを構築する場合に通常必要とされる遺伝子である。ただし、前記複製開始領域は後述のようにベクターを宿主の染色体に組み込む際には除去されることが好ましい。
染色体にＬＤＨ遺伝子を組み込む場合、ベクターは、Ｓ．ポンベの細胞に導入する際には線状ＤＮＡ構造で導入することが好ましい。すなわち、通常用いられるプラスミドＤＮＡ等の環状ＤＮＡ構造を有するベクターである場合には、制限酵素でベクターを線状に切り開いた後にＳ．ポンベの細胞に導入することが好ましい。
この場合、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く位置は、組換え部位内とする。これにより、切り開かれたベクターの両端にそれぞれ組換え部位が部分的に存在することとなり、相同組換えによりベクター全体が染色体の標的部位に組み込まれる。
ベクターは、両端それぞれに組換え部位の一部が存在するような線状ＤＮＡ構造とすることができれば、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く方法以外の方法で構築してもよい。
この場合、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く位置は、組換え部位内とする。これにより、切り開かれたベクターの両端にそれぞれ組換え部位が部分的に存在することとなり、相同組換えによりベクター全体が染色体の標的部位に組み込まれる。
ベクターは、両端それぞれに組換え部位の一部が存在するような線状ＤＮＡ構造とすることができれば、環状ＤＮＡ構造を有するベクターを切り開く方法以外の方法で構築してもよい。
ベクターとしては、たとえば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等の大腸菌由来のプラスミドを好適に用いることができる。
この場合、相同組換えに用いる際のプラスミドベクターは、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域が除去されていることが好ましい。これにより、上述したベクターを染色体に組み込む際に、その組み込み効率を向上させることができる。
複製開始領域が除去されたベクターの構築方法は特に限定されないが、特開２０００−２６２２８４号公報に記載されている方法を用いることが好ましい。すなわち、組換え部位内の切断箇所に複製開始領域が挿入された前駆体ベクターを構築しておき、前述のように線状ＤＮＡ構造とすると同時に複製開始領域が切り出されるようにする方法が好ましい。これにより、簡便に複製開始領域が除去されたベクターを得ることができる。
また、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、国際公開第９６／２３８９０号パンフレット、特開平１０−２３４３７５号公報等に記載された発現ベクターおよびその構築方法を適用して、発現カセットおよび組換え部位を有する前駆体ベクターを構築し、さらに通常の遺伝子工学的手法で該前駆体ベクターから複製開始領域を除去して相同組換えに用いるベクターを得る方法であってもよい。
この場合、相同組換えに用いる際のプラスミドベクターは、大腸菌内での複製のために必要な「ｏｒｉ」と呼ばれる複製開始領域が除去されていることが好ましい。これにより、上述したベクターを染色体に組み込む際に、その組み込み効率を向上させることができる。
複製開始領域が除去されたベクターの構築方法は特に限定されないが、特開２０００−２６２２８４号公報に記載されている方法を用いることが好ましい。すなわち、組換え部位内の切断箇所に複製開始領域が挿入された前駆体ベクターを構築しておき、前述のように線状ＤＮＡ構造とすると同時に複製開始領域が切り出されるようにする方法が好ましい。これにより、簡便に複製開始領域が除去されたベクターを得ることができる。
また、特開平５−１５３８０号公報、特開平７−１６３３７３号公報、国際公開第９６／２３８９０号パンフレット、特開平１０−２３４３７５号公報等に記載された発現ベクターおよびその構築方法を適用して、発現カセットおよび組換え部位を有する前駆体ベクターを構築し、さらに通常の遺伝子工学的手法で該前駆体ベクターから複製開始領域を除去して相同組換えに用いるベクターを得る方法であってもよい。
＜標的部位＞
ベクターを組み込む標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体中の１箇所のみに存在していてもよく、２箇所以上に存在していてもよい。標的部位が２箇所以上存在している場合、Ｓ．ポンベの染色体の２箇所以上に該ベクターを組み込める。また、１の発現カセット中のＬＤＨ遺伝子を複数とした場合には、標的部位の１箇所に複数のＬＤＨ遺伝子を組み込むことができる。さらに、２種以上の標的部位に、それぞれの標的部位に対応する組換え部位を有する２種以上のベクターを用いて、発現カセットを組み込むこともできる。該方法で、Ｓ．ポンベの染色体に複数のＬＤＨ遺伝子を組み込むことができ、これによりＬＤＨの発現量を増大させ、乳酸の生産性を向上させることができる。
ベクターを組み込む標的部位は、Ｓ．ポンベの染色体中の１箇所のみに存在していてもよく、２箇所以上に存在していてもよい。標的部位が２箇所以上存在している場合、Ｓ．ポンベの染色体の２箇所以上に該ベクターを組み込める。また、１の発現カセット中のＬＤＨ遺伝子を複数とした場合には、標的部位の１箇所に複数のＬＤＨ遺伝子を組み込むことができる。さらに、２種以上の標的部位に、それぞれの標的部位に対応する組換え部位を有する２種以上のベクターを用いて、発現カセットを組み込むこともできる。該方法で、Ｓ．ポンベの染色体に複数のＬＤＨ遺伝子を組み込むことができ、これによりＬＤＨの発現量を増大させ、乳酸の生産性を向上させることができる。
１箇所の標的部位に発現カセットを組み込む場合、たとえば特開２０００−２６２２８４号公報に記載の方法記載の標的部位を使用できる。異なる組込み部位を有する２種以上のベクターを用いて、異なる標的部位にそれぞれベクターを組み込むことができる。しかし、染色体の２箇所以上にベクターを組み込む場合、該方法は煩雑である。
