CN102154345B - 谷氨酸脱羧酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶基因及其应用，属于基因工程技术领域。是将来源于短乳杆菌的谷氨酸脱羧酶基因gadB2、以及与gadB2相连的转运蛋白基因gadC和调控蛋白基因gadR通过棒状杆菌表达载体pDXW8导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，重组谷氨酸棒杆菌能够将其自身积累的谷氨酸直接转化成γ-氨基丁酸。

Description

谷氨酸脱羧酶基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种谷氨酸脱羧酶基因及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，简称GABA），由谷氨酸（Glutamic acid，Glu）经谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase, 简称GAD）催化脱羧而来。γ-氨基丁酸是哺乳动物中枢神经系统中的重要的抑制性神经递质。具有重要的生理功能，已报道的生理活性有调节血压、促使精神安定、促进脑部血流、增进脑活力、营养神经细胞、增加生长激素分泌、健肝利肾、预防肥胖、促进乙醇代谢（醒酒）、改善更年期综合症等多种功效。

目前利用基因工程技术过量表达谷氨酸脱羧酶基因，来进一步提高GABA的产量的研究已有相关报道。在这个研究领域中，主要是将这些来源于GABA积累菌株的谷氨酸脱羧酶基因导入到大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的某个野生型菌株中，并使谷氨酸脱羧酶在宿主菌中得到高效表达，从而增强宿主菌生产GABA的能力，但是采用该方法生产GABA，需要加入大量L-谷氨酸或L-谷氨酸钠作为前体物质，而L-谷氨酸或L-谷氨酸钠通常由谷氨酸棒杆菌发酵产生。因此，现有技术生产GABA的过程复杂且生产成本高。

发明内容

本发明提供了一种谷氨酸脱羧酶基因gadB2，该基因是根据基因组全序列已公布的短乳杆菌 ATCC 367的谷氨酸脱羧酶基因为参照设计引物，以筛选出的短乳杆菌CCTCC NO：M 2010367的基因组为模板，利用PCR技术将其基因组中编码谷氨酸脱羧酶的基因gadB2扩增出来，并进行基因测序，其核苷酸序列如Seq ID NO .1。

本发明还提供了一种谷氨酸脱羧酶基因gadCB2，该基因除了含有谷氨酸脱羧酶的基因gadB2外，还含有与gadB2相连的编码谷氨酸/γ-氨基丁酸反向转运蛋白的基因gadC，其核苷酸序列如Seq ID NO .2。

本发明还提供了一种谷氨酸脱羧酶基因gadRCB2，该基因除了含有谷氨酸脱羧酶的基因gadCB2外，还含有与gadCB2相连的编码正转录调控蛋白的gadR基因，其核苷酸序列如Seq ID NO .3。

所述谷氨酸脱羧酶基因gadB2、gadCB2、gadRCB2均来源于短乳杆菌CCTCC NO： M 2010367。

所述短乳杆菌CCTCC NO：M 2010367为从本实验室系列乳酸菌中利用纸层析方法筛选出一株产γ-氨基丁酸的乳酸菌，已于2010年12月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2010367，分类学命名：短乳杆菌Lb85(Lactobacillus brevis Lb85)。

为构建GABA生产菌株，将gadB2、gadCB2、gadRCB2基因分别连接到载体上，构建出三种谷氨酸脱羧酶重组表达质粒pDXW8-gadB2、pDXW8-gadCB2、pDXW8-gadRCB2；将三种重组质粒通过电转化的方法导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，得到三株重组谷氨酸棒杆菌pDXW8-gadB2/ATCC13032、pDXW8-gadCB2/ATCC13032和pDXW8-gadRCB2/ATCC13032。

所述表达载体为大肠杆菌-棒状杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8（专利申请号200910233618.1）。

所述谷氨酸棒杆菌 ATCC13032购自ATCC，该菌株具有积累谷氨酸的能力。

发酵液中GABA的精确定量：氨基酸自动分析仪法。用5%三氯乙酸将发酵液稀释25倍后静止30min，12000rpm离心10min沉淀蛋白，取上清液，用日立L835-50型氨基酸自动分析仪检测。氨基酸自动分析仪采用 2619#树脂（阳离子交换柱f2.6×150mm），53℃分析，GABA用外标法定量。

