CN107619833B - 用于构建布鲁氏菌突变株的质粒pZF17-30及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于构建布鲁氏菌突变株的质粒pZF17‑30及其构建方法和应用，构建过程主要包括从商业化质粒pCMV‑BE3中扩增rAPOBEC1‑nCas9‑UGI片段，并将该片段与含有泛宿主复制子pBBR1‑MCS‑5和非特异性sgRNA的载体通过重组反应整合到一起，随后将ccdB基因与Chl抗性基因插入sgRNA中；利用限制性内切酶BsaI酶切质粒pZF17‑30，将特异性sgRNA与线性化pZF17‑30连接，构建的载体的序列如SEQ ID NO.3所示，该载体可用于构建布鲁氏菌突变株，将virB10基因CDS区478位碱基由C突变为T。

Description

用于构建布鲁氏菌突变株的质粒pZF17-30及其构建方法和 应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于构建布鲁氏菌突变株的质粒pZF17-30及其构建方法，可用于布鲁氏菌基因编码区终止突变，蛋白质翻译提前终止。

背景技术

布鲁氏菌病(brucellosis)是一种波及世界的重要的人畜共患病，对畜牧业造成了严重的经济损失，因为它人畜共患病的特点，也使其成为了人类健康和社会安全的一大威胁。然而，迄今为止，都未能研发出安全有效的疫苗。布鲁氏菌(Brucella)，又称作布氏杆菌，是造成布鲁氏菌病的病原体，要研发出安全有效的疫苗，对该菌各类基因的功能研究是十分重要的。

目前，对布鲁氏菌基因的功能研究存在许多困难。一是布鲁氏菌生长缓慢，在实验室稳定的培养环境下，菌体需要生长36-48h才能在平板上长出肉眼可见的菌落，初次分离的野生菌株生长往往更加缓慢。二是布鲁氏菌病人畜共患的特征，使得对布鲁氏菌的操作变的相当繁琐和耗时。这些因素都使得对布鲁氏菌基因的研究变得格外困难。随着对布鲁氏菌致病机理的深入研究以及与其相关的分子生物学技术的发展，布鲁氏菌病基因工程疫苗的研究成为生命科学的一项重要课题，基因工程疫苗有望代替传统的弱毒活疫苗，成为安全有效新型布病疫苗。基因工程疫苗旨在解决传统布病疫苗存在的安全、保护力低、干扰血清学诊断等问题，主要包括基因工程弱毒活疫苗、活载体疫苗、DNA疫苗和亚单位疫苗。其中基因工程活疫苗是利用分子生物学技术将布鲁氏菌的某个毒力基因进行缺失或者过提高保护性抗原的表达，由于其具有安全性更高、可以利用血清学诊断区分疫苗接种和自然感染，是目前布鲁氏菌病疫苗的研究热点(景志刚等2016)。利用分子生物学技术在強毒株或分离株上将毒力基因进行缺失，研发基因缺失疫苗。例如LPS合成基因如pgm、wboA、per等基因缺失突变株；外膜蛋白基因如omP25、omP31、bp26等基因缺失突变株；代谢通路和转录调控因子必须基因如vrrB2、vjbR等基因缺失突变株。这些基因缺失突变株改善了传统布鲁氏菌病弱毒疫苗安全性差、干扰血清学免疫诊断等缺点。但是目前构建布鲁氏菌毒力基因缺失的技术大多使用传统的同源重组结合自杀质粒进行，但是传统的同源重组技术存在自身的弊端，例如，针对不同的靶基因需要重新构建复杂的打靶和筛选载体质粒使得操作繁琐、工作量大、耗时长、增加了实验成本，同时载体质粒的构建也受克隆载体及靶基因所在的基因组上的限制性酶切位点的限制，进行功能基因组学实验操作时，克隆载体可能无法承受大片段的DNA，此外传统的同源重组技术发生重组的概率低(Copeland et al 2001)，限制了该项技术在实验室大规模应用，也使得布鲁氏菌毒力基因研究进展缓慢，因此这种传统的布鲁氏菌基因编辑技术有望得到改进。

发明内容

本发明的目的在于提供一种质粒pZF17-30，包含氯霉素抗性基因和毒性基因ccdB，两个酶切位点Bsa I，方便质粒重组筛选，可在大肠杆菌和布鲁氏菌等细菌中复制。

本发明的再一个目的在于提供由pZF17-30构建得到的载体在制备布鲁氏菌的单碱基突变株中的应用，仅需要插入特异性sgRNA，转化布鲁氏菌后即可实现对特定基因终止突变，获得细菌突变株。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

质粒pZF17-30的构建方法，其步骤是：

1.将sgRNA插入质粒pBBR1-MCS-5，所述的sgRNA的序列为5′-GTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTT-3′，转化大肠杆菌TransT1感受态细胞，得到pZF17-26；

2.以质粒pCMV-BE3为模板，oWY-158(5′-AAGGAAGCTAAAATGCATATGAGCTCAGAGACTGGCCCAG-3′)、oWY-159(5′-TGGAGATCCTTACTCGAGAGGCTGATCAGCGGGTTTAAAC-3′)为引物，扩增rAPOBEC1-nCas9-ugi片段(5182bp)；以pZF17-26为模板，oWY-156(5′-CTCGAGTAAGGATCTCCAGGCATCA-3′)、oWY-157(5′-ATGCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCT-3′)为引物，扩增含有泛宿主复制子的线性化载体(pBBR1oriV-lac I)(9119bp)；将上述扩增的线性化载体和插入基因(rAPOBEC1-nCas9-ugi片段)通过同源重组反应整合，转化大肠杆菌TransT1感受态细胞，得到pZF17-29质粒；

3.将pZF17-29用限制性内切酶Bsa I酶切线性化作为载体，以质粒pDONR221为模板，oWY-179(5′-CTGATGGAAGAGACCGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3′)、oWY-180(5′-CTAAAACTGAGACCAAGCTGCCAGGAAACAGCTATGA-3′)为引物扩增Chl抗性基因和ccdB基因(2520bp)，将PCR产物用限制性内切酶Bsa I酶切作为插入片段与载体进行酶连反应，转化大肠杆菌TransDB3.1感受态细胞，得到质粒pZF17-30，其序列如SEQ ID NO.1所示。

含有质粒pZF17-30的大肠杆菌(Escherichia coli)PZF17-30于2017年6月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号为CCTCC No：M2017395。

