BR122022004520B1 - Processo para a produção de um produto de fermentação - Google Patents

Abstract

A presente revelação refere-se a célula hospedeira microbiana recombinante com atividade de importação de glicerol aumentada, bem como uma atividade diminuída de glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD) dependente de NAD. A célula hospedeira microbiana recombinante é particularmente útil para a fermentação de meio à base de cana-de-açúcar ou melaço para a produção de etanol.

Description

[001] Dividido do BR 11 2019 024520 0, depositado em 23/05/2018.

DECLARAÇÃO RELATIVA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[002] A listagem de sequências associada a este pedido é fornecida em formato de texto, em vez de uma cópia em papel, e é incorporada ao presente documento a título de referência ao relatório descritivo. O nome do arquivo de texto que contém a listagem de sequência é 55729550-15PCT_Sequence_Listing. O arquivo de texto tem cerca de 56,2 KB, foi criado em 18 de maio de 2018 e está sendo enviado eletronicamente.

CAMPO TECNOLÓGICO

[003] A presente revelação se refere à célula hospedeira microbiana recombinante, bem como ao método associado para a fermentação de qualquer tipo de biomassa, o que inclui cana-de-açúcar, melaço ou seus produtos derivados (suco, mosto, etc.), em um produto fermentado, como etanol.

ANTECEDENTES

[004] A conversão de biomassa em etanol normalmente é concluída através do uso de fermentação microbiana (por exemplo, levedura). A conversão de açúcares derivados da cana-de-açúcar, como suco e/ou melaço, é única, no sentido de que, em geral, envolve a reciclagem e a lavagem ácida dos microrganismos da fermentação. Os microrganismos fermentadores, com frequência, são lançados individualmente ou em conjunto com outras cepas para iniciar o período de esmagamento e, em seguida, reciclados (com uso de lavagem com ácido) durante todo o período de esmagamento (~ 200 dias).

[005] Saccharomyces cerevisiae é o principal organismo usado em todo o mundo para a produção de etanol de combustível. A indústria de etanol de combustível converte sacarose da cana-de-açúcar em etanol com produções de até 92% da conversão teórica. Visto que mais da metade do custo final do etanol de cana- de-açúcar é proveniente do custo da cana-de-açúcar, qualquer aumento nas produções de etanol a partir da cana-de-açúcar seria um ganho econômico significativo para os fabricantes. Por exemplo, mesmo um aumento de 1% na produção de etanol significaria >250 milhões de litros extras de etanol produzidos anualmente, a partir da mesma quantidade de cana-de-açúcar que é esmagada.

[006] Desse modo, seria desejável que fosse dotada de uma célula hospedeira microbiana recombinante para a fermentação de cana-de-açúcar e/ou melaço com capacidade de fornecer um aumento na produção de etanol, especialmente sob condições estressantes.

SUMÁRIO BREVE

[007] A presente revelação se refere à célula hospedeira microbiana recombinante que tem um aumento na atividade de importação de glicerol, bem como uma diminuição na atividade de glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD) dependente de NAD. O aumento da atividade de importação de glicerol pode ser observado durante as condições glicolíticas. A diminuição na atividade GPD pode ser observada em condições altamente osmóticas. A célula hospedeira microbiana recombinante, em particular, é útil para a fermentação de carboidratos, como meio à base de cana- de-açúcar ou de melaço, para a produção de etanol.

[008] Em um primeiro aspecto, a presente revelação fornece uma célula hospedeira microbiana recombinante: a) que tem uma primeira modificação genética para aumentar, opcionalmente em condições glicolíticas, a atividade de uma primeira proteína nativa e/ou heteróloga, cuja função é importar glicerol para a célula hospedeira recombinante; b) que tem uma segunda modificação genética para diminuir, opcionalmente, em condições altamente osmóticas, a atividade de uma proteína glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD) dependente de NAD; e c) que expressa pelo menos uma proteína GPD nativa ou heteróloga. Em uma modalidade, a pelo menos uma proteína GPD nativa ou heteróloga é uma proteína GPD2. Ainda em outra modalidade, a proteína GPD2 é uma proteína GPD2 nativa expressa a partir de um gene GPD2 nativo, sob o controle de um promotor GPD2 nativo. Em uma modalidade, a primeira modificação genética compreende a introdução de uma primeira molécula de ácido nucleico heterólogo na célula hospedeira microbiana recombinante, e em que as primeiras moléculas de ácido nucleico heterólogo compreendem um primeiro polinucleotídeo que codifica a primeira proteína heteróloga, cuja função é importar glicerol. Ainda, em outra modalidade, a primeira modificação genética compreende a introdução de uma primeira molécula de ácido nucleico heteróloga na célula hospedeira microbiana, em que o primeiro ácido nucleico heterólogo compreende, e um segundo polinucleotídeo que codifica um promotor glicolítico com capacidade de ser ligado de forma operacional a um gene que codifica a primeira proteína heteróloga nativa, cuja função é importar glicerol. Ainda, em outra modalidade, a primeira modificação genética compreende a introdução de uma primeira molécula de ácido nucleico heterólogo na célula hospedeira microbiana recombinante, e em que as primeiras moléculas de ácido nucleico heterólogo compreendem um primeiro polinucleotídeo que codifica a primeira proteína heteróloga, cuja função é importar glicerol, um segundo polinucleotídeo que codifica um promotor glicolítico ligado, de forma operacional, ao primeiro polinucleotídeo. Ainda, em outra modalidade, o promotor glicolítico compreende um promotor de um gene ADH1, um gene PGI1, um gene PFK1, um gene PFK2, um gene FBA1, um gene TPI1, um gene TDH1, um gene TDH2, um gene TDH3, um gene PGK1, um gene GPM1, um gene ENO1, um gene ENO2, um gene PYK2 e/ou um gene CDC19. Em uma modalidade adicional, o promotor glicolítico é um promotor constitutivo. Ainda, em uma modalidade adicional, a célula hospedeira microbiana recombinante tem pelo menos 2, 4, 6 ou 8 cópias da primeira molécula de ácido nucleico heterólogo. Ainda, em outra modalidade, a primeira proteína nativa e/ou heteróloga, cuja função é importar glicerol, é um co-transportador de prótons de glicerol, como, por exemplo, uma proteína STL1, uma variante de uma proteína STL1 ou um fragmento de uma proteína STL1. A proteína STL1 pode ser derivada, por exemplo, de Saccharomyces cerevisiae. Em outra modalidade, a segunda modificação genética é para redução da expressão de uma proteína nativa de glicerol- 3-fosfato desidrogenase-1 (GPD1). Em uma modalidade, a segunda modificação genética compreende a inibição da expressão da proteína nativa de glicerol-3-fosfato desidrogenase-1 (GPD1). Em outra modalidade, a segunda modificação genética compreende a deleção de pelo menos um nucleotídeo do gene que codifica a proteína GPD1 nativa. Ainda, em uma modalidade adicional, a segunda modificação genética compreende a introdução de uma segunda molécula de ácido nucleico heterólogo na célula hospedeira microbiana recombinante, e em que as segundas moléculas de ácido nucleico heterólogo compreendem um terceiro polinucleotídeo que codifica uma proteína GPD2 heteróloga. Em uma modalidade, a segunda modificação genética compreende a introdução de uma segunda molécula de ácido nucleico heterólogo na célula hospedeira microbiana recombinante, em que a segunda molécula de ácido nucleico heterólogo compreende um quarto polinucleotídeo que codifica um promotor osmótico com capacidade de ser ligado, de forma operacional, a um gene que codifica uma proteína GPD2 heteróloga. Ainda, em uma modalidade adicional, a segunda modificação genética compreende a introdução de uma segunda molécula de ácido nucleico heterólogo na célula hospedeira microbiana recombinante, e em que a segunda molécula de ácido nucleico heterólogo compreende um quinto polinucleotídeo que codifica uma proteína GPD2 heteróloga e um sexto polinucleotídeo que codifica um promotor osmótico ligado, de forma operacional, ao quinto polinucleotídeo. Em outra modalidade, o promotor osmótico é proveniente de um promotor de um gene GDP1, um gene DAK1 e/ou um gene TPS2. Nas modalidades, a célula hospedeira microbiana recombinante pode ser uma célula hospedeira de levedura recombinante. A célula hospedeira de levedura recombinante pode ser do gênero Saccharomyces sp., por exemplo, da espécie Saccharomyces cerevisiae.

[009] Em um segundo aspecto, a presente revelação fornece um processo para a produção de um produto de fermentação, sendo que o processo compreende colocar (i) um primeiro meio de fermentação que compreende um carboidrato em contato com (ii) a célula hospedeira microbiana recombinante, descrita no presente documento, para obter um primeiro meio fermentado sob condições de promover a produção do produto de fermentação. Em uma modalidade, o meio de fermentação compreende cana-de-açúcar, um derivado de cana-de-açúcar, melaço e/ou um derivado de melaço. Ainda em outra modalidade, o produto de fermentação é etanol. Ainda em outra modalidade, o processo compreende adicionalmente pelo menos um ciclo de fermentação que compreende a lavagem ácida da célula hospedeira microbiana recombinante, presente no meio fermentado, para obter uma célula hospedeira microbiana recombinante lavada com ácido, e a colocação da célula hospedeira microbiana recombinante lavada com ácido em contato com um segundo meio de fermentação que compreende um carboidrato para obter um segundo meio fermentado sob condições de promover a produção do produto de fermentação. Ainda em outra modalidade, o processo compreende adicionalmente pelo menos dois ou mais ciclos de fermentação. Em outra modalidade, o processo compreende adicionalmente a mistura da célula hospedeira microbiana recombinante com um microrganismo adicional, como, por exemplo, um microrganismo não modificado geneticamente.

[0010] Em um terceiro aspecto, a presente revelação fornece um meio de fermentação que compreende a célula hospedeira microbiana recombinante, descrita no presente documento. O meio de fermentação pode compreender, por exemplo, microrganismos adicionais (como, por exemplo, microrganismos não modificados geneticamente ou microrganismos contaminantes). O meio de fermentação também pode compreender cana-de-açúcar (ou um derivado de cana-de-açúcar) e/ou melaço (ou um derivado de melaço). Em algumas modalidades, o meio de fermentação também pode compreender etanol e/ou glicerol.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0011] Tendo desse modo geralmente descrito a natureza da invenção, agora será feita referência aos desenhos anexos, que mostram a título de ilustração, uma modalidade sua preferencial, e na qual:

[0012] Figura 1 compara as taxas de efluentes gasosos de CO2 de fermentação em lotes alimentados com cepas M7101 (de tipo selvagem, a linha preta grossa), M7772 (linha preta fina), M8690 (linha pontilhada) ou M8376 (linha tracejada). Os resultados são apresentados como fluxo de CO2 (mL/min.), em função do tempo (horas) para as diferentes cepas testadas. Consultar o Exemplo I para uma descrição das várias cepas usadas.

[0013] Figura 2 compara a taxa máxima de crescimento (em escala logarítmica) das cepas M7101, M7762, M7763, M7764, M7768, M7769 e M7770 que cresceram em sacarose (barras cinza) ou frutose (barras brancas), a 38 °C. Consultar o Exemplo I para uma descrição das várias cepas usadas.

[0014] Figura 3 compara o aumento percentual na produção de etanol (quando comparado à cepa de tipo selvagem M7101, conforme mostrado nas barras hachuradas diagonais, eixo esquerdo) e a porcentagem de redução de glicerol (quando comparada à cepa de tipo selvagem M7101, conforme mostrado em barras pontilhadas, eixo direito) entre as cepas M7772 e M8397. Consultar o Exemplo I para uma descrição das várias cepas usadas.

[0015] Figura 4 compara o aumento percentual na produção de etanol (quando comparado à cepa do tipo selvagem M7101, conforme mostrado nas barras hachuradas diagonais (reator de 2 L) ou nas barras verticais (reator de 50 mL), eixo esquerdo) e a porcentagem de redução de glicerol (quando comparado à cepa do tipo selvagem M7101, conforme mostrado nas barras brancas (reator de 2 L), ou nas barras horizontais (reator de 50 mL), eixo direito) entre cepas M10753, M10761 e M10682. Consultar o Exemplo II para uma descrição das várias cepas usadas.

[0016] Figura 5 compara as taxas de efluentes gasosos de CO2 para as cepas M7101 (linha preta grossa), M10761 (linha preta fina), M10753 (linha tracejada (longa)) e M10682 (linha tracejada (curta)) no sistema de fermentação de 2 L. Os resultados são apresentados como fluxo de CO2 (mL/min.) assim como uma função do tempo (horas) para as diferentes cepas testadas. Consultar o Exemplo II para uma descrição das várias cepas usadas.

[0017] Figuras 6A a 6E comparam a taxa de crescimento, o aumento da porcentagem de produção de etanol, a porcentagem de redução de glicerol e as taxas de efluentes gasosos de CO2 para diversas cepas que portam modificações no gene GPD1 ou GPD2. (Figura 6A) Taxa de crescimento máximo (“MaxV”, em uma escala logarítmica, eixo esquerdo e barras pretas) e o tempo para atingir a taxa de crescimento máximo (“tempo em MaxV”, conforme medido em horas, em uma escala logarítmica, eixo geométrico direito e quadrados brancos), são fornecidos para várias cepas cultivadas em meio YP suplementado com sacarose. (Figura 6B) Produção de etanol (fornecido como um aumento percentual, quando comparado à cepa M7101), para as cepas M10648 (♦□), M10686 (□) e M10682 (A), ao longo de 5 ciclos de fermentação (F1 a F5). (Figura 6C) Porcentagem de diminuição da produção de glicerol (quando comparada à cepa M7101) para as cepas M10648 (barras cinzas mais escuras), M10686 (barras brancas) e M10682 (barras cinzas mais claras) para os ciclos F3 e F5. A produção de glicerol não foi determinada (ND) durante os ciclos F1, F2 e F4. (Figura 6D) Taxas de efluente gasoso de CO2 (fornecidas em mL/min.), ao longo do tempo (fornecido em horas) para as cepas M7101 (linha sólida escura), M10648 (linha pontilhada escura), M10686 (linha sólida clara) e M10682 (linha tracejada clara) no terceiro ciclo da fermentação. (Figura 6E) Taxas de efluentes gasosos de CO2 (fornecidas em mL/min.), ao longo do tempo (fornecido em horas) para as cepas M7101 (linha sólida escura), M10648 (linha pontilhada escura), M10686 (linha sólida clara) e M10682 (linha tracejada clara) no quinto ciclo da fermentação. Consultar o Exemplo II para uma descrição das várias cepas usadas.

[0018] Figuras 7A a 7C comparam a robustez da cepa M10682 à da cepa M7101, no aumento da concentração de açúcar e na presença de contaminação bacteriana. Na (Figura 7A), resultados são mostrados como a produção de etanol (g/g, eixo esquerdo, M7101 (■), M10682 (♦)) ou titulação de etanol (v/v, eixo geométrico direito, M7101: linha tracejada escura, M10682: linha tracejada clara) para cepas cultivadas em quantidade crescente de mosto total que reduz a concentração de açúcar (g/L). Na (Figura 7B), os resultados são fornecidos à medida que a porcentagem de produção de etanol aumenta, quando comparada à cepa M7101, na ausência de contaminação bacteriana (controle), na presença de contaminação de 108 células bacterianas ou na presença de contaminação de 109 células bacterianas. Na (Figura 7C), os resultados são mostrados como as taxas de efluentes gasosos de CO2 (fornecidas em mL/min.), em função do tempo (horas) para a cepa M7101, na ausência (linha sólida escura) ou na presença (linha tracejada escura) de uma contaminação bacteriana (109 células bacterianas) e da cepa M10682, na ausência (linha sólida clara) ou na presença (linha tracejada clara) de uma contaminação bacteriana (109 células bacterianas). Consultar o Exemplo III para uma descrição das várias cepas utilizadas.

[0019] Figura 8 compara produção de etanol a partir de fermentações de mosto de cana-de-açúcar, com uso de uma cepa hospedeira de levedura recombinante (M10682) e cepas de leveduras da indústria brasileira de etanol (Cat-1, Moinho 1 e Moinho 2). Os resultados são fornecidos como a titulação média de etanol (medida em g/L, eixo e barras esquerdos) ou a mudança na produção de etanol (eixo e círculos direitos). N = 9. Consultar o Exemplo III para uma descrição das várias cepas utilizadas.

[0020] Figura 9 compara a produção de glicerol proveniente de fermentações de mosto de cana-de-açúcar com uso de uma célula hospedeira de levedura recombinante (M10682) e cepas de levedura da indústria brasileira de etanol (Cat-1, Moinho 1 e Moinho 2). Os resultados são fornecidos como a titulação média de glicerol (medida em g/L, eixo e barras esquerdos) ou a mudança na produção de glicerol (eixo geométrico e círculos direitos). N = 9. Consultar o Exemplo III para uma descrição das várias cepas usadas.

[0021] Figura 10 compara a produção de etanol a partir de fermentações de mosto de cana-de-açúcar, com uso de uma célula hospedeira de levedura recombinante (M10682), sozinha ou em combinação com cepas de levedura da indústria brasileira de etanol (Moinho 1 ou Moinho 2). Os resultados são fornecidos como a titulação média de etanol (medida em g/L, eixo e barras esquerdos) ou a mudança na produção de etanol (eixo e círculos direitos). N = 9. Consultar o Exemplo III para uma descrição das várias cepas usadas.

[0022] Figura 11 compara produção de glicerol a partir de fermentações de mosto de cana-de-açúcar com uso de uma célula hospedeira de levedura recombinante (M10682) sozinha ou em combinação com cepas de levedura da indústria brasileira de etanol (Moinho 1 ou Moinho 2). Os resultados são fornecidos como a titulação média de glicerol (medida em g/L, eixo e barras esquerdos) ou a mudança na produção de glicerol (eixo e círculos direitos). N = 9. Consultar o Exemplo III para uma descrição das várias cepas usadas.

[0023] Figura 12 compara as taxas de efluentes gasosos de CO2 para as cepas M10682 sozinhas ou em combinação com leveduras da indústria brasileira de etanol ("Moinho"). Os resultados são apresentados como fluxo de CO2 (mL/min.), em função do tempo (horas) para a cepa M10682 (linha sólida cinza-escuro), leveduras da indústria brasileira de etanol (linha sólida cinza-claro) ou uma combinação de ambas (linha tracejada cinza-escuro). Consultar o Exemplo III para uma descrição das várias cepas usadas.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0024] Durante o metabolismo microbiano (e especialmente o metabolismo de leveduras), um dos principais subprodutos da fermentação é o glicerol. O glicerol é produzido em microrganismos, como leveduras, em resposta a um estresse osmótico ou redox. O glicerol produzido, então, é exportado da célula onde é considerado resíduo. Embora a produção de glicerol seja importante para proteger os microrganismos de vários estressores, ela também tende a diminuir as produções de etanol, especialmente quando os microrganismos estão crescendo ou enfrentando estresse osmótico.

[0025] Em leveduras, o glicerol é um produto final metabólico necessário da fermentação do etanol, o que permite que a levedura equilibre seu estado redox e regenere o NAD+ usado como cofator durante a glicólise. Durante o crescimento anaeróbico em carboidratos, a produção de etanol e dióxido de carbono é redox neutra, enquanto as reações que criam biomassa celular e dióxido de carbono associado são mais oxidadas em relação aos carboidratos. A produção de glicerol, que é mais reduzido em relação aos carboidratos, funciona como um sequestrador de elétrons para compensar a formação de biomassa celular, de modo que a neutralidade redox geral seja conservada. Isso é essencial, a partir de uma consideração teórica da conservação de massa e, na prática, as cepas sem capacidade de produzir glicerol não têm capacidade de crescer em condições anaeróbicas.