本发明将来源于野生菌的谷氨酸脱羧酶基因导入谷氨酸棒杆菌中，构建了谷氨酸棒杆菌基因工程菌，该菌株以葡萄糖作为碳源、尿素等无机氮作为氮源，相对于需要外源添加L-谷氨酸或L-谷氨酸钠为前体物质的生物转化，生产成本明显降低。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。

材料和试剂：

所用限制性内切酶，T4 DNA连接酶，PCR试剂等均购于TaKaRa宝生物公司；大肠杆菌JM109购自天根生物公司；引物，质粒提取试剂盒，PCR产物纯化试剂盒均购于上海生工生物工程公司；电转仪购自Bio-Rad公司；其他试剂均为国内或国外购买的分析纯试剂。

实施例一：谷氨酸脱羧酶基因gadB2的获得

从本实验室系列乳酸菌中利用纸层析方法筛选出一株产γ-氨基丁酸的乳酸菌，通过镜检和16SrDNA鉴定，证实与GenBank中公布的各种短乳杆菌的16SrDNA的同源性为99%，从而确定该菌株为短乳杆菌。

所述短乳杆菌已于2010年12月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2010367，分类学命名：短乳杆菌Lb85(Lactobacillus brevis Lb85)。

根据基因组全序列已公布的短乳杆菌 ATCC 367的谷氨酸脱羧酶基因LVIS_0079为参照设计引物，以筛选出的这株产GABA的短乳杆菌CCTCC NO：M 2010367的基因组为模板，利用PCR技术将其基因组中编码谷氨酸脱羧酶的基因gadB2扩增出来，并进行基因测序，其核苷酸序列如Seq ID NO .1。

上游引物B2F：

5’-CTAGCTAGCAGAAGGAGATATAGGATGAATAAAAACGATCAGGAAACACAG-3’

下游引物B2R：

5’-GATAAGCTTTTAACTTCGAACGGTGGTCTTG-3’

实施例二：重组谷氨酸棒杆菌pDXW8-gadB2/ATCC13032的构建：

1.        将gadB2与pDXW-8用同样的两种限制性内切酶NheI、HindIII进行双酶切，分别回收1.46kb和9.48kb酶切片段，然后将这两个片段用T4 DNA连接酶连接，并转化到大肠杆菌JM109中完成pDXW8-gadB2重组质粒的构建；

2.        将重组质粒pDXW8-gadB2经电转化的方法导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态中，得到重组谷氨酸棒杆菌pDXW8-gadB2/ATCC13032。

    谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态的制备。将谷氨酸棒杆菌ATCC13032单菌落于液体LBG培养基（10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，5g/L葡萄糖）中30℃培养过夜，随后以10%的接种量转接于30mL感受态培养基（10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，25g/L甘氨酸，0.1% Tween-80）中，30℃培养3-5h，之后将菌液置于冰水浴冷却15min，离心弃上清，将细胞悬浮于30mL冰冷的10%甘油中，再次离心弃上清，并用10%甘油重复洗涤2次，最后用400μL 10%的冷甘油重悬细胞，分装后于-70℃保存或直接用于电转化。

实施例三：谷氨酸脱羧酶基因gadCB2的获得

根据基因组全序列已公布的短乳杆菌 ATCC 367的gadC-gadB2基因LVIS_0078-LVIS_0079为参照设计引物，以筛选出的这株产GABA的短乳杆菌CCTCC NO：M 2010367的基因组为模板，利用PCR技术将其基因组中编码谷氨酸脱羧酶的基因gadCB2扩增出来，并进行基因测序，其核苷酸序列如Seq ID NO .2。

上游引物CB2F：

5’-CTACTCGAGAGAAGGAGATATACCATGGATGAAAATAAGTCTGAACAGC-3’

下游引物B2R：

5’-GATAAGCTTTTAACTTCGAACGGTGGTCTTG-3’