由pZF17-30构建得到的载体的制备方法，其步骤是：

1.设计特异性sgRNA，具体序列如下：oWY-181(5′-TGGAACAGTCAAAAGAACACCAAGC-3′)，oWY-182(5′-CAAAGCTTGGTGTTCTTTTGACTGT-3′)；

2.线性化质粒载体的制备：利用限制性内切酶Bsa I酶切质粒pZF17-30，使其线性化，纯化后用作载体；

3.sgRNA的制备：将sgRNA引物做磷酸化处理，37℃反应30min后，将2条引物混合均匀，94℃反应5min，随后缓慢退火形成dimer；

4.载体与sgRNA的连接：将sgRNA dimer与线性化载体连接，即插入pZF17-30的两个Bsal位点之间，替换掉ccdB毒性基因和Chl抗性基因(插入位点123-143)，转化大肠杆菌TransT1感受态细胞，挑取转化子，通过测序验证特异性sgRNA插入成功，序列如SEQ IDNO.3所示。

由pZF17-30构建得到的载体在制备布鲁氏菌的单碱基突变株中的应用：

将含有特异性sgRNA的载体转化布鲁氏菌，提取待检菌体的基因组DNA，随后利用PCR对靶基因(布鲁氏菌VirB10基因的CDS区序列)进行扩增(引物VirB10-F 5′-atgacacaggaaaacattccgg-3′，VirB10-R 5′-tcacttcggtttgacatcataca-3′)，并对突变位点进行测序验证。结果显示，在挑取的21个转化子中有11个样品的VirB10基因的CDS区序列单碱基突变成功，突变株的测序结果如SEQ ID NO.4所示，突变后第478位的碱基C突变为T。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：相比现有传统技术利用单交换和双交换方法获得突变株存在的耗时长、重组率低和筛选工作量大的缺陷，本系统具有sgRNA设计简易、特异性强、效率高等优点，并且能够实现传统技术不具备的定点基因突变，而且由于sgRNA是特异的，所以每次的定点突变都只需设计相应的sgRNA，操作技术简单并且大大节约了时间成本，使其在基因的定点突变领域得到了广泛有效的利用。

附图说明

图1为质粒pZF17-30的图谱。

图2为质粒pZF17-30的构建流程图。

具体实施方式

各实施例中使用的生物材料来源如下：

质粒pBBR1-MCS-5：购自美国BioVector NTCC公司

质粒pCMV-BE3：购自美国Addgene公司

质粒pDONR221：购自美国BioVector NTCC公司

大肠杆菌TransT1感受态细胞：购自北京全式金生物(TransGen Biotech)

大肠杆菌TransDB3.1感受态细胞：购自北京全式金生物(TransGen Biotech)实施例1pZF17-30质粒构建

pZF17-30质粒的组成如图1所示，构建流程如图2所述，具体方法如下：

1.将sgRNA插入质粒pBBR1-MCS-5，所述的sgRNA的序列为5′-GTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCTAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGGCCAACATGAGGATCACCCATGTCTGCAGGGCCAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTT-3′，转化大肠杆菌TransT1感受态细胞，得到pZF17-26；

2.以质粒pCMV-BE3为模板，oWY-158(5′-AAGGAAGCTAAAATGCATATGAGCTCAGAGACTGGCCCAG-3′)、oWY-159(5′-TGGAGATCCTTACTCGAGAGGCTGATCAGCGGGTTTAAAC-3′)为引物，扩增rAPOBEC1-nCas9-ugi片段(5182bp)；以pZF17-26为模板，oWY-156(5′-CTCGAGTAAGGATCTCCAGGCATCA-3′)、oWY-157(5′-ATGCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCT-3′)为引物，扩增含有泛宿主复制子的线性化载体(pBBR1oriV-lac I)(9119bp)；将上述扩增的线性化载体和插入基因(rAPOBEC1-nCas9-ugi片段)通过同源重组反应整合，转化大肠杆菌TransT1感受态细胞，得到pZF17-29质粒；

3.将pZF17-29用限制性内切酶Bsa I酶切线性化作为载体，以质粒pDONR221为模板，oWY-179(5′-CTGATGGAAGAGACCGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3′)、oWY-180(5′-CTAAAACTGAGACCAAGCTGCCAGGAAACAGCTATGA -3′)为引物扩增Chl抗性基因和ccdB基因(2520bp)，将PCR产物用限制性内切酶Bsa I酶切作为插入片段与载体进行酶连反应，转化大肠杆菌TransDB3.1感受态细胞，得到质粒pZF17-30，其序列如SEQ ID NO.1所示。

质粒pZF17-30含有如下片段：ColE1复制子、庆大霉素抗性基因、pBBR1复制子、氯霉素抗性基因-ccdB自杀基因、sgRNA骨架、lacI基因、rAPOBEC1-nCas9-UGI融合基因，功能分别为：(1)作为大肠杆菌中质粒复制必要元件，承担质粒复制任务，高拷贝复制子，提高质粒提取效率；(2)提供庆大霉素抗性，用于筛选；(3)泛宿主复制子可于大肠杆菌和布鲁氏菌中复制，作为穿梭元件；(4)该片段两端有BsaI位点，可被切除，产生粘性末端，用于构建sgRNA seedregion区，自杀基因可有效提高重组质粒阳性率；(5)作为sgRNA骨架，在CRISPR系统工作时发挥引导Cas9的作用；(6)编码合成lacI抑制蛋白，负调控rAPOBEC1-nCas9-UGI基因表达；(7)编码融合蛋白，该蛋白具有切割dsDNA，造成其中一条链断裂，在切口附近将dCTP转化为dUTP，并且抑制细菌内源的UNG酶(尿嘧啶DNA糖基酶)活性。该质粒具有如下特性：(1)于大肠杆菌和布鲁氏菌等革兰阴性菌穿梭；(2)高效构建重组质粒；(3)特异性可诱导定向突变细菌基因组碱基。含有该质粒的大肠杆菌菌株(DB3.1)PZF17-30(Escherichiacoli)于2017年6月29日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，其保藏编号：CCTCC No：M 2017395。

实施例2质粒pZF17-30在制备布鲁氏菌突变株中的应用

本实施例以pZF17-30作为出发质粒构建布鲁氏菌突变株，将布鲁氏菌VirB10基因的CDS区序列的第478位碱基C定向突变为T，布鲁氏菌virB10基因CDS区序列如SEQ ID NO.2所示。具体方法如下：

1.设计特异性sgRNA，具体序列如下：oWY-181(5′-TGGAACAGTCAAAAGAACACCAAGC-3′)，oWY-182(5′-CAAAGCTTGGTGTTCTTTTGACTGT-3′)，加粗表示sgRNA和靶基因的同源序列，下划线为待突变的终止密码子。