[0026] Visto que o glicerol é um subproduto de baixo valor, pode ser um subproduto indesejável da fermentação. Existe um forte incentivo comercial para reduzir o glicerol como subproduto durante a produção de combustíveis e produtos químicos, pois a redução normalmente resulta em um aumento da produção do composto desejado.

[0027] Várias estratégias estão disponíveis na técnica para a conversão de glicerol em produtos de maior valor, por meio bioquímico ou outros meios. Além disso, várias estratégias foram empregadas para reduzir a produção de glicerol, o que pode levar a uma melhoria da produção geral de açúcar em etanol ou outros produtos finais do metabolismo desejados. Através da engenharia de vias alternativas, com a redução ou deleção, ao mesmo tempo, da via do glicerol, podem ser utilizados aceptores de elétrons alternativos ou de substituição para a regeneração do NAD+, durante o metabolismo da levedura. Os exemplos de tais aceptores de elétrons alternativos ou de substituição incluem moléculas, como formato ou hidrogênio.

[0028] A eliminação dos genes de síntese de glicerol foi demonstrada, mas a remoção dessa via bloqueou completamente o crescimento anaeróbico da levedura, o que impede a aplicação útil durante um processo industrial. Outros métodos para contornar a formação de glicerol exigem a co-utilização de fontes de carbono adicionais, como xilose ou acetato, para servir como aceptores de elétrons. A engenharia de uma liase de formato de piruvato de E. coli, que tem capacidade de converter piruvato em formato, foi realizada anteriormente para aumentar a produção de formato. Conforme mostrado no documento n° WO 2012/138942, o uso de uma via de formato como um aceitador de elétrons alternativo permite que a formação de glicerol seja desviada, e a produção de etanol seja aumentada.

[0029] Além de seu papel conhecido durante o crescimento anaeróbico, o glicerol também é sintetizado por S. cerevisiae, em resposta ao estresse osmótico. A formação de glicerol é mediada, em parte, pela atividade de duas glicerol-3-fosfato desidrogenases: GPD1 e GPD2. O glicerol formado em resposta ao estresse osmótico é mediado principalmente através da ação da GPD1, ao passo que o glicerol formado como um sequestrador de elétrons para o excesso de elétrons gerados durante a produção de biomassa, durante o crescimento anaeróbico, é mediado principalmente pela ação da GPD2. O glicerol é exportado da célula de levedura através de um canal de aquaporina, conhecido como FPS1. Este canal é fechado em resposta ao estresse osmótico, a fim de reduzir o efluxo de glicerol a partir da célula, o que permite, desse modo, o acúmulo de níveis mais altos de glicerol intracelular. Além disso, as leveduras podem aumentar os níveis intracelulares de glicerol através da captação de glicerol do ambiente extracelular, através da ação de outro transportador de glicerol, conhecido como STL1. A expressão de STL1, no entanto, é limitada pela repressão transcricional do gene na presença de glicose. Conforme mostrado no documento n° WO2015/023989, a super expressão de STL1, em combinação com outras proteínas heterólogas, pode ser usada para melhorar a produção de etanol.

[0030] A produção anaeróbica de glicerol, em resposta ao estresse osmótico, no entanto, não pode ocorrer na ausência de uma reação de oxidação secundária. Sob condições anaeróbicas, as leveduras, em fase estacionária, precisam gerar energia redutora para produzir glicerol, em resposta ao estresse osmótico. O resultado final é que, além de produzir glicerol em resposta ao estresse osmótico, o organismo também deve produzir um produto final oxidado, que reduz ainda mais a produção do produto desejado.

[0031] Foi demonstrado que um aumento na produção de acetato, piruvato e succinato acompanha a produção anaeróbica de glicerol, em resposta ao estresse osmótico. A concentração desses metabólitos, no entanto, foi apenas suficiente para produzir aproximadamente metade do NADH necessário para equilibrar o aumento do glicerol. Além disso, níveis elevados de piruvato, succinato, acetaldeído, acetoína e 2,3-butanodiol foram observados em cepas de vinho projetadas para produzir mais glicerol. A produção desses compostos se refletiu no equilíbrio de redox e de carbono, embora a relação não tenha sido elaborada.

[0032] A presente revelação fornece uma célula hospedeira microbiana recombinante que produz menos glicerol e mais etanol, especialmente quando a célula hospedeira é colocada em condições glicolíticas. A célula hospedeira microbiana recombinante tem pelo menos duas modificações genéticas. A célula hospedeira de levedura microbiana recombinante tem uma primeira modificação genética que permite, de preferência, em condições glicolíticas, um aumento na atividade de uma proteína (nativa e/ou heteróloga), cuja função é importar glicerol. A célula hospedeira microbiana recombinante também tem uma segunda modificação genética, o que permite, de preferência em condições altamente osmóticas, uma redução na atividade de uma proteína glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD) dependente de NAD (nativa e/ou heteróloga). Importante, a célula hospedeira de levedura recombinante, da presente revelação, exibe tanto a importação de glicerol quanto a atividade de GPD dependente de NAD, de preferência, em condições glicolíticas, bem como em condições osmóticas regulares e baixas.

DEFINIÇÕES

[0033] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que é comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta invenção pertence. Além disso, a menos que exigido de outra forma pelo contexto, os termos no singular devem incluir plurais, e os termos no plural devem incluir o singular. Todas as publicações, patentes e outras referências mencionadas no presente documento são incorporadas a título de referência, em sua totalidade, para todos os fins.

[0034] O termo "heterólogo" quando usado em referência a um polinucleotídeo, um gene, um polipeptídeo ou uma enzima, refere-se a um ácido nucleico, um polinucleotídeo, um gene, uma proteína, um polipeptídeo ou uma enzima normalmente não encontrada no organismo hospedeiro. "Heterólogo" também inclui uma região de codificação nativa, ou uma porção dela, que é reintroduzida no organismo de origem em uma forma que é diferente da do gene nativo correspondente, por exemplo, não em sua localização natural no genoma do organismo. O polinucleotídeo heterólogo, ou gene, pode ser introduzido no organismo hospedeiro, por exemplo, por meio de transferência de genes. Um gene heterólogo pode incluir uma região de codificação nativa, que é uma porção de um gene quimérico, que inclui regiões reguladoras não nativas, que é reintroduzida no hospedeiro nativo. Os genes estranhos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo, ou genes quiméricos. O termo "heterólogo", quando usado em referência a uma molécula de ácido nucleico (como um promotor, um terminador ou uma sequência de codificação) ou uma proteína, refere-se a uma molécula de ácido nucleico ou uma proteína que não é encontrada nativamente na célula hospedeira recombinante. Por exemplo, um elemento heterólogo poderia ser derivado de uma cepa diferente da célula hospedeira ou de um organismo de um grupo taxonômico diferente (por exemplo, reino diferente, filo, classe, ordem, gênero familiar ou espécie, ou qualquer subgrupo dentro de uma dessas classificações). Um elemento heterólogo pode ser derivado de qualquer fonte, por exemplo, eucariotos, procariotos, vírus ou fragmentos polinucleotídicos sintéticos.

[0035] As moléculas, ou os polinucleotídeos heterólogos de ácido nucleico presentes na célula hospedeira recombinante podem ser integrados ao genoma da célula hospedeira. O termo "integrado", conforme usado no presente documento, refere-se a elementos genéticos que são colocados, através de técnicas de biologia molecular, no genoma de uma célula hospedeira. Por exemplo, elementos genéticos podem ser colocados nos cromossomos da célula hospedeira, em oposição a um vetor como um plasmídeo transportado pela célula hospedeira. Os métodos para integrar elementos genéticos ao genoma de uma célula hospedeira são bem conhecidos na técnica e incluem recombinação homóloga. A molécula de ácido nucleico heterólogo pode estar presente em uma ou mais cópias (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou mais cópias) no genoma da célula hospedeira microbiana (nos mesmos loci, em loci diferentes). Alternativamente, a molécula de ácido nucleico heterólogo pode ser replicada, de forma independente, a partir do genoma da levedura. Em tal modalidade, a molécula de ácido nucleico pode ser estável e autorreplicadora.

[0036] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico heterólogo que podem ser introduzidas nas células hospedeiras microbianas recombinantes que são otimizadas por códon, em relação à célula hospedeira de levedura recombinante destinatária pretendida. Conforme usado no presente documento, o termo "região de codificação otimizada por códon" significa uma região de codificação de ácido nucleico que foi adaptada para expressão nas células de um determinado organismo, o que substitui pelo menos um ou mais de um códon por um ou mais códons que são usados com mais frequência nos genes desse organismo. Em geral, os genes altamente expressos em um organismo são orientados por códons que são reconhecidos pelas espécies de tRNA mais abundantes nesse organismo. Uma medida dessa orientação é o "índice de adaptação de códons" ou "CAI", que mede até que ponto os códons usados para codificar cada aminoácido em um gene específico são aqueles que ocorrem com mais frequência em um conjunto de referência de genes altamente expressos de um organismo. O CAI da molécula de ácido nucleico heterólogo otimizado para códon, descrito no presente documento, corresponde entre cerca de 0,8 e 1,0, entre cerca de 0,8 e 0,9 ou cerca de 1,0.

[0037] A molécula de ácido nucleico heterólogo pode ser introduzida na célula hospedeira microbiana recombinante com uso de um vetor. Um "vetor", por exemplo, um "plasmídeo", "cosmídeo" ou "cromossomo artificial" (como, por exemplo, um cromossomo artificial de levedura) se refere a um elemento cromossômico extra e, em geral, está na forma de uma molécula de DNA de fita dupla circular. Tais vetores podem ser sequências de replicação de forma autônoma, sequências de integração ao genoma, sequências de fagos ou nucleotídeos, lineares, circulares ou super espiraladas, de um DNA ou RNA de fita simples ou dupla, derivados de qualquer fonte, na qual várias sequências nucleotídicas se juntaram ou se recombinaram em uma construção única, que tem capacidade de introduzir um fragmento de promotor e uma sequência de DNA em um produto gênico, selecionado juntamente com a sequência não traduzida em 3' apropriada em uma célula.

[0038] No contexto da presente revelação, um "ortólogo de gene" é entendido como um gene em uma espécie diferente que evoluiu de um gene ancestral comum por especiação. Entende-se que a proteína codificada por um ortólogo de gene retém a mesma função que a proteína codificada pelo gene original.

[0039] As moléculas/ polinucleotídeos heterólogos de ácido nucleico descrito no presente documento podem compreender regiões de controle transcricionais e/ou translacionais. As "regiões de controle transcricional e translacional" são regiões reguladoras de DNA, como promotores, intensificadores, terminadores e similares, que fornecem a expressão de uma região de codificação em uma célula hospedeira. Nas células eucarióticas, os sinais de poliadenilação são regiões de controle.

[0040] O termo "promotor" se destina a incluir um polinucleotídeo que pode controlar de forma transcricional um gene de interesse que ele não controla de forma transcricional na natureza. Em certas modalidades, o controle transcricional de um promotor resulta em um aumento na expressão do gene de interesse sob certas circunstâncias. Em certas modalidades, um promotor é colocado 5' no gene de interesse. Um promotor pode ser usado para substituir o promotor natural, ou pode ser usado em complemento ao promotor natural. Um promotor substituto pode ser endógeno, em relação à célula hospedeira na qual é usado, ou pode ser uma sequência polinucleotídica heteróloga, introduzida na célula hospedeira, por exemplo, exógena em relação à célula hospedeira na qual é usada.

[0041] Os termos "gene (ou genes)" ou "polinucleotídeo" ou "sequência (ou sequências) de polinucleotídeo" se destinam a incluir moléculas de ácido nucleico, por exemplo, polinucleotídeos que incluem um quadro aberto de leitura que codifica um polipeptídeo, e podem adicionalmente incluir sequências reguladoras não codificadoras e íntrons. Além disso, os termos se destinam a incluir um ou mais genes mapeados em um locus funcional. Além disso, os termos se destinam a incluir um gene específico para uma finalidade selecionada. O gene pode ser endógeno da célula hospedeira ou pode ser introduzido de forma recombinante na célula hospedeira, por exemplo, como um plasmídeo mantido de forma epissomal, ou um plasmídeo (ou um fragmento dele) que está integrado, de maneira estável, ao genoma. Além da forma de plasmídeo, um gene pode, por exemplo, estar na forma de DNA linear. Em certas modalidades, o gene ou polinucleotídeo está envolvido em pelo menos uma etapa na bioconversão de biomassa, por exemplo, em etanol.

[0042] As proteínas ou os polipeptídeos heterólogos podem ser uma variante de uma proteína ou de um polipeptídeo conhecido/ nativo. Uma variante compreende pelo menos uma diferença de aminoácidos, quando comparada com a sequência de aminoácidos da proteína ou polipeptídeo nativo. Conforme usado no presente documento, uma variante se refere às alterações na sequência de aminoácidos que não afetam adversamente as funções biológicas da proteína ou do polipeptídeo. Diz- se que uma substituição, inserção ou deleção afeta adversamente a proteína, quando a sequência alterada impede ou interrompe uma função biológica associada à proteína ou ao polipeptídeo nativo. Por exemplo, a carga total, estrutura ou as propriedades hidrofóbicas e hidrofílicas da proteína podem ser alteradas, sem afetar adversamente uma atividade biológica. Por conseguinte, a sequência de aminoácidos pode ser alterada, por exemplo, para tornar o peptídeo mais hidrofóbico ou hidrofílico, sem afetar adversamente as atividades biológicas da enzima alimentar e/ou do alimento. As variantes de proteínas ou polipeptídeos têm pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com as proteínas e os polipeptídeos nativos descritos no presente documentos. O termo "porcentagem de identidade", conforme conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências polipeptídicas, ou duas ou mais sequências polinucleotídicas, conforme determinado pela comparação das sequências. O nível de identidade pode ser determinado convencionalmente com uso de programas de computador conhecidos. A identidade pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos, o que inclui, entre outros, os descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, AM, ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, DW, ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, AM e Griffin, HG, (org.)) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., ed.) Stockton Press, NY (1991). Os métodos preferenciais para determinar a identidade são projetados para fornecer a melhor correspondência entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e a similaridade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Os alinhamentos de sequência e os cálculos de porcentagem de identidade podem ser realizados com uso do programa Megalign, do conjunto de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wis.). Vários alinhamentos das sequências reveladas no presente documento foram realizados com uso do método de alinhamento Clustal (Higgins e Sharp (1989) CABIOS. 5: p. 151 a 153) com os parâmetros padrão (PENALIDADE PARA LACUNAS (GAP PENALTY) = 10, PENALIDADE DE COMPRIMENTO PARA LACUNAS (GAP LENGTH PEN ALT Y) = 10). Os parâmetros padrão para alinhamentos aos pares com uso do método Clustal foram KTUPLB 1, PENALIDADE PARA LACUNAS (GAP PENALTY) = 3, JANELA = 5 e DIAGONAIS SALVAS (DIAGONALS SAVED)= 5.

[0043] As proteínas ou os polipeptídeos variantes descritos no presente documentos podem ser (i) um em que um ou mais resíduos de aminoácidos são substituídos por um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (de preferência, um resíduo de aminoácido conservado) e esse resíduo de aminoácido substituído pode ou pode não ser um codificado pelo código genético, ou (ii) um no qual um ou mais dos resíduos de aminoácidos incluem um grupo substituinte, ou (iii) um no qual o polipeptídeo maduro é fundido com outro composto, como um composto para aumentar a meia-vida do polipeptídeo (por exemplo, polietileno glicol), ou (iv) um no qual os aminoácidos adicionais são fundidos ao polipeptídeo maduro para purificação do polipeptídeo. Uma "variante" da enzima alimentar e/ou do alimento pode ser uma variante conservadora ou uma variante alélica.

[0044] As proteínas ou os polipeptídeos heterólogos podem ser um fragmento de uma proteína ou um polipeptídeo conhecido/ nativo/ variante. Um fragmento compreende pelo menos um resíduo de aminoácido menor, quando comparado à sequência de aminoácidos da proteína ou do polipeptídeo conhecido/ nativo/ variante, e ainda possui a atividade biológica da proteína ou do polipeptídeo nativo. Em algumas modalidades, os "fragmentos" de proteína ou polipeptídeo têm pelo menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 ou mais aminoácidos consecutivos da proteína ou do polipeptídeo conhecido/ nativo/ variante. Em algumas modalidades, os fragmentos têm pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com as proteínas e os polipeptídeos conhecidos/ nativos/ variantes descritos no presente documentos. Em algumas modalidades, os fragmentos podem ser empregados para a produção da proteína ou do polipeptídeo de comprimento completo correspondente por meio de síntese peptídica. Por essa razão, os fragmentos podem ser empregados como intermediários para a produção de proteínas de comprimento completo.

[0045] O termo "controle transcricional" se destina a incluir a capacidade de modular a expressão gênica no nível da transcrição. Em certas modalidades, a transcrição e, desse modo, a expressão gênica, é modulada por meio de substituição ou adição de um promotor substituto próximo à terminação 5' da região de codificação de um gene de interesse, o que resulta, desse modo, na expressão gênica alterada. Em certas modalidades, o controle transcricional de um ou mais genes é modificado para resultar na expressão ótima de tais genes, por exemplo, em uma razão desejada. O termo também inclui controle transcricional passível de indução, conforme reconhecido na técnica.

[0046] No contexto da presente revelação, a célula hospedeira recombinante é um microrganismo e inclui, sem limitações, bactérias, leveduras, fungos, células vegetais e de mamíferos. Em uma modalidade, a célula hospedeira microbiana recombinante é uma levedura e, em algumas modalidades adicionais, a levedura pode ser usada na produção de biocombustíveis. As células hospedeiras de levedura adequadas podem ser, por exemplo, do gênero Saccharomyces, Kluyveromyces, Arxula, Debaryomyces, Candida, Pichia, Phaffia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces, Torula ou Yarrowia. As espécies de leveduras adequadas podem incluir, por exemplo, S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, C. utilis, K. lactis, K. marxianus ou K. fragilis. Em algumas modalidades, a levedura é selecionada dentre o grupo que consiste em Saccharomyces cerevisiae, Schizzosaccharomyces pombe, Candida albicans, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Cândida utilis, adeninivorans Arxula, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus, Schizosaccharomyces pombe e Schwanniomyces occidentalis. Em algumas modalidades, a célula hospedeira pode ser uma célula de levedura oleaginosa. Por exemplo, a célula hospedeira de levedura oleaginosa pode ser do gênero Blakeslea, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidum, Rhodotorula, Trichosporon ou Yarrowia. Em alguma modalidade alternativa, a célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira de microalgas oleaginosas (por exemplo, do gênero Thraustochytrium ou Schizochytrium). Em uma modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante é do gênero Saccharomyces e, em algumas modalidades, da espécie Saccharomyces cerevisiae.

ATIVIDADE DE IMPORTAÇÃO DE GLICEROL

[0047] No contexto da presente revelação, a célula hospedeira microbiana recombinante tem pelo menos uma primeira modificação genética, que permite aumentar a atividade (biológica) de uma proteína, cuja função é importar glicerol (por exemplo, transportar ativamente glicerol dentro da célula) e/ou diminuir a atividade (biológica) de uma proteína, cuja função é exportar glicerol (por exemplo, transportar ativamente glicerol dentro da célula). Ainda, no contexto da presente revelação, a atividade da proteína, cuja função é importar/ exportar glicerol na célula hospedeira microbiana recombinante, é opcionalmente modulada em condições glicolíticas. Conforme mostrado nos Exemplos abaixo, aumentar a importação de glicerol durante as condições glicolíticas é vantajoso, em relação à modificação de vias alternativas de produção de glicerol, devido ao fato de que, entre outras coisas, isso aumentou a produção de etanol, diminui a produção de glicerol, enquanto mantém robustez adequada (taxas de crescimento, cinética, altas temperaturas, ou na presença de contaminação bacteriana).

