CN101348775A - 肠杆菌重组菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肠杆菌的重组菌及其应用。本发明所提供的重组菌，是将肠杆菌中的丙酮酸甲酸裂解酶基因灭活得到的重组菌。实验表明，与对照相比，本发明的重组菌在发酵过程中产生的副产物CO2量显著减少且目的产物的量明显提高，例如，产酸克氏杆菌发酵产生的乳酸、琥珀酸、2，3－丁二醇分别比对照提高30％、9％和23％，而产生的CO2量仅为对照的8.04％。所以本发明重组菌有助于缓解温室效应的压力，本发明重组菌将实际工业化生产中发挥重要作用，既能大幅减少CO2产量，又能提高底物转化为产物的转化率，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组菌及其应用，特别涉及肠杆菌的重组菌及其应用。
背景技术
在发酵工业中，底物在微生物或者酶的作用下生成目的产物的同时往往会有副产物产生，CO2就是发酵工业中最常见的副产物之一。在肠杆菌科各属菌株厌氧发酵糖类时，糖类经一系列反应转化为磷酸烯醇式丙酮酸，一部分磷酸烯醇式丙酮酸转化为琥珀酸，另一部分转化为丙酮酸，丙酮酸有三条去路：1.在乳酸脱氢酶催化下转化为乳酸；2.通过乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸脱羧酶和3-羟基2-丁酮还原酶(2，3-丁二醇脱氢酶)依次催化反应下经α-乙酰乳酸、3-羟基丁酮最终转化为2，3-丁二醇；3.在丙酮酸甲酸裂解酶催化下分解为乙酰CoA和甲酸，乙酰CoA会进一步生成乙酸和乙醇，甲酸往往又会分解为CO2和H2，这就是发酵过程中产生大量CO2的原因。CO2的产生既造成了底物转化为产物的转化率的降低，又加剧了本来就日益严重的温室效应。
温室效应就是由于大气中CO2等气体含量增加，使全球气温升高的现象。全球变暖是人类面临的一个重要而又棘手的热点问题，是21世纪人类面临的巨大挑战，直接关系到人类的生存和发展。CO2约占温室气体总量的75％，如果CO2含量继续增加，温室效应将使两极地区冰川融化，海平面升高，自然灾害加剧，并在农业、生态、医疗卫生、经济等方面给人类带来许多不良影响。为了减缓温室效应，各国制定了各种措施，主要包括：节约能源和提高能源利用率，开发可再生替代能源，植树造林以及采用一些方法来吸收CO2。近年来，在保护环境和节约化石能源的同时，发酵工业迅猛发展，在发酵过程中产生的CO2也势必会给人类带来不利影响。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种肠杆菌重组菌，该重组菌在发酵过程中可以在提高产物产量的同时减少副产物CO2和H2的生成量。
本发明所提供的肠杆菌的重组菌，是将肠杆菌中的丙酮酸甲酸裂解酶基因灭活得到的重组菌。
所述灭活具体可以通过同源重组实现。
所述同源重组可以是将同源序列片段导入所述肠杆菌中实现的；所述同源序列片段由上游至下游依次为同源臂1、抗性基因和同源臂2；所述同源臂1和同源臂2选自丙酮酸甲酸裂解酶的基因组基因及其上下游序列。
所述同源臂1的核苷酸序列具体可以如序列表中序列3所示；所述同源臂2的核苷酸序列具体可以如序列表中序列4所示。
具有序列3和4所示同源臂的同源序列片段具体可以是按照如下方法得到的：以所述出发菌的基因组DNA为模板，用序列表中序列1和序列2所示引物进行扩增，得到含有所述丙酮酸甲酸裂解酶基因及其上下游序列的PCR扩增产物，再用抗性基因替换所述PCR产物中所述丙酮酸甲酸裂解酶基因的部分基因片段。
在上述同源序列片段的制备中，还可以用其它的引物对进行扩增，扩增得到的片段既可以包括整个丙酮酸甲酸裂解酶基因，也可以只含有部分丙酮酸甲酸裂解酶基因，只要被抗性基因替换的部分是丙酮酸甲酸裂解酶基因的序列即可。
上述任一所述同源序列片段导入所述肠杆菌的方法可以由以下两步组成：
1)所述同源序列片段插入自杀质粒的多克隆位点得到重组质粒，再将所述重组质粒导入宿主菌中得到重组宿主菌；
2)将所述重组宿主菌与所述肠杆菌杂交；
所述自杀质粒含有抗性基因，所述自杀质粒中的抗性基因与所述同源序列片段中的抗性基因不同。
其中，所述自杀质粒为具备以下条件的质粒：①自杀质粒在受体菌中不能复制；②自杀质粒必须带有一个在整合到染色体内以后可供选择的抗性标记；③自杀质粒带有易于克隆的多克隆位点。
所述自杀质粒具体可以为pGPGm质粒、pGPCm质粒或pGPKm质粒；
所述pGPGm质粒是按照如下方法得到的：用限制性内切酶PstI酶切pGP704质粒，回收被切除部分Ap基因的质粒片段；用限制性内切酶PstI酶切pUCGm质粒，回收Gm基因片段；将以上两回收片段进行连接，得到pGPGm质粒。
所述pGPKm质粒是按照如下方法得到的：用限制性内切酶PstI酶切pGP704质粒，回收被切除部分Ap基因的质粒片段；用限制性内切酶PstI酶切pUC4K质粒(含有Km抗性基因片段)(GE Healthcare Life Sciences)，回收Km基因片段；将以上两回收片段进行连接，得到pGPKm质粒。
所述pGPCm质粒具体可以参见文献：赵德华、李季伦.肺炎克氏杆菌固氮酶双突变株的构建及其对底物还原的特性.科学通报，2004，49(15)：1512-1518。
所述宿主菌为含有λpir基因的大肠杆菌，具体可如含有λpir基因的大肠杆菌SM10或含有λpir基因的大肠杆菌S17-1。
所述重组质粒可通过热激法或电转化法等常规方法转化宿主菌。
所述肠杆菌可以为肠杆菌科克雷伯氏菌属、埃希氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属或沙雷氏菌属的菌。
