BR112021008130A2

BR112021008130A2 - processo para prevenir ou limitar contaminação microbiana durante cultura contínua

Info

Publication number: BR112021008130A2
Application number: BR112021008130-5A
Authority: BR
Inventors: Emily Agnes Stonehouse; Kristen M. Deleault; Zachary LOSORDO; John McBride
Original assignee: Lallemand Hungary Liquidity Management Llc.
Priority date: 2018-11-02
Filing date: 2019-11-01
Publication date: 2021-08-03
Also published as: WO2020089847A1

Abstract

PROCESSO PARA PREVENIR OU LIMITAR CONTAMINAÇÃO MICROBIANA DURANTE CULTURA CONTÍNUA. Os processos de fermentação contínua ou de longo prazo são suscetíveis à contaminação por micro-organismos que podem levar à diminuição da eficiência. A presente invenção fornece um processo para limitar uma contaminação microbiana (entre 0,1-10%) durante uma cultura contínua de uma célula hospedeira de levedura recombinante em um meio. O processo é com base na utilização de uma combinação de uma célula hospedeira de levedura recombinante possuindo uma modificação genética para reduzir a expressão de um gene nocivo capaz de converter um agente pró-citotóxico em um agente citotóxico e um agente pró-citotóxico.

Description

“PROCESSO PARA PREVENIR OU LIMITAR CONTAMINAÇÃO MICROBIANA DURANTE CULTURA CONTÍNUA” REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO

[0001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisional U.S. 62/755.244 depositado em 2 de Novembro de 2018 e aqui incorporado em sua totalidade.

CAMPO TECNOLÓGICO

[0002] A presente invenção refere-se a processos para prevenir e/ou limitar e, em alguns casos, monitorar a contaminação microbiana durante uma cultura contínua, por exemplo, durante a produção de biocombustível por células hospedeiras de levedura recombinantes. Os processos são com base no uso de células hospedeiras de levedura geneticamente modificadas com uma modificação genética para reduzir a expressão de um gene potencialmente nocivo.

FUNDAMENTO

[0003] Fermentações contínuas (tais como, a fermentação de etanol combustível brasileira e/ou a fermentação de milho contínua) são suscetíveis a contaminações. Por exemplo, nas fermentações de etanol combustível brasileiras, as leveduras são inoculadas no início da safra da cana- de-açúcar e são recicladas continuamente por mais de 200 dias. As leveduras são recicladas usando centrifugação contínua e lavagem com ácido para melhorar a produtividade. Contaminantes de levedura selvagem estão continuamente entrando na fermentação, uma vez que os substratos de fermentação (por exemplo, caldo de cana-de-açúcar e melaço) não são esterilizados. Além disso, as cepas de levedura Saccharomyces cerevisiae predominantes usadas na indústria de etanol combustível brasileira são altamente heterozigotas e são conhecidas por terem rearranjos genômicos que criam desafios aos métodos de identificação molecular tradicionais usados para monitorar populações de levedura (tais como, por exemplo, amplificação de microssatélite e sequência interdelta, DNA polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) ou cariótipo por eletroforese em campo pulsado (PFGE)).

[0004] Monitorar e limitar a contaminação é importante em fermentações contínuas, tanto do ponto de vista econômico quanto do processamento. A levedura contaminante tem sido associada à diminuição da produção de etanol, floculação e formação de espuma. Mais de 95% das leveduras contaminantes são relatadas como outras cepas de Saccharomyces, muitas das quais têm características de fermentação desfavoráveis e podem levar a grandes perdas de produtividade se deixadas proliferarem. Menos de 5% não são Saccharomyces, tais como Dekkera bruxellensis, Candida krusei e Schizosaccharomyces pombe, mas essas cepas podem causar problemas se não forem controladas.

[0005] Há, portanto, a necessidade de ser fornecido um método de detecção estável e confiável para a dinâmica populacional que não seja sensível à recombinação cromossômica e permitiria uma maneira mais confiável de seguir a presença de cepas durante a fermentação. Há também a necessidade de métodos que permitam limitar a contaminação microbiana durante a fermentação contínua.

BREVE SUMÁRIO

[0006] A presente invenção refere-se ao uso de um agente pró- citotóxico para limitar a contaminação microbiana de uma cultura contínua de um meio de uma célula hospedeira de levedura recombinante e/ou para fazer um produto de fermentação pela célula hospedeira de levedura recombinante. A célula hospedeira de levedura recombinante é modificada para ser incapaz de metabolizar um agente pró-citotóxico em um agente citotóxico. Em algumas modalidades, o agente pró-citotóxico é usado para manter a contaminação microbiana entre 0,1-10% (e, em algumas modalidades, entre 0,1-1%) da população microbiana total na cultura contínua ou durante a fermentação.