[0048] Em uma modalidade, as células hospedeiras microbianas recombinantes têm pelo menos uma primeira modificação genética, que permite aumentar a atividade (biológica) de uma proteína, cuja função é importar glicerol (por exemplo, transportar ativamente glicerol dentro da célula). Em algumas modalidades, a atividade da proteína, cuja função é importar glicerol na célula hospedeira microbiana recombinante é aumentada em condições glicolíticas. A proteína STL1 é uma proteína exemplificativa, cuja função é importar glicerol.

[0049] Em outra modalidade, as células hospedeiras microbianas recombinantes têm pelo menos uma primeira modificação genética, que permite diminuir a atividade (biológica) de uma proteína, cuja função é exportar glicerol (por exemplo, transportar ativamente glicerol para fora da célula). Em algumas modalidades, a atividade da proteína que funciona para exportar glicerol na célula hospedeira microbiana recombinante é reduzida em condições glicolíticas. A proteína FPS1 é uma proteína exemplificativa, cuja função é exportar glicerol. A proteína FPS1 é uma proteína de canal localizada na membrana plasmática que controla o acúmulo e a liberação de glicerol na osmorregulação da levedura. Os mutantes nulos dessa cepa acumulam grandes quantidades de glicerol intracelular, crescem muito mais lentamente que o tipo selvagem e consomem o substrato de açúcar em uma taxa mais lenta. Como tal, a primeira modificação genética pode incluir a redução ou deleção da expressão do gene que codifica a proteína FPS1 durante condições glicolíticas.

[0050] Conforme usado no contexto da presente revelação, a expressão "condições glicolíticas" se refere à presença de glicose suficiente no ambiente, em torno da célula hospedeira microbiana recombinante, para disparar a absorção dessa glicose, pela célula. O aumento na atividade de importação de glicerol pode ser observado, em relação à mesma célula microbiana recombinante que não está em glicólise (por exemplo, durante a fase de propagação da célula microbiana recombinante ou na ausência de glicose). Esse aumento também pode ser observado em relação a uma célula hospedeira microbiana recombinante correspondente, sem a primeira modificação genética. No contexto da presente revelação, não é necessário que o aumento da atividade da proteína, cuja função é importar glicerol, seja limitado a circunstâncias nas quais a célula hospedeira microbiana recombinante esteja em condições glicolíticas, mas é importante que o aumento da atividade seja observado, quando a célula hospedeira microbiana recombinante for colocada em condições glicolíticas.

[0051] As células hospedeiras microbianas recombinantes da presente revelação incluem uma primeira modificação genética para introduzir (uma ou mais cópias de) de uma molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica uma proteína heteróloga, cuja função é importar glicerol e/ou substituir o promotor do gene que codifica a proteína nativa, cuja função é importar glicerol com um promotor glicolítico.

[0052] A fim de aumentar a atividade do funcionamento da proteína para importar glicerol, é possível incluir, na célula hospedeira microbiana recombinante, uma ou mais cópias de uma molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica o funcionamento da proteína para importar glicerol. Conforme indicado acima, no contexto da presente revelação, uma molécula de ácido nucleico é considerada "heteróloga", mesmo que seja derivada da célula hospedeira microbiana, quando é reintroduzida em um ou mais locais que são nativos para essa molécula de ácido nucleico. Por exemplo, a célula hospedeira microbiana recombinante pode ter uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou mais cópias da molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica a proteína, cuja função é importar glicerol. Em uma modalidade, a célula hospedeira microbiana recombinante compreende entre quatro e oito cópias da molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica a proteína, cuja função é importar glicerol. Em uma modalidade, a célula hospedeira microbiana recombinante compreende pelo menos (e, em algumas modalidades adicionais, não mais do que) duas cópias da molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica a proteína, cuja função é importar glicerol. Em outra modalidade, a célula hospedeira microbiana recombinante compreende pelo menos (e, em algumas modalidades adicionais, não mais do que) três cópias da molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica a proteína, cuja função é importar glicerol. Ainda, em outra modalidade, a célula hospedeira microbiana recombinante compreende pelo menos (e, em algumas modalidades adicionais, não mais do que) quatro cópias da molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica a proteína, cuja função é importar glicerol. Ainda em outra modalidade, a célula hospedeira microbiana recombinante compreende pelo menos (e, em algumas modalidades adicionais, não mais do que) cinco cópias da molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica a proteína, cuja função é importar glicerol. Em uma modalidade adicional, a célula hospedeira microbiana recombinante compreende pelo menos (e, em algumas modalidades adicionais, não mais do que) seis cópias da molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica a proteína, cuja função é importar glicerol. Ainda, em uma outra modalidade, a célula hospedeira microbiana recombinante compreende pelo menos (e, em algumas modalidades adicionais, não mais do que) sete cópias da molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica a proteína, cuja função é importar glicerol. Ainda, em uma modalidade adicional, a célula hospedeira microbiana recombinante compreende pelo menos (e, em algumas modalidades adicionais, não mais do que) oito cópias da molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica a proteína, cuja função é importar glicerol. A molécula de ácido nucleico heterólogo pode ser replicada de forma independente, ou integrada à célula hospedeira microbiana recombinante. Quando a molécula de ácido nucleico heterólogo é integrada à célula hospedeira microbiana recombinante, é, de preferência, posicionada no sítio de integração neutro. Quando mais de uma cópia da molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica a proteína, cuja função é importar glicerol, é introduzida na célula hospedeira microbiana recombinante, cada cópia pode ser integrada a um ou mais sítios de integração (iguais ou diferentes).

[0053] Para alcançar a expressão (ou, em algumas modalidades, a superexpressão) da atividade da proteína, cuja função é importar glicerol, em condições glicolíticas, pode ser necessário incluir um promotor glicolítico para controlar a expressão do gene que codifica a proteína, cuja função é importar glicerol. No contexto da presente revelação, um "promotor glicolítico" é um promotor (ou uma combinação de promotores) que permite a expressão (ou, em algumas modalidades, a superexpressão) de um gene associado de forma operacional a ele, quando a célula microbiana recombinante é colocada em condições glicolíticas. O promotor glicolítico pode ser incluído na célula hospedeira microbiana recombinante para controlar a expressão de um gene nativo e/ou heterólogo que codifica a proteína, cuja função é importar glicerol. O promotor glicolítico pode ser um promotor constitutivo ou um promotor passível de indução à glicose. Os promotores glicolíticos excluem os promotores que podem reprimir a glicose. Os promotores passíveis de indução à glicose são, em geral, associados aos genes que codificam enzimas na via glicolítica, e os promotores que controlam a expressão de enzimas que são reguladas positivamente na via glicolítica podem ser usados na célula hospedeira microbiana recombinante da presente revelação. As enzimas da via glicolítica, cuja expressão é regulada na presença de glicose, incluem, mas sem limitação, aquelas codificadas por um gene de álcool desidrogenase, um gene de glicose-6-fosfato isomerase, um gene de fosfofrutoquinase, um gene de fosfofrutoquinase, um gene de aldolase, um triosefosfato isomerase, um gene de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, um gene de 3-fosfoglicerato quinase, um fosfoglicerato mutase, um gene da enolase e um piruvato quinase. Como tal, no contexto da presente revelação, o promotor glicolítico pode ser um promotor (ou uma combinação de promotores) de um gene de desidrogenase de álcool, um gene de glicose-6-fosfato isomerase, um gene de fosfofrutoquinase, um gene de aldolase, um triosefosfato gene da isomerase, um gene da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, um gene da 3-fosfoglicerato quinase, uma fosfoglicerato mutase, um gene da enolase e/ou piruvato quinase.

[0054] Em Saccharomyces cerevisiae, as enzimas da via glicolítica, cuja expressão é regulada na presença de glicose, incluem, entre outras, aquelas codificadas por um gene ADH1, um gene PGI1, um gene PFK1, um gene PFK2, um gene FBA1, um gene TPI1, um gene TDH1, um gene TDH2, um gene TDH3, um gene PGK1, um gene GPM1, um gene ENO1, um gene ENO2, um gene PYK2 e um gene CDC19. Como tal, no contexto da presente revelação, o promotor glicolítico pode ser um promotor (ou uma combinação de promotores) de um gene ADH1 (conhecido como promotor ADH1 ou adh1p), um gene PGI1 (conhecido como promotor PGI1 ou pgi1p), um gene PFK1 (conhecido como promotor PFK1 ou pfki1p), um gene PFK2 (conhecido como promotor PFK2 ou pfk2p), um gene FBA1 (conhecido como promotor FBA1 ou fba1p), um gene TPI1 (conhecido como um promotor TPI1 ou tpi1p), um gene TDH1 (conhecido como promotor TDH1 ou tdh1p), um gene TDH2 (conhecido como promotor TDH2 ou tdh2p), um gene TDH3 (conhecido como promotor TDH3 ou tdh3p), um gene PGK1 (conhecido como promotor PGK1 ou pgk1p), um gene GPM1 (conhecido como promotor GPM1 ou gpm1p), um gene ENO1 (conhecido como promotor ENO1 ou eno1p), um gene ENO2 (conhecido como promotor ENO2 ou eno2p), um gene PYK2 (conhecido como promotor PYK2 ou pyk2p) e/ou um gene CDC19 (conhecido como CDC19 ou cdc19p).

[0055] As proteínas exemplificativas com capacidade de funcionar para importar glicerol incluem aquaporinas, bem como facilitadoras de glicerol. A proteína FPS1 (codificada pelo gene ID 850683 em Saccharomyces cerevisiae) é uma facilitadora de glicerol com capacidade de importar glicerol. Como tal, a proteína com capacidade de funcionar para importar glicerol pode ser uma proteína FPS1 ou uma proteína codificada por um ortólogo do gene FPS1. A proteína FPS1 pode ser derivada, por exemplo, de Saccharomyces cerevisiae ou de um ortólogo correspondente encontrado em Pachysolen tannophilus, Komagataella pastoris, Yarrowia lipolytica e/ou Cyberlindnera jadinii.

[0056] Outra proteína exemplificativa com capacidade de funcionar para importar glicerol é o co-transportador de glicerol/ próton inativado por glicose STL1. A função nativa da proteína STL1 é a captação de glicerol do ambiente extracelular. STL1 é um membro da Família Portadora de Açúcar, que faz parte da Superfamília Principal Facilitadora (MFS). O STL1 transporta glicerol por meio de co- transportação de prótons, o que significa que o glicerol e os prótons são cotransportados através do STL1 para a célula. Em S. cerevisiae, a expressão de STL1 e a captação de glicerol são tipicamente reprimidas, quando existem outras fontes de carbono, como a glicose disponível. Quando as células sofrem choque osmótico alto, o STL1 é expresso para ajudar a lidar com o choque osmótico por meio de transporte do glicerol osmoprotetor para a célula e por meio de aumento da concentração intracelular de glicerol. No contexto da presente revelação, a proteína, cuja função é importar glicerol, pode ser a proteína STL1, uma variante da proteína STL1, ou um fragmento da proteína STL1. Nas modalidades em que a proteína, cuja função é importar glicerol, é uma variante ou um fragmento da proteína STL1, a variante ou o fragmento precisa exibir pelo menos parte da atividade biológica da proteína STL1 nativa, ou seja, a capacidade de agir como um co-transportador de prótons, conforme indicado acima.

[0057] A proteína heteróloga, cuja função é importar glicerol, pode ser codificada por um gene STL1. A proteína STL1 é expressa nativamente em leveduras e fungos; por essa razão, a proteína heteróloga, cuja função é importar glicerol, pode ser derivada de leveduras e fungos. Os genes STL1 que codificam a proteína STL1 incluem, mas sem limitação, Saccharomyces cerevisiae, Gene ID: 852149 (codificado por SEQ ID NO: 1 e apresentado na SEQ ID NO: 2), Candida albicans (codificado por SEQ ID NO: 3 e apresentado na SEQ ID NO: 4), Kluyveromyces lactis, Gene ID: 2896463 (apresentado na SEQ ID NO: 10), Ashbya gossypii, Gene ID: 4620396 (apresentado na SEQ ID NO: 11), Eremothecium sinecaudum, Gene ID: 28724161 (apresentado na SEQ ID NO: 12), Torulaspora delbrueckii, Gene ID: 11505245 (apresentado na SEQ ID NO: 13), Lachancea thermotolerans, Gene ID: 8290820 (apresentado na SEQ ID NO: 14), Phialophora attae, Gene ID: 28742143 (apresentado na SEQ ID NO: 15), Penicillium digitatum, Gene ID: 26229435 (apresentado na SEQ ID NO: 16), Aspergillus oryzae, Gene ID: 5997623 (apresentado na SEQ ID NO: 17), Aspergillus fumigatus, Gene ID: 3504696 (apresentado na SEQ ID NO: 18), Talaromyces atroroseus, Gene ID: 31007540 (apresentado na SEQ ID NO: 19), Rasamsonia emersonii, Gene ID: 25315795 (apresentado na SEQ ID NO: 20), Aspergillus flavus, Gene ID: 7910112 (apresentado na SEQ ID NO: 21), Aspergillus terreus, Gene ID: 4322759 (apresentado na SEQ ID NO: 22), Penicillium chrysogenum, Gene ID: 8310605 (apresentado na SEQ ID NO: 23), Alternaria alternata, Gene ID: 29120952 (apresentado na SEQ ID NO: 24), Paraphaeosphaeria sporulosa, Gene ID: 28767590 (apresentado na SEQ ID NO: 25), Pyrenophora tritici- repentis, Gene ID: 6350281 (apresentado na SEQ ID NO: 26), Metarhizium robertsii, Gene ID: 19259252 (apresentado na SEQ ID NO: 27), Isaria fumosorosea, Gene ID: 30023973 (apresentado na SEQ ID NO: 28), Cordyceps militaris, Gene ID: 18171218 (apresentado na SEQ ID NO: 29), Pochonia chlamydosporia, Gene ID: 28856912 (apresentado na SEQ ID NO: 30), Metarhizium majus, Gene ID: 26274087 (apresentado na SEQ ID NO: 31), Neofusicoccum parvum, Gene ID:19029314 (apresentado na SEQ ID NO: 32), Diplodia corticola, Gene ID: 31017281 (apresentado na SEQ ID NO: 33), Verticillium dahliae, Gene ID: 20711921 (apresentado na SEQ ID NO: 34), Colletotrichum gloeosporioides, Gene ID: 18740172 (apresentado na SEQ ID NO: 35), Verticillium albo-atrum, Gene ID: 9537052 (apresentado na SEQ ID NO: 36), Paracoccidioides lutzii, Gene ID: 9094964 (apresentado na SEQ ID NO: 37), Trichophyton rubrum, Gene ID: 10373998 (apresentado na SEQ ID NO: 38), Nannizzia gypsea, Gene ID: 10032882 (apresentado na SEQ ID NO: 39), Trichophyton verrucosum, Gene ID: 9577427 (apresentado na SEQ ID NO: 40), Arthroderma benhamiae, Gene ID: 9523991 (apresentado na SEQ ID NO: 41), Magnaporthe oryzae, Gene ID: 2678012 (apresentado na SEQ ID NO: 42), Gaeumannomyces graminis var. tritici, Gene ID: 20349750 (apresentado na SEQ ID NO: 43), Togninia minima, Gene ID: 19329524 (apresentado na SEQ ID NO: 44), Eutypa lata, Gene ID: 19232829 (apresentado na SEQ ID NO: 45), Scedosporium apiospermum, Gene ID: 27721841 (apresentado na SEQ ID NO: 46), Aureobasidium namibiae, Gene ID: 25414329 (apresentado na SEQ ID NO: 47), Sphaerulina musiva, Gene ID: 27905328 (apresentado na SEQ ID NO: 48), bem como Pachysolen tannophilus, Números de acesso ao Banco de Genes: JQ481633 (apresentado na SEQ ID NO: 49) e JQ481634 (apresentado na SEQ ID NO: 50), Saccharomyces paradoxus STL1 (codificado pela SEQ ID NO: 7 e apresentado na SEQ ID NO: 8) e Pichia sorbitophilia (codificado pela SEQ ID NO: 5 e apresentado na SEQ ID NO: 6). Em uma modalidade, a proteína STL1 é codificada por Saccharomyces cerevisiae, Gene ID: 852149.

[0058] A proteína heteróloga, cuja função é importar glicerol, pode ser codificada por um gene STL1, conforme indicado no presente documento, ou por um ortólogo do gene STL1. A proteína heteróloga, cuja função é importar glicerol, pode ser uma proteína STL1, conforme definido no presente documento, uma variante da proteína STL1 e/ou um fragmento da proteína STL1. Além disso, quando mais do de uma cópia do STL1 heterólogo é incluída na célula microbiana recombinante, a pluralidade de moléculas de ácido nucleico heterólogo que codifica a proteína STL1 pode ser a mesma, ou diferente, integrada ao mesmo sítio, ou a sítios de integração diferentes.

ATIVIDADE DE GLICEROL-3-FOSFATO DEPENDENTE DE NAD

[0059] No contexto da presente revelação, a célula hospedeira microbiana recombinante tem pelo menos uma segunda modificação genética, que permite que ela diminua sua atividade de glicerol-3-fosfato (biológico) dependente de NAD opcionalmente em condições altamente osmóticas. Em algumas modalidades, a célula hospedeira microbiana recombinante retém substancialmente a mesma atividade glicerol-3-fosfato (biológica) dependente de NAD em condições osmóticas normais a baixas. Conforme mostrado nos Exemplos abaixo, a atividade reduzida de glicerol-3-fosfato dependente de NAD em condições altamente osmóticas, acoplada à manutenção da atividade glicerol-3-fosfato dependente de NAD, em condições osmóticas normais a baixas permitiu, entre outras coisas, aumentar ainda mais a produção de etanol, reduzir a produção de glicerol e manter a cinética de fermentação adequada. É por isso que a célula hospedeira microbiana recombinante do presente expressa pelo menos uma proteína GDP (que pode ser nativa ou heteróloga à célula hospedeira microbiana).

[0060] Conforme usado no presente documento, a expressão "condições altamente osmóticas" se refere à presença de uma pressão osmótica alta, em geral, causada por um aumento na concentração de soluto no ambiente circundante à célula hospedeira microbiana recombinante. Em algumas modalidades, "condições altamente osmóticas" estão associadas a uma regulação positiva da via HOG, uma concentração de açúcares superior a cerca de 50 g/L e/ou equivalente a pelo menos 1 g/L de um sal (como NaCl), quando a célula hospedeira microbiana recombinante é uma célula hospedeira de levedura. Essa diminuição na atividade de glicerol-3-fosfato dependente de NAD pode ser observada em relação à mesma célula recombinante, em condições osmóticas normais ou baixas, ou em relação a uma célula hospedeira microbiana recombinante, sem a segunda modificação genética. Conforme, também, usado na presente revelação, a expressão "condições osmóticas normais ou baixas" se refere às condições que não estão associadas à pressão osmótica alta.

[0061] A maioria das células de mamíferos expressa duas glicerol-3-fosfato desidrogenases (GPDs) necessárias para a produção de glicerol, e são expressas em resposta aos diferentes sinais celulares: as proteínas GPD1 e GPD2. Ambas as proteínas compartilham 75% de identidade de aminoácidos e, embora catalisem a mesma reação, as diferenças em sua sequência de aminoácidos as tornam enzimas mais eficientes sob as condições ambientais que induzem sua expressão. Sabe-se que a GPD2 não tem capacidade de substituir totalmente a GPD1 na produção de produção de glicerol osmoticamente induzido, o que sugere que essa enzima tem atividade mais baixa que a GPD1 sob estresse osmótico. Conforme mostrado nos Exemplos, abaixo, a substituição da sequência de codificação do gene GPD1 pela sequência de codificação do gene GPD2 permitiu que a célula hospedeira de levedura recombinante diminuísse sua atividade glicerol-3-fosfato (biológica) dependente de NAD durante as condições altamente osmóticas, enquanto mantém sua atividade glicerol-3-fosfato (biológica) dependente de NAD durante as condições osmóticas normais ou baixas. Conforme, também, mostrado nos Exemplos, a modulação da expressão de GPD1 e GPD2 pode prejudicar a taxa de crescimento e a cinética.