所述肠杆菌具体可为产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)。
上述任一所述重组菌在生产乳酸和/或琥珀酸和/或2，3-丁二醇中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明中通过使菌中丙酮酸甲酸裂解酶基因的部分片段被抗性基因取代而使丙酮酸甲酸裂解酶基因灭活，从而得到重组菌。实验表明，与对照相比，本发明的重组菌在发酵过程中产生的副产物CO2量显著减少且目的产物的量明显提高，例如，产酸克氏杆菌发酵产生的乳酸、琥珀酸、2，3-丁二醇分别比对照提高30％、9％和23％，而产生的CO2量仅为对照的8.04％，且没有H2产生。所以本发明重组菌有助于缓解温室效应的压力，本发明重组菌将实际工业化生产中发挥重要作用，既能大幅减少CO2产量，又能提高底物转化为产物的转化率，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为载体pGPGm或载体pGPKm的构建图。
图2为PCR扩增丙酮酸甲酸裂解酶基因及其上下游序列的结果图。
图3为丙酮酸甲酸裂解酶基因破坏质粒pGPGPK构建过程图。
具体实施方式
下述实施例中所使用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、丙酮酸甲酸裂解酶基因被灭活的产酸克氏杆菌重组菌的构建
一、丙酮酸甲酸裂解酶基因pf1及其上下游序列的克隆
根据产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)部分基因组序列(Genome Project ID：12627)和丙酮酸甲酸裂解酶基因pf1序列(EU276019)设计引物p1和p2，PCR扩增丙酮酸甲酸裂解酶基因pf1及其上下游序列，引物序列如下：
p1(上游引物)：5’-TCAGGTACCTTGACAGCGATTTGATGGCT-3’(序列表中序列1)，
p2(下游引物)：5’-AGTGAGCTCGAAGCGTTCATAAAGTGGCG-3’(序列表中序列2)；引物由北京赛百盛公司合成。
以野生型产酸克氏杆菌M5al(Ohta K，Beall DS，Mejia JP，et al.Metabolicengineering of Klebsiella oxytoca M5A1 for ethanol production from xyloseand glucose.Appl Environ Microbiol 1991，157：2810-2815.)(清华大学)的基因组DNA为模板，在引物p1和p2的引导下，PCR扩增丙酮酸甲酸裂解酶基因pf1及其上下游序列；PCR扩增条件为：先94℃ 5min；再94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 51min，共30个循环；最后72℃ 10min。将PCR扩增产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示(泳道1为PCR扩增产物，泳道2为marker)，回收并纯化约4kb的目的片段。
将回收的PCR产物片段与克隆载体pMD-19T Simple载体(TaKaRa公司)连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性转化子，提质粒，用限制性内切酶Kpn I和Sac I进行双酶切鉴定，获得正确的含有丙酮酸甲酸裂解酶基因及其上下游序列的重组载体，将其命名为pTP。
二、丙酮酸甲酸裂解酶基因破坏质粒pGPGPK的构建
构建过程如图3所示。
用限制性内切酶Pst I酶切pTP质粒，回收被切除了部分丙酮酸甲酸裂解酶基因片段的pTP质粒片段；再用限制性内切酶Pst I酶切pUC4K质粒(GE公司)，回收从pUC4K质粒切下的卡那霉素抗性基因片段；将两回收产物用T4DNA连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性转化子，提质粒，用限制性内切酶Pst I进行酶切鉴定，将正确的重组载体命名为pTPK。
用限制性内切酶Kpn I和Sac I双酶切pTPK质粒，回收含有卡那霉素抗性基因的杂合丙酮酸甲酸裂解酶基因上下游序列即同源序列片段(其由上游至下游依次为同源臂1、抗性基因、同源臂2)，将同源序列片段进行测序，测得同源臂1的序列如序列表中序列3所示，共1688bp，测得同源臂2的序列如序列表中序列4所示，共1500bp；用限制性内切酶Kpn I和Sac I双酶切pGPGm质粒，回收线性的pGPGm质粒片段；将回收的同源序列片段和线性的pGPGm质粒片段用T4DNA连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌S17-1(λpir)感受态细胞(Simon R，Priefer U，Pühler A(1983)A broad-host range mobilization system for in vivo geneticengineering：transposon mutagenesis in Gram-negative bacteria.Biotechnology 1：784-791.)[也可以转化至SM10(λpir)感受态细胞(Miller VLand Mekalanos JJ.A novel suicide vector and its use in construction ofinsertion mutations：Osmoregulation of outer membrane proteins andvirulence determinants in Vibrio Cholerae requires toxR.J Bacteriol 1988，170(6)：2575-2583.)]，筛选阳性转化子，提质粒，用Kpn I和Sac I酶进行酶切鉴定，得到正确的丙酮酸甲酸裂解酶基因破坏质粒，命名为pGPGPK。