实施例四：重组谷氨酸棒杆菌pDXW8-gadCB2/ATCC13032的构建：

1.        将gadCB2与pDXW-8用同样的两种限制性内切酶XhoI、HindIII进行双酶切，分别回收3.02kb和9.51kb酶切片段，然后将这两个片段用T4 DNA连接酶连接，并转化到大肠杆菌JM109中完成pDXW8-gadCB2重组质粒的构建；

2.        将重组质粒pDXW8-gadCB2经电转化的方法导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态中，得到重组谷氨酸棒杆菌pDXW8-gadCB2/ATCC13032。

实施例五：谷氨酸脱羧酶基因gadRCB2的获得

根据基因组全序列已公布的短乳杆菌 ATCC 367的gadR-gadC-gadB2基因LVIS_0077-LVIS_0078-LVIS_0079为参照设计引物，以筛选出的这株产GABA的短乳杆菌CCTCC NO：M 2010367的基因组为模板，利用PCR技术将其基因组中编码谷氨酸脱羧酶的基因gadRCB2扩增出来，并进行基因测序，其核苷酸序列如Seq ID NO .3。

上游引物RCB2F：

5’-CTAGCTAGCAGAAGGAGATATACCATGGAATCCAGAACTAAGGAAAGG-3’

下游引物B2R：

5’-GATAAGCTTTTAACTTCGAACGGTGGTCTTG-3’

实施例六：重组谷氨酸棒杆菌pDXW8-gad RCB2/ATCC13032的构建：

1.        将gad RCB2与pDXW-8用同样的两种限制性内切酶NheI、HindIII进行双酶切，分别回收3.81kb和9.48kb酶切片段，然后将这两个片段用T4 DNA连接酶连接，并转化到大肠杆菌JM109中完成pDXW8-gadRCB2重组质粒的构建；

2.        将重组质粒pDXW8-gadRCB2经电转化的方法导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态中，得到重组谷氨酸棒杆菌pDXW8-gad RCB2/ATCC13032。

    实施例七：重组谷氨酸棒杆菌发酵生产GABA

    培养基：种子培养基（葡萄糖2.5%，尿素0.6%，玉米浆3.0%，K₂HPO₄·3H₂O 0.15%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，pH 7.0～7.5）；发酵培养基（葡萄糖16%，尿素0.4%，玉米浆 0.3%，K₂HPO₄·3H₂O 0.2%，MgSO₄·7H₂O 0.08%，MnSO₄ 2mg/L，FeSO₄ 2mg/L，pH 7.0～7.5）

    培养条件：重组谷氨酸棒杆菌在种子培养基中30℃振荡培养12h后，以10%的接种量转接到发酵培养基中进行发酵，在发酵12h时加入1mM IPTG诱导，并在随后的24h之内通过间歇性添加尿素的方法使培养基pH值控制在中性范围，之后继续发酵至60h，测定发酵液中γ-氨基丁酸含量。

    经检测重组菌pDXW8-gadB2/ATCC13032、pDXW8-gadCB2/ATCC13032、pDXW8-gadRCB2 /ATCC13032发酵60h的发酵液中γ-氨基丁酸的产量分别为7.25mM、6.99mM和6.28mM，野生菌ATCC13032发酵液中未检出γ-氨基丁酸。