[0062] As células hospedeiras microbianas recombinantes da presente revelação podem incluir uma segunda modificação genética para inibir (pelo menos parcial ou totalmente) a expressão da proteína glicerol-3-fosfato atividade 1 (GPD1) dependente de NAD, ou um ortólogo do gene GPD1. A segunda modificação genética pode incluir uma deleção, a deleção ou a substituição de um ou mais de um resíduo (ou resíduos) de ácido nucleico, em um gene (ou ortólogo de gene) que codifica a proteína GPD1 (particularmente na sequência de codificação do gene), o que causaria uma redução na atividade da proteína GPD1 em condições altamente osmóticas. Em uma modalidade, a segunda modificação genética pode incluir a deleção de toda a sequência de codificação de um gene (ou um ortólogo de gene) que codifica a proteína GPD1. Alternativamente, ou em combinação, a célula hospedeira microbiana recombinante pode expressar uma variante ou um fragmento de proteína GPD1 heteróloga com uma atividade reduzida, durante as condições altamente osmóticas, quando comparada à proteína GPD1 nativa.

[0063] A proteína GPD1 é expressa de forma nativa em leveduras, fungos, células de mamíferos e vegetais. Os genes de GPD1 que codificam a proteína GPD1 incluem, mas sem limitação, Saccharomyces cerevisiae, Gene ID: 851539 (apresentado na SEQ ID NO: 51), Schizosaccharomycespombe, Gene ID: 2540547 (apresentado na SEQ ID NO: 52), Schizosaccharomyces pombe, Gene ID: 2540455 (apresentado na SEQ ID NO: 53), Neurospora crassa, Gene ID: 3873099 (apresentado na SEQ ID NO: 54), Candida albicans, Gene ID: 3643924 (apresentado na SEQ ID NO: 55), Scheffersomyces stipitis, Gene ID: 4840320 (apresentado na SEQ ID NO: 56), Spathaspora passalidarum, Gene ID: 18874668 (apresentado na SEQ ID NO: 57), Trichoderma reesei, Gene ID: 18482691 (apresentado na SEQ ID NO: 58), Nectria haematococca, Gene ID: 9668637 (apresentado na SEQ ID NO: 59), Candida dubliniensis, Gene ID: 8046432 (apresentado na SEQ ID NO: 60), Chlamydomonas reinhardtii, Gene ID: 5716580 (apresentado na SEQ ID NO: 61), Brassica napus, Gene ID: 106365675 (apresentado na SEQ ID NO: 62), Chlorella variabilis, Gene ID: 17355036 (apresentado na SEQ ID NO: 63), Brassica napus, Gene ID: 106352802 (apresentado na SEQ ID NO: 64), Mus musculus, Gene ID: 14555 (apresentado na SEQ ID NO: 65), Homo sapiens Gene ID: 2819 (apresentado na SEQ ID NO: 66), Rattus norvegicus Gene ID: 60666 (apresentado na SEQ ID NO: 67), Sus scrofa Gene ID: 100153250 (apresentado na SEQ ID NO: 68), Gallus, Gene ID: 426881 (apresentado na SEQ ID NO: 69), Bos taurus, Gene ID: 525042 (apresentado na SEQ ID NO: 70), Xenopus tropicalis, Gene ID: 448519 (apresentado na SEQ ID NO: 71), Pan troglodytes, Gene ID: 741054 (apresentado na SEQ ID NO: 72), Canis lupus familiaris, Gene ID: 607942 (apresentado na SEQ ID NO: 73), Callorhinchus milii, Gene ID: 103188923 (apresentado na SEQ ID NO: 74), Columba livia, Gene ID: 102088900 (apresentado na SEQ ID NO: 75), Macaca fascicularis, Gene ID: 101865501 (apresentado na SEQ ID NO: 76), Myotis brandtii, Gene ID: 102257341 (apresentado na SEQ ID NO: 77), Heterocephalus glaber, Gene ID: 101702723 (apresentado na SEQ ID NO: 78), Nannospalax galili, Gene ID: 103746543 (apresentado na SEQ ID NO: 79), Mustela putorius furo, Gene ID: 101681348 (apresentado na SEQ ID NO: 80), Callithrix jacchus, Gene ID: 100414900 (apresentado na SEQ ID NO: 81), Labrus bergylta, Gene ID: 109980872 (apresentado na SEQ ID NO: 82), Monopterus albus, Gene ID: 109969143 (apresentado na SEQ ID NO: 83), Castor canadensis, Gene ID: 109695417 (apresentado na SEQ ID NO: 84), Paralichthys olivaceus, Gene ID: 109635348 (apresentado na SEQ ID NO: 85), Bos indicus, Gene ID: 109559120 (apresentado na SEQ ID NO: 86), Hippocampus comes, Gene ID: 109507993 (apresentado na SEQ ID NO: 87), Rhinolophus sinicus, Gene ID: 109443801 (apresentado na SEQ ID NO: 88), Hipposideros armiger, Gene ID: 109393253 (apresentado na SEQ ID NO: 89), Crocodylus porosus, Gene ID: 109324424 (apresentado na SEQ ID NO: 90), Gavialis gangeticus, Gene ID: 109293349 (apresentado na SEQ ID NO: 91), Panthera pardus, Gene ID: 109249099 (apresentado na SEQ ID NO: 92), Cyprinus carpio, Gene ID: 109094445 (apresentado na SEQ ID NO: 93), Scleropages formosus, Gene ID: 108931403 (apresentado na SEQ ID NO: 94), Nanorana parkeri, Gene ID: 108789981 (apresentado na SEQ ID NO: 95), Rhinopithecus bieti, Gene ID: 108543924 (apresentado na SEQ ID NO: 96), Lepidothrix coronata, Gene ID: 108509436 (apresentado na SEQ ID NO: 97), Pygocentrus nattereri, Gene ID: 108444060 (apresentado na SEQ ID NO: 98), Manis javanica, Gene ID: 108406536 (apresentado na SEQ ID NO: 99), Cebus capucinus imitator, Gene ID: 108316082 (apresentado na SEQ ID NO: 100), Ictalurus punctatus, Gene ID: 108255083 (apresentado na SEQ ID NO: 101), Kryptolebias marmoratus, Gene ID: 108231479 (apresentado na SEQ ID NO: 102), Miniopterus natalensis, Gene ID: 107528262 (apresentado na SEQ ID NO: 103), Rousettus aegyptiacus, Gene ID: 107514265 (apresentado na SEQ ID NO: 104), Coturnix japonica, Gene ID: 107325705 (apresentado na SEQ ID NO: 105), Protobothrops mucrosquamatus, Gene ID: 107302714 (apresentado na SEQ ID NO: 106), Parus major, Gene ID: 107215690 (apresentado na SEQ ID NO: 107), Marmota marmota marmota, Gene ID: 107148619 (apresentado na SEQ ID NO: 108), Gekko japonicus, Gene ID: 107122513 (apresentado na SEQ ID NO: 109), Cyprinodon variegatus, Gene ID: 107101128 (apresentado na SEQ ID NO: 110), Acinonyx jubatus, Gene ID: 106969233 (apresentado na SEQ ID NO: 111), Poecilia latipinna, Gene ID: 106959529 (apresentado na SEQ ID NO: 112), Poecilia mexicana, Gene ID: 106929022 (apresentado na SEQ ID NO: 113), Calidris pugnax, Gene ID: 106891167 (apresentado na SEQ ID NO: 114), Sturnus vulgaris, Gene ID: 106863139 (apresentado na SEQ ID NO: 115), Equus asinus, Gene ID: 106845052 (apresentado na SEQ ID NO: 116), Thamnophis sirtalis, Gene ID: 106545289 (apresentado na SEQ ID NO: 117), Apteryx australis mantelli, Gene ID: 106499434 (apresentado na SEQ ID NO: 118), Anser cygnoidesdomesticus, Gene ID: 106047703 (apresentado na SEQ ID NO: 119), Dipodomys ordii, Gene ID: 105987539 (apresentado na SEQ ID NO: 120), Clupea harengus, Gene ID: 105897935 (apresentado na SEQ ID NO: 121), Microcebus murinus, Gene ID: 105869862 (apresentado na SEQ ID NO: 122), Propithecus coquereli, Gene ID: 105818148 (apresentado na SEQ ID NO: 123), Aotus nancymaae, Gene ID: 105709449 (apresentado na SEQ ID NO: 124), Cercocebus atys, Gene ID: 105580359 (apresentado na SEQ ID NO: 125), Mandrillus leucophaeus, Gene ID: 105527974 (apresentado na SEQ ID NO: 126), Colobus angolensis palliatus, Gene ID: 105507602 (apresentado na SEQ ID NO: 127), Macaca nemestrina, Gene ID: 105492851 (apresentado na SEQ ID NO: 128), Aquila chrysaetos canadensis, Gene ID: 105414064 (apresentado na SEQ ID NO: 129), Pteropus vampyrus, Gene ID: 105297559 (apresentado na SEQ ID NO: 130), Camelus dromedarius, Gene ID: 105097186 (apresentado na SEQ ID NO: 131), Camelus bactrianus, Gene ID: 105076223 (apresentado na SEQ ID NO: 132), Esox lucius, Gene ID: 105016698 (apresentado na SEQ ID NO: 133), Bison bison bison, Gene ID: 105001494 (apresentado na SEQ ID NO: 134), Notothenia coriiceps, Gene ID: 104967388 (apresentado na SEQ ID NO: 135), Larimichthyscrocea, Gene ID: 104928374 (apresentado na SEQ ID NO: 136), Fukomys damarensis, Gene ID: 04861981 (apresentado na SEQ ID NO: 137), Haliaeetus leucocephalus, Gene ID: 104831135 (apresentado na SEQ ID NO: 138), Corvus cornix cornix, Gene ID: 104683744 (apresentado na SEQ ID NO: 139), Rhinopithecus roxellana, Gene ID: 104679694 (apresentado na SEQ ID NO: 140), Balearica regulorum gibbericeps, Gene ID: 104630128 (apresentado na SEQ ID NO: 141), Tinamus guttatus, Gene ID: 104575187 (apresentado na SEQ ID NO: 142), Mesitornis unicolor, Gene ID: 104539793 (apresentado na SEQ ID NO: 143), Antrostomus carolinensis, Gene ID: 104532747 (apresentado na SEQ ID NO: 144), Buceros rhinoceros silvestris, Gene ID: 104501599 (apresentado na SEQ ID NO: 145), Chaetura pelagica, Gene ID: 104385595 (apresentado na SEQ ID NO: 146), Leptosomus discolor, Gene ID: 104353902 (apresentado na SEQ ID NO: 147), Opisthocomus hoazin, Gene ID: 104326607 (apresentado na SEQ ID NO: 148), Charadrius vociferus, Gene ID: 104284804 (apresentado na SEQ ID NO: 149), Struthio camelusaustralis, Gene ID: 104144034 (apresentado na SEQ ID NO: 150), Egretta garzetta, Gene ID: 104132778 (apresentado na SEQ ID NO: 151), Cuculus canorus, Gene ID: 104055090 (apresentado na SEQ ID NO: 152), Nipponia nippon, Gene ID: 104011969 (apresentado na SEQ ID NO: 153), Pygoscelis adeliae, Gene ID: 103914601 (apresentado na SEQ ID NO: 154), Aptenodytes forsteri, Gene ID: 103894920 (apresentado na SEQ ID NO: 155), Serinus canaria, Gene ID: 103823858 (apresentado na SEQ ID NO: 156), Manacus vitellinus, Gene ID: 103760593 (apresentado na SEQ ID NO: 157), Ursus maritimus, Gene ID: 103675473 (apresentado na SEQ ID NO: 158), Corvus brachyrhynchos, Gene ID: 103613218 (apresentado na SEQ ID NO: 159), Galeopterus variegatus, Gene ID: 103598969 (apresentado na SEQ ID NO: 160), Equus przewalskii, Gene ID: 103546083 (apresentado na SEQ ID NO: 161), Calypte anna, Gene ID: 103536440 (apresentado na SEQ ID NO: 162), Poecilia reticulata, Gene ID: 103464660 (apresentado na SEQ ID NO: 163), Cynoglossus semilaevis, Gene ID: 103386748 (apresentado na SEQ ID NO: 164), Stegastes partitus, Gene ID: 103355454 (apresentado na SEQ ID NO: 165), Eptesicus fuscus, Gene ID: 103285288 (apresentado na SEQ ID NO: 166), Chlorocebus sabaeus, Gene ID: 103238296 (apresentado na SEQ ID NO: 167), Orycteropus afer afer, Gene ID: 103194426 (apresentado na SEQ ID NO: 168), Poecilia formosa, Gene ID: 103134553 (apresentado na SEQ ID NO: 169), Erinaceus europaeus, Gene ID: 103118279 (apresentado na SEQ ID NO: 170), Lipotes vexillifer, Gene ID: 103087725 (apresentado na SEQ ID NO: 171), Python bivittatus, Gene ID: 103049416 (apresentado na SEQ ID NO: 172), Astyanax mexicanus, Gene ID: 103021315 (apresentado na SEQ ID NO: 173), Balaenoptera acutorostrata scammoni, Gene ID: 103006680 (apresentado na SEQ ID NO: 174), Physeter catodon, Gene ID: 102996836 (apresentado na SEQ ID NO: 175), Panthera tigris altaica, Gene ID: 102961238 (apresentado na SEQ ID NO: 176), Chelonia mydas, Gene ID: 102939076 (apresentado na SEQ ID NO: 177), Peromyscus maniculatus bairdii, Gene ID: 102922332 (apresentado na SEQ ID NO: 178), Pteropus alecto, Gene ID: 102880604 (apresentado na SEQ ID NO: 179), Elephantulus edwardii, Gene ID: 102844587 (apresentado na SEQ ID NO: 180), Chrysochloris asiatica, Gene ID: 102825902 (apresentado na SEQ ID NO: 181), Myotis davidii, Gene ID: 102754955 (apresentado na SEQ ID NO: 182), Leptonychotes weddellii, Gene ID: 102730427 (apresentado na SEQ ID NO: 183), Lepisosteus oculatus, Gene ID: 102692130 (apresentado na SEQ ID NO: 184), Alligator mississippiensis, Gene ID: 102576126 (apresentado na SEQ ID NO: 185), Vicugna pacos, Gene ID: 102542115 (apresentado na SEQ ID NO: 186), Camelus ferus, Gene ID: 102507052 (apresentado na SEQ ID NO: 187), Tupaia chinensis, Gene ID: 102482961 (apresentado na SEQ ID NO: 188), Pelodiscus sinensis, Gene ID: 102446147 (apresentado na SEQ ID NO: 189), Myotis lucifugus, Gene ID: 102420239 (apresentado na SEQ ID NO: 190), Bubalus bubalis, Gene ID: 102395827 (apresentado na SEQ ID NO: 191), Alligator sinensis, Gene ID: 102383307 (apresentado na SEQ ID NO: 192), Latimeria chalumnae, Gene ID: 102345318 (apresentado na SEQ ID NO: 193), Pantholops hodgsonii, Gene ID: 102326635 (apresentado na SEQ ID NO: 194), Haplochromis burtoni, Gene ID: 102295539 (apresentado na SEQ ID NO: 195), Bos mutus, Gene ID: 102267392 (apresentado na SEQ ID NO: 196), Xiphophorus maculatus, Gene ID: 102228568 (apresentado na SEQ ID NO: 197), Pundamilia nyererei, Gene ID: 102192578 (apresentado na SEQ ID NO: 198), Capra hircus, Gene ID: 102171407 (apresentado na SEQ ID NO: 199), Pseudopodoces humilis, Gene ID: 102106269 (apresentado na SEQ ID NO: 200), Zonotrichia albicollis, Gene ID: 102070144 (apresentado na SEQ ID NO: 201), Falco cherrug, Gene ID: 102047785 (apresentado na SEQ ID NO: 202), Geospiza fortis, Gene ID: 102037409 (apresentado na SEQ ID NO: 203), Chinchilla lanigera, Gene ID: 102014610 (apresentado na SEQ ID NO: 204), Microtus ochrogaster, Gene ID: 101990242 (apresentado na SEQ ID NO: 205), Ictidomys tridecemlineatus, Gene ID: 101955193 (apresentado na SEQ ID NO: 206), Chrysemys picta, Gene ID: 101939497 (apresentado na SEQ ID NO: 207), Falco peregrinus, Gene ID: 101911770 (apresentado na SEQ ID NO: 208), Mesocricetus auratus, Gene ID: 101824509 (apresentado na SEQ ID NO: 209), Ficedula albicollis, Gene ID: 101814000 (apresentado na SEQ ID NO: 210), Anas platyrhynchos, Gene ID: 101789855 (apresentado na SEQ ID NO: 211), Echinops telfairi, Gene ID: 101641551 (apresentado na SEQ ID NO: 212), Condylura cristata, Gene ID: 101622847 (apresentado na SEQ ID NO: 213), Jaculus jaculus, Gene ID: 101609219 (apresentado na SEQ ID NO: 214), Octodon degus, Gene ID: 101563150 (apresentado na SEQ ID NO: 215), Sorex araneus, Gene ID: 101556310 (apresentado na SEQ ID NO: 216), Ochotona princeps, Gene ID: 101532015 (apresentado na SEQ ID NO: 217), Maylandia zebra, Gene ID: 101478751 (apresentado na SEQ ID NO: 218), Dasypus novemcinctus, Gene ID: 101446993 (apresentado na SEQ ID NO: 219), Odobenus rosmarus divergens, Gene ID: 101385499 (apresentado na SEQ ID NO: 220), Tursiops truncatus, Gene ID: 101318662 (apresentado na SEQ ID NO: 221), Orcinus orca, Gene ID: 101284095 (apresentado na SEQ ID NO: 222), Oryzias latipes, Gene ID: 101154943 (apresentado na SEQ ID NO: 223), Gorilla gorilla, Gene ID: 101131184 (apresentado na SEQ ID NO: 224), Ovis aries, Gene ID: 101119894 (apresentado na SEQ ID NO: 225), Felis catus, Gene ID: 101086577 (apresentado na SEQ ID NO: 226), Takifugu rubripes, Gene ID: 101079539 (apresentado na SEQ ID NO: 227), Saimiri boliviensis, Gene ID: 101030263 (apresentado na SEQ ID NO: 228), Papio anubis, Gene ID: 101004942 (apresentado na SEQ ID NO: 229), Pan paniscus, Gene ID: 100981359 (apresentado na SEQ ID NO: 230), Otolemur garnettii, Gene ID: 100946205 (apresentado na SEQ ID NO: 231), Sarcophilus harrisii, Gene ID: 100928054 (apresentado na SEQ ID NO: 232), Cricetulus griseus, Gene ID: 100772179 (apresentado na SEQ ID NO: 233), Cavia porcellus, Gene ID: 100720368 (apresentado na SEQ ID NO: 234), Oreochromis niloticus, Gene ID: 100712149 (apresentado na SEQ ID NO: 235), Loxodonta africana, Gene ID: 100660074 (apresentado na SEQ ID NO: 236), Nomascus leucogenys, Gene ID: 100594138 (apresentado na SEQ ID NO: 237), Anolis carolinensis, Gene ID: 100552972 (apresentado na SEQ ID NO: 238), Meleagris gallopavo, Gene ID: 100542199 (apresentado na SEQ ID NO: 239), Ailuropoda melanoleuca, Gene ID: 100473892 (apresentado na SEQ ID NO: 240), Oryctolagus cuniculus, Gene ID: 100339469 (apresentado na SEQ ID NO: 241), Taeniopygia guttata, Gene ID: 100225600 (apresentado na SEQ ID NO: 242), Pongo abelii, Gene ID: 100172201 (apresentado na SEQ ID NO: 243), Ornithorhynchus anatinus, Gene ID: 100085954 (apresentado na SEQ ID NO: 244), Equus caballus, Gene ID: 100052204 (apresentado na SEQ ID NO: 245), Mus musculus, Gene ID: 100198 (apresentado na SEQ ID NO: 246), Xenopus laevis, Gene ID: 399227 (apresentado na SEQ ID NO: 247), Danio rerio, Gene ID: 325181 (apresentado na SEQ ID NO: 248), Danio rerio, Gene ID: 406615 (apresentado na SEQ ID NO: 249), Melopsittacus undulatus, Gene ID: 101872435 (apresentado na SEQ ID NO: 250), Ceratotherium simum simum, Gene ID: 101408813 (apresentado na SEQ ID NO: 251), Trichechus manatus latirostris, Gene ID: 101359849 (apresentado na SEQ ID NO: 252) e Takifugu rubripes, Gene ID: 101071719 (apresentado na SEQ ID NO: 253)). Na presente revelação, a célula microbiana recombinante pode reduzir ou inibir a expressão de um gene GDP1 (ou um ortólogo do gene GPD1) que codifica uma proteína, uma variante ou um fragmento de GDP1.