2.线性化质粒载体的制备：利用限制性内切酶Bsa I酶切质粒pZF17-30，使其线性化，用磁珠法微量DNA胶回收试剂盒(TAKARA)纯化后用作载体，酶切体系如下：

pZF17-30	2.5μL
		Bsa I	2.5μL
10倍buffer	5μL
		水	40μL
Total	50μL

3.sgRNA的制备：利用Thermo Fisher T4PNK将sgRNA引物做磷酸化处理，体系如下：

引物(100μM)	1μL
		ATP(10mM)	1μL
10倍PNK buffer	1μL
		T4PNK酶	1μL
水	6μL
		Total	10μL

37℃，反应30min后，将2条引物混合均匀，94℃反应5min，随后缓慢退火形成dimer。

4.载体与sgRNA的连接：利用Thermo Fisher T4DNA ligase将sgRNA dimer与线性化载体连接，即插入pZF17-30的两个Bsal位点之间，替换掉ccdB毒性基因和Chl抗性基因(插入位点123-143)，连接体系如下：

Vector	2μL
		Insert	2μL
10倍T4DNA ligase buffer	1μL
		T4DNA ligase	0.5μL
水	4.5μL
		Total	10μL

22℃反应1h，转化大肠杆菌TransT1感受态细胞，挑取转化子，通过测序验证sgRNA插入成功，序列如SEQ ID NO.3所示。

5.含有特异性sgRNA的质粒转化布鲁氏菌：

(1)从-80℃冰箱中取出需要的布鲁氏菌感受态细胞，置于冰上待其溶化，同时将电转杯放在冰上预冷；

(2)在生物安全柜中，小心地打开装有布鲁氏菌感受态细胞的离心管，用移液器吸取5μL质粒DNA加入感受态细胞中，轻轻吹打混匀，置于冰上；

(3)调节电转仪电转电压2.5kV，将电转杯用干燥的纱布擦净，并在纱布上轻轻撞击电转杯底部，使电转杯中无气泡；

(4)将电转杯放置在电转仪的电击槽位中，按Pulse键，听到电击结束提示后迅速拿出电转杯，使用移液器加入1mL不含抗生素的TSB培养基，适度吹打，使感受态细胞均匀分布；

(5)吸取全部1mL菌液至20mL一次性的细菌瓶中，使用浸有75％酒精的纱布仔细擦拭细菌瓶进行消毒，最后将细菌瓶装在自封袋中，于37℃，180rpm的条件下复苏4-6h；

(6)复苏结束后，用移液器小心吸取菌液至1.5mL离心管中，8000rpm离心3min；

(7)吸出900μL上清液，用移液器轻轻吹吸，重悬离心管中的菌体，小心转移到事先准备好带有所需抗性的TSB平板上，使用刮铲将菌液涂布均匀，待菌液干燥后，用浸有75％酒精的纱布仔细擦拭平板表面进行消毒，最后将平板装在自封袋中，倒置于37℃恒温培养箱中，培养约3-4d。

6.突变株的鉴定

挑取平板上的转化子(本实施例挑取20个)，摇菌(5mL TSB，Gm终浓度50mg/mL)至菌体状态为平台期；利用酒精苯酚混合液(乙醇：苯酚的体积比95:5)对菌体灭活，收集菌液；利用天根细菌基因组提取试剂盒提取待检菌体的基因组，随后利用PCR对靶基因进行扩增(引物VirB10-F 5′-atgacacaggaaaacattccgg-3′，VirB10-R 5′-tcacttcggtttgacatcataca-3′)，并对突变位点进行测序验证。结果显示，在挑取的21个转化子中有11个样品的单碱基突变成功，突变株的测序结果如SEQ ID NO.4所示，野生型对照(转化未加入特异性sgRNA的质粒pZF17-30，其他处理相同)的测序结果如SEQ ID NO.5所示，突变后第478位的碱基C突变为T。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 用于构建布鲁氏菌突变株的质粒pZF17-30及其构建方法和应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 14300

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acggtcacgg atccgcgcgc cagggttttc ccagtcacga cctcgagaaa aaagccagac 60

aaacgtccgg cttttgaatt aaggcctccc ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg 120