序列表

<110>  江南大学

<120>  谷氨酸脱羧酶基因及其应用

<160>  9     

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  1440

<212>  DNA

<213>  Seq ID NO .1

<220>  

<223>  扩增得到基因序列

<400>  1

atgaataaaa acgatcagga aacacagcag atgattaata atgtggattt agaaaaaacg       60

tttttaggca gtgtcgaagc cgggcaatcc ttacccacca atacattacc agatgatccc      120

atggcaccgg atgttgccgc tcaattggtg gaacactatc gtttaaatga agccaaggct      180

aatcaaaacc tggcgacctt ctgtaccaca caaatggaac cacaagccga tgaattaatg      240

aagaacgcgt tgaataccaa tgcgattgat aaatcggaat accctaagac cgcggcaatg      300

gaaaattact gtggcagcat gattgctcac ctatggggaa ttcctgacaa tgaaaagatt      360

tacgatgatt tcattgggac ctcaacggta ggttcttctg aaggatgtat gttaggcggc      420

ttggcgctac tacatagttg gaagcaccgg gccaaggcag ctggttttga tattgaagac      480

ctgcatagcc acaagcccaa cttggtcatc atgtcaggtt accaagttgt ttgggaaaag      540

ttctgtacct attggaatgt cgagatgcgc caagtgccaa ttaatggtga ccaagtttcc      600

ttagatatgg atcatgtgat ggattatgtt gatgaaaata cgattgggat tatcggaatt      660

gagggcatta cgtacacagg ctccgttgat gatattcaaa cgctagataa cctcgtgacc      720

gaatataata agaccgcgac gatgccggta cggattcacg ttgatgctgc ctttggtggc      780

ctgttcgcgc cgttcgtcga tggctttaac ccgtgggact tccggttgaa gaacgtggtt      840

tccattaacg tttcgggcca taagtacggg atggtttacc ctgggttggg gtggattgtt      900

tggcggcaca acacggctga tattttaccc gcagaaatgc ggttccaagt gccatatcta      960

ggtaagaccg ttgattcaat cgccattaac ttctcacaca gtggtgccca tatcagtgcg     1020

caatactaca atttcattcg atttggattg tcaggttaca agacgatcat gcaaaatgtt     1080

cggaaggtgt cattgaagct gacggcagct ctgaaaacgt atgggatttt cgatatttta     1140

gttgatgggt cacagctacc aattaactgt tggaaactag cggacgatgc gccggttggt     1200

tggacgttgt atgatttgga gtccgagctg gctaagtatg gttggcaagt tccggcatat     1260

ccactgccaa agaatcgcga cgatgtgaca attagccgga tcgtggtacg cccatccatg     1320

accatgacga ttgccgatga tttcttggat gatttgaaat tagcaattga tggattaaat     1380

cacacatttg gcgtgacgac caccgttgat caagataaca agaccaccgt tcgaagttaa     1440

<210>  2

<211>  3001

<212>  DNA

<213>  Seq ID NO .2

<220>  

<223>  扩增得到基因序列

<400>  2

gtggatgaaa ataagtctga acagcaaatt gatacgcaaa aggcaaatcg aataacgggc       60

tttcagttat tttccatgac gacttccatg gtcatgacgg tttacggttt tgcggcattt      120

gctaagcaag gaccaaccgc tttcttttac ctgtttttag ccgggatctt atggttttta      180

ccggtgactc ggacctcagg agagatggcg tccatcgatg gctggagtaa aggcggtatc      240

tttacttggt cacggaatat gttaggtgaa cgcgccggtt ggtcggcatt attctaccaa      300

tggattcaca ttacggttgg gatgaataca atgatgtatt tcattatcgg ctgtttttcg      360

gtaacgtttg gcttacccat tatcacggat aacccgttag ttaagtttat tttgaggatg      420

atcattttat ggggccttat ctttctacag caaaaaggaa cgagtgttac cggtaagatt      480

gcccaatggt gtttcacgtt aggggtgatt atcccagtct tcttcttact ctttctattt      540

attttgtacc tcgtacaagg aaacccagcg atgattcacg tcaacatgca caccattttt      600

ccatcgagtt ggaatgggag tgtcttagtg ggatttgttc cgtttatctt ggcttttgcc      660

ggtgccgaag ggtcggcacc acacgttaag gacttggata aacctagcat ctatcctaag      720