[0064] Alternativamente, ou em combinação, a segunda modificação genética pode incluir a modificação da célula hospedeira recombinante para expressar, opcionalmente, em condições altamente osmóticas, uma proteína glicerol- 3-fosfato desidrogenase 2 (GPD2) dependente de NAD. Isso pode ser feito, por exemplo, por meio de expressão de um gene nativo e/ou heterólogo (ou ortólogo de gene) que codifica a proteína GPD2, com uso de um promotor osmótico. Em tal modalidade, é importante que pelo menos uma única cópia nativa do gene (ou o ortólogo do gene) que codifica a proteína GPD2 esteja sob o controle do promotor GPD2 nativo.

[0065] No contexto da presente revelação, um "promotor osmótico" pode ser um promotor (ou uma combinação de promotores) que permite a expressão (ou, em algumas modalidades, a superexpressão) de um gene, quando a célula hospedeira microbiana recombinante é colocada em altas condições osmóticas, mas que refreia a expressão (ou, em algumas modalidades, a superexpressão) de um gene, quando a célula hospedeira microbiana recombinante é colocada em condições osmóticas normais ou baixas. Nessa modalidade, o promotor osmótico pode ser um promotor passível de indução. Os promotores osmóticos são, em geral, associados a genes na via HOG1, e os promotores que controlam a expressão de genes que são regulados positivamente na via HOG1 podem ser utilizados na célula hospedeira microbiana recombinante da presente revelação. As enzimas na via HOG1, cuja expressão é suprarregulada em condições altamente osmóticas, incluem, mas sem limitação, um gene de glicerol-3-fosfato desidrogenase 1 dependente de NAD, um gene de di- hidroxiacetona quinase e um gene de trealose-fosfatase. Como tal, no contexto da presente revelação, o promotor osmótico pode ser um promotor (ou uma combinação de promotores) de um gene de glicerol-3-fosfato desidrogenase 1 dependente de NAD, um gene de di-hidroxiacetona quinase e/ou uma trealose-fosfatase gene. Em Saccharomyces cerevisiae, as enzimas na via HOG1, cuja expressão é regulada positivamente na presença de condições altamente osmóticas, incluem, mas sem limitação, um gene GPD1, um gene DAK1 e um gene TPS2. Como tal, no contexto da presente revelação, o promotor osmótico pode ser um promotor (ou uma combinação de promotores) de um gene GPD1 (conhecido como promotor GPD1 ou gpd1p), um gene DAK1 (conhecido como promotor DAK1 ou dak1p) e/ou um gene TPS2 (conhecido como o promotor TPS2 ou tps2p).

[0066] Um "promotor osmótico" também pode ser um promotor constitutivo que permite a expressão de sequências de codificação associadas de forma operacional a elas, durante condições osmóticas. Em algumas modalidades, é preferencial que o promotor constitutivo seja um promotor constitutivo "baixo". Os promotores constitutivos "baixos" exemplificativos podem ser associados à expressão de genes de manutenção e, por exemplo, podem incluir o promotor do gene CYC1. Em algumas modalidades, o promotor osmótico não é um promotor constitutivo alto.

[0067] Conforme indicado acima, a célula hospedeira microbiana recombinante expressa pelo menos uma cópia de uma proteína GPD nativa ou heteróloga. Em uma modalidade, a proteína GPD nativa ou heteróloga é uma proteína GPD2 nativa ou heteróloga. Na modalidade em que a pelo menos uma proteína GPD é a proteína GPD2, a célula hospedeira microbiana recombinante pode, em algumas modalidades, expressar uma, duas ou mais cópias de um gene heterólogo que codifica para a proteína GPD2, ou um ortólogo GPD2 correspondente. Quando uma ou mais cópias do gene GDP2 ou do ortólogo do gene GPD2 estão presentes na célula hospedeira microbiana recombinante, ela pode ser expressa sob o controle de um ou mais promotores osmóticos. Ainda, em uma modalidade adicional, o gene heterólogo GPD2 ou o ortólogo do gene GPD2 da célula hospedeira microbiana recombinante é expresso sob o controle do promotor GPD1, por exemplo, por meio de substituição de uma ou de ambas as sequências de codificação do gene GPD1, pela sequência de codificação do gene GPD2 (ou do ortólogo do gene GPD2).

[0068] A proteína GPD2 é expressa em bactérias, leveduras, fungos, células de mamíferos e vegetais. Os genes GPD2 que codificam a proteína GPD2 incluem, entre outros, Mus musculus, Gene ID: 14571 (apresentado na SEQ ID NO: 254), Homo sapiens, Gene ID: 2820 (apresentado na SEQ ID NO: 255), Saccharomyces cerevisiae, Gene ID: 854095 (apresentado na SEQ ID NO: 256), Rattus norvegicus, Gene ID: 25062 (apresentado na SEQ ID NO: 257), Schizosaccharomyces pombe, Gene ID: 2541502 (apresentado na SEQ ID NO: 258), Mus musculus, Gene ID: 14380 (apresentado na SEQ ID NO: 259), Danio rerio, Gene ID: 751628 (apresentado na SEQ ID NO: 260), Caenorhabditis elegans, Gene ID: 3565504 (apresentado na SEQ ID NO: 261), Mesocricetus auratus, Gene ID: 101825992 (apresentado na SEQ ID NO: 262), Xenopus tropicalis, Gene ID: 779615 (apresentado na SEQ ID NO: 263), Macaca mulatta, Gene ID: 697192 (apresentado na SEQ ID NO: 264), Bos taurus, Gene ID: 504948 (apresentado na SEQ ID NO: 265), Canis lupus familiaris, Gene ID: 478755 (apresentado na SEQ ID NO: 266), Cavia porcellus, Gene ID: 100721200 (apresentado na SEQ ID NO: 267), Gallus gallus, Gene ID: 424321 (apresentado na SEQ ID NO: 268), Pan troglodytes, Gene ID: 459670 (apresentado na SEQ ID NO: 269), Oryctolagus cuniculus, Gene ID: 100101571 (apresentado na SEQ ID NO: 270), Candida albicans, Gene ID: 3644563 (apresentado na SEQ ID NO: 271), Xenopus laevis, Gene ID: 444438 (apresentado na SEQ ID NO: 272), Macaca fascicularis, Gene ID: 102127260 (apresentado na SEQ ID NO: 273), Ailuropoda melanoleuca, Gene ID: 100482626 (apresentado na SEQ ID NO: 274), Cricetulus griseus, Gene ID: 100766128 (apresentado na SEQ ID NO: 275), Heterocephalus glaber, Gene ID: 101715967 (apresentado na SEQ ID NO: 276), Scheffersomyces stipitis, Gene ID:4838862 (apresentado na SEQ ID NO: 277), Ictalurus punctatus, Gene ID: 108273160 (apresentado na SEQ ID NO: 278), Mustela putoriusfuro, Gene ID: 101681209 (apresentado na SEQ ID NO: 279), Nannospalax galili, Gene ID: 103741048 (apresentado na SEQ ID NO: 280), Callithrix jacchus, Gene ID: 100409379 (apresentado na SEQ ID NO: 281), Lates calcarifer, Gene ID: 108873068 (apresentado na SEQ ID NO: 282), Nothobranchius furzeri, Gene ID: 07384696 (apresentado na SEQ ID NO: 283), Acanthisitta chloris, Gene ID: 103808746 (apresentado na SEQ ID NO: 284), Acinonyx jubatus, Gene ID: 106978985 (apresentado na SEQ ID NO: 285), Alligator mississippiensis, Gene ID: 102562563 (apresentado na SEQ ID NO: 286), Alligator sinensis, Gene ID: 102380394 (apresentado na SEQ ID NO: 287), Anas platyrhynchos, Anolis carolinensis, Gene ID: 100551888 (apresentado na SEQ ID NO: 288), Anser cygnoides domesticus, Gene ID: 106043902 (apresentado na SEQ ID NO: 289), Aotus nancymaae, Gene ID: 105719012 (apresentado na SEQ ID NO: 290), Apaloderma vittatum, Gene ID: 104281080 (apresentado na SEQ ID NO: 291), Aptenodytes forsteri, Gene ID: 103893867 (apresentado na SEQ ID NO: 292), Apteryx australis mantelli, Gene ID: 106486554 (apresentado na SEQ ID NO: 293), Aquila chrysaetos canadensis, Gene ID: 105412526 (apresentado na SEQ ID NO: 294), Astyanax mexicanus, Gene ID: 103029081 (apresentado na SEQ ID NO: 295), Austrofundulus limnaeus, Gene ID: 106535816 (apresentado na SEQ ID NO: 296), Balaenoptera acutorostrata scammoni, Gene ID: 103019768 (apresentado na SEQ ID NO: 297), Balearica regulorum gibbericeps, Bison bison bison, Gene ID: 104988636 (apresentado na SEQ ID NO: 298), Bos indicus, Gene ID: 109567519 (apresentado na SEQ ID NO: 299), Bos mutus, Gene ID: 102277350 (apresentado na SEQ ID NO: 300), Bubalus bubalis, Gene ID: 102404879 (apresentado na SEQ ID NO: 301), Buceros rhinoceros silvestris, Gene ID: 104497001 (apresentado na SEQ ID NO: 302), Calidris pugnax, Gene ID: 106902763 (apresentado na SEQ ID NO: 303), Callorhinchus milii, Gene ID: 103176409 (apresentado na SEQ ID NO: 304), Calypte anna, Gene ID: 103535222 (apresentado na SEQ ID NO: 305), Camelus bactrianus, Gene ID: 105081921 (apresentado na SEQ ID NO: 306), Camelus dromedarius, Gene ID: 105093713 (apresentado na SEQ ID NO: 307), Camelus ferus, Gene ID: 102519983 (apresentado na SEQ ID NO: 308), Capra hircus, Gene ID: 102176370 (apresentado na SEQ ID NO: 309), Cariama cristata, Gene ID: 104154548 (apresentado na SEQ ID NO: 310), Castor canadensis, Gene ID: 109700730 (apresentado na SEQ ID NO: 311), Cebus capucinusimitator, Gene ID: 108316996 (apresentado na SEQ ID NO: 312), Cercocebus atys, Gene ID: 105576003 (apresentado na SEQ ID NO: 313), Chaetura pelagica, Gene ID: 104391744 (apresentado na SEQ ID NO: 314), Charadrius vociferus, Gene ID: 104286830 (apresentado na SEQ ID NO: 315), Chelonia mydas, Gene ID: 102930483 (apresentado na SEQ ID NO: 316), Chinchilla lanigera, Gene ID: 102017931 (apresentado na SEQ ID NO: 317), Chlamydotis macqueenii, Gene ID: 104476789 (apresentado na SEQ ID NO: 318), Chlorocebus sabaeus, Gene ID: 103217126 (apresentado na SEQ ID NO: 319), Chrysemys picta, Gene ID: 101939831 (apresentado na SEQ ID NO: 320), Chrysochloris asiatica, Gene ID: 102831540 (apresentado na SEQ ID NO: 321), Clupea harengus, Gene ID: 105902648 (apresentado na SEQ ID NO: 322), Colius striatus, Gene ID: 104549356 (apresentado na SEQ ID NO: 323), Colobus angolensispalliatus, Gene ID: 105516852 (apresentado na SEQ ID NO: 324), Columba livia, Gene ID: 102090265 (apresentado na SEQ ID NO: 325), Condylura cristata, Gene ID: 101619970 (apresentado na SEQ ID NO: 326), Corvus brachyrhynchos, Coturnix japonica, Gene ID: 107316969 (apresentado na SEQ ID NO: 327), Crocodylus porosus, Gene ID: 109322895 (apresentado na SEQ ID NO: 328), Cuculus canorus, Gene ID: 104056187 (apresentado na SEQ ID NO: 329), Cynoglossus semilaevis, Gene ID: 103389593 (apresentado na SEQ ID NO: 330), Dasypus novemcinctus, Gene ID: 101428842 (apresentado na SEQ ID NO: 331), Dipodomys ordii, Gene ID: 105996090 (apresentado na SEQ ID NO: 332), Echinops telfairi, Gene ID: 101656272 (apresentado na SEQ ID NO: 333), Egretta garzetta, Gene ID: 104135263 (apresentado na SEQ ID NO: 334), Elephantulus edwardii, Gene ID: 102858276 (apresentado na SEQ ID NO: 335), Eptesicus fuscus, Gene ID: 103283396 (apresentado na SEQ ID NO: 336), Equus asinus, Gene ID: 106841969 (apresentado na SEQ ID NO: 337), Equus caballus, Gene ID: 100050747 (apresentado na SEQ ID NO: 338), Equus przewalskii, Gene ID: 103558835 (apresentado na SEQ ID NO: 339), Erinaceus europaeus, Gene ID: 103114599 (apresentado na SEQ ID NO: 340), Eurypyga helias, Gene ID: 104502666 (apresentado na SEQ ID NO: 341), Falco cherrug, Gene ID: 102054715 (apresentado na SEQ ID NO: 342), Falco peregrinus, Gene ID: 101912742 (apresentado na SEQ ID NO: 343), Felis catus, Gene ID: 101089953 (apresentado na SEQ ID NO: 344), Ficedula albicollis, Gene ID: 101816901 (apresentado na SEQ ID NO: 345), Fukomys damarensis, Gene ID: 104850054 (apresentado na SEQ ID NO: 346), Fundulus heteroclitus, Gene ID: 105936523 (apresentado na SEQ ID NO: 347), Galeopterus variegatus, Gene ID: 103586331 (apresentado na SEQ ID NO: 348), Gavia stellata, Gene ID: 104250365 (apresentado na SEQ ID NO: 349), Gavialis gangeticus, Gene ID: 109301301 (apresentado na SEQ ID NO: 350), Gekko japonicus, Gene ID: 107110762 (apresentado na SEQ ID NO: 351), Geospiza fortis, Gene ID: 102042095 (apresentado na SEQ ID NO: 352), Gorilla gorilla, Gene ID: 101150526 (apresentado na SEQ ID NO: 353), Haliaeetus albicilla, Gene ID: 104323154 (apresentado na SEQ ID NO: 354), Haliaeetus leucocephalus, Gene ID: 104829038 (apresentado na SEQ ID NO: 355), Haplochromis burtoni, Gene ID: 102309478 (apresentado na SEQ ID NO: 356), Hippocampus comes, Gene ID: 109528375 (apresentado na SEQ ID NO: 357), Hipposideros armiger, Gene ID: 109379867 (apresentado na SEQ ID NO: 358), Ictidomys tridecemlineatus, Gene ID: 101965668 (apresentado na SEQ ID NO: 359), Jaculus jaculus, Gene ID: 101616184 (apresentado na SEQ ID NO: 360), Kryptolebias marmoratus, Gene ID: 108251075 (apresentado na SEQ ID NO: 361), Labrus bergylta, Gene ID: 109984158 (apresentado na SEQ ID NO: 362), Larimichthys crocea, Gene ID: 104929094 (apresentado na SEQ ID NO: 363), Latimeria chalumnae, Gene ID: 102361446 (apresentado na SEQ ID NO: 364), Lepidothrix coronata, Gene ID: 108501660 (apresentado na SEQ ID NO: 365), Lepisosteus oculatus, Gene ID: 102691231 (apresentado na SEQ ID NO: 366), Leptonychotes weddellii, Gene ID: 102739068 (apresentado na SEQ ID NO: 367), Leptosomus discolor, Gene ID: 104340644 (apresentado na SEQ ID NO: 368), Lipotes vexillifer, Gene ID: 103074004 (apresentado na SEQ ID NO: 369), Loxodonta africana, Gene ID: 100654953 (apresentado na SEQ ID NO: 370), Macaca nemestrina, Gene ID: 105493221 (apresentado na SEQ ID NO: 371), Manacus vitellinus, Gene ID: 103757091 (apresentado na SEQ ID NO: 372), Mandrillus leucophaeus, Gene ID: 105548063 (apresentado na SEQ ID NO: 373), Manis javanica, Gene ID: 108392571 (apresentado na SEQ ID NO: 374), Marmota marmota marmota, Gene ID: 107136866 (apresentado na SEQ ID NO: 375), Maylandia zebra, Gene ID: 101487556 (apresentado na SEQ ID NO: 376), Mesitornis unicolor, Gene ID: 104545943 (apresentado na SEQ ID NO: 377), Microcebus murinus, Gene ID: 105859136 (apresentado na SEQ ID NO: 378), Microtus ochrogaster, Gene ID: 101999389 (apresentado na SEQ ID NO: 379), Miniopterus natalensis, Gene ID: 107525674 (apresentado na SEQ ID NO: 380), Monodelphis domestica, Gene ID: 100014779 (apresentado na SEQ ID NO: 381), Monopterus albus, Gene ID: 109957085 (apresentado na SEQ ID NO: 382), Myotis brandtii, Gene ID: 102239648 (apresentado na SEQ ID NO: 383), Myotis davidii, Gene ID: 102770109 (apresentado na SEQ ID NO: 384), Myotis lucifugus, Gene ID: 102438522 (apresentado na SEQ ID NO: 385), Nanorana parkeri, Gene ID: 108784354 (apresentado na SEQ ID NO: 386), Nestor notabilis, Gene ID: 104399051 (apresentado na SEQ ID NO: 387), Nipponia nippon, Gene ID: 104012349 (apresentado na SEQ ID NO: 388), Nomascus leucogenys, Gene ID: 100590527 (apresentado na SEQ ID NO: 389), Notothenia coriiceps, Gene ID: 104964156 (apresentado na SEQ ID NO: 390), Ochotona princeps, Gene ID: 101530736 (apresentado na SEQ ID NO: 391), Octodon degus, Gene ID: 101591628 (apresentado na SEQ ID NO: 392), Odobenus rosmarus divergens, Gene ID: 101385453 (apresentado na SEQ ID NO: 393), Oncorhynchus kisutch, Gene ID: 109870627 (apresentado na SEQ ID NO: 394), Opisthocomus hoazin, Gene ID: 104338567 (apresentado na SEQ ID NO: 395), Orcinus orca, Gene ID: 101287409 (apresentado na SEQ ID NO: 396), Oreochromis niloticus, Gene ID: 100694147 (apresentado na SEQ ID NO: 397), Ornithorhynchus anatinus, Gene ID: 100081433 (apresentado na SEQ ID NO: 398), Orycteropus afer afer, Gene ID: 103197834 (apresentado na SEQ ID NO: 399), Oryzias latipes, Gene ID: 101167020 (apresentado na SEQ ID NO: 400), Otolemur garnettii, Gene ID: 100966064 (apresentado na SEQ ID NO: 401), Ovis aries, Gene ID: 443090 (apresentado na SEQ ID NO: 402), Pan paniscus, Gene ID: 100970779 (apresentado na SEQ ID NO: 403), Panthera pardus, Gene ID: 109271431 (apresentado na SEQ ID NO: 404), Panthera tigris altaica, Gene ID: 102957949 (apresentado na SEQ ID NO: 405), Pantholops hodgsonii, Gene ID: 102323478 (apresentado na SEQ ID NO: 406), Papio anubis, Gene ID: 101002517 (apresentado na SEQ ID NO: 407), Paralichthys olivaceus, Gene ID: 109631046 (apresentado na SEQ ID NO: 408), Pelodiscus sinensis, Gene ID: 102454304 (apresentado na SEQ ID NO: 409), Peromyscus maniculatusbairdii, Gene ID: 102924185 (apresentado na SEQ ID NO: 410), Phaethon lepturus, Gene ID: 104624271 (apresentado na SEQ ID NO: 411), Phalacrocorax carbo, Gene ID: 104049388 (apresentado na SEQ ID NO: 412), Physeter catodon, Gene ID: 102978831 (apresentado na SEQ ID NO: 413), Picoides pubescens, Gene ID: 104296936 (apresentado na SEQ ID NO: 414), Poecilia latipinna, Gene ID: 106958025 (apresentado na SEQ ID NO: 415), Poecilia mexicana, Gene ID: 106920534 (apresentado na SEQ ID NO: 416), Poecilia reticulata, Gene ID: 103473778 (apresentado na SEQ ID NO: 417), Pongo abelii, Gene ID: 100452414 (apresentado na SEQ ID NO: 418), Propithecus coquereli, Gene ID: 105807399 (apresentado na SEQ ID NO: 419), Protobothrops mucrosquamatus, Gene ID: 107289584 (apresentado na SEQ ID NO: 420), Pseudopodoces humilis, Gene ID: 102109711 (apresentado na SEQ ID NO: 421), Pterocles gutturalis, Gene ID: 104461236 (apresentado na SEQ ID NO: 422), Pteropus alecto, Gene ID: 102879110 (apresentado na SEQ ID NO: 423), Pteropus vampyrus, Gene ID: 105291402 (apresentado na SEQ ID NO: 424), Pundamilia nyererei, Gene ID: 102200268 (apresentado na SEQ ID NO: 425), Pygocentrus nattereri, Gene ID: 108411786 (apresentado na SEQ ID NO: 426), Pygoscelis adeliae, Gene ID: 103925329 (apresentado na SEQ ID NO: 427), Python bivittatus, Gene ID: 103059167 (apresentado na SEQ ID NO: 428), Rhincodon typus, Gene ID: 109920450 (apresentado na SEQ ID NO: 429), Rhinolophus sinicus, Gene ID: 109445137 (apresentado na SEQ ID NO: 430), Rhinopithecus bieti, Gene ID: 108538766 (apresentado na SEQ ID NO: 431), Rhinopithecus roxellana, Gene ID: 104654108 (apresentado na SEQ ID NO: 432), Rousettus aegyptiacus, Gene ID: 107513424 (apresentado na SEQ ID NO: 433), Saimiri boliviensis, Gene ID: 101027702 (apresentado na SEQ ID NO: 434), Salmo salar, Gene ID: 106581822 (apresentado na SEQ ID NO: 435), Sarcophilus harrisii, Gene ID: 100927498 (apresentado na SEQ ID NO: 436), Scleropages formosus, Gene ID: 108927961 (apresentado na SEQ ID NO: 437), Serinus canaria, Gene ID: 103814246 (apresentado na SEQ ID NO: 438), Sinocyclocheilus grahami, Gene ID: 107555436 (apresentado na SEQ ID NO: 439), Sorex araneus, Gene ID: 101543025 (apresentado na SEQ ID NO: 440), Stegastes partitus, Gene ID: 103360018 (apresentado na SEQ ID NO: 441), Struthio camelusaustralis, Gene ID: 104138752 (apresentado na SEQ ID NO: 442), Sturnus vulgaris, Gene ID: 106861926 (apresentado na SEQ ID NO: 443), Sugiyamaella lignohabitans, Gene ID: 30033324 (apresentado na SEQ ID NO: 444), Sus scrofa, Gene ID: 397348 (apresentado na SEQ ID NO: 445), Taeniopygia guttata, Gene ID: 100222867 (apresentado na SEQ ID NO: 446), Takifugu rubripes, Gene ID: 101062218 (apresentado na SEQ ID NO: 447), Tarsius syrichta, Gene ID: 103254049 (apresentado na SEQ ID NO: 448), Tauraco erythrolophus, Gene ID: 104378162 (apresentado na SEQ ID NO: 449), Thamnophis sirtalis, Gene ID: 106538827 (apresentado na SEQ ID NO: 450), Tinamus guttatus, Gene ID: 104572349 (apresentado na SEQ ID NO: 451), Tupaia chinensis, Gene ID: 102471148 (apresentado na SEQ ID NO: 452), Tursiops truncatus, Gene ID: 101330605 (apresentado na SEQ ID NO: 453), Ursus maritimus, Gene ID: 103659477 (apresentado na SEQ ID NO: 454), Vicugna pacos, Gene ID: 102533941 (apresentado na SEQ ID NO: 455), Xiphophorus maculatus, Gene ID: 102225536 (apresentado na SEQ ID NO: 456), Zonotrichia albicollis, Gene ID: 102073261 (apresentado na SEQ ID NO: 457), Ciona intestinalis, Gene ID: 100183886 (apresentado na SEQ ID NO: 458), Meleagris gallopavo, Gene ID: 100546408 (apresentado na SEQ ID NO: 459), Trichechus manatus latirostris, Gene ID: 101355771 (apresentado na SEQ ID NO: 460), Ceratotherium simum simum, Gene ID: 101400784 (apresentado na SEQ ID NO: 461), Melopsittacus undulatus, Gene ID: 101871704 (apresentado na SEQ ID NO: 462), Esox lucius, Gene ID: 10502249 (apresentado na SEQ ID NO: 463) e Pygocentrus nattereri, Gene ID: 108411786 (apresentado na SEQ ID NO: 464). Em uma modalidade, a proteína GPD2 é codificada por Saccharomyces cerevisiae, Gene ID: 854095.