[0007] De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um processo para prevenir ou limitar uma contaminação microbiana causada por micro-organismos contaminantes durante uma cultura contínua de uma célula hospedeira de levedura recombinante. O processo compreende cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante na presença de um agente pró-citotóxico, em que a célula hospedeira de levedura recombinante tem uma modificação genética para reduzir a expressão de um gene nocivo, e em que a modificação genética impede a conversão do agente pró-citotóxico em um agente citotóxico. Em uma modalidade, a modificação genética compreende interromper o quadro de leitura aberto do gene nocivo. Em outra modalidade, a modificação genética compreende o aumento da expressão de um gene que codifica um inibidor da expressão do gene nocivo.

Em uma modalidade adicional, o processo compreende: (a) cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante em um primeiro meio sem o agente pró-citotóxico até que um primeiro limite de micro-organismos contaminantes seja excedido, em que o primeiro meio compreende uma primeira população microbiana total e o primeiro limite de micro-organismos contaminantes é, pelo menos, acima de cerca de 0,1% da primeira população microbiana total; (b) quando o primeiro limite de micro-organismos contaminantes é atingido no primeiro meio, cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante em um segundo meio com o agente pró- citotóxico até que um segundo limite de micro-organismos contaminantes seja atingido, em que o segundo meio tem uma segunda população microbiana total e o segundo limite ≤ 0,1% da segunda população microbiana total; e (c) se ou quando o segundo limite de micro-organismos contaminantes for atingido no segundo meio, cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante no primeiro meio sem o agente pró-citotóxico.

Em outra modalidade, o processo compreende cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante no primeiro meio quando o segundo limite é atingido.

Em ainda outra modalidade, o processo compreende: (a) cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante em um segundo meio com o agente pró-citotóxico até que um segundo limite de micro- organismos contaminantes seja atingido, em que o segundo meio compreende uma segunda população microbiana total e o segundo limite de micro- organismos contaminantes ≤ 0,1% da segunda população microbiana total; (b) quando o segundo limite de micro-organismos contaminantes é atingido no segundo meio, cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante em um primeiro meio sem o agente pró-citotóxico até que um primeiro limite de micro- organismos contaminantes seja excedido, em que o primeiro meio tem uma primeira população microbiana total e o primeiro limite está acima de cerca de 0,1% da primeira população microbiana total; e (c) se ou quando o primeiro limite de micro-organismos contaminantes for excedido no primeiro meio, cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante no segundo meio sem o agente pró- citotóxico.

Em ainda outra modalidade, o processo compreende cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante no segundo meio quando o primeiro limite é excedido.

Em ainda outra modalidade, as etapas (a) e (b) são repetidas após a etapa (c). Em ainda outra modalidade, o processo compreende monitorar, no primeiro meio, a porcentagem de micro-organismos contaminantes em relação à primeira população microbiana total. Em ainda outra modalidade, o processo compreende monitorar, no segundo meio, a porcentagem de micro-organismos contaminantes em relação à segunda população microbiana total. Em outra modalidade, o monitoramento é feito, pelo menos, uma vez por mês ou, pelo menos, uma vez por semana. Em ainda outra modalidade, o monitoramento compreende avaliar o número de unidades formadoras de colônias dos micro- organismos contaminantes para monitorar a porcentagem de micro-organismos contaminantes. Em uma outra modalidade, o processo compreende adicionar o agente pró-citotóxico ao primeiro meio para obter o segundo meio. Em ainda uma outra modalidade, o processo compreende abster-se de adicionar o agente pró-citotóxico ao segundo meio para obter o primeiro meio. Em ainda uma outra modalidade, o processo compreende cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante em um segundo meio com o agente pró-citotóxico durante a cultura contínua. Em uma modalidade, o gene nocivo é, pelo menos, um de FCY1, FUR1, URA3, LYS2, LEU2, TRP1, HIS3, MET15 ou ADE2. Em ainda outra modalidade, o gene nocivo compreende FCY1 e, em ainda uma outra modalidade, o agente pró-citotóxico é 5-fluorocitosina (5-FC). Em uma outra modalidade, o gene nocivo é FUR1 e, em ainda uma outra modalidade, o agente pró-citotóxico é 5-fluorocitosina (5-FC) ou 5-fluorouracil (5-FU). Em uma outra modalidade, o gene nocivo compreende FCY1 e FUR1 e, em ainda uma outra modalidade, o agente pró-citotóxico é 5-fluorocitosina (5-FC) ou 5-fluorouracil (5- FU). Em uma modalidade, a concentração de 5-FC ou 5-FU está entre cerca de 0,1 e cerca de 500 ppm no segundo meio. Em ainda outra modalidade, o processo compreende colocar em contato o agente pró-citotóxico com a célula hospedeira de levedura recombinante, pelo menos, uma, duas ou três vezes por ano. Em uma outra modalidade, os micro-organismos contaminantes compreendem leveduras. Em outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante é de Saccharomyces sp. e, em outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante é de Saccharomyces cerevisiae.