pGPGm质粒的构建方法如下(图1，图中所用的中间质粒中，含有Gm抗性基因的为pUCGm质粒，含有Km抗性基因的为pUC4K质粒；所得到的最终质粒中，含有Gm抗性基因的为pGPGm质粒，含有Km抗性基因的为pGPKm质粒)：用限制性内切酶PstI酶切pGP704质粒，回收被切除部分Ap基因的质粒片段；用限制性内切酶PstI酶切pUCGm质粒，回收Gm基因片段；将以上两回收片段进行连接，经转化、筛选后得到pGPGm质粒。
其中，pUCGm质粒参见文献：Schweizer H D.Small broad-host-rangegentamycin resistance gene cassettes for site-specific insertion anddeletion mutagenesis.Bio Techniques 1993，15：831-834.(清华大学)；pGP704质粒参见文献：Miller VL and Mekalanos JJ.A novel suicide vector and itsuse in construction of insertion mutations：Osmoregulation of outer membraneproteins and virulence determinants in Vibrio Cholerae requires toxR.JBacteriol 1988，170(6)：2575-2583.(清华大学)；
三、产酸克氏杆菌丙酮酸甲酸裂解酶基因灭活重组菌的构建
将携带有破坏载体pGPGPK的大肠杆菌S17-1(λpir)(供体菌)和野生型产酸克氏杆菌(受体菌)进行双亲本杂交，具体方法为：在LB液体培养基中分别过夜培养供体菌和受体菌；供体菌和受体菌按3∶1培养的菌液体积比比例混合于10mM的MgSO4溶液中，过滤，菌体都位于滤膜上，然后将滤膜置于LB平板上，37℃培养8-12小时；用10mM的MgSO4溶液洗下长在滤膜上的菌苔，梯度稀释后涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养，长出的单菌落分别接种于含庆大霉素和卡那霉素的LB平板上，37℃培养，最终得到具有卡那霉素抗性但没有庆大霉素抗性的菌株，即为丙酮酸甲酸裂解酶基因被灭活的产酸克氏杆菌重组菌。
实施例2、丙酮酸甲酸裂解酶基因被灭活的产酸克氏杆菌重组菌的葡萄糖厌氧发酵
产酸克氏杆菌以葡萄糖为底物进行发酵，能够产生乳酸、琥珀酸，2，3-丁二醇和副产物CO2、H2。本实验用实施例1构建的重组菌进行厌氧发酵，以野生型菌株(即出发菌)为对照，比较其产物和副产物的结果。具体方法如下：
一、种子培养
从平板上挑取野生型产酸克氏杆菌(出发菌)单菌落或实施例1中得到的产酸克氏杆菌重组菌的单菌落，接入到装有100毫升L B培养基的500毫升三角瓶中，37℃、180r/min培养12小时，得到种子培养液。
二、发酵
将150微升步骤一得到的种子培养液接入装有30毫升发酵培养基的厌氧瓶中，37℃、180r/min培养16小时，检测产生的CO2和H2的量，以及产生的乳酸、琥珀酸，2，3-丁二醇的量。
其中，所用的发酵培养基的组成如下：每升培养基中含有K2HPO4(磷酸氢二钾)3.5g，KH2PO4(磷酸二氢钾)1.4g，glucose(葡萄糖)30g，(NH4)2SO4(硫酸铵)2.0g，MgSO4·7H2O(硫酸镁)0.2g，yeast extract(酵母粉)1.5g。
实验设3次重复，结果取平均数。结果如表1所示。结果表明，本发明重组菌发酵过程中没有H2产生，产生的CO2的量仅为野生型菌株的8.04％；乳酸、琥珀酸、2，3-丁二醇较野生型菌株分别提高30％、9％和23％。
表1、野生型和重组菌的发酵结果比较
| 菌株 | CO2+H2(ml) | CO2(ml) | 乳酸(g/L发酵液) | 琥珀酸(g/L发酵液) | 2，3-丁二醇(g/L发酵液) |
| 野生型(对照) | 82 | 42.3 | 2.61 | 1.34 | 8.37 |
| 重组菌 | 3.4 | 3.4 | 3.39 | 1.53 | 10.72 |
序列表
<160>4
<210>1
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
tcaggtacct tgacagcgat ttgatggct 29
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
agtgagctcg aagcgttcat aaagtggcg 29
<210>3
<211>1688
<212>DNA
<213>产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)
<400>3
ttgacagcga tttgatggct ttcccggctc atcagtcgtt attgaaggcc tatgaaaagc 60
