CN103173435A

CN103173435A - 红平菇hp1漆酶基因的克隆及重组酶的染料脱色方法

Info

Publication number: CN103173435A
Application number: CN2012105206707A
Authority: CN
Inventors: 郑苗苗; 邵淑丽; 池玉杰
Original assignee: Qiqihar University
Current assignee: Qiqihar University
Priority date: 2012-12-06
Filing date: 2012-12-06
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2032-12-06
Also published as: CN103173435B

Abstract

本发明提供了一种红平菇HP1漆酶基因的克隆及重组酶的染料脱色方法。本发明根据几种白腐真菌漆酶基因铜离子结合位点氨基酸的保守区设计一对简并引物，通过RT-PCR扩增出漆酶cDNA基因核心片段，最后利用3'/5'RACE技术扩增出漆酶cDNA全长序列。红平菇cDNA与表达载体pPICZB相连接构建重组质粒pPICZB/lac后通过电转化法转化Pichiapastoris SMD1168H，获得工程菌株。利用DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱层析、聚乙二醇浓缩和SephadexG-75凝胶过滤层析柱方法获得纯化漆酶。可以将纯化漆酶对茜素红独特的降解能力，用于染料污染后废水的处理。

Description

红平菇HP1漆酶基因的克隆及重组酶的染料脱色方法

技术领域

本发明涉及一种新型漆酶基因，通过RT-PCR和RACE技术相结合，首次从该菌株中获得编码漆酶基因的cDNA及Genomic DNA的全长序列，并且将得到的漆酶cDNA与表达载体pPICZB相连获得重组表达载体pPICZB/lac，通过电转化法转化毕赤酵母（P.pastoris）SMD1168H细胞，利用DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱层析、聚乙二醇浓缩和SephadexG-75凝胶过滤层析柱方法获得纯化漆酶，用纯化后漆酶对终浓度为50mg/L的不同化学结构的染料的脱色。即红平菇HP1漆酶基因的克隆、异源表达、粗酶液的纯化及纯化漆酶的染料脱色方法。

背景技术

漆酶（Laccase，EC1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，属于蓝色多铜氧化酶家族，能够氧化多种芳香化合物和其它有机化合物，并使氧气还原生成水。到目前为止，发现漆酶广泛存在于真菌、植物中，而且某些昆虫、细菌当中也含有漆酶。其中真菌中的白腐菌类含有漆酶最多，研究也是最为广泛的。但白腐菌生长周期长、酶活低，不利于工业化生产。近年来，有关漆酶的研究越来越受到国际上的重视，不同漆酶的底物的专一性不同，其利用领域便可能不同。因此，漆酶在纸张漂白、生物修复、染料脱色、果汁与酒的澄清和纺织品的清洁等方面具有很大的研究价值和应用潜力。因此研究漆酶的异源表达具有重要的现实意义。

茜素红、中性红、刚果红和结晶紫都是合成染料，在工业生产中应用广泛。据估计，1~10％的染料在使用中会丢失，从而导致大量的环境污染。合成染料在结构上具有相当的差异，而且染料污染后的水可能是对人类和动物具有毒性。由于其复杂的芳香结构，大多数染料耐降解。传统的物理和化学方法处理废水要么没有效果，要么成本过高。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术存在的问题，即白腐菌类含有漆酶最多，但白腐菌生长周期长、酶活低，不利于工业化生产以及传统的物理和化学方法处理废水要么没有效果，要么成本过高的问题，进而提供一种红平菇HP1漆酶基因的克隆及重组酶的染料脱色方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种红平菇HP1漆酶基因的克隆方法：

一、基因组DNA和总RNA的提取

参照DNAquick_快捷型植物基因组DNA提取系统（TIANGEN）使用说明提取红平菇HP1基因组DNA，参照E.Z.N.A真菌RNA提取试剂盒（OMEGA）使用说明提取红平菇HP1总RNA，产物用核酸检测仪测定纯度，通过琼脂糖凝胶电泳检验RNA完整性。