[0008] De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção fornece um processo para fazer um produto de fermentação a partir de um primeiro e/ou um segundo meio de fermentação compreendendo um carboidrato.

O processo compreendendo cultivar uma célula hospedeira de levedura recombinante na presença de um agente pró-citotóxico sob condições de modo a permitir a produção do produto de fermentação, em que a célula hospedeira de levedura recombinante tem uma modificação genética para reduzir a expressão de um gene nocivo e, em que a modificação genética impede a conversão do agente pró-citotóxico em um agente citotóxico.

Em uma modalidade, a modificação genética compreende interromper o quadro de leitura aberto do gene nocivo.

Em outra modalidade, a modificação genética compreende o aumento da expressão de um gene que codifica um inibidor da expressão do gene nocivo.

Em uma modalidade, o processo compreende: (a) colocar em contato a célula hospedeira recombinante com o primeiro meio de fermentação compreendendo um carboidrato e sem o agente pró-citotóxico sob condições para promover a produção do produto de fermentação e até que um primeiro limite de micro-organismos contaminantes seja excedido, em que o primeiro meio de fermentação compreende uma primeira população microbiana total e o primeiro limite de micro-organismos contaminantes está acima de cerca de 0,1% da primeira população microbiana total; (b) quando o primeiro limite de micro-organismos contaminantes é excedido no primeiro meio de fermentação, cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante no segundo meio de fermentação com o carboidrato e o agente pró-citotóxico até que um segundo limite de micro-organismos contaminantes seja atingido, em que o segundo meio de fermentação tem uma segunda população microbiana total e o segundo limite ≤ 0,1% da segunda população microbiana total; e (c) se ou quando o segundo limite de micro-organismos contaminantes for atingido no segundo meio de fermentação, cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante no primeiro meio de fermentação.

Em uma modalidade, o processo compreende cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante no primeiro meio de fermentação quando o segundo limite é atingido.

Em ainda outra modalidade, o processo compreende: (a) cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante em um segundo meio de fermentação com um carboidrato e o agente pró-citotóxico até que um segundo limite de micro-organismos contaminantes seja atingido, em que o segundo meio de fermentação compreende uma segunda população microbiana total e o segundo limite de micro-organismos contaminantes ≤ 0,1% da segunda população microbiana total; (b) quando o segundo limite de micro-

organismos contaminantes é atingido no segundo meio de fermentação, cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante em um primeiro meio de fermentação compreendendo o carboidrato e sem o agente pró-citotóxico até que um primeiro limite de micro-organismos contaminantes seja excedido, em que o primeiro meio de fermentação tem uma primeira população microbiana total e o primeiro limite está entre cerca de 1-10% da primeira população microbiana total; e (c) se ou quando o primeiro limite de micro-organismos contaminantes for excedido no primeiro meio de fermentação, cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante no segundo meio de fermentação.

Em outra modalidade, o processo compreende cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante no segundo meio de fermentação quando o primeiro limite é excedido.

Em ainda outra modalidade, as etapas (a) e (b) são repetidas após a etapa (c). Em ainda outra modalidade, o processo compreende monitorar, no primeiro meio de fermentação, a porcentagem de micro-organismos contaminantes em relação à primeira população microbiana total.

Em outra modalidade, o processo compreende monitorar, no segundo meio de fermentação, a porcentagem de micro-organismos contaminantes em relação à segunda população microbiana total.

Em uma outra modalidade, o monitoramento é feito, pelo menos, uma vez por mês ou, pelo menos, uma vez por semana.

Em ainda outra modalidade, o monitoramento compreende avaliar o número de unidades formadoras de colônias dos micro-organismos contaminantes para monitorar a porcentagem de micro-organismos contaminantes.

Em uma outra modalidade, o processo compreende adicionar o agente pró-citotóxico ao primeiro meio de fermentação para obter o segundo meio de fermentação.

Em outra modalidade, o processo compreende abster-se de adicionar o agente pró-citotóxico ao segundo meio de fermentação para obter o primeiro meio de fermentação.

Em ainda outra modalidade, o processo compreende cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante em um segundo meio com o agente pró-citotóxico durante a cultura contínua.