染色体中に複数箇所存在する互いに実質的に同一の塩基配列部分を標的部位として、該複数箇所の標的部位にそれぞれベクターを組み込むことができれば、１種類のベクターを使用して染色体の２箇所以上にベクターを組み込むことができる。互いに実質的に同一の塩基配列とは、塩基配列の相同性が９０％以上であることを意味する。標的部位同士の相同性は９５％以上であることが好ましい。また、互いに実質的に同一である塩基配列の長さは、前記ベクターの組換え部位を包含する長さであり、１０００ｂｐ以上であることが好ましい。１箇所の標的部位に複数のＬＤＨ遺伝子が組み込まれている場合に比較して、ＬＤＨ遺伝子の組み込み数が同一であっても、複数存在する標的部位にＬＤＨ遺伝子が分散して組み込まれている場合には、形質転換体が増殖する際にＬＤＨ遺伝子が染色体から１度に脱落することが少なくなり、形質転換体の継代における維持安定性が向上する。
染色体中の３箇所の標的部位にそれぞれ１個のＨｓＬＤＨ遺伝子を有する発現カセットを組み込む場合、該発現カセットを組み込む標的部位としては、たとえば、ｕｒａ４遺伝子座近傍、ｌｅｕ１遺伝子座近傍、ａｄｈ１遺伝子座近傍、ｇｐｄ１遺伝子座近傍、ｅｎｏ１０１遺伝子座近傍、ｌｅｕ１遺伝子座近傍、およびｇｐｍ１遺伝子座近傍から選ばれる３箇所が挙げられる。
なお、「Ｘ遺伝子座近傍」とは、染色体中のＸ遺伝子のＯＲＦの上流端から上流１０ｋｂｐ（１００００ｂｐ）から、該ＯＲＦの下流端から下流１０ｋｂｐまでの範囲内であって、他の遺伝子のＯＲＦを含まない領域を意味する。
本発明に係る形質転換体としては、ＨｓＬＤＨ遺伝子が、Ｓ．ポンベの染色体中のｅｎｏ１０１遺伝子座近傍、ｌｅｕ１遺伝子座近傍、およびｇｐｍ１遺伝子座近傍から選ばれる標的部位に導入されているものが好ましい。すなわち、本発明に係る形質転換体としては、ＨｓＬＤＨ遺伝子が、Ｓ．ポンベの染色体中のｅｎｏ１０１遺伝子座上流１００００ｂｐから下流１００００ｂｐの領域、ｌｅｕ１遺伝子座上流１００００ｂｐから下流１００００ｂｐの領域、およびｇｐｍ１遺伝子座上流１００００ｂｐから下流１００００ｂｐの領域から選ばれる領域に導入されているものが好ましく、Ｓ．ポンベの染色体中のｅｎｏ１０１遺伝子座上流５０００ｂｐから下流５０００ｂｐの領域、ｌｅｕ１遺伝子座上流５０００ｂｐから下流５０００ｂｐの領域、およびｇｐｍ１遺伝子座上流５０００ｂｐから下流５０００ｂｐの領域から選ばれる領域に導入されているものがより好ましい。
染色体中に複数箇所存在する標的部位としては、トランスポゾン遺伝子Ｔｆ２が挙げられる。Ｔｆ２は、Ｓ．ポンベの３本（一倍体）の染色体それぞれに合計１３箇所存在するトランスポゾン遺伝子であり、長さ（塩基数）は約４９００ｂｐであり、それらの遺伝子間における塩基配列相同性は９９．７％であることが知られている（下記文献参照）。
Nathan J. Bowen et al, “Retrotransposons and Their Recognition of pol II Promoters: A Comprehensive Survey of the Transposable Elements From the Complete Genome Sequence of Schizosaccharomyces pombe”, Genome Res. 2003 13: 1984-1997
Nathan J. Bowen et al, “Retrotransposons and Their Recognition of pol II Promoters: A Comprehensive Survey of the Transposable Elements From the Complete Genome Sequence of Schizosaccharomyces pombe”, Genome Res. 2003 13: 1984-1997
染色体に１３箇所存在するＴｆ２の１箇所のみにベクターを組み込むことができる。この場合、２個以上のＬＤＨ遺伝子を有するベクターを組み込むことにより、２個以上のＬＤＨ遺伝子を有する形質転換体を得ることができる。また、Ｔｆ２の２箇所以上にベクターを組み込むことにより、２個以上のＬＤＨ遺伝子を有する形質転換体を得ることができる。この場合、２個以上のＬＤＨ遺伝子を有するベクターを組み込むことにより、さらに多くのＬＤＨ遺伝子を有する形質転換体を得ることができる。
＜形質転換方法＞
形質転換方法は、公知の形質転換方法がいずれも用いられる。該形質転換方法としては、たとえば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、ガラスビーズ法など従来周知の方法、特開２００５−１９８６１２号公報記載の方法が挙げられる。また、市販の酵母形質転換用キットを用いてもよい。
形質転換方法は、公知の形質転換方法がいずれも用いられる。該形質転換方法としては、たとえば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、ガラスビーズ法など従来周知の方法、特開２００５−１９８６１２号公報記載の方法が挙げられる。また、市販の酵母形質転換用キットを用いてもよい。
Ｓ．ポンベ宿主を相同組み換え法で形質転換する方法としては、公知の相同組み換え法を使用できる。本発明に係る形質転換体を製造する際の形質転換方法としては、上述のＰＤＣ遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活したＳ．ポンベを宿主とし、その染色体に上述のベクターを用いて、発現カセットを相同組換えにより組み込む方法が好ましい。該方法によれば、本発明に係る形質転換体を簡便に製造できる。
形質転換体の製造では、通常、相同組換えを行った後、得られた形質転換体を選択する。選択する方法としては、たとえば、以下に示す方法が挙げられる。前記栄養要求性マーカーにより形質転換体を選択できる培地によりスクリーニングし、得られたコロニーから複数を選択する。次に、それらを別々に液体培養した後、それぞれの培養液における異種蛋白質（本発明においては、ＨｓＬＤＨ）の発現量を調べ、該異種蛋白質の発現量がより多い形質転換体を選択する。それら選択した形質転換体に対してパルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行うことにより、染色体に組み込まれたベクターの数および発現カセットの数を調べられる。
染色体に組み込まれるベクターの数は組み込み条件などを調整することによりある程度は調整可能である。ベクターの大きさ（塩基数）および構造により、組み込み効率および組み込み数も変化すると考えられる。