二、cDNA核心片段克隆

合成cDNA第一链参照两步法RT-PCR试剂盒（TaKaRa）使用说明。在GenBank中选取20条不同漆酶全长基因的氨基酸序列，用序列比对软件ClustalX 2.0进行同源序列比较，根据比对的结果查找出同源序列保守区，从而设计一对简并引物Lcc-RT1和Lcc-RT2（见表1），PCR反应体系25μL，含10×PCR buffer 2.5μL，dNTP Mixture（2.5mMeach）1μL，TaKaRa Ex Taq^TM HS（5U/μl）0.5μL，引物Lcc-RT1和Lcc-RT2各0.5μL，cDNA 1μL。反应条件为94℃预变性3min,然后以94℃30s，55℃30s，72℃2min进行30个循环，于72℃延伸10min,取3μL扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表1扩增漆酶cDNA序列和基因组序列引物

Table 1Primers for amplifying the laccase gene fragment

三、漆酶cDNA3′/5'末端的RACE-PCR的扩增

参照3′RACE试剂盒（TaKaRa）和SMART RACE cDNA扩增试剂盒（Clontech）使用说明合成cDNA，根据已扩增得到漆酶cDNA基因片段的序列，设计3'/5'RACE特异性引物，分别为3'末端内侧引物3′race GSP(outer)和3'末端外侧引物3′race NGSP(inner)，5'末端引物5′race GSP，从而获得漆酶cDNA基因的3'/5'末端序列（见表1），cDNA3′末端套式PCR反应体系25μL，第一次PCR反应含10×LA PCR Buffer II（Mg²⁺Free）2μL，MgCl₂（25mM）1μL，1×cDNA Dilution Buffer II 1μL，3'RACE Outer Primer（10μM）1μL，TaKaRa LA

（5U/μl）1μL，Gene Specific Outer Primer（10μM）1μL，cDNA 1μL。反应条件：94℃预变性2min，94℃30S，58℃30S，72℃2min，20个循环，72℃15min。第二次PCR反应含10×LA PCR Buffer II（Mg²⁺Free）2.5μL，MgCl₂（25mM）2.5μL，dNTP Mixture（2.5mM each）4μL，Gene Specific InnerPrimer（10μM）1μL，3′RACE Inner Primer（10μM）1μL，TaKaRa LA Taq（5U/μl）0.25μL，1stPCR产物0.5μL。反应条件：94℃预变性2min，94℃30S，58℃30S，72℃2min，30个循环，72℃15min。取3μL扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。cDNA3′末端套式PCR反应体系25μL，10×Advantage2 PCR Buffer2.5μl，dNTP Mix（10mM）0.5μl，50×Advantage2polymerase Mix 0.5μl，5′RACE-Ready cDNA 1.5μl，GSP1（10μM）0.5μl，UPM（10×）2.5μl。反应条件同3′RACE。

四、漆酶cDNA全长及漆酶Genomic DNA全长的扩增

根据cDNA 3'/5'末端测序的结果，分别在其5'末端和3'末端设计特异性引物Lcc2-S1和Lcc2-S2，用于扩增漆酶cDNA全长（见表1）。同时，以基因组DNA为模板，扩增漆酶Genomic DNA全长（见表1）。cDNA全长PCR反应体系50μL，含5×Prime STAR^TMBuffer（Mg²⁺plus）10μL，dNTP Mixture（10mM each）4μL，Prime STAR^TM HS DNAPolymerase（2.5U/μl）0.5μL，引物Lcc2-S1和Lcc2-S2各1μL，反转录cDNA 5μL。Genomic DNA全长PCR反应体系同步骤二，反应条件同步骤二。

红平菇HP1漆酶漆酶cDNA基因的异源表达方法：

一、重组表达载体的构建

用XbaI、EcoRI分别双酶切上述Pd-lac的cDNA和载体pPICZB，凝胶纯化后用T4DNA连接酶连接。该重组质粒经E.coli JM109倍增后，用限制性内切酶XbaI和EcoRI双酶切，凝胶回收4.9kb带，然后连接到用相同酶处理的pPICZB载体片段（3.3kb）上，得到表达质粒pPICZB/lac。对pPICZB/lac进行测序，确定Pd-lac cDNA序列具有正确的编码框。