Em uma modalidade, o gene nocivo é, pelo menos, um de FCY1, FUR1, URA3, LYS2, LEU2, TRP1, HIS3, MET15 ou ADE2. Em ainda outra modalidade, o gene nocivo compreende FCY1 e, em ainda outra modalidade, o agente pró-citotóxico é 5- fluorocitosina (5-FC). Em ainda outra modalidade, o gene nocivo é FUR1 e, em ainda outra modalidade, o agente pró-citotóxico é 5-fluorocitosina (5-FC) ou 5-

fluorouracil (5-FU). Em ainda outra modalidade, o gene nocivo compreende FCY1 e FUR1 e, em ainda outra modalidade, o agente pró-citotóxico é 5- fluorocitosina (5-FC) ou 5-fluorouracil (5-FU). Em ainda outra modalidade, o segundo meio de fermentação compreende entre cerca de 0,1 e cerca de 500 ppm de 5-FC ou 5-FU.

Em ainda uma outra modalidade, o processo compreende colocar em contato o agente pró-citotóxico com a célula hospedeira de levedura recombinante, pelo menos, uma, duas ou três vezes por ano.

Em uma modalidade, os micro-organismos contaminantes compreendem leveduras.

Em ainda outra modalidade, o carboidrato é um caldo de cana-de-açúcar, um derivado de cana-de-açúcar, milho, um derivado de milho, melaço e/ou um derivado de melaço.

Em ainda uma outra modalidade, o produto de fermentação é etanol, isopropanol, n-propanol, 1-butanol, metanol, acetona, 1, 2 propanodiol ou um polipeptídeo heterólogo.

Em uma modalidade, o processo ainda compreende colocar em contato o agente procitotóxico com a célula hospedeira de levedura recombinante antes de cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante.

Em outra modalidade, o processo ainda compreende, pelo menos, um ciclo de fermentação compreendendo a lavagem com ácido da célula hospedeira de levedura recombinante presente no primeiro e/ou segundo meio de fermentação para obter uma célula hospedeira microbiana recombinante lavada com ácido e colocar em contato a célula hospedeira de levedura recombinante lavada com ácido com o primeiro e/ou o segundo meio de fermentação para promover a produção do produto de fermentação.

Em ainda outra modalidade, o processo ainda compreende, pelo menos, dois ou mais ciclos de fermentação.

Em ainda outra modalidade, as etapas (a), (b) e (c) são realizadas, pelo menos, uma vez antes da lavagem com ácido.

Em ainda uma outra modalidade, as etapas (a), (b) e (c) são realizadas, pelo menos, uma vez em cada ciclo de fermentação.

Em uma modalidade, a modificação genética do gene nocivo não altera substancialmente o desempenho de fermentação da célula hospedeira de levedura recombinante quando comparado ao desempenho de fermentação de uma célula hospedeira de levedura correspondente sem a modificação genética.

Em ainda outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante é de Saccharomyces sp. e, em algumas modalidades adicionais, a célula hospedeira de levedura recombinante é de Saccharomyces cerevisiae.

[0009] De acordo com um terceiro aspecto, a presente invenção fornece um método para determinar a presença de micro-organismos contaminantes em um espécime com uma população microbiana total e compreendendo uma célula hospedeira de levedura recombinante, a célula hospedeira de levedura recombinante com uma modificação genética para reduzir a expressão de um gene nocivo e, em que a modificação genética impede a conversão de um agente pró-citotóxico em um agente citotóxico. O método compreende: (a) cultivar uma primeira amostra do espécime em um meio seletivo compreendendo o agente pró-citotóxico para determinar a presença de células hospedeiras de levedura recombinantess no espécime; (b) cultivar uma segunda amostra do espécime em um meio permissivo sem o agente pró-citotóxico para determinar a população microbiana total do espécime; e (c) determinar a presença de micro-organismos contaminantes no espécime com base na determinação feita nas etapas (a) e (b). Em uma modalidade, o gene nocivo é FCY1 e, em ainda uma outra modalidade, o agente pró-citotóxico é 5- fluorocitosina (5-FC). Em uma modalidade, o gene nocivo é FUR1 e, em ainda uma outra modalidade, o agente pró-citotóxico é 5-fluorocitosina (5-FC) ou 5- fluorouracil (5-FU). Em uma modalidade, o gene nocivo compreende FUR1 e, em ainda uma outra modalidade, o agente pró-citotóxico é 5-fluorocitosina (5- FC) ou 5-fluorouracil (5-FU).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00010] Tendo assim descrito genericamente a natureza da invenção, referência será feita agora aos desenhos anexos, mostrando a título de ilustração, uma modalidade preferida da mesma, e na qual:

[00011] A Figura 1 fornece uma modalidade do processo para monitorar e limitar a contaminação microbiana durante a fermentação.