染色体に組み込まれるベクターの数は組み込み条件などを調整することによりある程度は調整可能である。ベクターの大きさ（塩基数）および構造により、組み込み効率および組み込み数も変化すると考えられる。
一般には発現カセットの数が多いほどＬＤＨの発現効率が高まり、ひいては乳酸の生産効率が高まると予想される。このため、Ｓ．ポンベの染色体に複数のＬＤＨ遺伝子を組み込むことによりＬＤＨの発現量を増大させ、乳酸の生産性を向上させることができると考えられる。しかし、発現カセットの数が多すぎると細胞の生存および増殖に対する負荷が増大し、ひいては乳酸生産効率が低下することも考えられる。一方で、１の発現カセットに複数の遺伝子を含ませることにより、染色体に組み込む発現カセットの数を抑えつつ、多数のＬＤＨ遺伝子を染色体に組み込むことができる。しかし、ベクターが大きくなると、染色体に組み込まれる確率が低下し、組み込まれるベクター数を多くすることが困難となり、ひいては形質転換体を得ること自体が困難となると考えられる。
そこで、本発明者等は、適度な大きさの発現カセットを染色体に比較的少数組み込んだ場合でも、より高い乳酸生産効率を有するＳ．ポンベ形質転換体を得るためには、Ｓ．ポンベにおける発現効率が高く、かつ発現したＬＤＨの活性も高い外来ＬＤＨ遺伝子を選択して適切なコピー数導入することが必要であると考えた。そして、ＨｓＬＤＨ遺伝子３〜５コピーをＰＤＣ遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活しているＳ．ポンベ形質転換体に組み込むことにより、ＨｓＬＤＨ遺伝子１コピーまたは２コピーを組み込んだＳ．ポンベ形質転換体よりも、乳酸産生効率が非常に高く、増殖能はさほど損なわれていない形質転換体が得られることがわかった。
［乳酸の製造方法］
本発明に係る乳酸の製造方法は、前記本発明に係る形質転換体を培養液中で培養し、該培養液から乳酸を取得する乳酸の製造方法である。
本発明に係る形質転換体を、糖を含む培養液中で培養することにより、解糖系により該糖から得られるピルビン酸がＬＤＨにより還元されて乳酸が産生され、培養液に産出された乳酸を培養液から取得することで乳酸を製造できる。
本発明に係る乳酸の製造方法は、前記本発明に係る形質転換体を培養液中で培養し、該培養液から乳酸を取得する乳酸の製造方法である。
本発明に係る形質転換体を、糖を含む培養液中で培養することにより、解糖系により該糖から得られるピルビン酸がＬＤＨにより還元されて乳酸が産生され、培養液に産出された乳酸を培養液から取得することで乳酸を製造できる。
乳酸の製造に用いる培養液としては、糖を含有する公知の酵母培養培地を用いることができ、さらにＳ．ポンベが資化しうる窒素源、無機塩類等を含有し、Ｓ．ポンベの培養を効率良く行えるものであればよい。培養液としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。
炭素源である糖としては、たとえば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース等の糖が挙げられる。窒素源としては、たとえば、アンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または無機酸のアンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸、イーストエキス等が挙げられる。無機塩類としては、たとえば、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。さらには、プロテオリピド等の発酵促進因子などを含ませることができる。
炭素源である糖としては、たとえば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース等の糖が挙げられる。窒素源としては、たとえば、アンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または無機酸のアンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸、イーストエキス等が挙げられる。無機塩類としては、たとえば、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。さらには、プロテオリピド等の発酵促進因子などを含ませることができる。
本発明に係る乳酸の製造方法では、糖として特にグルコースを含有する培養液を用いることが好ましい。培養初期の培養液（１００質量％）中のグルコース濃度は１質量％以上が好ましく、１〜５０質量％がより好ましく、２〜１６質量％がさらに好ましい。培養によりグルコース濃度が低下することより、必要によりグルコースを添加して培養を継続することが好ましい。培養終期のグルコース濃度は１質量％以下となってもよい。また、乳酸を分離しながら培養液を循環させて連続的に培養を行う場合には、前記グルコース濃度を維持することが好ましい。グルコース濃度を２質量％以上とすることにより、乳酸の生産性がより向上する。また、培養液中のグルコースを１６質量％以下とすることにより、乳酸の生産効率がより向上する。
また、乳酸製造の生産性を高くするために、高密度培養を行うことが好ましい。高密度培養では、培養液中の形質転換体の初発菌体濃度を乾燥菌体重量換算値で表して０．１〜５ｇ／Ｌとすることが好ましい。培養液中の形質転換体の初発菌体濃度を乾燥菌体重量換算値で表して０．２〜２ｇ／Ｌとすることがより好ましい。初発菌体濃度を高くすることにより短時間で高い生産性を達成できる。また、初発菌体濃度があまりに高すぎると菌体の凝集および精製効率の低下等の問題が生じるおそれがある。
なお、後述の実施例等で示す菌体濃度は、日本分光社製可視紫外分光器Ｖ５５０によって測定した波長６６０ｎｍの光の吸光度（ＯＤ６６０）から換算した値である。６６０ｎｍにおけるＯＤ６６０＝１は、分裂酵母乾燥重量の０．２ｇ、湿重量の０．８ｇに相当する。
なお、後述の実施例等で示す菌体濃度は、日本分光社製可視紫外分光器Ｖ５５０によって測定した波長６６０ｎｍの光の吸光度（ＯＤ６６０）から換算した値である。６６０ｎｍにおけるＯＤ６６０＝１は、分裂酵母乾燥重量の０．２ｇ、湿重量の０．８ｇに相当する。
培養には公知の酵母培養方法を用いることができ、たとえば振とう培養、攪拌培養等により行うことができる。
また、培養温度は、２３〜３７℃であることが好ましい。また、培養時間は適宜決定できる。