二、阳性重组子的筛选

表达载体pPICZB和相应的空白质粒分别电转化P.pastoris SMD1168H感受态细胞，涂布YPD平板，于27℃培养以筛选Zeocin⁺抗性转化子。随机挑取200个Zeocin⁺抗性转化子，点种到含有0.25mmol/L CuSO4和0.2mmol/L ABTS(2，2-L连氮基-双-[3-乙基笨并噻唑啉-6-磺酸])的BMMY平板上，于28℃培养，每天补加5%甲醇，至菌落周围有ABTS氧化特征色生成。

三、漆酶活力测定

用分光光度计在420nm下检测漆酶与底物在25℃反应3min的吸光度，计算漆酶活性。酶的活性定义为每分钟氧化1μmol底物为产物所需的酶量为一个酶活力单位。测定吸光度体系为：空白对照管中加2.95mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH3.4）和50μL稀释后的酶液；检测管中加1.95mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH3.4），50μL稀释后的酶液，1mL 1mmol/L ABTS。

四、粗漆酶的制备

将重组菌毕赤酵母SMD1168H/pPICZBlac接种到BMGY培养基中，27℃，240r/min振荡培养18~20h至OD600为3~7；然后将培养液经2000r/min，离心8min，收集菌体重新悬浮于BMMY诱导培养基中，在BMMY中加入0.25mmol/L的CuSO4，诱导温度27℃、240r/min振荡培养，每隔24h添加5%甲醇诱导表达，诱导培养5d后，离心收集上清液，即得到粗酶液，在冰箱中冷冻（-80℃）保存备用。

漆酶的纯化方法：

将上清液超滤（10KDa分子量PM膜）浓缩后，通过DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱层析，再用聚乙二醇浓缩。收集漆酶，浓缩后，加样到SephadexG-75凝胶过滤层析柱上，用pH值6.0的25mmol/L醋酸缓冲液洗脱，洗脱流速为0.5mL/min，自动部分收集器收集100管，每管3mL。用SDS-PAGE对纯化的漆酶蛋白进行电泳。

纯化漆酶的染料脱色方法：

重组菌发酵培养物纯化后，用于茜素红、刚果红、中性红和结晶紫都是合成染料的脱色实验。反应体系有50mmol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液（PH 4.0）、终浓度50mg/L染料和纯化漆酶。在体系中添加1mmol/L ABTS，考察小分子介体对染料脱色的影响，同时设立不加酶液的空白对照。体系在50℃反应48h，每隔一定的时间在四种燃料的最大吸收峰波长处测吸光度，得到吸光度为A₁；用同样的方法在反应体系中加入等量的灭活酶液作为对照，测得其吸光度为A₀。染料脱色率计算：

本发明具有以下优点：本发明根据几种白腐真菌漆酶基因铜离子结合位点氨基酸的保守区设计一对简并引物，通过RT-PCR扩增出漆酶cDNA基因核心片段，最后利用3'/5'RACE技术扩增出漆酶cDNA全长序列，另外设计一对全长特异性引物扩增出漆酶Genomic DNA全长序列，并且进行了序列分析。红平菇CDNA与表达载体pPICZB相连接构建重组质粒pPICZB/lac后通过电转化法转化P.pastoris SMD1168H，重组质粒插入到酵母基因组中，从而获得工程菌株。利用DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱层析、聚乙二醇浓缩和SephadexG-75凝胶过滤层析柱方法获得纯化漆酶。红平菇HP1对不同的染料具有脱色能力，而且脱色率有所不同，可用于染料污染后废水的处理。

附图说明

图1为红平菇HP1的总RNA图；

图2为红平菇HP1漆酶的RT-PCR结果图；

图3为红平菇HP1漆酶的3′RACE Outer PCR和3′RACE Inner PCRLg-lac1PCR结果图；

图4为红平菇HP1漆酶的5′RACE结果图；

图5为红平菇HP1漆酶Genomic DNA全长结果图；

图6为重组毕赤酵母pPICZB/Lac诱导表达的漆酶活性曲线图；

图7为毕赤酵母发酵液纯化后的电泳图谱；

图8为粗酶液对四种染料脱色率/%比较曲线图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明做进一步的详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式，但本发明的保护范围不限于下述实施例。