[00012] As Figuras 2A a 2C mostram resultados de cultura de leveduras contaminantes (incluindo a cepa PE-2) e a cepa M10682 em meio carecendo e compreendendo 5-fluorocitosina (5FC). (Figura 2A) As placas mostradas no painel superior carecem de 5-FC e as placas mostradas no painel inferior incluem 500 μg/mL de 5-FC. Várias combinações de cepas M10682 e PE-2 ((i) 12% de M10682, 88% de PE-2; (ii) 26% de M10682, 74% de PE-2; (iii) 51% de M10682, 49% de PE-2; (iv) 73% de M10682, 27% de PE-2 e (v) 92% de M10682, 8% de PE-2) foram feitas e banhadas. O número de unidades formadoras de colônias está incluído para cada placa. (Figura 2B) As placas mostradas no painel superior carecem de 5-FC e permitem o crescimento de todas as cepas de levedura testadas. A placa de placas mostrada no painel inferior inclui 5-FC e não permitiu o crescimento de célula hospedeira de levedura de tipo selvagem (por exemplo, não recombinante). (Figura 2C) Meio líquido carecendo (i) ou compreendendo 500 μg/mL de 5-FC (ii) não foi inoculado (meio sozinho) ou inoculado com a cepa PE-2 ou M10682.

[00013] As Figuras 3A a 3C mostram o efeito da adição de 5-FC em culturas mistas de M10682 e PE-2. M10682 foi misturada com 1% (Figura 3A), 5% (Figura 3B) ou 10% (Figura 3C) de levedura PE-2 e várias rodadas de fermentação e reciclagem de células foram realizadas em uma cana-de-açúcar de origem industrial suplementada com 0 (♦), 1 (□) ou 4 () ppm de 5-FC. Após cada um dos quatro ciclos de fermentação, as leveduras foram subcultivadas e crescidas sem seleção por sete gerações. A abundância da cepa relativa foi, em seguida, determinada por PCR quantitativa (qPCR). Os resultados são apresentados como a percentagem de levedura contaminante (PE-2) detectada em função da quantidade de 5-FC utilizada e do ciclo de fermentação.

[00014] A Figura 4 mostra o efeito de uma deleção fur1 na resistência ao 5-FU e à produção de etanol. Os resultados são apresentados como o teor de etanol (g/L) em função das diferentes cepas ou combinações de cepas utilizadas. Barras cinza escuro fornecem a produção de etanol de cada cepa/população mista na ausência de 5-FU. Barras cinza claro fornecem a produção de etanol de cada cepa/população mista na presença de 50 ppm de 5- FU.

[00015] As Figuras 5A e 5B mostram o efeito de uma deleção fur1 na resistência a 5-FC. (Figura 5A) A cepa PE-2 foi misturada com as cepas M10682 ou M15980 (na relação indicada nas figuras) e as fermentações foram realizadas a 33°C em uma cana-de-açúcar industrial ou a mesma deve ser suplementada com 0 ou 10 ppm de 5-FC. Os títulos de etanol finais medidos por HPLC. Os resultados são apresentados como o teor de etanol (g/L) em função das diferentes cepas ou combinações de cepas usadas na ausência (barra cinza escuro) ou na presença (barras cinza claro) de 5-FC. (Figura 5B) A porcentagem de leveduras recombinantes na população de levedura fermentada antes (barras cinza escuro) e após (barras cinza claro) tratamento com 10 ppm de 5FC conforme determinado por plaqueamento de ágar seletivo. Os resultados são apresentados como a percentagem de levedura recombinante na população de levedura em função da combinação de leveduras testada.

[00016] A Figura 6 fornece um diagrama da conversão de citosina (painel esquerdo) ou 5-fluorocitosina (5FC)/5-fluorouracil (5FU) (painel direito) durante as sínteses de proteína e DNA. Conforme mostrado no painel esquerdo, 5FU está sendo convertido pela proteína FUR1 em compostos (FUMP, FUDP e FdUMP) que inibem as sínteses de RNA ou DNA e são assim considerados citotóxicos para uma célula de levedura que expressa a proteína FUR1.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00017] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. Além disso, a menos que exigido de outra forma pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular. Todas as publicações, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência em sua totalidade para todos os fins.

[00018] Os termos "gene(s)" ou "polinucleotídeo" ou "sequência(s) polinucleotídica(s)" destinam-se a incluir moléculas de ácido nucleico, por exemplo, polinucleotídeos que incluem um quadro de leitura aberto que codifica um polipeptídeo, e podem incluir ainda sequências regulatórias não codificantes e íntrons. Além disso, os termos se destinam a incluir um ou mais genes que mapeiam para um locus funcional. Na presente invenção, o gene é endógeno à célula hospedeira e, portanto, está localizado no genoma da célula hospedeira.

[00019] No contexto da presente invenção, um "gene ortólogo" é entendido como um gene em uma espécie diferente que evoluiu de um gene ancestral comum por especiação. Entende-se que a proteína codificada por um gene ortólogo retém a mesma função que a proteína codificada pelo gene ancestral comum.