gtcatgatgg cactagcagt tgctgcgatc tgttccgata ttatcggcag tatggcaatt      780

gctatgacga ttccgaataa tcagattcag ttaagtaatg ggattgttta cgcctatggg      840

gccttagttg cccgctatgg tgtgggcgtg gtctttgtcg aaaagctaac agggttctta      900

ttagccgttg gtgtcttggg tgaaatcagt agctgggtcg tgggtcctaa cgcggggatg      960

tttgaagcag ccaaggctgg atacttacca ccgcgcttct ctaaggccaa taaatatggg     1020

attgaaacca atgtcatggt ccttcaaggg gtcatcgtgt cgattgttgg ggcgctgttg     1080

acgtttgggg ctggcgggaa caaggcgagc ctttccttcc agactgcaat gagtttgacg     1140

gtagccttat acaccttgat gtatatgctg atgtttatta gttatttggt cttacagttc     1200

aagtatgtcg atttgcatcg ggactttgtg gccgctaagt cgcgttggtt gcggatcact     1260

tacggtatcc tagggtttat tttatcggcc tttggatttg tcgtgacctt cttcccgcca     1320

gcagatttat ccgttgcctc aaaacacacg tacctaatgt tgttagtgag tgcctttgtg     1380

gtcatgctcg ttttgccatt tatcttgtac cgtttccacg acaaatgggc cttgcagcta     1440

ggggtcaatg tggatgaagt ggcagcaccg accggtcatg aggcgttgga aaaagaaacc     1500

aagtagtgaa aaataattaa ggaggcaagc catatcgcaa tacggatatg acgactatat     1560

aatgaataaa aacgatcagg aaacacagca gatgattaat aatgtggatt tagaaaaaac     1620

gtttttaggc agtgtcgaag ccgggcaatc cttacccacc aatacattac cagatgatcc     1680

catggcaccg gatgttgccg ctcaattggt ggaacactat cgtttaaatg aagccaaggc     1740

taatcaaaac ctggcgacct tctgtaccac acaaatggaa ccacaagccg atgaattaat     1800

gaagaacgcg ttgaatacca atgcgattga taaatcggaa taccctaaga ccgcggcaat     1860

ggaaaattac tgtggcagca tgattgctca cctatgggga attcctgaca atgaaaagat     1920

ttacgatgat ttcattggga cctcaacggt aggttcttct gaaggatgta tgttaggcgg     1980

cttggcgcta ctacatagtt ggaagcaccg ggccaaggca gctggttttg atattgaaga     2040

cctgcatagc cacaagccca acttggtcat catgtcaggt taccaagttg tttgggaaaa     2100

gttctgtacc tattggaatg tcgagatgcg ccaagtgcca attaatggtg accaagtttc     2160

cttagatatg gatcatgtga tggattatgt tgatgaaaat acgattggga ttatcggaat     2220

tgagggcatt acgtacacag gctccgttga tgatattcaa acgctagata acctcgtgac     2280

cgaatataat aagaccgcga cgatgccggt acggattcac gttgatgctg cctttggtgg     2340

cctgttcgcg ccgttcgtcg atggctttaa cccgtgggac ttccggttga agaacgtggt     2400

ttccattaac gtttcgggcc ataagtacgg gatggtttac cctgggttgg ggtggattgt     2460

ttggcggcac aacacggctg atattttacc cgcagaaatg cggttccaag tgccatatct     2520

aggtaagacc gttgattcaa tcgccattaa cttctcacac agtggtgccc atatcagtgc     2580

gcaatactac aatttcattc gatttggatt gtcaggttac aagacgatca tgcaaaatgt     2640

tcggaaggtg tcattgaagc tgacggcagc tctgaaaacg tatgggattt tcgatatttt     2700

agttgatggg tcacagctac caattaactg ttggaaacta gcggacgatg cgccggttgg     2760

ttggacgttg tatgatttgg agtccgagct ggctaagtat ggttggcaag ttccggcata     2820

tccactgcca aagaatcgcg acgatgtgac aattagccgg atcgtggtac gcccatccat     2880

gaccatgacg attgccgatg atttcttgga tgatttgaaa ttagcaattg atggattaaa     2940

tcacacattt ggcgtgacga ccaccgttga tcaagataac aagaccaccg ttcgaagtta     3000

a                                                                     3001

<210>  3

<211>  3785

<212>  DNA

<213>  Seq ID NO .3

<220>  

<223>  扩增得到基因序列

<400>  3