また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。たとえば、回分培養で培養を行った後、菌体を培養液から分離して、乳酸を含む培養液を取得できる。また、連続培養法では、たとえば、培養中の培養槽から培養液の一部を抜き出し、抜き出した培養液から乳酸を分離するとともに、培養上清を回収し、該培養上清にグルコースおよび新たな培養液等を加えて培養槽に戻すことを繰り返して、連続的に培養する方法が挙げられる。連続培養を行うことにより、乳酸の生産性がより向上する。
また、培養温度は、２３〜３７℃であることが好ましい。また、培養時間は適宜決定できる。
また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。たとえば、回分培養で培養を行った後、菌体を培養液から分離して、乳酸を含む培養液を取得できる。また、連続培養法では、たとえば、培養中の培養槽から培養液の一部を抜き出し、抜き出した培養液から乳酸を分離するとともに、培養上清を回収し、該培養上清にグルコースおよび新たな培養液等を加えて培養槽に戻すことを繰り返して、連続的に培養する方法が挙げられる。連続培養を行うことにより、乳酸の生産性がより向上する。
本発明に係る形質転換体を用いた乳酸の製造方法では、耐酸性に特に優れたＳ．ポンベを用いているため、乳酸の蓄積により低ｐＨ（ｐＨ２〜４程度）となっても中和を行わずに乳酸を生産できる。そのため、培養液のｐＨが３．５以下になった後も、さらに培養を継続する連続培養により乳酸を製造できる。培養終期のｐＨおよび連続培養におけるｐＨは、３．５以下が好ましく、特に２．３〜３．５が好ましい。乳酸の生産性を高くするために、培養液のｐＨが３．５以下になった後にさらに培養を継続することが好ましい。本発明に係る形質転換体は耐酸性が優れているため、該形質転換体により産生された培養液中の乳酸を中和することなく培養を継続できる。
培養液からの乳酸の取得は、公知の方法を用いることができる。特に、培養液中の乳酸を中和することなく、培養液と乳酸を分離して、乳酸を取得することが好ましい。たとえば、培養終了後の培養液から遠心分離により菌体を分離し、ｐＨ１以下にした後にジエチルエーテルや酢酸エチル等により抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着させて洗浄した後に溶出させる方法、活性炭を用いて不純物を除去する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させた後に蒸留する方法、分離膜を用いて分離する方法が挙げられる。また、場合によっては培養液中の乳酸を中和した後培養液と乳酸塩を分離して、乳酸を取得することもできる。たとえば、培養液中の乳酸をカルシウム塩またはリチウム塩に変換し、該中和塩を晶析する方法で乳酸を取得することもできる。
以上説明した本発明に係る乳酸の製造方法は、特に耐酸性に優れたＳ．ポンベを宿主とする形質転換体を用いるため、アルカリによる中和を行わなくても高い生産性で簡便に乳酸を製造できる。また、ＰＤＣ遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活していることでエタノール発酵の効率が低下しているため、乳酸の対糖収率（消費された糖の量に対する乳酸の生産量の割合）が向上する。本発明においては、乳酸の対糖収率を５０％以上とすることが容易にできる。場合により、乳酸の対糖収率は７０％以上にも達する。また、本発明に係る乳酸の製造方法は、高濃度のグルコース存在下、および高濃度の形質転換体による高密度培養にも適している。
以下、実施例および比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。また、本実施例においては特に断りのない限り「％」は「質量％」を意味する。
［例１］
Ｓ．ポンベを宿主とし、ＰＤＣ２遺伝子が削除され、かつＨｓＬＤＨ遺伝子が３コピー導入された形質転換体を作製した。
Ｓ．ポンベを宿主とし、ＰＤＣ２遺伝子が削除され、かつＨｓＬＤＨ遺伝子が３コピー導入された形質転換体を作製した。
＜Ｓ．ポンベＰＤＣ２遺伝子削除株の作製＞
Ｓ．ポンベのウラシル要求性株ＡＲＣ０１０株（遺伝子型：ｈ− 、ｌｅｕ１−３２、ｕｒａ４−Ｄ１８）（国際公開第２００７／０１５４７０号パンフレット参照。）を、ｐｄｃ２削除断片で、東田らの方法（米国特許第６，２３５，４９９号明細書参照。）に従って形質転換し、該断片がＳ．ポンベのゲノム上のｐｄｃ２遺伝子座近傍に導入された形質転換体を得た。該形質転換体を、さらにＬａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁、国際公開第２００７／０６３９１９号パンフレットに記載）に従ってＦＯＡ処理し、ＰＤＣ２遺伝子（系統名：SPAC1F8.07c）を削除した削除株（ＩＧＦ５４３株）を作製した。
ｐｄｃ２削除断片（２８１１ｂｐ、配列番号１１）の作製には、Ｓ．ポンベのＡＲＣ０３２株（遺伝子型：ｈ−）（国際公開第２００７／０１５４７０号パンフレット参照。）からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示す塩基配列を有する８種の合成オリゴＤＮＡ（オペロン社製）を使用した。
Ｓ．ポンベのウラシル要求性株ＡＲＣ０１０株（遺伝子型：ｈ− 、ｌｅｕ１−３２、ｕｒａ４−Ｄ１８）（国際公開第２００７／０１５４７０号パンフレット参照。）を、ｐｄｃ２削除断片で、東田らの方法（米国特許第６，２３５，４９９号明細書参照。）に従って形質転換し、該断片がＳ．ポンベのゲノム上のｐｄｃ２遺伝子座近傍に導入された形質転換体を得た。該形質転換体を、さらにＬａｔｏｕｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．誌、２００６年、３４巻、ｅ１１頁、国際公開第２００７／０６３９１９号パンフレットに記載）に従ってＦＯＡ処理し、ＰＤＣ２遺伝子（系統名：SPAC1F8.07c）を削除した削除株（ＩＧＦ５４３株）を作製した。
ｐｄｃ２削除断片（２８１１ｂｐ、配列番号１１）の作製には、Ｓ．ポンベのＡＲＣ０３２株（遺伝子型：ｈ−）（国際公開第２００７／０１５４７０号パンフレット参照。）からＤＮｅａｓｙ（キアゲン社製）によって調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示す塩基配列を有する８種の合成オリゴＤＮＡ（オペロン社製）を使用した。