[00020] No contexto da presente invenção, a célula hospedeira de levedura é um micro-organismo recombinante, por exemplo, uma célula hospedeira de levedura na qual uma modificação genética foi introduzida. Quando a modificação genética tem como objetivo reduzir ou inibir a expressão de um gene alvo específico (que é endógeno à célula hospedeira, tal como, por exemplo, um gene potencialmente nocivo), as modificações genéticas podem ser feitas em uma ou ambas as cópias dos genes alvo.

Alternativamente ou em combinação, as modificações genéticas podem ser feitas em uma ou em ambas as cópias de um gene, cujo produto de expressão modula a expressão ou função dos genes alvo (tal como, por exemplo, um gene que codifica para um inibidor de expressão dos genes alvo ou para um inibidor para uma proteína codificada pelos genes alvo). Tal modificação genética pode resultar na interrupção do quadro de leitura aberto, seja pela deleção de um ou mais resíduos de ácido nucleico no gene ou pela adição de um ou mais resíduos de ácido nucleico no gene.

Quando a modificação genética tem como objetivo aumentar a expressão de um gene direcionado específico (que é considerado heterólogo para a célula hospedeira, tal como, por exemplo, um gene envolvido na produção de um biocombustível), a modificação genética pode ser feita em um ou múltiplas localizações genéticas.

No contexto da presente invenção, quando a célula de levedura recombinante é qualificada como sendo "geneticamente modificada", entende-se que ela foi manipulada para adicionar, pelo menos, um ou mais resíduos de ácido nucleico heterólogos ou exógenos (por exemplo, adição genética) e/ou removida, pelo menos, um resíduo de ácido nucleico endógeno (ou nativo) (por exemplo, deleção genética). Em algumas modalidades, o um ou mais resíduos de ácido nucleico que são adicionados podem ser derivados de uma célula heteróloga ou da própria célula hospedeira recombinante.

No último cenário, os resíduos de ácido nucleico são adicionados em uma localização genômica que é diferente da localização genômica nativa.

Em algumas modalidades, uma única modificação genética pode ser feita para aumentar a expressão de um gene específico e diminuir a expressão de outro gene específico.

Isto pode ser feito, por exemplo, introduzindo a sequência codificadora do gene específico dentro da sequência codificadora do outro gene específico que acabará por causar a interrupção do quadro de leitura do outro gene específico.

As modificações genéticas aqui descritas não ocorreram na natureza e são os resultados de manipulações in vitro da levedura e/ou de uma evolução adaptativa de uma cepa parental cultivada na presença de uma pressão de evolução (tal como, por exemplo, na presença de um ou mais compostos (pró) citotóxicos).

[00021] A célula hospedeira de levedura recombinante pode ser obtida a partir de qualquer célula hospedeira de levedura. Em uma modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante pode ser usada na produção de biocombustíveis. As células hospedeiras de levedura adequadas podem ser, por exemplo, do gênero Saccharomyces, Kluyveromyces, Arxula, Debaryomyces, Candida, Pichia, Phaffia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces, Torula ou Yarrowia. As espécies de levedura adequadas podem incluir, por exemplo, S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, C. utilis, K. lactis, K. marxianus ou K. fragilis. Em algumas modalidades, a célula hospedeira de levedura é selecionada a partir do grupo que consiste em Saccharomyces cerevisiae, Schizzosaccharomyces pombe, Candida albicans, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utilis, Arxula adeninivorans, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus, Schizosaccharomyces pombe e Schwanniomyces occidentalis. Em algumas modalidades, a célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de levedura oleaginosa. Por exemplo, a célula hospedeira de levedura oleaginosa pode ser do gênero Blakeslea, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidum, Rhodotorula, Trichosporon ou Yarrowia. Em alguma modalidade alternativa, a célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira de microalgas oleaginosas (por exemplo, por exemplo, do gênero Thraustochytrium ou Schizochytrium). Em uma modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante é do gênero Saccharomyces e, em algumas modalidades, da espécie Saccharomyces cerevisiae.

[00022] Unidades formadoras de colônias. Conforme usado no contexto da presente invenção, unidades formadoras de colônias (ou CFU) é uma unidade usada para estimar o número de micro-organismos viáveis em uma amostra.