atggaatcca gaactaagga aaggctgggg gcaacgttgc agcgtctaac cgatgatgaa       60

caatttgata cgatcacggt taaacggcta gttttggaaa gccatgttaa tcgacagaca      120

ttttattatc atttccaaga taaatttgat tgtctgcagt atcagttcga tcgcgaggca      180

cagcggctgg tggggaaagt aacggccgac aactggctgg ctagttatct gagcttgttt      240

cgctacattg atgcgcatca gaacttttgt catcacgtcg tcgattctca tgcttattcg      300

gaatttgatg attttatctt ggaaacgatc gatctgatcg tagagcgatt aaaccagagt      360

ctgaagcagg catgtccgca gttacatttc cgcaatgaat cgggtctatt actatttgag      420

tatggcttac aggggattgt tcgcaattgg tttcgcagtg gcctccgaga aaatccggct      480

ttggtcgttg aggggatcgg accggttagc cagcggcaat tggccatgtt attagaaaca      540

gaaagtctgc tcaccaaagt atcagtcaaa caacaactgg catctgtcta gcacttatac      600

ataacccagt ctctgtctat tctttatttg gtacgtcagc tctactctta gggtgttaac      660

acggaatcac cattggtggt ggttcacaat tattcggccg aataatgagt tcccaaattg      720

aaaccgctgt cacttgtgct taattgacac cgcttcgttt ggttgtgaag ggattgtgta      780

gcaagtggat gaaaataagt ctgaacagca aattgatacg caaaaggcaa atcgaataac      840

gggctttcag ttattttcca tgacgacttc catggtcatg acggtttacg gttttgcggc      900

atttgctaag caaggaccaa ccgctttctt ttacctgttt ttagccggga tcttatggtt      960

tttaccggtg actcggacct caggagagat ggcgtccatc gatggctgga gtaaaggcgg     1020

tatctttact tggtcacgga atatgttagg tgaacgcgcc ggttggtcgg cattattcta     1080

ccaatggatt cacattacgg ttgggatgaa tacaatgatg tatttcatta tcggctgttt     1140

ttcggtaacg tttggcttac ccattatcac ggataacccg ttagttaagt ttattttgag     1200

gatgatcatt ttatggggcc ttatctttct acagcaaaaa ggaacgagtg ttaccggtaa     1260

gattgcccaa tggtgtttca cgttaggggt gattatccca gtcttcttct tactctttct     1320

atttattttg tacctcgtac aaggaaaccc agcgatgatt cacgtcaaca tgcacaccat     1380

ttttccatcg agttggaatg ggagtgtctt agtgggattt gttccgttta tcttggcttt     1440

tgccggtgcc gaagggtcgg caccacacgt taaggacttg gataaaccta gcatctatcc     1500

taaggtcatg atggcactag cagttgctgc gatctgttcc gatattatcg gcagtatggc     1560

aattgctatg acgattccga ataatcagat tcagttaagt aatgggattg tttacgccta     1620

tggggcctta gttgcccgct atggtgtggg cgtggtcttt gtcgaaaagc taacagggtt     1680

cttattagcc gttggtgtct tgggtgaaat cagtagctgg gtcgtgggtc ctaacgcggg     1740

gatgtttgaa gcagccaagg ctggatactt accaccgcgc ttctctaagg ccaataaata     1800

tgggattgaa accaatgtca tggtccttca aggggtcatc gtgtcgattg ttggggcgct     1860

gttgacgttt ggggctggcg ggaacaaggc gagcctttcc ttccagactg caatgagttt     1920

gacggtagcc ttatacacct tgatgtatat gctgatgttt attagttatt tggtcttaca     1980

gttcaagtat gtcgatttgc atcgggactt tgtggccgct aagtcgcgtt ggttgcggat     2040

cacttacggt atcctagggt ttattttatc ggcctttgga tttgtcgtga ccttcttccc     2100

gccagcagat ttatccgttg cctcaaaaca cacgtaccta atgttgttag tgagtgcctt     2160

tgtggtcatg ctcgttttgc catttatctt gtaccgtttc cacgacaaat gggccttgca     2220

gctaggggtc aatgtggatg aagtggcagc accgaccggt catgaggcgt tggaaaaaga     2280

aaccaagtag tgaaaaataa ttaaggaggc aagccatatc gcaatacgga tatgacgact     2340

atataatgaa taaaaacgat caggaaacac agcagatgat taataatgtg gatttagaaa     2400

aaacgttttt aggcagtgtc gaagccgggc aatccttacc caccaataca ttaccagatg     2460