1、总RNA检测

提取红平菇HP1菌丝总RNA后，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示28S rRNA、18S rRNA条带清晰，且前者亮度约为后者2倍，表明所提取RNA完整性较好；经核酸检测仪检测，260/280、260/230分别为2.07、2.37，说明纯度较高。所提取RNA可以用于后续试验（如图1所示）。

2、红平菇HP1漆酶cDNA的克隆与序列分析

根据真菌漆酶基因保守的Cu-bind结构域Ⅰ和Ⅳ氨基酸序列设计的简并引物扩增漆酶cDNA核心片段，获得一条约1000bp基因片段，将其进行T载体克隆并测序，结果得到大小为1021bp的基因片段，其序列与GenBank中序列Blastn比对后得知其为漆酶基因片段（如图2所示）。根据获得的漆酶cDNA核心片段的3'端保守区域设计特异性的正向引物：3′race GSP(outer)和3′race NGSP(inner)，以此引物扩增反转录的3′RACE cDNA，获得一大小约600bp条带，将其纯化后进行测序，获得基因片段为657bp，其3'端有典型的PolyA尾巴，在PolyA尾前有一加尾信号（AATAAA)（如图3所示）。将该序列输入到GenBank中Blastx比对后确认其与漆酶基因具有很高的同源性。根据获得的漆酶cDNA核心片段5'端保守区域设计特异性反向互补引物：5′race GSP，以此引物扩增反转录的5'RACE cDNA，获得一大小约750bp，将其纯化后测序获得片段为752bp，5'端有一非编码区(1bp~66bp),编码区的长度为679bp，该序列与RT-PCR扩增的片段有重复区域，且将该序列输入到GenBank中Blastx比对后发现其与漆酶基因具有很高的同源性（如图4所示）。

根据RT-PCR获得的漆酶基因片段与3'/5'RACE获得的漆酶基因片段具有重复区域，剪切拼接后得到一全长为1579bp的漆酶基因，命名为Pd-lac1。Laccase具有真核基因的一般特征：在其5'端有一非编码区，长度为66bp；3'端有一个典型的PolyA尾巴和一加尾信号（AATAAA）。通过NCBI的ORF Finder查找到一条长1590bp的完整开放式阅读框（open reading frame，ORF），预测蛋白分子量为55.52kD，等电点pI约为4.72，限制性酶切位点有78个，其编码529个氨基酸。利用SignalP V2.0软件分析编码的氨基酸序列发现其N端包括一典型信号肽序列(1~19aa)，剪切位点为（AHA-AI）。通过应用Scanprosite程序可得出在Laccase基因编码的氨基酸序列中含有3个N-糖基化位点（N-X-S/T），天冬酰胺残基分别位于氨基酸序列的第216、311、444处，它们都是潜在的糖基化位点。应用RPS-Blast进行保守结构域分析表明，该蛋白有3个保守的结构域：即pfam07732、pfam07731和pfam00394，其中pfam07732和pfam07731是多铜氧化酶中与次级代谢物生物合成、运输和分解代谢相关的结构域；第3个pfam00394是Cu-oxidase的保守结构域（见Pd-lac基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列表）。将Laccase编码的氨基酸序列与GenBank中登录的蛋白序列进行Blastp比对后发现，它与桃红侧耳Pleurotussalmoneostramineus的氨基酸序列具有较高的同源性，相似性达97%，与齿耳菌Steccherinum murashkinskyi漆酶氨基酸序列相似性达到72%。

3、漆酶Genomic DNA全长的获得与结构分析

根据漆酶cDNA的全长序列，设计一对特异性引物，以基因组DNA为模板通过PCR扩增获得该漆酶Genomic DNA的全长序列，长度大小为2258bp，命名为Pd-lac1'（如图5所示）。

通过比较漆酶基因的cDNA和Genomic DNA全长序列，发现该漆酶基因包含13个外显子和12个内含子。内含子的长度分别为56bp、48bp、53bp、51bp、55bp、66bp、51bp、51bp、58bp、68bp、51bp和56bp，是典型的真菌内含子的长度（49bp~85bp）。内含子中剪切位点的特征序列为5'GT…AG-3′。