tgtggaagag accgacgttg taaaacgacg gccagtctta agctcgggcc ccaaataatg 180

attttatttt gactgatagt gacctgttcg ttgcaacaca ttgatgagca atgctttttt 240

ataatgccaa ctttgtacaa aaaagctgaa cgagaaacgt aaaatgatat aaatatcaat 300

atattaaatt agattttgca taaaaaacag actacataat actgtaaaac acaacatatc 360

cagtcactat gaatcaacta cttagatggt attagtgacc tgtagtcgac cgacagcctt 420

ccaaatgttc ttcgggtgat gctgccaact tagtcgaccg acagccttcc aaatgttctt 480

ctcaaacgga atcgtcgtat ccagcctact cgctattgtc ctcaatgccg tattaaatca 540

taaaaagaaa taagaaaaag aggtgcgagc ctcttttttg tgtgacaaaa taaaaacatc 600

tacctattca tatacgctag tgtcatagtc ctgaaaatca tctgcatcaa gaacaatttc 660

acaactctta tacttttctc ttacaagtcg ttcggcttca tctggatttt cagcctctat 720

acttactaaa cgtgataaag tttctgtaat ttctactgta tcgacctgca gactggctgt 780

gtataaggga gcctgacatt tatattcccc agaacatcag gttaatggcg tttttgatgt 840

cattttcgcg gtggctgaga tcagccactt cttccccgat aacggaaacc ggcacactgg 900

ccatatcggt ggtcatcatg cgccagcttt catccccgat atgcaccacc gggtaaagtt 960

cacgggagac tttatctgac agcagacgtg cactggccag ggggatcacc atccgtcgcc 1020

cgggcgtgtc aataatatca ctctgtacat ccacaaacag acgataacgg ctctctcttt 1080

tataggtgta aaccttaaac tgcatttcac cagcccctgt tctcgtcagc aaaagagccg 1140

ttcatttcaa taaaccgggc gacctcagcc atcccttcct gattttccgc tttccagcgt 1200

tcggcacgca gacgacgggc ttcattctgc atggttgtgc ttaccagacc ggagatattg 1260

acatcatata tgccttgagc aactgatagc tgtcgctgtc aactgtcact gtaatacgct 1320

gcttcatagc atacctcttt ttgacatact tcgggtatac atatcagtat atattcttat 1380

accgcaaaaa tcagcgcgca aatacgcata ctgttatctg gcttttagta agccggatcc 1440

acgcggcgtt tacgccccgc cctgccactc atcgcagtac tgttgtaatt cattaagcat 1500

tctgccgaca tggaagccat cacagacggc atgatgaacc tgaatcgcca gcggcatcag 1560

caccttgtcg ccttgcgtat aatatttgcc catggtgaaa acgggggcga agaagttgtc 1620

catattggcc acgtttaaat caaaactggt gaaactcacc cagggattgg ctgagacgaa 1680

aaacatattc tcaataaacc ctttagggaa ataggccagg ttttcaccgt aacacgccac 1740

atcttgcgaa tatatgtgta gaaactgccg gaaatcgtcg tggtattcac tccagagcga 1800

tgaaaacgtt tcagtttgct catggaaaac ggtgtaacaa gggtgaacac tatcccatat 1860

caccagctca ccgtctttca ttgccatacg gaattccgga tgagcattca tcaggcgggc 1920

aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa 1980

ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc 2040

ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt 2100

tttctccatt ttagcttcct tagctcctga aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg 2160

tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca 2220

ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc ggtatcaaca gggacaccag gatttattta 2280

ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtat ttattcggcg caaagtgcgt cgggtgatgc 2340

tgccaactta gtcgactaca ggtcactaat accatctaag tagttgattc atagtgactg 2400

gatatgttgt gttttacagt attatgtagt ctgtttttta tgcaaaatct aatttaatat 2460

attgatattt atatcatttt acgtttctcg ttcagctttc ttgtacaaag ttggcattat 2520

aagaaagcat tgcttatcaa tttgttgcaa cgaacaggtc actatcagtc aaaataaaat 2580

cattatttgc catccagctg atatccccta tagtgagtcg tattacatgg tcatagctgt 2640

ttcctggcag cttggtctca gttttagagc taggccaaca tgaggatcac ccatgtctgc 2700

agggcctagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttggccaaca tgaggatcac 2760

ccatgtctgc agggccaagt ggcaccgagt cggtgctttt tctgcaggag gcatcaaata 2820

aaacgaaagg ctcagtcgaa agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac 2880

gctctcctga gtaggacaaa tgggtaaaaa aaaaccccgc ttcggcgggg tttttttttt 2940

actacactta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 3000

gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgccaggg 3060

tggtttttct tttcaccagt gagacgggca acagctgatt gcccttcacc gcctggccct 3120

gagagagttg cagcaagcgg tccacgctgg tttgccccag caggcgaaaa tcctgtttga 3180

tggtggttaa cggcgggata taacatgagc tgtcttcggt atcgtcgtat cccactaccg 3240

agatatccgc accaacgcgc agcccggact cggtaatggc gcgcattgcg cccagcgcca 3300

tctgatcgtt ggcaaccagc atcgcagtgg gaacgatgcc ctcattcagc atttgcatgg 3360

tttgttgaaa accggacatg gcactccagt cgccttcccg ttccgctatc ggctgaattt 3420

gattgcgagt gagatattta tgccagccag ccagacgcag acgcgccgag acagaactta 3480

atgggcccgc taacagcgcg atttgctggt gacccaatgc gaccagatgc tccacgccca 3540

gtcgcgtacc gtcttcatgg gagaaaataa tactgttgat gggtgtctgg tcagagacat 3600

caagaaataa cgccggaaca ttagtgcagg cagcttccac agcaatggca tcctggtcat 3660

ccagcggata gttaatgatc agcccactga cgcgttgcgc gagaagattg tgcaccgccg 3720

ctttacaggc ttcgacgccg cttcgttcta ccatcgacac caccacgctg gcacccagtt 3780

gatcggcgcg agatttaatc gccgcgacaa tttgcgacgg cgcgtgcagg gccagactgg 3840

aggtggcaac gccaatcagc aacgactgtt tgcccgccag ttgttgtgcc acgcggttgg 3900

gaatgtaatt cagctccgcc atcgccgctt ccactttttc ccgcgttttc gcagaaacgt 3960

ggctggcctg gttcaccacg cgggaaacgg tctgataaga gacaccggca tactctgcga 4020

catcgtataa cgttactggt ttgtgcatgg tataaccctt ggtgttatag acgttccggg 4080

cgctatcatg ccataccgcg aaaggttttg cgccattgag ctcaatgata cggcgaccac 4140

cgaaattgac aattaatcat ccggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaaa 4200

gattttcagg agctaaggaa gctaaaatgc atatgagctc agagactggc ccagtggctg 4260

tggaccccac attgagacgg cggatcgagc cccatgagtt tgaggtattc ttcgatccga 4320

gagagctccg caaggaaacc tgcctgcttt acgaaattaa ttgggggggc cggcactcca 4380

tttggcgaca tacatcacag aacactaaca agcacgtcga agtcaacttc atcgagaagt 4440

tcacgacaga aagatatttc tgtccgaaca caaggtgcag cattacctgg tttctcagct 4500

ggagcccatg cggcgaatgt agtagggcca tcactgaatt cctgtcaagg tatccccacg 4560

tcactctgtt tatttacatc gcaaggctgt accaccacgc tgacccccgc aatcgacaag 4620

gcctgcggga tttgatctct tcaggtgtga ctatccaaat tatgactgag caggagtcag 4680

gatactgctg gagaaacttt gtgaattata gcccgagtaa tgaagcccac tggcctaggt 4740

atccccatct gtgggtacga ctgtacgttc ttgaactgta ctgcatcata ctgggcctgc 4800

ctccttgtct caacattctg agaaggaagc agccacagct gacattcttt accatcgctc 4860

ttcagtcttg tcattaccag cgactgcccc cacacattct ctgggccacc gggttgaaaa 4920

gcggcagcga gactcccggg acctcagagt ccgccacacc cgaaagtgat aaaaagtatt 4980

ctattggttt agccatcggc actaattccg ttggatgggc tgtcataacc gatgaataca 5040

aagtaccttc aaagaaattt aaggtgttgg ggaacacaga ccgtcattcg attaaaaaga 5100

atcttatcgg tgccctccta ttcgatagtg gcgaaacggc agaggcgact cgcctgaaac 5160

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ttgtcgaaga ggacaagaaa catgaacggc accccatctt tggaaacata gtagatgagg 5340

tggcatatca tgaaaagtac ccaacgattt atcacctcag aaaaaagcta gttgactcaa 5400

ctgataaagc ggacctgagg ttaatctact tggctcttgc ccatatgata aagttccgtg 5460

ggcactttct cattgagggt gatctaaatc cggacaactc ggatgtcgac aaactgttca 5520

tccagttagt acaaacctat aatcagttgt ttgaagagaa ccctataaat gcaagtggcg 5580

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ttagtaagga cacgtacgat gacgatctcg acaatctact ggcacaaatt ggagatcagt 5820