tacagcgcgc gaaagccgca ttttgggcta aataaagcgt ttcttccgtt aaaatgacga 120
taacaggggg tcgactgcga cccctttttc ctgttttgca ctatttccgc cgatgttgta 180
gctataaagt taattagtgg tgagaaataa taaaatactg ccgcaaatat tgttaatttt 240
aataaaaata ccccatttta attaaccgaa aaacgggggc aaaatgaaaa taatcaacat 300
tatttgtaaa ttttaaaatt tattttttta ttaaaaaaca aaaagttacc taaaaaaata 360
agcaaaccca cacactaaaa aggcctatag ttccggtagg atatgatcta catcaaattc 420
ccttctataa tgctttgtta gtatctcacc gccaacttac ataaagagag agttagtgtg 480
aaagctgaca acccttttga tcttttactc cctgctgcca tggcgaaagt cgccgaagaa 540
gcgggcgtct ataaagcgac aaaacatccg ataaagacgt tttatctggc tatcaccgca 600
ggtgtcttca tctctatcgc ttttgttttc tatattaccg cgacaaccgg cacggccggg 660
atgccattcg gggttgccaa actgattggg ggcatctgct tctcactggg tttgattctc 720
tgcgttattt gcggtgccga cctgtttacc tcaaccgttc ttatcgttgt cgcgaaagcc 780
agcggaagaa tcacatgggg tcaactggcg aaaaactggc tcaacgtata tgttggtaac 840
ctgattggtt gcttactgtt tgtattgctg atgtggcttt caggcgaata tatgactgcc 900
aacggtcaat ggggacttaa cgttctgcaa accgccgacc acaaaatgca ccatactttt 960
gttgaagccg tgtgcctggg tatcctggca aacctgatgg tctgccttgc ggtatggatg 1020
agttactccg gccgtagcct gatggataaa gccatgatta tggttttacc ggtggcaatg 1080
tttgttgcca gcgggtttga gcatagtatc gcgaacatgt ttatgatccc gctgggtatc 1140
gttatccgcg actttgcaag cccggaattc tggaccgcag ttggttcaac tccggaaagt 1200
ttctctcacc tgaccgtcat gaacttcatc actgataacc tgattccggt aactatcggg 1260
aacatcatcg gcggtggtct gctggttggg ttgacatact gggtcattta cctgcgtggc 1320
gacgaccatc actaagggtt gtttcaggca gtaaataaaa aatccactta agaaggtagg 1380
tgttacatgt ccgagcttaa tgaaaagtta gccacagcct gggaaggttt tgcgaaaggt 1440
gactggcaga acgaagtcaa cgtacgcgac ttcatccaga aaaactatac cccgtacgaa 1500
ggtgacgagt ccttcctggc tggcgcaact gacgcgacca ccaagctgtg ggacaccgta 1560
atggaaggcg ttaaacagga aaaccgcact cacgcgcctg ttgattttga tacttccctt 1620
gcgtccacca tcacttctca tgacgctggc tacatcgaga aaggtctcga gaaaatcgtt 1680
ggcctgca 1688
<210>4
<211>1500
<212>DNA
<213>产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)
<400>4
agtacgagaa cgatgatctg atgcgtcctg acttcaacaa cgatgactat gctatcgctt 60
gctgcgtaag cccgatggtt gttggtaagc aaatgcagtt cttcggtgct cgcgctaacc 120
tggcgaaaac catgctgtac gcaatcaacg gcggcgttga tgaaaaactg aaaatgcagg 180
ttggtcctaa atctgaaccg atcaaaggcg acgtcctgaa cttcgacgaa gtgatggagc 240
gcatggatca cttcatggac tggctggcta aacagtacgt cactgcgctg aacatcatcc 300