以下为Pd-lac基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列表：

gcttttcgctcgtacggtatataagcttcgctggtgaagtgcttctctatcctcaggttcctcgcc-1

ACTCTTCTGACTCTCTCCCTCGTCGTGTCTGCAGCTGCCTTGACGGCTCATGCCGCCATCGGTCCTGTCGCAGACTTACCGATCGTCAACATGGATT

100

M T L L T L S L V V S A A A L T A H A A I G P V A D L P I V N M D 14

TAGCTCCTGgtatgtcgtgctcgtttctctgttgtctatctcttcactcaaccctcttttgctagATGGTACAACGCGCCCgtgagttcaaacggcatcg

200

L A PTⅠ DGT T R P

23

tgcaagggctgtttctcacaaccttttagCACTGTCCTCGCTGCTGGAACCTTCCCCGGCCCTCTCATTCGAGGAAATAAGgtaattggatgtcgccgcc

300

TⅡT V LA A G T F P G P L I R G N K 40

gctcgcttgctgctagtctaacatattgcttcagGGAGATAACTTCCGGATAAATGTTATCAACCAGCTCTCTGACACTCAAATGGACATCGACACGAGC

400

TⅢG D N F R I N V I N Q L S D T Q M D ID T S 62

ATTgtgagttcccccgcaccacaccttgggtagaaaactcatccttccccacagCATTGGCACGGTCTCTTCCAGAAAGGGACTAACTGGGCTGACGgta

500

ITⅣ H W H G L F Q K G T N W A D 76

▲²▲³

gctcgttgtcgttctcctcgggcgttggtggctctgaccaataatttcatagGCCCAGCGATGGTGACGCAGTGTCCCATCATACCTGATCACTCCTTCC

600

TⅤG PA M V T Q C PII P D H S F 92

◆

TgtgcgtgtccatgacgatacatgtttgacactaagacgcgtttggttaactctctttcgcgcgtagGTACGATTTCAACGTACCTGATCAAGCCGGTAC

700

L TⅥY D F N V P DQ A G T 104

TTTCTGgtgagattacacgtcctcagatagctcagaccaatgcttaacgcgttacagGTACCATTCCCACCTAGGTTTGCAATACTGCGATGGGCTCCGC

800

F WTⅦY H S H L G L Q Y C D GL R 120

▲³ ▲³ ◆

GGAGCTTTCGTTGTCTATGACCCCAACGATCCCCATAAGgtatgtggttagactatccccgatcgtcctttgcttgacttcgatatcaagAACTTGTACG

900

G AF V V Y D P N D P H K TⅧNL Y 136

ATGTCGATGATGAGTCGACCGTATTGACCATTGGTGACTGGTACCACGTTCCTTCGCCTCAGgttcgttccttttgccttttaaattaactgcctccctg

1000

D VD G E S T V L T I G D W Y H V P S P Q TⅨ157

acattcggttaatcgtgtagGAAGGTGGACCTCCCTCCGCTGATTCTACCTTGTTCAACGGCAAGGGTCGCTTTAGGGATGACCCTACCGCAGACCTCTT