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aatataagga aatattcttt gatcagtcga aaaacgggta cgcaggttat attgacggcg 6060

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caagaaagtc cgaagaaacg attactccat ggaattttga ggaagttgtc gataaaggtg 6420

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gtgagtttgt gtatggtgat tacaaagttt atgacgtccg taagatgatc gcgaaaagcg 8040

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gggacccgaa aaagtacggt ggcttcgata gccctacagt tgcctattct gtcctagtag 8400

tggcaaaagt tgagaaggga aaatccaaga aactgaagtc agtcaaagaa ttattgggga 8460

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cggaaaatat tatccatttg tttactctta ccaacctcgg cgctccagcc gcattcaagt 8940

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cactgattca ccaatccatc acgggattat atgaaactcg gatagatttg tcacagcttg 9060

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gcaacggtga gaacaagatt aagatgctct ctggtggttc tcccaagaag aagaggaaag 9360

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attgcgcatg gtgccgcaac cgtgcggcac cctaccgcat ggagataagc atggccacgc 13380

agtccagaga aatcggcatt caagccaaga acaagcccgg tcactgggtg caaacggaac 13440

gcaaagcgca tgaggcgtgg gccgggctta ttgcgaggaa acccacggcg gcaatgctgc 13500

tgcatcacct cgtggcgcag atgggccacc agaacgccgt ggtggtcagc cagaagacac 13560

tttccaagct catcggacgt tctttgcgga cggtccaata cgcagtcaag gacttggtgg 13620

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ctcaggcatt tgagaagcac 14300

<210> 2

<211> 1143

<212> DNA

<213> 布鲁氏菌

<400> 2

atgacacagg aaaacattcc ggtgcagccg ggcacacttg acggtgagcg tggcctaccc 60

accgtgaacg aaaacggctc cggccgcacc cgcaaggtgt tgctctttct ctttgtcgtg 120

ggcttcatcg tcgtgctgct gttgctgctc gtgtttcaca tgaggggcaa tgcagagaat 180

aatccccatt catacaagac gatggtgcag accagcacag ttccgatgcg aactttcaag 240

ctgccacccc cgccaccacc agcaccacca gaaccaccag ccccgccacc ggccccagcc 300

atgcccatcg cggaacccgc agcggcggcg ctgagcctgc caccattgcc ggatgatacg 360

ccggcaaagg acgatgtact ggacaagtcg gccagcgcgt tgatggtcgt caccaagtcc 420

agcggcgata cggtcgttca aacgaccaat gcgcgcattc aagccctgct cgacagtcaa 480

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gcacgcatgg cgagccttct gcgcaaccgt gatttcctgc tcgcgaaggg cagcatcatc 600

aattgcgcgc tgcaaacccg tctggattcg acggtgccgg gcatggctgc ctgcgtggtc 660

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tcgggtgaat atgatgccaa cgtaaagcag ggcatggctc gcatttatgt cctgtggacg 780

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ggttcaaatc agatcaacct caataccggc ggaggtgaat cgacgagcaa cctggcttca 1020

actgccttga aggatacgat caacattccg ccgacactgt acaagaacca gggcgaagag 1080

atcggcatct atatcgcccg cgacctagat ttttcgagtg tgtatgatgt caaaccgaag 1140

tga 1143

<210> 3

<211> 11783

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acggtcacgg atccgcgcgc cagggttttc ccagtcacga cctcgagaaa aaagccagac 60

aaacgtccgg cttttgaatt aaggcctccc ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg 120

tgacagtcaa aagaacacca agcgttttag agctaggcca acatgaggat cacccatgtc 180

tgcagggcct agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttggcca acatgaggat 240

cacccatgtc tgcagggcca agtggcaccg agtcggtgct ttttctgcag gaggcatcaa 300

ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg 360

aacgctctcc tgagtaggac aaatgggtaa aaaaaaaccc cgcttcggcg gggttttttt 420

tttactacac ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg 480

ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgcca 540

gggtggtttt tcttttcacc agtgagacgg gcaacagctg attgcccttc accgcctggc 600

cctgagagag ttgcagcaag cggtccacgc tggtttgccc cagcaggcga aaatcctgtt 660

tgatggtggt taacggcggg atataacatg agctgtcttc ggtatcgtcg tatcccacta 720

ccgagatatc cgcaccaacg cgcagcccgg actcggtaat ggcgcgcatt gcgcccagcg 780

ccatctgatc gttggcaacc agcatcgcag tgggaacgat gccctcattc agcatttgca 840

tggtttgttg aaaaccggac atggcactcc agtcgccttc ccgttccgct atcggctgaa 900

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ccagtcgcgt accgtcttca tgggagaaaa taatactgtt gatgggtgtc tggtcagaga 1080

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caggatactg ctggagaaac tttgtgaatt atagcccgag taatgaagcc cactggccta 2220

ggtatcccca tctgtgggta cgactgtacg ttcttgaact gtactgcatc atactgggcc 2280

tgcctccttg tctcaacatt ctgagaagga agcagccaca gctgacattc tttaccatcg 2340

ctcttcagtc ttgtcattac cagcgactgc ccccacacat tctctgggcc accgggttga 2400

aaagcggcag cgagactccc gggacctcag agtccgccac acccgaaagt gataaaaagt 2460

attctattgg tttagccatc ggcactaatt ccgttggatg ggctgtcata accgatgaat 2520

acaaagtacc ttcaaagaaa tttaaggtgt tggggaacac agaccgtcat tcgattaaaa 2580

agaatcttat cggtgccctc ctattcgata gtggcgaaac ggcagaggcg actcgcctga 2640

aacgaaccgc tcggagaagg tatacacgtc gcaagaaccg aatatgttac ttacaagaaa 2700

tttttagcaa tgagatggcc aaagttgacg attctttctt tcaccgtttg gaagagtcct 2760

tccttgtcga agaggacaag aaacatgaac ggcaccccat ctttggaaac atagtagatg 2820

aggtggcata tcatgaaaag tacccaacga tttatcacct cagaaaaaag ctagttgact 2880

caactgataa agcggacctg aggttaatct acttggctct tgcccatatg ataaagttcc 2940

gtgggcactt tctcattgag ggtgatctaa atccggacaa ctcggatgtc gacaaactgt 3000

tcatccagtt agtacaaacc tataatcagt tgtttgaaga gaaccctata aatgcaagtg 3060

gcgtggatgc gaaggctatt cttagcgccc gcctctctaa atcccgacgg ctagaaaacc 3120

tgatcgcaca attacccgga gagaagaaaa atgggttgtt cggtaacctt atagcgctct 3180

cactaggcct gacaccaaat tttaagtcga acttcgactt agctgaagat gccaaattgc 3240

agcttagtaa ggacacgtac gatgacgatc tcgacaatct actggcacaa attggagatc 3300

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acgatgaaca tcaccaagac ttgacacttc tcaaggccct agtccgtcag caactgcctg 3480