具体的には、ＵＦとＵＲでＵＰ領域を、ＯＦとＯＲでＯＬ領域を、ＤＦとＤＲでＤＮ領域をそれぞれＫＯＤ−Ｄａｓｈ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ法によって作製したのち、さらにそれらを鋳型として、それぞれＦＦとＦＲを用いた同様のＰＣＲ法によって全長の削除断片を作製した。全長の削除断片作製時には、表２に示す塩基配列を有する２種の合成オリゴＤＮＡ（オペロン社製）を用い、ＡＲＣ０３２株より同様に調製した全ゲノムＤＮＡを鋳型とし、同様のＰＣＲ法によって調製したｕｒａ４領域断片も鋳型として合わせて使用した。
得られたＳ．ポンベＰＤＣ２遺伝子削除株（ＩＧＦ５４３株、ｈ− ｌｅｕ１−３２ｕｒａ４−Ｄ１８ ｐｄｃ２−Ｄ２３）は生育速度が遅いものであった。そこで、その生育速度を回復すべく、ＩＧＦ５４３株をＹＥＳプレート（イーストエキス０．５％／グルコース３％／ＳＰサプリメント）にストリークして２５℃にて培養し、得られたコロニーをＹＰＤ培地（イーストエキス１％／ペプトン２％／グルコース２％）に植え継ぎ２５℃にて培養し、充分に生育した培養液を用いてグリセロールストックを作製し、−８０℃にて保存した。前記作業を適切な生育速度が得られるまで繰り返し、生育速度の回復した株を作製した（名称はＩＧＦ５４３を継承）。
＜Ｓ．ポンベＨｓＬＤＨ遺伝子１コピー導入株の作製＞
まず、ＨｓＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持する単座組込型組換えベクターｐＳＭ−ＨｓＬＤＨベクター（４５６２ｂｐ、図１）を作製した。ｐＳＭ−ＨｓＬＤＨベクターは、ＤＮＡ合成により、配列番号１２に示す塩基配列からなるＤＮＡ断片として作製した。
次いで、ＩＧＦ５４３株を、ｐＳＭ−ＨｓＬＤＨベクターで形質転換した。該操作により、ＨｓＬＤＨ発現カセットがゲノム上のｇｐｍ１遺伝子座近傍に導入された。該形質転換株（ＨｓＬＤＨ遺伝子１コピー導入株）をＡＳＰ３４９４株とした。
まず、ＨｓＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持する単座組込型組換えベクターｐＳＭ−ＨｓＬＤＨベクター（４５６２ｂｐ、図１）を作製した。ｐＳＭ−ＨｓＬＤＨベクターは、ＤＮＡ合成により、配列番号１２に示す塩基配列からなるＤＮＡ断片として作製した。
次いで、ＩＧＦ５４３株を、ｐＳＭ−ＨｓＬＤＨベクターで形質転換した。該操作により、ＨｓＬＤＨ発現カセットがゲノム上のｇｐｍ１遺伝子座近傍に導入された。該形質転換株（ＨｓＬＤＨ遺伝子１コピー導入株）をＡＳＰ３４９４株とした。
＜Ｓ．ポンベＨｓＬＤＨ遺伝子２コピー導入株の作製＞
ＡＳＰ３４９４株を、ＨｓＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持し、ｉｈｃ１プロモーターを有する単座組込型組換えベクターｐＳＬ１７−ＨｓＬＤＨ（特許文献３参照。）の制限酵素ＢｓｉＷＩ消化物で、Ｂａｈｌｅｒらの方法（Ｙｅａｓｔ誌、１９９８年、１４巻、９４３−９５１頁）に従い形質転換した。該操作により、該発現カセットがゲノム上のｌｅｕ１遺伝子座近傍に導入され、ｇｐｍ１遺伝子座近傍にｈＣＭＶプロモーターによって制御されたＨｓＬＤＨ遺伝子を１コピーと、Ｌｅｕ１遺伝子座近傍にｉｈｃプロモーターによって制御されたＨｓＬＤＨ遺伝子を１コピーとの合計２コピーのＨｓＬＤＨ遺伝子が導入された形質転換株を作製した。該形質転換株（ＨｓＬＤＨ遺伝子２コピー導入株）をＡＳＰ４１２１株とした。
ＡＳＰ３４９４株を、ＨｓＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持し、ｉｈｃ１プロモーターを有する単座組込型組換えベクターｐＳＬ１７−ＨｓＬＤＨ（特許文献３参照。）の制限酵素ＢｓｉＷＩ消化物で、Ｂａｈｌｅｒらの方法（Ｙｅａｓｔ誌、１９９８年、１４巻、９４３−９５１頁）に従い形質転換した。該操作により、該発現カセットがゲノム上のｌｅｕ１遺伝子座近傍に導入され、ｇｐｍ１遺伝子座近傍にｈＣＭＶプロモーターによって制御されたＨｓＬＤＨ遺伝子を１コピーと、Ｌｅｕ１遺伝子座近傍にｉｈｃプロモーターによって制御されたＨｓＬＤＨ遺伝子を１コピーとの合計２コピーのＨｓＬＤＨ遺伝子が導入された形質転換株を作製した。該形質転換株（ＨｓＬＤＨ遺伝子２コピー導入株）をＡＳＰ４１２１株とした。
＜ウラシル要求性の復帰＞
ｐＳＭ−ＨｓＬＤＨベクターによりＳ．ポンベのゲノムに導入されたｕｒａ４遺伝子は、２つのｈＣＭＶプロモーター配列に挟まれている為、ホモロガスリコンビネーションによりゲノム上から脱落しやすい。
そこで、ＡＳＰ４１２１株をＦＯＡ処理し、ウラシルの要求性を復帰させた。
ｐＳＭ−ＨｓＬＤＨベクターによりＳ．ポンベのゲノムに導入されたｕｒａ４遺伝子は、２つのｈＣＭＶプロモーター配列に挟まれている為、ホモロガスリコンビネーションによりゲノム上から脱落しやすい。
そこで、ＡＳＰ４１２１株をＦＯＡ処理し、ウラシルの要求性を復帰させた。
＜Ｓ．ポンベＨｓＬＤＨ遺伝子３コピー導入株の作製＞
まず、ＨｓＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持する単座組込型組換えベクターｐＳＮ−ＨｓＬＤＨベクター（４５３５ｂｐ、図２）を作製した。ｐＳＮ−ＨｓＬＤＨベクターは、ＤＮＡ合成により、配列番号１３に示す塩基配列からなるＤＮＡ断片として作製した。
次いで、ＡＳＰ４１２１株をＦＯＡ処理してウラシルの要求性を復帰させた形質転換株を、ｐＳＮ−ＨｓＬＤＨベクターで形質転換した。該操作により、ＨｓＬＤＨ発現カセットがゲノム上のｅｎｏ１０１遺伝子座近傍に導入され、ｇｐｍ１遺伝子座近傍にｈＣＭＶプロモーターによって制御されたＨｓＬＤＨ遺伝子を１コピーと、Ｌｅｕ１遺伝子座近傍にｉｈｃプロモーターによって制御されたＨｓＬＤＨ遺伝子を１コピーと、ｅｎｏ１０１遺伝子座近傍にｈＣＭＶプロモーターによって制御されたＨｓＬＤＨ遺伝子を１コピーとの合計３コピーのＨｓＬＤＨ遺伝子が導入された形質転換株を作製した。該形質転換株（ＨｓＬＤＨ遺伝子３コピー導入株）をＡＳＰ４９５６株とした。
まず、ＨｓＬＤＨ遺伝子発現カセットを保持する単座組込型組換えベクターｐＳＮ−ＨｓＬＤＨベクター（４５３５ｂｐ、図２）を作製した。ｐＳＮ−ＨｓＬＤＨベクターは、ＤＮＡ合成により、配列番号１３に示す塩基配列からなるＤＮＡ断片として作製した。