actacatgca cgacaagtac agctacgaag cttcactgat ggcgctgcac gaccgtgatg 360
ttatccgcac catggcatgc ggtatcgcag gtctgtccgt tgcggctgac tccctgtccg 420
caatcaaata tgcgaaagtt aaaccgattc gtgacgaaaa cggtctggct gtcgacttcg 480
aaatcgaagg tgaatacccg cagtttggta acaacgactc tcgcgtcgat gatatggccg 540
ttgacctggt tgaacgtttc atgaagaaaa ttcagaaact gcacacctac cgcaacgcta 600
tcccgactca gtccgagctg accatcacct ctaacgttgt gtatggtaag aaaaccggta 660
acacccctga cggtcgtcgc gctggctgtt ccgttcggac caggtgctaa cccgatgcac 720
ggtcgtcacc agaaaggtgc tgttgcctct ctgacctccg ttgcgaaact gccgtttgct 780
tacgcgaaag atggtatttc ttacaccttc tctatcgtgc cgaacgcgct gggcaaagac 840
gacgaagtgc gtaaaactaa cctcgccggc ctgatggatg gttattccac cacgaagcgt 900
ccatcgaagg cggtcagcat ctgaacgtca acgtcatgaa ccgcgagatg ctgctcgacg 960
cgatggaaaa cccggaaaaa tatccgcagc tgaccatccg cgtatccggc tacgcagtac 1020
gttttaactc cctgactaaa gaacagcagc aggacgtgat tactcgtacc ttcactcaga 1080
ccatgtaatg gtattgactg aaatcgtaca gtaataagcg tacaataaag gctccacgca 1140
agtggggcct ttttagcaat atcatcctgt cccagtctct tttgtctgct gtctatactt 1200
tatggataac agccaaaaca gactcgacat agcctttgag ctgtgcatct acataggccc 1260
cggatgggcc aaattcggag atatcaccgc aatgtcaaca attggtcgca ttcactcctt 1320
tgaatcctgt ggcaccgtcg atggcccggg gatccgcttt atcaccttct tccagggctg 1380
cctgatgcgc tgcctctatt gccacaaccg cgacacctgg gatacccacg gcggcaaaga 1440
gattaccgtt gaagagctga tgaaagaggt ggtgacctat cgccacttta tgaacgcttc 1500
Claims (9)
1、肠杆菌的重组菌，是将肠杆菌中的丙酮酸甲酸裂解酶基因灭活得到的重组菌。
2、根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述灭活是通过同源重组实现的。
3、根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于：所述同源重组是将同源序列片段导入所述肠杆菌中实现的；所述同源序列片段由上游至下游依次为同源臂1、抗性基因和同源臂2；所述同源臂1和同源臂2选自丙酮酸甲酸裂解酶的基因组基因及其上下游序列。
4、根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于：所述同源臂1的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述同源臂2的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
5、根据权利要求3或4所述的重组菌，其特征在于：所述同源序列片段导入所述肠杆菌的方法由以下两步组成：
1)所述同源序列片段插入自杀质粒的多克隆位点得到重组质粒，再将所述重组质粒导入宿主菌中得到重组宿主菌；
2)将所述重组宿主菌与所述肠杆菌杂交；
所述自杀质粒含有抗性基因，所述自杀质粒中的抗性基因与所述同源序列片段中的抗性基因不同。
6、根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述宿主菌为含有λpir基因的大肠杆菌。
7、根据权利要求1-6中任一所述的重组菌，其特征在于：所述肠杆菌为克雷伯氏菌属、埃希氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属或沙雷氏菌属的菌。
8、根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于：所述肠杆菌为产酸克氏杆菌(Klebsiella oxytoca)。
9、权利要求1-8中任一所述重组菌在生产乳酸和/或琥珀酸和/或2，3-丁二醇中的应用。
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