[0069] A proteína GPD2 heteróloga pode ser codificada por um gene GPD2 ou um ortólogo do gene GPD2, conforme definido no presente documento. A proteína GPD2 heteróloga também pode ser uma variante da proteína GPD2 e/ou um fragmento da proteína GPD2. Além disso, quando mais de uma cópia do gene heterólogo da GPD2 ou do ortólogo do gene é incluída na célula microbiana recombinante, a pluralidade de moléculas de ácido nucleico heterólogo que codificam a proteína GPD2 pode ser igual ou diferente, integrada ao mesmo, ou em diferentes sítios de integração.

MODIFICAÇÕES E COMBINAÇÕES ADICIONAIS

[0070] A célula hospedeira microbiana recombinante da presente revelação não precisa ter modificações genéticas adicionais, além daquelas feitas com o objetivo de aumentar a atividade do funcionamento da proteína para importar glicerol, durante as condições glicolíticas, e para diminuir a atividade do glicerol-3-fosfato desidrogenase dependente de NAD+, durante condições osmóticas elevadas. No entanto, em algumas modalidades, a célula hospedeira microbiana recombinante pode incluir uma ou mais modificações genéticas adicionais que codificam uma enzima, pode ser co-cultivada com células hospedeiras recombinantes adicionais, o que inclui modificações genéticas adicionais que codificam enzimas, ou pode ser usada com enzimas heterólogas (purificadas) descritas no presente documento.

[0071] Por exemplo, a enzima adicional pode permitir a produção de uma glucoamilase heteróloga. Muitos micróbios produzem uma amilase para degradar amidos extracelulares. Além de clivar as últimas ligações α(1-4) glicosídicas na extremidade não redutora de amilose e amilopectina, que produzi glicose, a Y-amilase clivará as ligações α(1-6) glicosídicas. A glucoamilase heteróloga pode ser derivada de qualquer organismo. Em uma modalidade, a proteína heteróloga é derivada de uma Y-amilase, tal como, por exemplo, a glucoamilase de Saccharomycoces filbuligera (por exemplo, codificada pelo gene glu 0111). O polipeptídeo GLU0111 inclui os seguintes aminoácidos (ou corresponde aos seguintes aminoácidos), que estão associados à atividade da glucoamilase, e incluem, mas sem limitação, os aminoácidos localizados nas posições 41, 237, 470, 473, 479, 485, 487 da SEQ ID NO: 9. Os exemplos de células hospedeiras de levedura recombinantes que expressam tais enzimas são descritas no documento n° WO 2011/153516, bem como no documento n° WO 2017/037614.

[0072] Ainda, em outro exemplo, a enzima pode reduzir a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para catabolizar (decomposição) o formato. Conforme usado no contexto da presente revelação, a expressão "polipeptídeos nativos que funcionam para catabolizar o formato" se refere aos polipeptídeos que são encontrados de forma endógena na célula hospedeira de levedura recombinante. As enzimas nativas que funcionam para catabolizar o formato incluem, mas sem limitação, os polipeptídeos FDH1 e FDH2 (também conhecidos como FDH1 e FDH2, respectivamente). Em uma modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante porta uma modificação genética em pelo menos um dos genes FDH1 (que codificam o polipeptídeo FDH1), o gene FDH2 (que codifica o polipeptídeo FDH2) ou os ortólogos. Em outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante tem modificações genéticas no gene FDH1 (que codifica o polipeptídeo FDH1) e no gene fdh2 (que codifica o polipeptídeo FDH2), ou em seus ortólogos. Os exemplos de células hospedeiras de levedura recombinantes portadoras de tais modificações genéticas que levam à redução na produção de uma ou mais enzimas nativas, que funcionam para catabolizar o formato, são descritas no documento n° WO 2012/138942. De preferência, a célula hospedeira de levedura recombinante tem modificações genéticas (como uma deleção ou inserção genética) no gene FDH1 e no gene FDH2 que faria com que a célula hospedeira eliminasse os genes FDH1 e FDH2.

[0073] Ainda, em outro exemplo, a enzima pode aumentar a produção de uma enzima heteróloga que funciona para anabolizar (formar) o formato. Conforme usado no contexto da presente revelação, "uma enzima que funciona para anabolizar o formato" se refere aos polipeptídeos que podem, ou não, ser encontrados de forma endógena na célula hospedeira de levedura recombinante e que são introduzidos propositadamente nas células hospedeiras de levedura recombinantes. Em algumas modalidades, a enzima heteróloga que funciona para anabolizar o formato é uma piruvato formato liase heterólogo (PFL), um acetaldeído desidrogenase heterólogo, um álcool desidrogenases heterólogo e/ou acetilaldeído/ álcool desidrogenases bifuncional heterólogo (AADH), como aqueles descritos na Patente de Número de série US 8.956.851 e WO 2015/023989. Mais especificamente, as enzimas PFL e AADH, para uso nas células hospedeiras de levedura recombinantes, podem ser provenientes de uma fonte bacteriana ou eucariótica. O PFL heterólogo da presente revelação inclui, mas sem limitação, o polipeptídeo PFLA, um polipeptídeo codificado por um ortólogo de gene de PFLA, o polipeptídeo PFLB ou um polipeptídeo codificado por um ortólogo do gene de PFLB. Os AADHs heterólogos da presente revelação incluem, mas sem limitação, polipeptídeos ADHE ou um polipeptídeo codificado por um ortólogo do gene de ADHE. Em uma modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante da presente revelação compreende pelo menos uma das seguintes enzimas heterólogas, cuja função é anabolizar o formato: o polipeptídeo PFLA, o polipeptídeo PFLB e/ou o polipeptídeo ADHE. Em uma modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante da presente revelação compreende pelo menos duas das seguintes enzimas heterólogas, cuja função é anabolizar o formato: o polipeptídeo PFLA, o polipeptídeo PFLB e/ou o polipeptídeo ADHE. Em outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante da presente revelação compreende as seguintes enzimas heterólogas, cuja função é anabolizar o formato: o polipeptídeo PFLA, o polipeptídeo PFLB e o polipeptídeo ADHE.

[0074] Em algumas modalidades, a enzima envolvida na clivagem ou hidrólise de seu substrato (por exemplo, uma enzima lítica e, em algumas modalidades, uma enzima sacarolítica). Ainda, em outra modalidade, a enzima pode ser uma hidrolase de glicosídeo. No contexto da presente revelação, o termo "glicosídeo hidrolase" se refere a uma enzima envolvida na digestão, no metabolismo e/ou na hidrólise de carboidratos, que inclui amilases, celulases, hemicelulases, enzimas acessórias celulolíticas e amilolíticas, inulinases, levanases, trealases, pectinases, sucranases, dextranase e açúcar pentose que utiliza enzimas. Em outra modalidade, a enzima pode ser uma protease. No contexto da presente revelação, o termo "protease" se refere a uma enzima envolvida na digestão, no metabolismo e/ou na hidrólise de proteínas. Ainda, em outra modalidade, a enzima pode ser uma esterase. No contexto da presente revelação, o termo "esterase" se refere a uma enzima envolvida na hidrólise de um éster de um ácido ou de um álcool, o que inclui fosfatases, como fitases.

[0075] A enzima adicional pode ser uma "enzima amilolítica", uma enzima envolvida na digestão, no metabolismo e/ou na hidrólise da amilose. O termo "amilase" se refere a uma enzima que decompõe o amido em açúcar. Todas as amilases são hidrolases glicosídicas e atuam nas ligações a-1,4-glicosídica. Algumas amilases, como a Y-amilase (glucoamilase), também atuam nas ligações α-1,6- glicosídica. As enzimas amilase incluem α-amilase (EC 3.2.1.1), β-amilase (EC 3.2.1.2) e Y-amilase (EC 3.2.1.3). As α-amilases são metaloenzimas de cálcio, sem capacidade de funcionar na ausência de cálcio. Ao atuar em locais aleatórios ao longo da cadeia do amido, a α-amilase decompõe os carboidratos de cadeia longa, produzindo maltotriose e maltose a partir da amilose, ou maltose, glicose e "dextrina- limite" da amilopectina. Devido ao fato de que pode atuar em qualquer lugar do substrato, a α-amilase tende a ter ação mais rápida do que a β-amilase. Em uma modalidade, a proteína heteróloga é derivada de uma α-amilase, tal como, por exemplo, a partir da α-amilase de Bacillus amyloliquefacens. Outra forma de amilase, a β-amilase também é sintetizada por bactérias, fungos e plantas. Trabalhando a partir da extremidade não redutora, a β-amilase catalisa a hidrólise da segunda ligação α- 1,4 glicosídica, separando duas unidades de glicose (maltose) de cada vez. Outra enzima amilolítica é a α-glucosidase, que atua sobre a maltose e outros malto- oligossacarídeos curtos produzidos pelas α-, β- e Y-amilases, que as converte em glicose. Outra enzima amilolítica é a pululanase. A pululanase é um tipo específico de glucanase, uma exoenzima amilolítica, que degrada o pululano. O pululano é considerado uma cadeia de unidades de maltotriose ligadas por ligações alfa-1,6- glicosídicas. A pululanase (EC 3.2.1.41) também é conhecida como pululan-6- glucano-hidrolase (enzima de desramificação). Outra enzima amilolítica, a isopululanase, hidrolisa o pululano em isopanose (6-alfa-maltossilglucose). A isopullulanase (EC 3.2.1.57) também é conhecida como pululano 4-glicano-hidrolase. Uma "amilase" pode ser qualquer enzima envolvida na digestão, no metabolismo e/ou na hidrólise de amilase, o que inclui α-amilase, β-amilase, glucoamilase, pululanase, isopullulanase e alfa-glucosidase.

[0076] A enzima adicional pode ser uma "dextranase". O dextrano é um polissacarídeo ramificado complexo composto por unidades de monômero de glicose. Ele contém uma cadeia linear de ligações α-1,6 glicosídicas, e ramificações ligadas por ligações α-1,2, α-1,3 ou α-1,4 glicosídicas. Várias enzimas participam da decompõe do dextrano. A dextranase (EC 3.2.1.11), também conhecida como alfa- 1,6-glucano-6-glucano-hidrolase, é uma enzima que realiza a endo-hidrólise das ligações α-1,6 glicosídicas no dextrano. Outras enzimas que atuam para decompor o dextrano incluem: glucano-1,6-α-D-glucosidases (EC3.2.1.70), glucano-1,6-α- isomaltosidases (EC3.2.1.94), 1,6 dextrano-α-isomaltotriosidases (EC3.2.1.95), exo- 1,2-α-glucosidases de dextrano ramificado (EC3.2.1.115), α-glucosidase (EC3.2.1.20) e glucanotransferase de cicloisomalto-oligossacarídeo (CITase).

[0077] A enzima adicional pode ser uma "enzima celulolítica", uma enzima envolvida na digestão, no metabolismo e/ou na hidrólise da celulose. O termo "celulase" se refere a uma classe de enzimas que catalisam a celulólise (isto é, a hidrólise) da celulose. São conhecidos vários tipos diferentes de celulases, que diferem estrutural e mecanicamente. Existem tipos gerais de celulases, com base no tipo de reação catalisada: a endocelulase decompõe as ligações internas para interromper a estrutura cristalina da celulose e expor cadeias individuais de polissacarídeos de celulose; a exocelulase cliva 2 a 4 unidades das extremidades das cadeias expostas produzidas pela endocelulase, o que resulta em tetrassacarídeos ou dissacarídeos, como a celobiose. Existem dois tipos principais de exocelulases (ou celobio-hidrolases, abreviação, CBH) - um tipo que trabalha de forma processual, a partir da extremidade redutora, e um tipo que trabalha de forma processual, a partir da extremidade não redutora da celulose; a celobiase ou a beta-glucosidase hidrolisam o produto exocelulase em monossacarídeos individuais; celulases oxidativas que despolimerizam a celulose por reações radicais, como, por exemplo, celobiose desidrogenase (aceitador); fosforilases de celulose que despolimerizam a celulose com uso de fosfatos em vez de água. No caso mais familiar da atividade da celulase, o complexo enzimático decompõe a celulose em beta-glicose. Uma "celulase" pode ser qualquer enzima envolvida na digestão, no metabolismo e/ou na hidrólise da celulose, o que inclui uma proteína endoglucanase, glucosidase, celobio- hidrolase, xilanase, glucanase, xilosidase, xilano esterase, arabinofuranosidase, galactosidase, celobiose fosforilase, celodextrina fosforilase, mananase, manosidase, xiloglucanase, endoxilanase, glucuronidase, acetilxilanesterase, arabinofurano- hidrolase, swolenina, glucuronil esterase, expansina, pectinase e feruoil esterase.

[0078] A enzima adicional pode ter "atividade hemicelulolítica", uma enzima envolvida na digestão, no metabolismo e/ou na hidrólise da hemicelulose. O termo "hemicelulase" se refere a uma classe de enzimas que catalisam a hidrólise da celulose. Sabe-se que vários tipos diferentes de enzimas têm atividade hemicelulolítica, o que inclui, mas sem limitação, xilanases e mananases.