[00023] Agente citotóxico/pró-citotóxico. Conforme usado no contexto da presente invenção, um "agente citotóxico" refere-se a qualquer agente, geralmente um composto químico, capaz de reduzir o crescimento e/ou a viabilidade de um micro-organismo contaminante. O agente citotóxico é gerado pelo metabolismo de um "agente pró-citotóxico" pela atividade enzimática de uma proteína codificada por um gene nocivo. O gene é considerado “nocivo”

para o micro-organismo contaminante expressá-lo, pois permite o metabolismo do agente pró-citotóxico no agente citotóxico no micro-organismo contaminante. O agente citotóxico não reduz o crescimento e/ou a viabilidade da célula hospedeira de levedura recombinante porque a célula hospedeira de levedura recombinante inclui uma modificação genética de modo a permitir a redução ou a inibição da expressão do gene nocivo. A redução ou inibição da expressão do gene nocivo torna a célula hospedeira de levedura recombinante resistente (pelo menos em parte) ao agente citotóxico porque a célula hospedeira de levedura recombinante não tem a capacidade de converter metabolicamente o agente pró-citotóxico no agente citotóxico. Será entendido por aqueles versados na técnica que, nos métodos e processos da presente invenção, o agente utilizado deve ser cuidadosamente selecionado para corresponder ao gene nocivo sendo inibido na célula hospedeira de levedura de recombinação e vice-versa. Em uma modalidade, o gene nocivo é um gene nocivo que codifica uma enzima chave para a produção de um monômero usado na biossíntese (tais como, por exemplo, aminoácidos e nucleotídeos). Em Saccharomyces cerevisiae, os genes nocivos incluem, mas não estão limitados a FCY1 (que pode ser usado, em algumas modalidades, em combinação com o agente pró-citotóxico 5-FC), FUR1 (que pode ser usado, em algumas modalidades, em combinação com o agente pró-citotóxico 5-FC e/ou 5-FU), URA3 (que pode ser usado, em algumas modalidades, em combinação com o agente pró-citotóxico de ácido 5- fluoroorótico ou 5-FOA), LYS2, LEU2, TRP1, HIS3, MET15 e ADE2. No contexto da presente invenção, é contemplado que a expressão de mais de um gene nocivo seja inativada ou reduzida. Por exemplo, em algumas modalidades da presente invenção, é contemplado que FCY1 e FUR1 (que são considerados genes nocivos) sejam inativados na célula hospedeira de levedura recombinante.

[00024] População microbiana. Conforme usado no contexto da presente invenção, o termo "população microbiana" refere-se a um número de micro-organismos (independentemente do fato de que alguns membros da população podem ser células hospedeiras de levedura recombinantess ou micro- organismos contaminantes). A expressão "população microbiana total" refere-se ao número total de micro-organismos em um volume ou peso específico,

geralmente uma amostra do meio cultivado ou fermentado (também referido como meio de fermentação).

[00025] Contaminação microbiana. Conforme usado na presente invenção, o termo "contaminação microbiana" refere-se a uma subpopulação da população microbiana distinta das células hospedeiras de levedura recombinantess aqui descritas. A contaminação microbiana é composta por micro-organismos contaminantes que podem ser leveduras e carecem da modificação genética presente nas células hospedeiras de levedura recombinantess, tornando-as resistentes ao agente citotóxico. Os micro- organismos contaminantes incluem leveduras contaminantes (tais como, por exemplo, de Saccharomyces sp. (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae), Dekkera sp. (por exemplo, Dekkera bruxellensis), Candida sp. (por exemplo, Candida krusei) e/ou Schizosaccharomyces sp. (por exemplo, Schizosaccharomyces pombe), bem como, bactérias que expressam uma proteína com função similar à proteína nociva que foi inativada na célula hospedeira de levedura recombinante. Em uma modalidade, os micro- organismos contaminantes são leveduras. Em uma modalidade específica, a contaminação microbiana compreende uma maioria de leveduras de Saccharomyces sp. e uma minoria de leveduras de não Saccharomyces sp. (tais como, por exemplo, de Dekkera sp., Candida sp. e/ou Schizosaccharomyces sp.). Em ainda outra modalidade, a contaminação microbiana compreende, pelo menos, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% ou mais de leveduras de Saccharomyces sp. Em ainda outra modalidade, a contaminação microbiana compreende não mais do que 40%, 30%, 20%, 10%, 5% ou menos de leveduras de não Saccharomyces sp. Método para determinar/monitorar a contaminação microbiana

[00026] A presente invenção inclui um método para determinar a presença e/ou monitorar uma contaminação microbiana de um meio de cultura ou uma amostra do mesmo. O método é com base no uso de uma célula hospedeira de levedura recombinante portando uma modificação genética específica para diminuir ou impedir a expressão de um ou mais genes nocivos e, em última análise, conferir resistência a um agente citotóxico na célula hospedeira de levedura recombinante.

[00027] No contexto da presente invenção, e em células sem uma ou mais modificações genéticas, um agente pró-citotóxico é metabolizado pelo polipeptídeo codificado pelo gene nocivo para gerar o agente citotóxico. Como tal, limitar a expressão do gene nocivo na célula hospedeira de levedura recombinante inibe ou impede a expressão/atividade do polipeptídeo codificado pelo gene nocivo que altera ou reduz a conversão de um agente pró-citotóxico em um agente citotóxico que, em última análise, confere uma resistência (pelo menos parcial) ao agente citotóxico.