atcccatggc accggatgtt gccgctcaat tggtggaaca ctatcgttta aatgaagcca     2520

aggctaatca aaacctggcg accttctgta ccacacaaat ggaaccacaa gccgatgaat     2580

taatgaagaa cgcgttgaat accaatgcga ttgataaatc ggaataccct aagaccgcgg     2640

caatggaaaa ttactgtggc agcatgattg ctcacctatg gggaattcct gacaatgaaa     2700

agatttacga tgatttcatt gggacctcaa cggtaggttc ttctgaagga tgtatgttag     2760

gcggcttggc gctactacat agttggaagc accgggccaa ggcagctggt tttgatattg     2820

aagacctgca tagccacaag cccaacttgg tcatcatgtc aggttaccaa gttgtttggg     2880

aaaagttctg tacctattgg aatgtcgaga tgcgccaagt gccaattaat ggtgaccaag     2940

tttccttaga tatggatcat gtgatggatt atgttgatga aaatacgatt gggattatcg     3000

gaattgaggg cattacgtac acaggctccg ttgatgatat tcaaacgcta gataacctcg     3060

tgaccgaata taataagacc gcgacgatgc cggtacggat tcacgttgat gctgcctttg     3120

gtggcctgtt cgcgccgttc gtcgatggct ttaacccgtg ggacttccgg ttgaagaacg     3180

tggtttccat taacgtttcg ggccataagt acgggatggt ttaccctggg ttggggtgga     3240

ttgtttggcg gcacaacacg gctgatattt tacccgcaga aatgcggttc caagtgccat     3300

atctaggtaa gaccgttgat tcaatcgcca ttaacttctc acacagtggt gcccatatca     3360

gtgcgcaata ctacaatttc attcgatttg gattgtcagg ttacaagacg atcatgcaaa     3420

atgttcggaa ggtgtcattg aagctgacgg cagctctgaa aacgtatggg attttcgata     3480

ttttagttga tgggtcacag ctaccaatta actgttggaa actagcggac gatgcgccgg     3540

ttggttggac gttgtatgat ttggagtccg agctggctaa gtatggttgg caagttccgg     3600

catatccact gccaaagaat cgcgacgatg tgacaattag ccggatcgtg gtacgcccat     3660

ccatgaccat gacgattgcc gatgatttct tggatgattt gaaattagca attgatggat     3720

taaatcacac atttggcgtg acgaccaccg ttgatcaaga taacaagacc accgttcgaa     3780

gttaa                                                                 3785

<210>  4

<211>  51

<212>  DNA

<213>  人工合成序列B2F

<220>  

<223>  根据基因序列设计用于扩增

<400>  4

ctagctagca gaaggagata taggatgaat aaaaacgatc aggaaacaca g                51

<210>  5

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工合成序列B2R

<220>  

<223>  根据基因序列设计用于扩增

<400>  5

gataagcttt taacttcgaa cggtggtctt g                                      31

<210>  6

<211>  49

<212>  DNA

<213>  人工合成序列CB2F

<220>  

<223>  根据基因序列设计用于扩增

<400>  6

ctactcgaga gaaggagata taccatggat gaaaataagt ctgaacagc                   49

<210>  7

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工合成序列B2R

<220>  

<223>  根据基因序列设计用于扩增

<400>  7

gataagcttt taacttcgaa cggtggtctt g                                      31

<210>  8

<211>  48

<212>  DNA

<213>  人工合成序列RCB2F

<220>  

<223>  根据基因序列设计用于扩增

<400>  8

ctagctagca gaaggagata taccatggaa tccagaacta aggaaagg                    48

<210>  9

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工合成序列B2R

<220>  

<223>  根据基因序列设计用于扩增

<400>  9

gataagcttt taacttcgaa cggtggtctt g                                      31

Claims (3)

1.一种谷氨酸脱羧酶基因gadB2，核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。

2.一种含有权利要求1所述基因的谷氨酸脱羧酶基因gadCB2，核苷酸序列如Seq ID NO.2所示。

3.一种含有权利要求1所述基因的谷氨酸脱羧酶基因gadRCB2，核苷酸序列如Seq ID NO.3所示。