1100

EG G P P S A D S T L F N G K G R F R D DP T A D L F

184

CGTGATGAATGTGGAAAAAGGCAGCCGCTACCGCATTCGTCTTGTCAGCATTGCCTGCGATCCTTGGTTTGACTTCGCCATCGACGGACACAACTTCACG

1200

V M N V E K G S R Y R I R LV S I A C D P W F D F A I D G H N F T 217

◆★

ATCATCGAAGCTGATGGCGAGAGTACCCAACCGCACACGGTAGATGCTCTTCGCATTTTCGCCGGACAACGTTATTCCATCGTCCTTACCGCTGATCAAG

1300

I I E A D G E S T Q P H T V D A L R I F AG Q R Y S I V L T A D Q 250

ATGTTGGAAACTATTGGATCCGTGGTAATCCGAACCCCGCTTCCTCGATCGCTGGATTCGATGGTGGGATTAACTCGGCCATTTTACGCTACAACACCGC

1400

DV G N Y W I RG N P N P A S S I A G F D G G I N S A IL R Y N T A 284

ACCTGTGGAAGAGCCTACGACGCCACTTGCCACGCCGCAAATTCCTCTCAGGGAACAAGATCTTGTTGCTCTTACGAACCCAACTGTTCCCGGAACACAT

1500

P V E E P T T P L A T P Q IP L R E Q D L V A L T N P T V P G T H

217

★

ACCCTTGGGGCCGCTGATATCAACATTCCGCTGAACTTCGCCTTCGATGCAGCGAACGCACTCTTTGCTGTCAACAATTTCACTTTCGTCCCACCAAgtg

1600

T L G A A D I N I P L N F A F D A A N A LF A V N N F T F V P P 249

★

agctctttgttgccatcccagtggcttcgataattgactggaatccgataattctttttgcgtagATGTCCCCGTTCTGTTACAGATCCTATCCGGTGCT

1700

TⅩ NV P V L LQ I LS G A 261

CATACGCCCCAAGACTTGCTGCCCTCTGGGAGTGTTTACACTCTCGAGCGCAACAAAGTTGTCGAGCTTACCCTTCTCCCTCTTGCACTCGCTGGgtgag

1800

H T P Q D L L P S G S V Y T L E RN K V V E L T L L P L A L A G

293

tagccacccgagtacgtttctgtctgggcgatgctgacccaccctcGCCGCATCCCATCCATCTTCACGGCgtacgtgacagcctgcctatcagactcgc

1900

TⅪP H P I HL H G TⅫ301

▲¹ ▲² ▲³

gctccactgatctgctcacctttttagCACTCGTTCTACGTCGTCAAGAGCGCTGGTACTACGCAACTCAACTGGGACAATGCTGTCCGACGTGACGTAG

2000

H S F Y V V K S A G T T Q L N W DN A V R R D V

325

TTGCCTTGGGTACCACGGCTGGCGATAATGTCGTCATCCGATTTGAAACTGATAACCCAGGTCCTTGGTTCCTTCACTGCCATATCGATTTTCATCTCGA

2100

VA L G T T A G D N V V IR F E T D N P G P W F L H C H I D F H LE 359

▲³ ▲¹ ▲³ ▲¹

ACTAGGTTTCGCAGCCGTATTCGCTGAGGACCCAGAGGGTACTTCTGCTGCCAACCCCGTACCTCCCGCCTGGGATGAGCTTTGTCCTCTGTATGAAAGC

2200

L G F A A V F A E D P E G T S A A N PV P P A W D E L C P L Y E S

392

◆

AGCCATTCCCGACCACTTACCCAAGGAACCAACGATAACAATCTTCAACCATAATTTACTACTTCTATACCTAATTTAACAGCCTCGTAGTAATTCC

2297

S H S R P LT Q G T N D N N L Q P* 409。

表中的内含子部分用下划线表示标号为T Ⅰ到TⅫ。▲表示铜离子结合位点。◆表示半胱氨酸残留参与二硫化物桥梁的形成。★表示可能的N-糖基化位点。

4、阳性转化子的筛选

以pPICZB载体为媒介，将引物Lcc1-P1和Lcc1-P2扩增得到的pd-lac成熟肽编码序列（1590bp）连接到质粒pPICZB上，获得长4.9kb的重组表达载体（pPICZB/lac）。理论上，重组酶的N端序列与天然酶相同，不含额外的氨基酸序列。pPICZB/lac和空白对照质粒经Sac I酶进行线性化后，分别电转化P.pastoris SMD1168H细胞。通过YPDS平板筛选Zeocin⁺克隆，每ng质粒得到的转化子数少于100。随机转接200个Zeocin⁺转化子到BMMY（含ABTS）平板上，在24h内，约75%的转化子周围有漆酶氧化ABTS形成的特征色，判定这些克隆即为目标转化子。空白对照没有特征色生成。

5、重组漆酶的合成

在平板上随机挑取10株转化子，进行摇瓶发酵，获得的漆酶产量基本相同。从中随机选取一个转化子（pPICZB/lac）用于重组漆酶的合成。在含有0.25mmol/L CuSO4BMMY培养基中，30℃培养96h，发酵液的漆酶活力达到54U/L（如图6所示）。