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ggacggaaga gttgcttgta aaactcaatc gcgaagatct actgcgaaag cagcggactt 3660

tcgacaacgg tagcattcca catcaaatcc acttaggcga attgcatgct atacttagaa 3720

ggcaggagga tttttatccg ttcctcaaag acaatcgtga aaagattgag aaaatcctaa 3780

cctttcgcat accttactat gtgggacccc tggcccgagg gaactctcgg ttcgcatgga 3840

tgacaagaaa gtccgaagaa acgattactc catggaattt tgaggaagtt gtcgataaag 3900

gtgcgtcagc tcaatcgttc atcgagagga tgaccaactt tgacaagaat ttaccgaacg 3960

aaaaagtatt gcctaagcac agtttacttt acgagtattt cacagtgtac aatgaactca 4020

cgaaagttaa gtatgtcact gagggcatgc gtaaacccgc ctttctaagc ggagaacaga 4080

agaaagcaat agtagatctg ttattcaaga ccaaccgcaa agtgacagtt aagcaattga 4140

aagaggacta ctttaagaaa attgaatgct tcgattctgt cgagatctcc ggggtagaag 4200

atcgatttaa tgcgtcactt ggtacgtatc atgacctcct aaagataatt aaagataagg 4260

acttcctgga taacgaagag aatgaagata tcttagaaga tatagtgttg actcttaccc 4320

tctttgaaga tcgggaaatg attgaggaaa gactaaaaac atacgctcac ctgttcgacg 4380

ataaggttat gaaacagtta aagaggcgtc gctatacggg ctggggacga ttgtcgcgga 4440

aacttatcaa cgggataaga gacaagcaaa gtggtaaaac tattctcgat tttctaaaga 4500

gcgacggctt cgccaatagg aactttatgc agctgatcca tgatgactct ttaaccttca 4560

aagaggatat acaaaaggca caggtttccg gacaagggga ctcattgcac gaacatattg 4620

cgaatcttgc tggttcgcca gccatcaaaa agggcatact ccagacagtc aaagtagtgg 4680

atgagctagt taaggtcatg ggacgtcaca aaccggaaaa cattgtaatc gagatggcac 4740

gcgaaaatca aacgactcag aaggggcaaa aaaacagtcg agagcggatg aagagaatag 4800

aagagggtat taaagaactg ggcagccaga tcttaaagga gcatcctgtg gaaaataccc 4860

aattgcagaa cgagaaactt tacctctatt acctacaaaa tggaagggac atgtatgttg 4920

atcaggaact ggacataaac cgtttatctg attacgacgt cgatcacatt gtaccccaat 4980

cctttttgaa ggacgattca atcgacaata aagtgcttac acgctcggat aagaaccgag 5040

ggaaaagtga caatgttcca agcgaggaag tcgtaaagaa aatgaagaac tattggcggc 5100

agctcctaaa tgcgaaactg ataacgcaaa gaaagttcga taacttaact aaagctgaga 5160

ggggtggctt gtctgaactt gacaaggccg gatttattaa acgtcagctc gtggaaaccc 5220

gccaaatcac aaagcatgtt gcacagatac tagattcccg aatgaatacg aaatacgacg 5280

agaacgataa gctgattcgg gaagtcaaag taatcacttt aaagtcaaaa ttggtgtcgg 5340

acttcagaaa ggattttcaa ttctataaag ttagggagat aaataactac caccatgcgc 5400

acgacgctta tcttaatgcc gtcgtaggga ccgcactcat taagaaatac ccgaagctag 5460

aaagtgagtt tgtgtatggt gattacaaag tttatgacgt ccgtaagatg atcgcgaaaa 5520

gcgaacagga gataggcaag gctacagcca aatacttctt ttattctaac attatgaatt 5580

tctttaagac ggaaatcact ctggcaaacg gagagatacg caaacgacct ttaattgaaa 5640

ccaatgggga gacaggtgaa atcgtatggg ataagggccg ggacttcgcg acggtgagaa 5700

aagttttgtc catgccccaa gtcaacatag taaagaaaac tgaggtgcag accggagggt 5760

tttcaaagga atcgattctt ccaaaaagga atagtgataa gctcatcgct cgtaaaaagg 5820

actgggaccc gaaaaagtac ggtggcttcg atagccctac agttgcctat tctgtcctag 5880

tagtggcaaa agttgagaag ggaaaatcca agaaactgaa gtcagtcaaa gaattattgg 5940

ggataacgat tatggagcgc tcgtcttttg aaaagaaccc catcgacttc cttgaggcga 6000

aaggttacaa ggaagtaaaa aaggatctca taattaaact accaaagtat agtctgtttg 6060

agttagaaaa tggccgaaaa cggatgttgg ctagcgccgg agagcttcaa aaggggaacg 6120

aactcgcact accgtctaaa tacgtgaatt tcctgtattt agcgtcccat tacgagaagt 6180

tgaaaggttc acctgaagat aacgaacaga agcaactttt tgttgagcag cacaaacatt 6240

atctcgacga aatcatagag caaatttcgg aattcagtaa gagagtcatc ctagctgatg 6300

ccaatctgga caaagtatta agcgcataca acaagcacag ggataaaccc atacgtgagc 6360

aggcggaaaa tattatccat ttgtttactc ttaccaacct cggcgctcca gccgcattca 6420

agtattttga cacaacgata gatcgcaaac gatacacttc taccaaggag gtgctagacg 6480

cgacactgat tcaccaatcc atcacgggat tatatgaaac tcggatagat ttgtcacagc 6540

ttgggggtga ctctggtggt tctactaatc tgtcagatat tattgaaaag gaaaccggta 6600

agcaactggt tatccaggaa tccatcctca tgctcccaga ggaggtggaa gaagtcattg 6660

ggaacaagcc ggaaagcgat atactcgtgc acaccgccta cgacgagagc accgacgaga 6720

atgtcatgct tctgactagc gacgcccctg aatacaagcc ttgggctctg gtcatacagg 6780

atagcaacgg tgagaacaag attaagatgc tctctggtgg ttctcccaag aagaagagga 6840

aagtctaacc ggtcatcatc accatcacca ttgagtttaa acccgctgat cagcctctcg 6900

agtaaggatc tccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg 6960

ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct ctactagagt cacactggct caccttcggg 7020