次いで、ＡＳＰ４１２１株をＦＯＡ処理してウラシルの要求性を復帰させた形質転換株を、ｐＳＮ−ＨｓＬＤＨベクターで形質転換した。該操作により、ＨｓＬＤＨ発現カセットがゲノム上のｅｎｏ１０１遺伝子座近傍に導入され、ｇｐｍ１遺伝子座近傍にｈＣＭＶプロモーターによって制御されたＨｓＬＤＨ遺伝子を１コピーと、Ｌｅｕ１遺伝子座近傍にｉｈｃプロモーターによって制御されたＨｓＬＤＨ遺伝子を１コピーと、ｅｎｏ１０１遺伝子座近傍にｈＣＭＶプロモーターによって制御されたＨｓＬＤＨ遺伝子を１コピーとの合計３コピーのＨｓＬＤＨ遺伝子が導入された形質転換株を作製した。該形質転換株（ＨｓＬＤＨ遺伝子３コピー導入株）をＡＳＰ４９５６株とした。
＜ウラシル要求性の復帰＞
ｐＳＭ−ＨｓＬＤＨベクターによる場合と同様に、ｐＳＮ−ＨｓＬＤＨベクターによりＳ．ポンベのゲノムに導入されたｕｒａ４遺伝子は、２つのｈＣＭＶプロモーター配列に挟まれている為、ホモロガスリコンビネーションによりゲノム上から脱落しやすい。
そこで、ＡＳＰ４９５６株をＦＯＡ処理し、ウラシルの要求性を復帰させた。
ｐＳＭ−ＨｓＬＤＨベクターによる場合と同様に、ｐＳＮ−ＨｓＬＤＨベクターによりＳ．ポンベのゲノムに導入されたｕｒａ４遺伝子は、２つのｈＣＭＶプロモーター配列に挟まれている為、ホモロガスリコンビネーションによりゲノム上から脱落しやすい。
そこで、ＡＳＰ４９５６株をＦＯＡ処理し、ウラシルの要求性を復帰させた。
＜ウラシル要求性の補完＞
ＡＳＰ４９５６株をＦＯＡ処理してウラシルの要求性を復帰させた形質転換株を、ｕｒａ４遺伝子を含むＤＮＡ断片（３２７７ｂｐ、配列番号１４）で形質転換し、ウラシル要求性が補完された形質転換株を作製した。該形質転換株（ＨｓＬＤＨ遺伝子３コピー導入栄養要求補完株）をＡＳＰ５０１９株とした。
ＡＳＰ４９５６株をＦＯＡ処理してウラシルの要求性を復帰させた形質転換株を、ｕｒａ４遺伝子を含むＤＮＡ断片（３２７７ｂｐ、配列番号１４）で形質転換し、ウラシル要求性が補完された形質転換株を作製した。該形質転換株（ＨｓＬＤＨ遺伝子３コピー導入栄養要求補完株）をＡＳＰ５０１９株とした。
＜培養試験＞
ＡＳＰ５０１９株と、特許文献３に記載のＡＳＰ３５０９株、ＡＳＰ２９１４株、ＡＳＰ３６１９株、ＡＳＰ３６２１株、ＡＳＰ３６３１株、ＡＳＰ３６２２株、およびＡＳＰ３６２３株の増殖能と乳酸産生能を比較した。ＡＳＰ３５０９株はＩＧＦ５４３株にＨｓＬＤＨ遺伝子１コピーを導入した株であり、ＡＳＰ２９１４株はＩＧＦ５４３株にＨｓＬＤＨ遺伝子２コピーを導入した株であり、ＡＳＰ３６１９株はＩＧＦ５４３株にＨｓＬＤＨ遺伝子１コピーとＬｂＬＤＨ遺伝子（ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）のＬＤＨ遺伝子）１コピーを導入した株であり、ＡＳＰ３６２１株はＩＧＦ５４３株にＨｓＬＤＨ遺伝子１コピーとＳａＬＤＨ遺伝子（スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のＬＤＨ遺伝子）１コピーを導入した株であり、ＡＳＰ３６３１株はＩＧＦ５４３株にＨｓＬＤＨ遺伝子１コピーとＬｐＬＤＨ遺伝子１コピーを導入した株であり、ＡＳＰ３６２２株はＩＧＦ５４３株にＨｓＬＤＨ遺伝子１コピーとＬｐｌＬＤＨ遺伝子（ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のＬＤＨ遺伝子）１コピーを導入した株であり、ＡＳＰ３６２３株はＩＧＦ５４３株にＨｓＬＤＨ遺伝子１コピーとＰａＬＤＨ遺伝子（ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）のＬＤＨ遺伝子）１コピーを導入した株である。
ＡＳＰ５０１９株と、特許文献３に記載のＡＳＰ３５０９株、ＡＳＰ２９１４株、ＡＳＰ３６１９株、ＡＳＰ３６２１株、ＡＳＰ３６３１株、ＡＳＰ３６２２株、およびＡＳＰ３６２３株の増殖能と乳酸産生能を比較した。ＡＳＰ３５０９株はＩＧＦ５４３株にＨｓＬＤＨ遺伝子１コピーを導入した株であり、ＡＳＰ２９１４株はＩＧＦ５４３株にＨｓＬＤＨ遺伝子２コピーを導入した株であり、ＡＳＰ３６１９株はＩＧＦ５４３株にＨｓＬＤＨ遺伝子１コピーとＬｂＬＤＨ遺伝子（ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）のＬＤＨ遺伝子）１コピーを導入した株であり、ＡＳＰ３６２１株はＩＧＦ５４３株にＨｓＬＤＨ遺伝子１コピーとＳａＬＤＨ遺伝子（スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のＬＤＨ遺伝子）１コピーを導入した株であり、ＡＳＰ３６３１株はＩＧＦ５４３株にＨｓＬＤＨ遺伝子１コピーとＬｐＬＤＨ遺伝子１コピーを導入した株であり、ＡＳＰ３６２２株はＩＧＦ５４３株にＨｓＬＤＨ遺伝子１コピーとＬｐｌＬＤＨ遺伝子（ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のＬＤＨ遺伝子）１コピーを導入した株であり、ＡＳＰ３６２３株はＩＧＦ５４３株にＨｓＬＤＨ遺伝子１コピーとＰａＬＤＨ遺伝子（ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）のＬＤＨ遺伝子）１コピーを導入した株である。
各形質転換株を、５００ｍＬ容の坂口フラスコ（ＡＧＣテクノグラス社製）に入った１００ｍＬのＹＰＤ６液体培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グルコース６％）に初発菌体濃度を０．０４ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌになるように植菌して、温度３２℃、振盪速度１１０ｒｐｍかつ振り幅７ｃｍの振盪条件下で２０時間培養を行った。培養液のＯＤ６６０を測定した後、倍養を終了し、菌体を回収した。直径１８ｍｍかつ長さ１５０ｍｍの試験管に入った４．５ｍＬの１１．１％グルコース水溶液に初発菌体濃度を３６ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌになるように接種し、温度３２℃、仰角４３．５°、１１０ｒｐｍ、およびふり幅７ｃｍの振盪条件下で３時間発酵を行い、終了後、発酵液中の乳酸の濃度（ｇ／Ｌ）を測定した。各形質転換体の２０時間培養後の培養液の菌体濃度（ｇ（乾燥菌体換算（ｄｃｗ））／Ｌ）および３時間発酵後の乳酸濃度（ｇ／Ｌ）を表３に示す。