[0079] A enzima adicional pode ter "atividade xilanolítica", uma enzima com a capacidade de hidrolisar ligações glicosídicas em oligopentoses e polipentoses. O termo "xilanase" é o nome dado a uma classe de enzimas que degradam o polissacarídeo linear beta-1,4-xilano em xilose, que decompõe, desse modo, a hemicelulose, um dos principais componentes das paredes celulares das plantas. As xilanases incluem as enzimas que correspondem ao Número de Comissão de Enzima 3.2.1.8. A proteína heteróloga também pode ser uma "enzima metabolizadora da xilose", uma enzima envolvida na digestão, no metabolismo e/ou na hidrólise da xilose, o que inclui uma proteína xilose isomerase, xiluloquinase, xilose redutase, xilose desidrogenase, xilitol desidrogenase, xilonato desidratase, xilonato desidratase, xilose transquetolase e xilose transaldolase. Uma "enzima que utiliza açúcares pentoses" pode ser qualquer enzima envolvida na digestão, no metabolismo e/ou na hidrólise do açúcar pentose, que inclui xilanase, arabinase, arabinoxilanase, arabinosidase, arabinofuranosidase, arabinoxilanase, arabinosidase e arabinofuranosidase, arabinose isomerase, ribulose-5-fosfato 4-epimerase, xilose isomerase, xiluloquinase, xilose redutase, xilose desidrogenase, xilitol desidrogenase, xilonato desidratase, xilose transquetolase e/ou xilose transaldolase.

[0080] A enzima adicional pode ter "atividade manânica", uma enzima com a capacidade de hidrolisar os resíduos terminais de β-D-manose não redutores nos β- D-manosídeos. As mananases têm capacidade de decompor a hemicelulose, um dos principais componentes das paredes celulares das plantas. As xilanases incluem aquelas enzimas que correspondem ao Número de Comissão de Enzima 3.2.25.

[0081] A enzima adicional pode ser uma "pectinase", uma enzima, como pectoliase, pectozima e poligalacturonase, comumente conhecida na fabricação de cerveja como enzimas pécticas. Essas enzimas decompõem a pectina, um substrato polissacarídico encontrado nas paredes celulares das plantas.

[0082] A enzima adicional pode ter "atividade fitolítica", uma enzima que catalisa a conversão do ácido fítico em fósforo inorgânico. As fitases (EC 3.2.3) podem pertencer à família das fosfatases ácidas da histidina, das fitases da e-hélice, das fosfatases do ácido púrpura ou da família das fitases do tipo proteína tirosina- fosfatase.

[0083] A enzima adicional pode ter "atividade proteolítica", uma enzima envolvida na digestão, no metabolismo e/ou na hidrólise de proteínas, o que inclui proteases de serina, proteases de treonina, proteases de cisteína, proteases de aspartato, proteases de ácido glutâmico e metaloproteases.

[0084] Quando a célula hospedeira de levedura recombinante expressa uma proteína heteróloga, ela pode ser adicionalmente modificada para aumentar sua robustez em altas temperaturas. As modificações genéticas para aumentar a robustez de uma célula hospedeira de levedura recombinante geneticamente modificada são descritas no documento n° WO2017/ 037614.

[0085] Em algumas modalidades, as células hospedeiras microbianas recombinantes da presente revelação não têm (por exemplo, excluem) uma modificação genética em seu gene da glutamato sintase que consome NADH. Em Saccharomyces cerevisiae, o gene da glutamato sintase que consome NADH é conhecido como GLT1 (conforme descrito em Wang et al., 2013).

[0086] Ainda, em outra modalidade, as células hospedeiras microbianas recombinantes da presente revelação não fazem (por exemplo, excluem) modificações genéticas em genes que codificam enzimas heterólogas que funcionam em uma ou mais vias metabólicas modificadas para converter uma fonte de carboidrato em álcool, como aquelas descritas no documento n° WO2015/ 023989.

PROCESSOS DE FERMENTAÇÃO

[0087] A biomassa que pode ser fermentada com a célula hospedeira recombinante, descrita no presente documento, inclui qualquer tipo de biomassa conhecida na técnica e descrita no presente documento. Por exemplo, a biomassa pode incluir, mas sem limitação, amido, açúcar e materiais lignocelulósicos. Os materiais amiláceos podem incluir, mas sem limitação, mostos, como milho, trigo, centeio, cevada, arroz ou sorgo. Os materiais de açúcar podem incluir, entre outros, beterrabas, tubérculos de alcachofra, sorgo doce, melaço ou cana-de-açúcar. Os termos "material lignocelulósico", "substrato lignocelulósico" e "biomassa celulósica" significam qualquer tipo de biomassa que compreende celulose, hemicelulose, lignina ou suas combinações, tais como, sem limitação, biomassa lenhosa, gramíneas forrageiras, culturas energéticas herbáceas, biomassa de plantas não lenhosas, rejeitos agrícolas e/ou resíduos agrícolas, rejeitos florestais e/ou resíduos florestais, lodo de produção de papel e/ou lodo de rejeitos de papel, lodo de tratamento de águas residuais, resíduos sólidos municipais, fibra de milho proveniente de usinas de etanol de milho, de moinhos úmidos e secos e resíduos de processamento de açúcar. Os termos "hemicelulósicos", "porções hemicelulósicas" e "frações hemicelulósicas" significam os elementos não lignina e não celulósicos do material lignocelulósico, como, por exemplo, mas sem limitação, hemicelulose (isto é, que compreende xiloglucano, xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, manano, glucomanano e galactoglucomanano), pectinas (por exemplo, homogalacturonanos,ramnogalacturonano I e II e xilogalacturonano) e proteoglicanos (por exemplo, proteína arabinogalactana, proteína extensina e proteínas ricas em prolina).

[0088] Em um exemplo sem limitação, o material lignocelulósico pode incluir, mas sem limitação, biomassa lenhosa, como fibra de polpa de madeira reciclada, serragem, madeira dura, madeira macia e suas combinações; gramíneas, como grama forrageira, esparto, azevém, canário-amarelo, miscanthus ou uma combinação delas; resíduos de processamento de açúcar, como, mas sem limitação, bagaço de cana-de-açúcar; resíduos agrícolas, tais como, sem limitação, palha de arroz, casca de arroz, palha de cevada, espiga de milho, palha de cereal, palha de trigo, palha de canola, palha de aveia, casca de aveia e fibra de milho; palha, tal como, sem limitação, palha de soja, palha de milho; suculentas, tais como, mas sem limitação, agave; e resíduos florestais, tais como, mas sem limitação, fibras de polpa de madeira reciclada, serragem, madeira (por exemplo, álamo, carvalho, bordo, bétula, salgueiro), madeira macia ou qualquer uma de suas combinações. O material lignocelulósico pode compreender uma espécie de fibra; alternativamente, o material lignocelulósico pode compreender uma mistura de fibras que se originam de diferentes materiais lignocelulósicos. Outros materiais lignocelulósicos são resíduos agrícolas, como palhas de cereais, o que inclui palha de trigo, palha de cevada, palha de canola e palha de aveia; fibra de milho; fogões, como palha de milho e palha de soja; gramíneas, como grama forrageira, canário-amarelo, cana-de-açúcar e miscanthus; ou suas combinações.

[0089] Os substratos para ensaios de atividade de celulose podem ser divididos em duas categorias, solúveis e insolúveis, com base em sua solubilidade em água. Os substratos solúveis incluem celodextrinas ou derivados, carboximetil celulose (CMC) ou hidroxietil celulose (HEC). Os substratos insolúveis incluem celulose cristalina, celulose microcristalina (Avicel), celulose amorfa, como celulose inchada por ácido fosfórico (PASC), celulose tingida ou fluorescente e biomassa lignocelulósica pré-tratada. Esses substratos, em geral, são material celulósico altamente ordenado e, desse modo, apenas moderadamente solúvel.

[0090] Será observado que o material lignocelulósico adequado pode ser qualquer matéria-prima que contenha celulose solúvel e/ou insolúvel, em que a celulose insolúvel pode estar na forma cristalina ou não cristalina. Em várias modalidades, a biomassa lignocelulósica compreende, por exemplo, madeira, milho, palha de milho, serragem, casca, melaço, cana-de-açúcar, folhas, resíduos agrícolas e florestais, gramíneas, como grama forrageira, produtos de digestão de ruminantes, resíduos municipais, efluentes de fábricas de papel, jornal, papelão ou suas combinações.

[0091] O lodo de papel também é uma matéria-prima viável para a produção de lactato ou acetato. O lodo de papel é um resíduo sólido resultante da polpa e fabricação de papel, e normalmente é removido das águas residuais do processo em um decantador primário. O custo do descarte de lodo úmido é um incentivo significativo para converter o material em outros usos, como a conversão em etanol. Os processos fornecidos pela presente invenção são amplamente aplicáveis. Além disso, os produtos de sacarificação e/ou fermentação podem ser utilizados para produzir etanol ou produtos químicos de maior valor agregado, como ácidos orgânicos, aromáticos, ésteres, acetona e intermediários de polímero.

[0092] Em algumas modalidades, a presente revelação fornece método para hidrolisar um substrato que compreende a biomassa, conforme descrito acima, por exemplo, um substrato que compreende melaço, cana-de-açúcar ou um derivado dela, por meio de contato do substrato com uma célula hospedeira microbiana recombinante descrita no presente documento. Em algumas modalidades, a presente revelação fornece um método para hidrolisar um substrato, por exemplo, substrato que compreende melaço, cana-de-açúcar ou um derivado dela, por meio de contato do substrato com uma cocultura que compreende as células hospedeiras microbianas recombinantes descritas e outro microrganismo, como, por exemplo, um microrganismo não modificado geneticamente. Em algumas modalidades, o método também pode compreender a inclusão de uma enzima purificada para permitir ou facilitar a hidrólise do substrato ou de um produto intermediário produzido pela célula hospedeira microbiana recombinante da presente revelação.

[0093] A produção de etanol pode ser realizada, por exemplo, a temperaturas de pelo menos cerca de 30 °C, cerca de 31 °C, cerca de 32 °C, cerca de 33 °C, cerca de 34 °C, cerca de 35 °C, cerca de 36 °C, cerca de 37 °C, cerca de 38 °C, cerca de 39 °C, cerca de 40 °C, cerca de 41 °C, cerca de 42 °C, cerca de 43 °C, cerca de 44 °C, cerca de 45 °C, cerca de 46 °C, cerca de 47 °C, cerca de 48 °C, cerca de 49 °C ou cerca de 50 °C. Em algumas modalidades, a produção de etanol a partir de celulose pode ser realizada, por exemplo, a temperaturas acima de cerca de 30 °C, cerca de 31 °C, cerca de 32 °C, cerca de 33 °C, cerca de 34 °C, cerca de 35 °C, cerca de 36 °C, cerca de 37 °C, cerca de 38 °C, cerca de 39 °C, cerca de 40 °C, cerca de 41 °C, cerca de 42 °C, ou cerca de 43 °C, ou cerca de 44 °C, ou cerca de 45 °C ou cerca de 50 °C. Em algumas modalidades, a célula hospedeira microbiana recombinante pode produzir etanol a partir de celulose, a temperaturas de cerca de 30 °C a 60 °C, cerca de 30 °C a 55 °C, cerca de 30 °C a 50 °C, cerca de 40 °C a 60 °C, cerca de 40 °C a 55 °C ou cerca de 40 °C a 50 °C.

[0094] Em algumas modalidades, a produção de etanol (ou outros produtos e coprodutos) pode ser adicionalmente realizada de acordo com o "processo do Brasil". Sob o "processo do Brasil", o suco de cana-de-açúcar não esterilizado e/ou o melaço são fermentados com um alto teor de inóculo para obter fermentações rápidas. Durante o processo de fermentação, a levedura é repetidamente reciclada durante a safra de mais de 200 dias, por meio de centrifugação e lavagem das células em ácido sulfúrico para diminuir a contaminação e interromper a floculação das células. As cepas industriais isoladas de fermentações de etanol no Brasil mostraram ter características que permitem que elas sobrevivam às condições de fermentação e lavagem ácida melhor do que as leveduras de laboratório típicas, ou outros isolados industriais de leveduras. Uma cepa de S. cerevisiae comumente usada no Brasil, PE- 2, é um isolado selvagem da fermentação com etanol de cana-de-açúcar (consultar Argueso et al., 2009, consultar também o genoma JAY291, Banco de Dados Genômico de Saccharomyces (SGD), yeastgenome.org). Nas fermentações brasileiras de etanol de cana-de-açúcar, a PE-2, e outras cepas industriais, produzem uma média de 4,5 g/L de glicerol. Em algumas modalidades, a cepa PE-2, ou uma versão modificada dela, é usada como organismo hospedeiro. Em certas modalidades, o etanol é produzido através da fermentação de uma célula hospedeira microbiana recombinante de acordo com o processo do Brasil. Em algumas modalidades, a célula hospedeira microbiana recombinante é usada para fermentar uma fonte de carboidratos, em que os microrganismos são reutilizados após uma ou mais fermentações (por exemplo, ciclos) e em que os microrganismos são lavados com um ácido (por exemplo, lavado com ácido) após cada fermentação. Em algumas modalidades, o ácido tem um pH entre 2,0 e 2,2. Em certas modalidades, o ácido é ácido sulfúrico. Em algumas modalidades adicionais, o ciclo de lavagem com ácido pode ser repetido mais de uma vez, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais ciclos de lavagem com ácido podem ser realizados.

[0095] Em algumas modalidades, os métodos de produção de etanol podem compreender colocar o substrato de fermentação em contato com uma célula hospedeira microbiana recombinante ou cocultura, conforme descrito no presente documento, e colocar o substrato em contato adicional com enzimas produzidas externamente, que podem ser fornecidas em uma forma purificada. As enzimas exemplificativas produzidas externamente incluem, mas sem limitação, enzimas degradantes de amido, enzimas degradantes de dextrano, fitase, protease, celulases e/ou xilose isomerase. As enzimas específicas produzidas externamente (e opcionalmente purificadas) incluem, mas sem limitação, trealases, glucoamilases, alfa-amilases, alfa-glucosidases, glucanases (endo/ exo), pululanases, fitases e/ou proteases.

[0096] Em algumas modalidades, os métodos compreendem a produção de etanol a uma taxa específica. Por exemplo, em algumas modalidades, o etanol é produzido a uma taxa de pelo menos cerca de 0,1 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 0,25 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 0,5 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 0,75 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 1,0 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 2,0 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 5,0 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 10 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 15 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 20,0 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 25 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 30 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 50 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 100 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 200 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 300 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 400 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 500 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 600 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 700 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 800 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 900 mg por hora, por litro, pelo menos 1 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 1,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 2 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 2,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 3 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 3,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 4 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 4,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 5,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 6 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 6,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 7 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 7,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 8 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 8,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 9 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 9,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 10 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 10,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 11 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 11,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 12 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 12,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 13 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 13,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 14 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 14,5 g por hora, por litro ou pelo menos cerca de 15 g por hora, por litro.

[0097] Em algumas modalidades, as células hospedeiras microbianas recombinantes podem produzir etanol a uma taxa de pelo menos cerca de 0,1 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 0,25 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 0,5 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 0,75 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 1,0 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 2,0 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 5,0 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 10 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 15 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 20,0 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 25 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 30 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 50 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 100 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 200 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 300 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 400 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 500 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 600 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 700 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 800 mg por hora, por litro, pelo menos cerca de 900 mg por hora r por litro, pelo menos cerca de 1 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 1,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 2 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 2,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 3 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 3,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 4 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 4,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 5,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 6 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 6,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 7 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 7,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 8 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 8,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 9 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 9,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 10 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 10,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 11 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 11,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 12 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 12,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 13 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 13,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 14 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 14,5 g por hora, por litro, pelo menos cerca de 15 g por hora, por litro, ou mais de uma cepa de controle (por exemplo, uma cepa do tipo selvagem, como, por exemplo, a cepa M7101) e cultivada nas mesmas condições. Em algumas modalidades, o etanol pode ser produzido na ausência de quaisquer celulases adicionadas externamente.

[0098] A produção de etanol pode ser medida com uso de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a quantidade de etanol nas amostras de fermentação pode ser avaliada com uso de análise por HPLC. Muitos kits de ensaios de etanol estão comercialmente disponíveis, que utilizam, por exemplo, ensaios à base de enzimas álcool oxidase. A presente invenção será mais facilmente entendida a título de referência aos seguintes exemplos que são fornecidos para ilustrar a invenção, em vez de limitar seu escopo.

EXEMPLO I - COMPARAÇÃO ENTRE DIFERENTES VIAS DE REDUÇÃO DE GLICEROL

[0099] Várias cepas de Saccharomyces cerevisiae (todas derivadas da linhagem M7101 do tipo selvagem) foram geneticamente modificadas para reduzir a produção de glicerol durante a produção de etanol, para determinar se poderia aumentar a produção de etanol. Duas cepas foram desenvolvidas para usar um aceitador de elétrons alternativo para substituir a função de equilíbrio de NADH/ NAD+ da produção de glicerol. A cepa M8690 usou o formato como o receptor alternativo de elétrons. Mais especificamente, a cepa M8690 superexpressou um formato heterólogo de piruvato liase e acetaldeído desidrogenase, e não expressou seu formato nativo desidrogenase, e reduziu a expressão de genes de glicerol-3- fosfato desidrogenase. A linhagem M8376 usou a conversão de ácido acético em etanol como um dissipador de elétrons. Mais especificamente, a cepa M8376 foi produzida por meio de sobre-expressão de um acetaldeído desidrogenase e por meio de deleção de gpd2, um dos genes do glicerol-3-fosfato desidrogenase. A cepa M7772 foi produzida através da sobre-expressão do transportador nativo de glicerol (por exemplo, STL1), que, normalmente, não está ativo durante a fermentação, para limitar a produção de glicerol. As cepas M7762, M7763 e M7764 foram produzidas pela inativação do gene que codifica a aquagliceroporina FPS1 (por exemplo, uma proteína com capacidade de exportar glicerol para fora da célula). O genótipo das várias cepas usadas nesse exemplo é apresentado na Tabela 1.

[00100] Tabela 1. Genótipo das várias cepas usadas neste exemplo

[00101] As fermentações em escala de laboratório foram realizadas com uso de recipientes de 50 mL ou 2 L, cheios de creme de levedura, tanto por propagação quanto por fermentação anterior, em um nível para reproduzir as concentrações padrão de levedura nas fermentações brasileiras de etanol (~ 10% de massa de células úmidas). Esse creme de levedura foi submetido a tratamento ácido em condições idênticas às práticas industriais brasileiras. Um sistema de alimentação, em seguida, foi utilizado para fornecer uma alimentação de substrato ou “mosto” (suco de cana-de-açúcar, melaço ou mistura proveniente de usinas brasileiras em operação), novamente a taxas e concentrações ditadas pelas condições médias ocorridas nas usinas brasileiras. Esse fluxo de alimentação foi fornecido através de uma bomba de seringa para fornecer excelente precisão, em relação à quantidade de substrato alimentado a cada reator. As fermentações foram mantidas sob condições de temperatura controlada e suavemente agitadas, e prosseguiram até a evolução do CO2 cair abaixo de um limite mínimo. Depois de concluídas, as amostras foram coletadas para análise por HPLC para comparar a produção de etanol, glicerol, ácidos orgânicos e outros compostos.

[00102] O monitoramento da taxa de efluente gasoso de CO2 da fermentação permite uma determinação indireta das taxas de consumo de açúcar e produção de etanol. Após o início da alimentação (no tempo = 0), a taxa de fermentação aumenta para o máximo e permanece nesse máximo até a alimentação terminar após 4,5 horas. Após a alimentação ser concluída, as cepas utilizam os açúcares restantes.