tgggcctttc tgcgtttata cctagctcta gaaattccgt cgcaaaaaac cccgcccctg 7080

acagggcggg gttttttcgc agtcatgcta gcctgtgtga aattgttatc cgctctgaac 7140

ctgcaggagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat 7200

ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat ccgccgccct agacctaggc 7260

gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 7320

tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 7380

aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 7440

aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 7500

ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 7560

tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc 7620

agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 7680

gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 7740

tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 7800

acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc 7860

tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 7920

caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 7980

aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgcccg gaattcaggc 8040

acgaacccag ttgacataag cctgttcggt tcgtaaactg taatgcaagt agcgtatgcg 8100

ctcacgcaac tggtccagaa ccttgaccga acgcagcggt ggtaacggcg cagtggcggt 8160

tttcatggct tgttatgact gtttttttgt acagtctatg cctcgggcat ccaagcagca 8220

agcgcgttac gccgtgggtc gatgtttgat gttatggagc agcaacgatg ttacgcagca 8280

gcaacgatgt tacgcagcag ggcagtcgcc ctaaaacaaa gttaggtggc tcaagtatgg 8340

gcatcattcg cacatgtagg ctcggccctg accaagtcaa atccatgcgg gctgctcttg 8400

atcttttcgg tcgtgagttc ggagacgtag ccacctactc ccaacatcag ccggactccg 8460

attacctcgg gaacttgctc cgtagtaaga cattcatcgc gcttgctgcc ttcgaccaag 8520

aagcggttgt tggcgctctc gcggcttacg ttctgcccag gtttgagcag ccgcgtagtg 8580

agatctatat ctatgatctc gcagtctccg gcgagcaccg gaggcagggc attgccaccg 8640

cgctcatcaa tctcctcaag catgaggcca acgcgcttgg tgcttatgtg atctacgtgc 8700

aagcagatta cggtgacgat cccgcagtgg ctctctatac aaagttgggc atacgggaag 8760

aagtgatgca ctttgatatc gacccaagta ccgccaccta acaattcgtt caagccgaga 8820

tcggcttccc ggccgcggag ttgttcggta aattgtcaca acgccgccag gtggcacttt 8880

tcggggaaat gtgcgcgccc gcgttcctgc tggcgctggg cctgtttctg gcgctggact 8940

tcccgctgtt ccgtcagcag cttttcgccc acggccttga tgatcgcggc ggccttggcc 9000

tgcatatccc gattcaacgg ccccagggcg tccagaacgg gcttcaggcg ctcccgaaga 9060

tctcgggccg tctcttgggc ttgatcggcc ttcttgcgca tctcacgcgc tcctgcggcg 9120

gcctgtaggg caggctcata cccctgccga accgcttttg tcagccggtc ggccacggct 9180

tccggcgtct caacgcgctt tgagattccc agcttttcgg ccaatccctg cggtgcatag 9240

gcgcgtggct cgaccgcttg cgggctgatg gtgacgtggc ccactggtgg ccgctccagg 9300

gcctcgtaga acgcctgaat gcgcgtgtga cgtgccttgc tgccctcgat gccccgttgc 9360

agccctagat cggccacagc ggccgcaaac gtggtctggt cgcgggtcat ctgcgctttg 9420

ttgccgatga actccttggc cgacagcctg ccgtcctgcg tcagcggcac cacgaacgcg 9480

gtcatgtgcg ggctggtttc gtcacggtgg atgctggccg tcacgatgcg atccgccccg 9540

tacttgtccg ccagccactt gtgcgccttc tcgaagaacg ccgcctgctg ttcttggctg 9600

gccgacttcc accattccgg gctggccgtc atgacgtact cgaccgccaa cacagcgtcc 9660

ttgcgccgct tctctggcag caactcgcgc agtcggccca tcgcttcatc ggtgctgctg 9720

gccgcccagt gctcgttctc tggcgtcctg ctggcgtcag cgttgggcgt ctcgcgctcg 9780

cggtaggcgt gcttgagact ggccgccacg ttgcccattt tcgccagctt cttgcatcgc 9840

atgatcgcgt atgccgccat gcctgcccct cccttttggt gtccaaccgg ctcgacgggg 9900

gcagcgcaag gcggtgcctc cggcgggcca ctcaatgctt gagtatactc actagacttt 9960

gcttcgcaaa gtcgtgaccg cctacggcgg ctgcggcgcc ctacgggctt gctctccggg 10020

cttcgccctg cgcggtcgct gcgctccctt gccagcccgt ggatatgtgg acgatggccg 10080

cgagcggcca ccggctggct cgcttcgctc ggcccgtgga caaccctgct ggacaagctg 10140

atggacaggc tgcgcctgcc cacgagcttg accacaggga ttgcccaccg gctacccagc 10200

cttcgaccac atacccaccg gctccaactg cgcggcctgc ggccttgccc catcaatttt 10260

tttaattttc tctggggaaa agcctccggc ctgcggcctg cgcgcttcgc ttgccggttg 10320

gacaccaagt ggaaggcggg tcaaggctcg cgcagcgacc gcgcagcggc ttggccttga 10380

cgcgcctgga acgacccaag cctatgcgag tgggggcagt cgaaggcgaa gcccgcccgc 10440

ctgccccccg agcctcacgg cggcgagtgc gggggttcca agggggcagc gccaccttgg 10500

gcaaggccga aggccgcgca gtcgatcaac aagccccgga ggggccactt tttgccggag 10560

ggggagccgc gccgaaggcg tgggggaacc ccgcaggggt gcccttcttt gggcaccaaa 10620