ＨｓＬＤＨ遺伝子１コピーを導入したＡＳＰ３５０９株とＨｓＬＤＨ遺伝子２コピーを導入したＡＳＰ２９１４株を比較すると、発酵３時間後の乳酸濃度はＡＳＰ２９１４株のほうが高く、培養２０時間後のＯＤ６６０はＡＳＰ３５０９株のほうが高かった。また、発酵３時間後の乳酸濃度が非常に高いＡＳＰ３６３１株は、培養２０時間後の培養液の菌体濃度は明らかに低かった。表３の結果を、縦軸を発酵３時間後の乳酸濃度（ｇ／Ｌ）、横軸を培養２０時間後の培養液の菌体濃度（ｇ（乾燥菌体換算（ｄｃｗ））／Ｌ）とした分散図（図３）に示す。図３に示すように、乳酸産生能が高い形質転換体ほど、増殖能が低くなる傾向がある。図３中、直線は、ＡＳＰ３５０９株とＡＳＰ３６３１株のプロットを結んだ直線である。該傾向からは、ＨｓＬＤＨ遺伝子３コピーを導入した形質転換株は、ＨｓＬＤＨ遺伝子２コピーを導入した形質転換株（ＡＳＰ２９１４株）と比べて、乳酸産生能は高く、増殖能は低いこと、および、仮にＨｓＬＤＨ遺伝子３コピーを導入した形質転換株の乳酸産生能がＡＳＰ３６３１株よりも高い場合には、該株の増殖能はＡＳＰ３６３１株よりも低いであろうことが、予想される。にもかかわらず、ＨｓＬＤＨ遺伝子３コピーを導入したＡＳＰ５０１９株は、ＡＳＰ３６３１株とほぼ同程度の高い乳酸産生能と、ＡＳＰ３５０９株とほぼ同程度の充分な増殖能を有していた。
［例２］
例１で用いたＡＳＰ５０１９株とＡＳＰ３６３１株について、フラスコ培養し、増殖能と乳酸産生能を比較した。
具体的には、各形質転換株をＹＥＳ液体培地（イーストエキス５ｇ／Ｌ、グルコース３０ｇ／Ｌ、アデニン１ｇ／Ｌ、ヒスチジン１ｇ／Ｌ、ロイシン１ｇ／Ｌ、ウラシル１ｇ／Ｌ、リシン１ｇ／Ｌ）に植菌して、温度３２℃、振盪速度１１０ｒｐｍの条件下で３０時間培養を行った。培養終了後、菌体を回収し、表４に示す組成に微量元素類およびビタミン類を適当量加えた培養培地を張り込んだ、３Ｌ容ジャーファーメンターに接種し、温度３２℃、ＯＤカスケード制御下にて６０時間流加培養を行い、終了後、培養液のＯＤ６６０を測定した。
次いで、培養終了後の培養液から遠心分離処理により菌体を分離し、該菌体を１１．１％グルコース水溶液に初発菌体濃度が３６ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌ（ＯＤ６６０＝１８０）になるように接種したものを発酵液として、７時間試験管にて発酵させた。発酵終了後の発酵液の乳酸濃度（ｇ／Ｌ）を測定した。
例１で用いたＡＳＰ５０１９株とＡＳＰ３６３１株について、フラスコ培養し、増殖能と乳酸産生能を比較した。
具体的には、各形質転換株をＹＥＳ液体培地（イーストエキス５ｇ／Ｌ、グルコース３０ｇ／Ｌ、アデニン１ｇ／Ｌ、ヒスチジン１ｇ／Ｌ、ロイシン１ｇ／Ｌ、ウラシル１ｇ／Ｌ、リシン１ｇ／Ｌ）に植菌して、温度３２℃、振盪速度１１０ｒｐｍの条件下で３０時間培養を行った。培養終了後、菌体を回収し、表４に示す組成に微量元素類およびビタミン類を適当量加えた培養培地を張り込んだ、３Ｌ容ジャーファーメンターに接種し、温度３２℃、ＯＤカスケード制御下にて６０時間流加培養を行い、終了後、培養液のＯＤ６６０を測定した。
次いで、培養終了後の培養液から遠心分離処理により菌体を分離し、該菌体を１１．１％グルコース水溶液に初発菌体濃度が３６ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌ（ＯＤ６６０＝１８０）になるように接種したものを発酵液として、７時間試験管にて発酵させた。発酵終了後の発酵液の乳酸濃度（ｇ／Ｌ）を測定した。
各形質転換体の６０時間培養後の培養液のＯＤ６６０と７時間発酵後の発酵液の乳酸濃度（ｇ／Ｌ）の測定結果を図４に示す。ＡＳＰ５０１９株は、ＡＳＰ３６３１株と同様に乳酸産生能が高く、かつ増殖能はＡＳＰ３６３１株よりも顕著に優れていることが確認された。
［例３］
例１で用いたＡＳＰ５０１９株とＡＳＰ３６３１株について、連続培養し、乳酸産生能を比較した。
具体的には、例２と同様の方法を用いて得られた６０時間流加培養菌体を回収し、該菌体を表５に示す組成に微量元素類およびビタミン類を適当量加えた発酵培地に、初発菌体濃度が３６ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌ（ＯＤ６６０＝１８０）になるように接種したものを発酵液とした。該発酵液０．５Ｌを、１Ｌ容ジャーファーメンター中に移し、クロスフロー方式の精密濾過膜を通して循環させた。そして、一定流量で発酵培地の供給および膜濾過液の引抜きを行う連続発酵を、２８℃で２００時間超行った。その際、希釈率は０．０６６（１／ｈ）とした。該連続発酵では、菌体のサイズよりも小さい細孔径の精密濾過膜を用いているため、菌体は槽内へ還流され、２００時間超の連続発酵中においてリサイクルされた。アルカリを用いたｐＨの中和は行わなかった。
例１で用いたＡＳＰ５０１９株とＡＳＰ３６３１株について、連続培養し、乳酸産生能を比較した。
具体的には、例２と同様の方法を用いて得られた６０時間流加培養菌体を回収し、該菌体を表５に示す組成に微量元素類およびビタミン類を適当量加えた発酵培地に、初発菌体濃度が３６ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌ（ＯＤ６６０＝１８０）になるように接種したものを発酵液とした。該発酵液０．５Ｌを、１Ｌ容ジャーファーメンター中に移し、クロスフロー方式の精密濾過膜を通して循環させた。そして、一定流量で発酵培地の供給および膜濾過液の引抜きを行う連続発酵を、２８℃で２００時間超行った。その際、希釈率は０．０６６（１／ｈ）とした。該連続発酵では、菌体のサイズよりも小さい細孔径の精密濾過膜を用いているため、菌体は槽内へ還流され、２００時間超の連続発酵中においてリサイクルされた。アルカリを用いたｐＨの中和は行わなかった。
連続発酵における発酵液中の乳酸濃度（ｇ／Ｌ）の経時変化を図５に示す。連続発酵を２００時間超行った結果、発酵開始から１２０時間経過時点までは、ＡＳＰ５０１９株とＡＳＰ３６３１株の乳酸濃度はほぼ同程度であり、ほぼ一定で推移し、発酵開始から１５０時間経過時点以降は、低下傾向にあった。ただし、乳酸濃度の低下傾向は、ＡＳＰ３６３１株よりもＡＳＰ５０１９株のほうが、緩やかであった。該結果から、ＡＳＰ５０１９株は、長期運転かつ高酸素条件下における乳酸産生能が顕著に高いことがわかった。