[00103] As cepas M7101, M7772, M8690 e M8376 foram submetidas a 56 ciclos de fermentação e lavagem ácida. Para a cepa M8690, as primeiras 20 rodadas de fermentação mostraram que poderia atingir um aumento de 1,8% na produção de etanol e uma queda de 27% na produção de glicerol, em relação à cepa M7101. No entanto, sua viabilidade diminuiu rapidamente após a fermentação 20, e a cepa M8690 começou a deixar os açúcares não fermentados na reação (dados não mostrados). Além disso, conforme é mostrado na Figura 1, a capacidade da cepa M8690 de terminar rapidamente a fermentação foi comprometida, pois o final do processo exigia uma hora adicional, em relação à cepa M7101 (por exemplo, cerca de 16% de aumento no tempo, quando comparado à cepa M7101).

[00104] A cepa M8376 mostrou um aumento de 2,1% na produção de etanol e uma diminuição de 32% na produção de glicerol, ao longo de 56 ciclos (dados não mostrados). No entanto, a cepa M8376 também mostrou uma taxa de fermentação mais lenta, em comparação com a taxa de fermentação da cepa M7101. Os resultados apresentados na Figura 1 indicam que a cepa M8376 terminou a fermentação cerca de 30 minutos mais lenta do que a M7101 2 (por exemplo, cerca de 16% de aumento no tempo, quando comparada à cepa M7101).

[00105] A linhagem M7772 mostrou um aumento de 1,1% na produção de etanol e uma diminuição de 14% na produção de glicerol ao longo de 56 ciclos (dados não mostrados). Diferentemente das cepas M8690 e M8376, a linhagem M7772 mostrou uma taxa de fermentação muito rápida ao longo das rodadas de fermentação. Conforme mostrado na Figura 1, a cepa M7772 teve capacidade de fermentar o açúcar mais rápido, ou mais rápido do que a cepa M7101, e também teve capacidade de terminar a fermentação rapidamente.

[00106] O impacto da inibição do nível de expressão do gene FPS1 foi avaliado. A robustez de três cepas diferentes, nas quais o gene FPS1 foi deletado (por exemplo, M7762, M7763 e M7764), foi comparada à robustez de três cepas diferentes que superexpressam o gene STL1 (por exemplo, M7768, M7769 e M7770). De forma resumida, as cepas foram pré-cultivadas em meio YP suplementado com sacarose e, depois, foram diluídas em meios YP + sacarose ou YP + frutose frescos para comparação da taxa de crescimento. A densidade óptica da cultura foi monitorada de forma anaeróbica, com uso de um leitor de placas Biotek, dentro de uma câmara anaeróbica, a uma temperatura de 38 °C, e permitiu o cálculo da taxa máxima de crescimento das culturas, bem como o tempo em que a taxa máxima de crescimento foi alcançado. Conforme mostrado na Figura 2, as cepas nas quais o gene FPS1 foi deletado cresceram mais lentamente em sacarose e frutose, quando colocadas a 38 °C.

[00107] O impacto do aumento do nível de expressão do gene STL1 foi então avaliado em cepas geneticamente modificadas adicionais derivadas da cepa M7101. A porcentagem de aumento de etanol/ redução de glicerol (quando comparada à cepa parental M7101) da cepa M7772 foi comparada à da cepa M8397 (que inclui 4 cópias adicionais heterólogas do gene STL1). Conforme mostrado na Figura 3, a inclusão de 4 cópias adicionais de STL1 na cepa M8397 aumentou a produção de etanol e diminuiu a produção de glicerol, quando comparada à cepa M7772.

[00108] A cepa M10753 foi produzida por meio de inclusão de 8 cópias do gene STL1, enquanto a cepa M10761 foi produzida por meio de inclusão de 12 cópias do gene STL1. As cepas M10753, M10671 e M10682 foram testadas em fermentação por alimentação em lote e reciclagem de ácido, tanto na escala de 50 mL quanto na escala de 2 L, conforme descrito acima. A Figura 4 mostra que a produção de etanol para a cepa M10761 não aumentou, em relação à da cepa M10753, sendo que ambas as cepas fornecem um aumento de 1 a 1,5% na produção de etanol e uma diminuição de 15 a 20% na produção de glicerol.

[00109] O impacto do aumento do nível de expressão do gene STL1, na cinética da fermentação, foi então determinado. A Figura 5 fornece os dados da taxa de fermentação de um dos ciclos de fermentação realizados nos fermentadores de 2 L e mostra que, como visto na Figura 1, a superexpressão do gene STL1 não afetou negativamente a taxa de fermentação ou o tempo necessário para concluir a fermentação.

EXEMPLO II - COMBINAÇÕES COM MODIFICAÇÕES NO GLICEROL-3- FOSFATO DESIDROGENASE

[00110] O impacto da modificação da expressão da glicerol-3-fosfato desidrogenase foi investigado. Todas as cepas usadas neste exemplo foram derivadas da cepa M7101, e seu genótipo é fornecido na Tabela 2.Tabela 2. Genótipo das várias cepas usadas neste exemplo

[00111] As cepas M8262 e M8190 de glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD) foram criadas a fim de manter a atividade GPD do promotor GPD1 e GPD2, que expressa, de forma diferencial, o GPD. As taxas de crescimento dessas cepas foram comparadas com o tipo selvagem M7101, em meio YP suplementado com sacarose. De forma resumida, as cepas foram pré-cultivadas em meio YP suplementado com sacarose e, depois, foram diluídas em meio YP fresco suplementado com sacarose para comparação da taxa de crescimento anaeróbico. A densidade óptica da cultura foi monitorada com uso de um leitor de placas Biotek e permitiu o cálculo da taxa máxima de crescimento das culturas, bem como o tempo em que a taxa máxima de crescimento foi atingida. Foi determinado que a deleção do GPD2 prejudicou o crescimento (M8190), enquanto a deleção do GPD1 e a expressão do GPD2 do promotor GPD1 (M8262) mantiveram uma taxa de crescimento semelhante à da M7101 do tipo selvagem (consultar a Figura 6A). A superexpressão do STL1 teve um efeito mínimo na taxa de crescimento (MaxV) de silenciamento do GPD (Figura 6A).

[00112] Para testar ainda mais o efeito do silenciamento da GPD com STL1, algumas das manchas foram testadas no sistema de escala de laboratório de 50 mL para cinco rodadas de fermentação e tratamento com ácido, conforme explicado no Exemplo I. As produções de etanol de fermentação, redução de glicerol (medido por HPLC) e a produção de CO2foi medida e comparada com o tipo selvagem M7101 em cada fermentação. Enquanto a cepa M10686 teve produções mais altas nos cinco ciclos de fermentação (Figuras 6B e 6C), a cinética dessa cepa foi mais lenta do que a da cepa M10682 (Figuras 6D e 6E).

[00113] As Figuras 4 e 5 fornecem os resultados de fermentação para a cepa M10682, em relação às cepas que superexpressam o gene STL1 (cepa M10753 e cepa M10761). Os resultados apresentados nas Figuras 4 e 5 mostram que a modificação do locus GPD1 leva a uma melhoria adicional da produção de etanol e à diminuição da produção de glicerol, apenas em relação à superexpressão de STL1. Além disso, e, de forma surpreendente, conforme mostrado na Figura 5, a taxa de fermentação da cepa M10682 é praticamente idêntica à das cepas M7101, M10753 e M10761.

EXEMPLO III - COMPARAÇÃO COM LEVEDURAS NÃO MODIFICADAS GENETICAMENTE

[00114] A cepa M10682 foi comparada a uma variedade de cepas de leveduras que são usadas regularmente no Brasil para a produção de combustível álcool. Uma descrição das várias cepas usadas neste exemplo é fornecida na Tabela 3.Tabela 3. Descrição e genótipo das várias cepas usadas neste exemplo

[00115] Primeiro, a cepa M10682 foi comparada a uma cepa do tipo selvagem (M7101), em várias condições de estresse, para testar sua robustez. A cepa M10682 e a cepa M7101 foram processadas em tratamentos paralelos de temperatura/ ácido/ açúcar e fermentações no mesmo mosto alimentado em condições padrão. De forma resumida, as cepas foram comparadas em um sistema de escala de laboratório (50 mL), ao longo de vários ciclos de fermentação. As cepas foram processadas em reatores duplicados no mosto produzido no Brasil. Para o teste de estresse de açúcar (Figura 7A), ambas as cepas foram testadas em vários açúcares redutores totais para produzir fermentações que criam entre 7 e 11% v/v de etanol, e relatadas como a média de nove rodadas consecutivas de fermentação e lavagem ácida em cada concentração de açúcar. Para o teste de estresse de contaminação bacteriana (Figuras 7B e 7C), uma mistura de quatro espécies diferentes de bactérias (Lactobacillus fermentum (39% do inóculo), Lactobacillus reuteri (29% do inóculo), Weissella sp. (27% do inóculo) e Lactobacillus farraginis (6% do inóculo)) foi utilizada para inocular os reatores desafiados a 108ou 109 células bacterianas/ mL. As titulações médias de etanol e glicerol do final das fermentações foram medidas por HPLC, e a taxa de produção de CO2foi medida, conforme indicado no Exemplo I. O desempenho da cepa M10682, em relação ao desempenho da cepa M7101, foi avaliado sob estresse de temperatura (39 °C) (Tabela 4), estresse fraco de ácido (Tabela 5), uma faixa de cargas totais de açúcares (Figura 7A) e desafio por contaminação bacteriana (Figuras 7B e 7C).Tabela 4. Comparação da robustez da cepa M10682 e da cepa M7101 em tempera turas elevadas.

Tabela 5. Comparação da robustez da cepa M10682 e da cepa M7101 em condições de estresse ácido (a 33 °C).

* As condições de baixa acidez contêm 2,5 g/L de ácido lático e 2,5 g/L de ácido acético A As condições de alta acidez contêm 5 g/L de ácido lático e 5 g/L de ácido acético

[00116] Nos vários testes de estresse, a robustez da cepa M10682 foi igual ou melhor do que a da cepa de referência M7101. Além disso, em todas as condições testadas, a cepa M10682 forneceu um aumento na produção de etanol, em comparação com a cepa de referência M7101.

[00117] Segundo, a cepa M10682 foi comparada com outras cepas de leveduras. As cepas M7101 e CAT-1, com frequência, são incluídas individualmente, ou em conjunto com outras cepas, para iniciar o período de esmagamento e, em seguida, recicladas para todo o período de esmagamento (~ 200 dias). Isso significa que as populações de levedura não modificadas geneticamente sofrem alterações ao longo da estação, o que pode incluir a adaptação por meio de modificações epigenéticas, modificações genéticas e/ou deslocamento das cepas de partida com as cepas de origem, com o mosto alimentado ou melaço (ou seja, cepas de leveduras do tipo “selvagem”). Para comparar as populações de leveduras que se adaptaram e/ou as alteradas, durante as operações dos moinhos, as amostras (conhecidas como “Moinho 1” e “Moinho 2”) das usinas de cana-de-açúcar em operação no Brasil foram obtidas regularmente durante todo o período de esmagamento, e as populações de leveduras presentes em seu processo foram utilizadas como base de comparação. A amostra Moinho 1 e a Moinho 2 foram inoculadas com uma mistura de M7101 e CAT- 1 no início do período e, então, as versões puras de M7101 e CAT-1 foram incluídas como controle.

[00118] As cepas M7101 e M10682 foram colocadas em quatro reatores separados de 50 mL cada (quadruplicado), enquanto as cepas CAT-1 e amostras Moinho 1 e Moinho 2 foram colocadas em dois reatores separados de 50 mL cada (duplicado). As cepas e as amostras foram submetidas a doze ciclos de fermentações e lavagem ácida. Os dados obtidos nas três primeiras fermentações não foram utilizados, pois as amostras de levedura moinho não se ajustaram às condições, depois de serem armazenadas e transportadas, deixando os açúcares para trás durante a fermentação. Após as três fermentações de ajuste iniciais, os dados das nove fermentações subsequentes (36 pontos de dados, cada, para as cepas M7101 e M10682, 18 pontos de dados, cada, para a cepa CAT-1 e as amostras Moinho 1 e Moinho 2) foram calculados para comparar os rendimentos da produção de etanol.

[00119] A Figura 8 fornece os resultados da comparação para a produção de etanol. A titulação média para a cepa M10682 foi mais de 1 grama por litro maior que a de todas as outras amostras, ou ~ 2% maior do que a titulação obtida da cepa M7101. Além disso, o desempenho da M7101 e das amostras das duas amostras Moinho foi quase idêntico, o que mostra como o desempenho da produção de etanol das cepas que foram usadas ao longo do período é muito próximo ao da cepa pura que os produtores usam para iniciar seu período.

[00120] A Figura 9 fornece os resultados para a comparação da produção de glicerol durante a fermentação. A titulação média de glicerol para a cepa M10682 foi 0,9 g/L menor do que a da cepa M7101, ou 23% menor. Além disso, a produção de glicerol pela cepa M7101 e pelas amostras dos dois moinhos foi quase idêntica, o que demonstra, novamente, que essas amostras apresentam desempenho muito semelhante à das culturas puras nas quais as estações são iniciadas.

[00121] Conforme indicado acima, no Brasil, as populações de cepas de leveduras em usinas comerciais em operação não são culturas puras. Isso se deve, em parte, à contaminação da população de levedura "selvagem" que entra na fermentação, em parte, devido à evolução da população original presente no fermentador e, em parte, devido ao fato de que é prática comum incluir mais de uma cepa de levedura como um inoculante no início do período de esmagamento. Por essa razão, a capacidade da cepa M10682 de atuar na presença de leveduras selvagens foi examinada com mais detalhes.

[00122] Para fazer isso, as fermentações foram realizadas conforme indicado no Exemplo I, exceto que foram adicionadas fermentações adicionais (em duplicata) para testar o desempenho de uma mistura de M10682 com a amostra de levedura Moinho 1 e Moinho 2. Conforme acima, foram relatadas as titulações médias do experimento (18 ou 36 pontos de dados individuais) e a variação percentual comparada à cepa M7101. Uma mistura 50/50 das cepas de levedura, em uma base úmida, foi medida e calculada.

[00123] Os resultados das Figuras 10 e 11 mostram, nas condições de fermentação utilizadas, um sinergismo impressionante e surpreendente entre M10682 e as amostras de levedura Moinho. Quando uma cultura pura de M10682 fornece um aumento de 2% na produção de etanol, em relação ao M7101, e a levedura moinho, um aumento de ~ 0,5%, as misturas 50/50 fornecem um aumento de quase 4% no rendimento. Isso é acompanhado por uma redução na produção de glicerol, que é quase a mesma para as misturas, em comparação com as culturas puras de M10682, embora apenas 50% da população seja composta por M10682.

[00124] Além da sinergia observada, em termos de rendimento da produção de etanol, os dados coletados também mostraram uma sinergia clara das amostras M10682 e da levedura moinho, em termos da taxa de fermentação. A Figura 11 apresenta taxas de efluentes gasosos de fermentação para o 11 °ciclo de fermentação, durante a fermentação de teste, e foi típico de todos os dados da taxa de fermentação. Os dados são mostrados para a cepa M10682, amostras de levedura Moinho 1 e a mistura dos dois. A mistura da cepa M10682 com a amostra de levedura Moinho 1 produziu a fermentação mais rápida, terminando cerca de uma hora mais rápido do que a cepa M10682, ou a amostra de levedura Moinho 1 sozinha, o que representa um aumento de 17% na produtividade.

[00125] Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com as suas modalidades específicas, deve ser entendido que o escopo das reivindicações não deve ser limitado pelas modalidades preferenciais estabelecidas nos exemplos, mas deve ser dada a interpretação mais ampla consistente com a descrição como um todo. REFERÊNCIAS Patente n° de série U.S. 8.956.851 Publicação do Pedido de Patente n° U.S. 2011/0189744 Publicação do Pedido de Patente n° U.S. 2011/0312054 Publicação do Pedido de Patente n° 2012/0003701 Publicação Internacional n° WO 2009/138877 Publicação Internacional n° WO 2010/056805 Publicação Internacional n° WO 2010/060056 Publicação Internacional n° WO 2010/075529 Publicação Internacional n° WO 2011/153516 Publicação Internacional n° WO 2012/138942 Publicação Internacional n° WO 2015/023989 Publicação Internacional n° WO 2017/037614 Argueso JL, Carazzolle MF, Mieczkowski PA, Duarte FM, Netto OV, Missawa SK, Galzerani F, Costa GG, Vidal RO, Noronha MF, Dominska M, Andrietta MG, Andrietta SR, Cunha AF, Gomes LH, Tavares FC, Alcarde AR Dietrich FS, McCusker JH, Petes TD, Pereira GA. Genome structure of a Saccharomyces cerevisiae strain widely used in bioethanol production. Genome Res. Dez. 2009; 19 (12): p. 2258 a 2270. Wang J, Liu W, Ding W, Zhang G, Liu J. Increasing ethanol titer and yield in a gpd1Δ gpd2Δ strain by simultaneous overexpression of GLT1 and STL1 in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Lett. Nov. 2013; 35 (11): p. 1859 a 1864.

Claims (10)

1. Processo para produção de um produto de fermentação, o processo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende contatar (i) um primeiro meio de fermentação compreendendo um carboidrato com (ii) uma célula hospedeira de levedura recombinante para obter um primeiro meio fermentado sob condições para promover a produção do produto de fermentação, em que a célula hospedeira de levedura recombinante (a) tem uma proteína heteróloga que funciona para importar glicerol na célula hospedeira recombinante; em que a proteína heteróloga que funciona para importar glicerol é uma proteína STL1 simporter de prótons de glicerol; (b) tem uma deleção de uma primeira proteína glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD) dependente de NAD nativa; em que a primeira proteína GPD nativa é uma GPD1 ou GPD2; e (c) expressa pelo menos uma segunda proteína GPD heteróloga; em que a segunda proteína GPD heteróloga é uma GPD1 ou GPD2; em que o produto de fermentação é etanol; em que a proteína STL1 simporter de prótons de glicerol é expressa a partir de um gene sob o controle de um promotor glicolítico, um promotor de ADH1, um promotor de PGI1, um promotor de PFK1, um promotor de PFK2, um promotor de FBA1, um promotor de TPI1, um promotor de TDH1, um promotor de TDH2, um promotor de TDH3, um promotor de PGK1, um promotor de GPM1, um promotor de ENO1, um promotor de ENO2, um promotor de PYK2 ou um promotor de CDC19; e em que a pelo menos uma segunda proteína GPD heteróloga é expressa a partir de um gene sob o controle de um promotor osmótico, um promotor de GPD1, um promotor de DAK1 ou um promotor de TPS2.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o meio de fermentação compreende cana-de-açúcar, um derivado de cana- de-açúcar, melaço e/ou um derivado de melaço.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda pelo menos um ciclo de fermentação que compreende a lavagem ácida da célula hospedeira de levedura recombinante presente no meio fermentado para obter uma célula hospedeira de levedura recombinante lavada com ácido e contatar a célula hospedeira de levedura recombinante lavada com ácido com um segundo meio de fermentação compreendendo um carboidrato para obter um segundo meio fermentado sob condições para promover a produção do produto de fermentação e/ou compreender ainda pelo menos dois ou mais ciclos de fermentação.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a pelo menos uma segunda proteína GPD hete- róloga é uma proteína GPD2.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o promotor glicolítico é um promotor constitutivo.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína STL1 apresenta uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 ou 10 a 50.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira proteína GPD nativa é uma proteína glicerol-3-fosfato desidrogenase-1 (GPD1) nativa.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira de levedura recombinante é do gênero Saccharomyces sp.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira de levedura recombinante é da espécie Saccharomyces cerevisiae.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda proteína GPD heteróloga apresenta uma das SEQ ID NOs: 51 a 464.

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