6、漆酶的纯化结果

经过一系列纯化步骤后可从500mL粗酶中得到2.74mg纯化的漆酶。通过SDS-PAGE和Native PAGE电泳结果可看到纯化的漆酶在电泳图片上只呈现单一条带（如图7所示），说明其他蛋白在纯化过程中已被除去，得到纯度较高的纯酶。通过SDS-PAGE测得纯酶的分子量为46.4kDa，这与大多数真菌漆酶的分子量一致。

7、纯化漆酶染料脱色结果

将纯化后的漆酶直接用于对茜素红、中性红、刚果红和结晶紫四种染料的脱色能力进行测定（如图8所示）。

结果表明，红平菇HP1对不同的染料具有脱色能力，而且脱色率有所不同。茜素红在1h时脱色效率达到100%，刚果红和中性红在24h时脱色效率分别达到60%和45%，随着时间的延长脱色效率几乎不变，结晶紫在1h时脱色效率达到8%，随时间延长没有明显变化。因此，纯化漆酶对茜素红具有较高脱色能力。空白对照转化子的发酵液则不具有脱色作用。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，这些具体实施方式都是基于本发明整体构思下的不同实现方式，而且本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims

1.一种红平菇HP1漆酶基因的克隆方法，其特征在于，

一、基因组DNA和总RNA的提取

参照DNAquick_快捷型植物基因组DNA提取系统使用说明提取红平菇HP1基因组DNA，参照E.Z.N.A真菌RNA提取试剂盒使用说明提取红平菇HP1总RNA，产物用核酸检测仪测定纯度，通过琼脂糖凝胶电泳检验RNA完整性；

二、cDNA核心片段克隆

合成cDNA第一链参照两步法RT-PCR试剂盒使用说明，在GenBank中选取20条不同漆酶全长基因的氨基酸序列，用序列比对软件ClustalX 2.0进行同源序列比较，根据比对的结果查找出同源序列保守区，从而设计一对简并引物Lcc-RT1和Lcc-RT2，PCR反应体系25μL，含10×PCR buffer 2.5μL，dNTP Mixture 1μL，TaKaRa Ex Taq^TM HS 0.5μL，引物Lcc-RT1和Lcc-RT2各0.5μL，cDNA 1μL；反应条件为94℃预变性3min，然后以94℃30s，55℃30s，72℃2min进行30个循环，于72℃延伸10min，取3μL扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定；

三、漆酶cDNA3'/5'末端的RACE-PCR的扩增

参照3'RACE试剂盒和SMART RACE cDNA扩增试剂盒使用说明合成cDNA，根据已扩增得到漆酶cDNA基因片段的序列，设计3'/5'RACE特异性引物，分别为3'末端内侧引物3′race GSP和3'末端外侧引物3′race NGSP，5'末端引物5′race GSP，从而获得漆酶cDNA基因的3'/5'末端序列，cDNA3'末端套式PCR反应体系25μL，第一次PCR反应含10×LA PCR Buffer II 2μL，MgCl₂1μL，1×cDNA Dilution Buffer II 1μL，3'RACE OuterPrimer 1μL，TaKaRa LA1μL，Gene Specific Outer Primer 1μL，cDNA 1μL；反应条件：94℃预变性2min，94℃30S，58℃30S，72℃2min，20个循环，72℃15min；第二次PCR反应含10×LA PCR Buffer II 2.5μL，MgCl₂ 2.5μL，dNTP Mixture 4μL，Gene Specific Inner Primer 1μL，3′RACE Inner Primer 1μL，TaKaRa LA Taq 0.25μL，1st PCR产物0.5μL；反应条件：94℃预变性2min，94℃30S，58℃30S，72℃2min，30个循环，72℃15min；取3μL扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定；cDNA3′末端套式PCR反应体系25μL，10×Advantage2 PCR Buffer 2.5μl，dNTP Mix 0.5μl，50×Advantage2 polymerase Mix 0.5μl，5′RACE-Ready cDNA 1.5μl，GSP10.5μl，UPM2.5μl；反应条件同3′RACE；