本発明に係る形質転換体およびそれを用いた乳酸の製造方法は、低ｐＨでもアルカリによる中和を行わずに高い生産性で乳酸を生産できるため、乳酸の工業的な製造方法として好適に用いることができる。
なお、２０１４年１０月１０日に出願された日本特許出願２０１４−２０９０４８号の明細書、特許請求の範囲、要約書および図面の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
なお、２０１４年１０月１０日に出願された日本特許出願２０１４−２０９０４８号の明細書、特許請求の範囲、要約書および図面の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
Claims (15)
- シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、ヒト由来の乳酸脱水素酵素遺伝子が３〜５コピー組み込まれ、かつ前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活していることを特徴とする形質転換体。
- 前記欠失または失活しているピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子がＰＤＣ２遺伝子である、請求項１に記載の形質転換体。
- 前記乳酸脱水素酵素遺伝子がシゾサッカロミセス・ポンベの染色体に組み込まれている、請求項１または２に記載の形質転換体。
- ５００ｍＬ容の坂口フラスコに入った、イーストエクストラクト１％、ペプトン２％、およびグルコース６％からなる液体培地１００ｍＬに初発菌体濃度を０．０４ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌになるように菌体を接種し、温度３２℃、１１０ｒｐｍかつ振り幅７ｃｍの振盪条件下で２０時間培養した培養液の菌体濃度が４．０ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌ以上であり、
５００ｍＬ容の坂口フラスコに入った、イーストエクストラクト１％、ペプトン２％、およびグルコース６％からなる液体培地１００ｍＬに初発菌体濃度を０．０４ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌになるように菌体を接種し、温度３２℃、１１０ｒｐｍかつ振り幅７ｃｍの振盪条件下で２０時間培養し得られた菌体を、直径１８ｍｍかつ長さ１５０ｍｍの試験管に入った４．５ｍＬの１１．１％グルコース水溶液に初発菌体濃度が３６ｇ（乾燥菌体換算）／Ｌになるように接種し、温度３２℃、仰角４３．５°、１１０ｒｐｍ、およびふり幅７ｃｍの振盪条件下で３時間発酵させた発酵液の乳酸濃度が８０ｇ／Ｌ以上であることを特徴とする形質転換体。 - シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、少なくとも１の乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつ前記シゾサッカロミセス・ポンベ宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活している、請求項４に記載の形質転換体。
- 前記欠失または失活しているピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子がＰＤＣ２遺伝子である、請求項５に記載の形質転換体。
- 前記乳酸脱水素酵素遺伝子がシゾサッカロミセス・ポンベの染色体に組み込まれている、請求項５または６に記載の形質転換体。
- シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、シゾサッカロミセス・ポンベ内で機能するプロモーターとターミネーターとヒト由来の乳酸脱水素酵素遺伝子とを含む発現カセットを、前記宿主の染色体中の３〜５箇所に導入した形質転換体を得ること、および、
前記宿主としてピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活した宿主を用いるか、または前記得られた形質転換体のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部の遺伝子を欠失または失活させること
を特徴とする、ヒト由来の乳酸脱水素酵素遺伝子が３〜５コピー組み込まれかつピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部の遺伝子が欠失または失活している形質転換体の製造方法。 - 前記発現カセットを、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のｅｎｏ１０１遺伝子座上流１００００ｂｐから下流１００００ｂｐの領域、ｌｅｕ１遺伝子座上流１００００ｂｐから下流１００００ｂｐの領域、およびｇｐｍ１遺伝子座上流１００００ｂｐから下流１００００ｂｐの領域から選ばれる領域に導入する、請求項８に記載の形質転換体の製造方法。
- 前記欠失または失活しているピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子がＰＤＣ２遺伝子である、請求項８または９に記載の形質転換体の製造方法。
- 請求項１〜７のいずれかに記載の形質転換体を培養液中で培養し、該培養液から乳酸を取得する乳酸の製造方法。
- 濃度１〜５０質量％のグルコースを含む培養液を使用して培養を行う、請求項１１に記載の乳酸の製造方法。
- 前記形質転換体により産生される乳酸により、前記培養液のｐＨが３．５以下になった後にさらに培養を継続する、請求項１１または１２に記載の乳酸の製造方法。
- 前記形質転換体により産生された培養液中の乳酸を中和することなく培養を継続する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の乳酸の製造方法。
- 前記形質転換体により産生された培養液中の乳酸を中和することなく、培養液から乳酸を分離する、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の乳酸の製造方法。
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