gaactagata tagggcgaaa tgcgaaagac ttaaaaatca acaacttaaa aaaggggggt 10680

acgcaacagc tcattgcggc accccccgca atagctcatt gcgtaggtta aagaaaatct 10740

gtaattgact gccactttta cgcaacgcat aattgttgtc gcgctgccga aaagttgcag 10800

ctgattgcgc atggtgccgc aaccgtgcgg caccctaccg catggagata agcatggcca 10860

cgcagtccag agaaatcggc attcaagcca agaacaagcc cggtcactgg gtgcaaacgg 10920

aacgcaaagc gcatgaggcg tgggccgggc ttattgcgag gaaacccacg gcggcaatgc 10980

tgctgcatca cctcgtggcg cagatgggcc accagaacgc cgtggtggtc agccagaaga 11040

cactttccaa gctcatcgga cgttctttgc ggacggtcca atacgcagtc aaggacttgg 11100

tggccgagcg ctggatctcc gtcgtgaagc tcaacggccc cggcaccgtg tcggcctacg 11160

tggtcaatga ccgcgtggcg tggggccagc cccgcgacca gttgcgcctg tcggtgttca 11220

gtgccgccgt ggtggttgat cacgacgacc aggacgaatc gctgttgggg catggcgacc 11280

tgcgccgcat cccgaccctg tatccgggcg agcagcaact accgaccggc cccggcgagg 11340

agccgcccag ccagcccggc attccgggca tggaaccaga cctgccagcc ttgaccgaaa 11400

cggaggaatg ggaacggcgc gggcagcagc gcctgccgat gcccgatgag ccgtgttttc 11460

tggacgatgg cgagccgttg gagccgccga cacgggtcac gctgccgcgc cggtagcact 11520

tgggttgcgc agcaacccgt aagtgcgctg ttccagacta tcggctgtag ccgcctcgcc 11580

gccctatacc ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg catggagccg ggccacctcg 11640

acctgaatgg aagccggcgg cacctcgcta acggattcac cgtttttatc aggctctggg 11700

aggcagaata aatgatcata tcgtcaatta ttacctccac ggggagagcc tgagcaaact 11760

ggcctcaggc atttgagaag cac 11783

<210> 4

<211> 939

<212> DNA

<213> 布鲁氏菌突变株

<400> 4

cggtgagcgt ggcctaccca ccgtgaacga aaacggctcc ggccgcaccc gcaaggtgtt 60

gctctttctc tttgtcgtgg gcttcatcgt cgtgctgctg ttgctgctcg tgtttcacat 120

gaggggcaat gcagagaata atcaccattc agacaagacg atggtgcaga ccagcacagt 180

tccgatgcga actttcaagc tgccaccccc gccacccccg ccaccaccag caccaccaga 240

accaccagcc ccgccaccgg ccccagccat gcccatcgcg gaacccgcag cggcggcgct 300

gagcctgcca ccattgccgg atgatacgcc ggcaaaggac gatgtactgg acaagtcggc 360

cagcgcgttg atggtcgtca ccaagtccag cggcgatacg aacgctcaaa cggccggtga 420

tacggtcgtt caaacgacca atgcgcgcat tcaagccctg ctcgacagtt aaaagaacac 480

caagcaggat gctggatcgc tgggtactct ccttcacggc acacaaacgg atgcacgcat 540

ggcgagcctt ctgcgcaacc gtgatttcct gctcgcgaag ggcagcatca tcaattgcgc 600

gctgcaaacc cgtctggatt cgacggtgcc gggcatggct gcctgcgtgg tcacacgcaa 660

catgtatagc gataacggca aggtgttgct gattgagcgc ggttcaacca tctcgggtga 720

atatgatgcc aacgtaaagc agggcatggc tcgcatttat gtcctgtgga cgcgcgtgaa 780

gacgccgaac ggtgtcgtga tcgatctcga ctctccaggc gccgaccccc tgggcggggc 840

aggcttgccc ggctacatcg actcccactt ctggaagcgc tttggcggcg ccttgatgtt 900

gagcacgatc gagaccctcg gccgctatgc aacccagaa 939

<210> 5

<211> 939

<212> DNA

<213> 布鲁氏菌野生型对照

<400> 5

cggtgagcgt ggcctaccca ccgtgaacga aaacggctcc ggccgcaccc gcaaggtgtt 60

gctctttctc tttgtcgtgg gcttcatcgt cgtgctgctg ttgctgctcg tgtttcacat 120

gaggggcaat gcagagaata atcaccattc agacaagacg atggtgcaga ccagcacagt 180

tccgatgcga actttcaagc tgccaccccc gccacccccg ccaccaccag caccaccaga 240

accaccagcc ccgccaccgg ccccagccat gcccatcgcg gaacccgcag cggcggcgct 300

gagcctgcca ccattgccgg atgatacgcc ggcaaaggac gatgtactgg acaagtcggc 360

cagcgcgttg atggtcgtca ccaagtccag cggcgatacg aacgctcaaa cggccggtga 420

tacggtcgtt caaacgacca atgcgcgcat tcaagccctg ctcgacagtc aaaagaacac 480

caagcaggat gctggatcgc tgggtactct ccttcacggc acacaaacgg atgcacgcat 540

ggcgagcctt ctgcgcaacc gtgatttcct gctcgcgaag ggcagcatca tcaattgcgc 600

gctgcaaacc cgtctggatt cgacggtgcc gggcatggct gcctgcgtgg tcacacgcaa 660

catgtatagc gataacggca aggtgttgct gattgagcgc ggttcaacca tctcgggtga 720

atatgatgcc aacgtaaagc agggcatggc tcgcatttat gtcctgtgga cgcgcgtgaa 780

gacgccgaac ggtgtcgtga tcgatctcga ctctccaggc gccgaccccc tgggcggggc 840

aggcttgccc ggctacatcg actcccactt ctggaagcgc tttggcggcg ccttgatgtt 900

gagcacgatc gagaccctcg gccgctatgc aacccagaa 939

Claims (4)

1.质粒pZF17-30，其特征在于，所述质粒pZF17-30的序列为SEQ ID NO.1所示。

2.利用权利要求1所述质粒pZF17-30构建得到的载体，其特征在于，所述载体的构建方法是：利用限制性内切酶Bsa I酶切质粒pZF17-30，将特异性sgRNA与线性化载体连接，所述的sgRNA为5′-TGGAACAGTCAAAAGAACACCAAGC-3′，5′-CAAAGCTTGGTGTTCTTTTGACTGT-3′，构建的载体的序列如SEQ ID NO.3所示。

3.权利要求2所述的载体在制备布鲁氏菌的单碱基突变株中的应用，其特征在于，所述的单碱基突变为virB10基因CDS区478位碱基由C突变为T。

4.含有权利要求1所述质粒pZF17-30的大肠杆菌，其特征在于，所述的大肠杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC No：M 2017395。

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