四、漆酶cDNA全长及漆酶Genomic DNA全长的扩增

根据cDNA 3'/5'末端测序的结果，分别在其5'末端和3'末端设计特异性引物Lcc2-S1和Lcc2-S2，用于扩增漆酶cDNA全长；同时，以基因组DNA为模板，扩增漆酶GenomicDNA全长；cDNA全长PCR反应体系50μL，含5×Prime STAR^TM Buffer10μL，dNTPMixture 4μL，Prime STAR^TM HS DNA Polymerase 0.5μL，引物Lcc2-S 1和Lcc2-S2各1μL，反转录cDNA5μL。Genomic DNA全长PCR反应体系同步骤二，反应条件同步骤

2.一种权利要求1所述的红平菇HP1漆酶基因的异源表达方法，其特征在于，

一、重组表达载体的构建

用XbaI、EcoRI分别双酶切上述Pd-lac的cDNA和载体pPICZB，凝胶纯化后用T4DNA连接酶连接；该重组质粒经E.coliJM109倍增后，用限制性内切酶XbaI和EcoRI双酶切，凝胶回收4.9kb带，然后连接到用相同酶处理的pPICZB载体片段上，得到表达质粒pPICZB/lac；对pPICZB/lac进行测序，确定Pd-lac cDNA序列具有正确的编码框；

二、阳性重组子的筛选

表达载体pPICZB和相应的空白质粒分别电转化P.pastoris SMD1168H感受态细胞，涂布YPD平板，于27℃培养以筛选Zeocin⁺抗性转化子；随机挑取200个Zeocin⁺抗性转化子，点种到含有0.25mmol/L CuSO4和0.2mmol/L ABTS的BMMY平板上，于28℃培养，每天补加5%甲醇，至菌落周围有ABTS氧化特征色生成；

三、漆酶活力测定

用分光光度计在420nm下检测漆酶与底物在25℃反应3min的吸光度，计算漆酶活性；酶的活性定义为每分钟氧化1μmol底物为产物所需的酶量为一个酶活力单位；测定吸光度体系为：空白对照管中加2.95mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液和50μL稀释后的酶液；检测管中加1.95mL柠檬酸-磷酸盐缓冲液，50μL稀释后的酶液，1mL 1mmol/LABTS；

四、粗漆酶的制备

将重组菌毕赤酵母SMD1168H/pPICZBlac接种到BMGY培养基中，27℃，240r/min振荡培养18~20h至OD600为3~7；然后将培养液经2000r/min，离心8min，收集菌体重新悬浮于BMMY诱导培养基中，在BMMY中加入0.25mmol/L的CuSO4，诱导温度27℃、240r/min振荡培养，每隔24h添加5%甲醇诱导表达，诱导培养5d后，离心收集上清液，即得到粗酶液，在冰箱中冷冻，-80℃条件下保存备用。

3.一种权利要求2所述的红平菇HP1漆酶基因的重组酶粗酶液纯化方法，其特征在于，

将上清液超滤浓缩后，通过DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱层析，再用聚乙二醇浓缩，收集漆酶，浓缩后，加样到SephadexG-75凝胶过滤层析柱上，用pH值6.0的25mmol/L醋酸缓冲液洗脱，洗脱流速为0.5mL/min，自动部分收集器收集100管，每管3mL，用SDS-PAGE对纯化的漆酶蛋白进行电泳。

4.一种权利要求3所述的纯化漆酶的染料脱色方法，其特征在于，

重组菌发酵培养物纯化后，用于茜素红、刚果红、中性红和结晶紫都是合成染料的脱色实验，反应体系有50mmol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液、终浓度50mg/L染料和纯化漆酶；在体系中添加1mmol/L ABTS，考察小分子介体对染料脱色的影响，同时设立不加酶液的空白对照，体系在50℃反应48h，每隔一定的时间在四种燃料的最大吸收峰波长处测吸光度，得到吸光度为A₁；用同样的方法在反应体系中加入等量的灭活酶液作为对照，测得其吸光度为A₀，染料脱色率计算：