[00028] Em termos gerais, o método de determinação compreende cultivar a população microbiana obtida a partir de um espécime, um meio de cultura, um meio fermentado ou uma amostra do mesmo em um meio seletivo (compreendendo o agente pró-citotóxico para permitir o crescimento da célula hospedeira de levedura recombinante compreendendo a modificação genética como aqui descrito e inibindo o crescimento de micro-organismos contaminantes que não possuem a modificação genética) e/ou em um meio permissivo (sem o agente pró-citotóxico para permitir o crescimento de micro-organismos presentes no meio de cultura ou na amostra do mesmo, independentemente do fato de serem portadores ou não da modificação genética). Este sistema de cultura duplo permite discriminar a população microbiana entre as células hospedeiras de levedura recombinantess (capazes de crescer em ambos os meios) e os micro-organismos contaminantes (capazes de crescer apenas no meio permissivo). O método também compreende a determinação da proporção de células hospedeiras de levedura recombinantess e/ou micro-organismos contaminantes na população microbiana do espécime, no meio de cultura ou no meio fermentado. Tal determinação pode ser feita por métodos conhecidos na técnica, tal como, por exemplo, avaliar o número de unidades formadoras de colônia em placas de cultura, a densidade óptica em meio líquido, o número de células usando um hemocitômetro, detecção de ácido nucleico (amplificação, sequenciamento, microarranjo, etc.), etc. Tal determinação pode ser apresentada, por exemplo, como a relação do número de células/CFU das leveduras recombinantes para o número total de células/CFU do meio ou da amostra, a relação do número de células/CFU dos micro-organismos contaminantes para o número total de células/CFU do meio ou da amostra, a relação do número de células/CFU das leveduras recombinantes para o número de células/CFU dos micro-organismos contaminantes e/ou a relação entre o número de células/CFU dos micro-organismos e o número de células/CFU das leveduras recombinantes. Em outro exemplo, a determinação pode ser apresentada como a porcentagem do número de células/CFU dos micro- organismos contaminantes em relação ao número total de células/CFU do meio ou da amostra, a porcentagem do número de células/CFU do hospedeiro de levedura recombinante em relação ao número total de células/CFU do meio ou da amostra. Em ainda outra modalidade, a determinação é apresentada como a porcentagem do número de células dos micro-organismos contaminantes em relação ao número total de células do meio ou da amostra. A determinação pode ser repetida com o tempo e, em tais casos, é chamada de “monitoramento” da cultura.

[00029] O método pode ser realizado para determinar a presença e extensão de uma contaminação microbiana por micro-organismos contaminantes e, como indicado acima, pode ser usado para monitorar a evolução da contaminação microbiana no tempo. O método é especialmente útil para monitorar culturas contínuas da célula hospedeira de levedura recombinante. Conforme usado no contexto da presente invenção, uma "cultura contínua" da célula hospedeira de levedura recombinante refere-se a uma cultura que dura, pelo menos, um ciclo de fermentação e está sujeita ao controle de micro-organismos contaminantes de tipo selvagem, tais como, por exemplo, por leveduras de tipo selvagem. As culturas contínuas podem incluir culturas descontínuas alimentadas, em que as células de levedura são recicladas para inocular uma nova cultura descontínua alimentada. Culturas contínuas são realizadas, por exemplo, nos processos de biocombustíveis brasileiros, na fermentação do milho, bem como, em outros processos de etanol de longa duração. Célula hospedeira de levedura recombinante

[00030] Conforme aqui descrito, a célula hospedeira de levedura recombinante carrega uma ou mais modificações genéticas para diminuir ou impedir a expressão de um ou mais genes nocivos endógenos. Genes nocivos endógenos adequados incluem, mas não são limitados a aqueles envolvidos nas sínteses de ácido nucleico de novo, tal como síntese de uridina (FCY1, FUR1) ou síntese de adenina, bem como, aqueles envolvidos nas sínteses de aminoácido (URA3, LYS2, LEU2, TRP1, HIS3, MET15 e ADE2). A modificação genética pode ser feita em um ou mais genes nocivos, bem como, em uma ou mais cópias dos genes nocivos. Em uma modalidade, a modificação genética é feita em todas as cópias dos genes nocivos selecionados. Em uma modalidade, a modificação genética é uma adição genética dentro do quadro de leitura aberto do gene nocivo de modo a interromper ao quadro de leitura de tal gene.

[00031] Em uma modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante pode carregar uma modificação genética para diminuir/impedir a expressão de um gene que codifica uma citosina desaminase, tal como, por exemplo, o gene FCY1 ou um gene ortólogo do gene FCY1. Em Saccharomyces cerevisiae, o gene FCY1 codifica uma citosina desaminase capaz de metabolizar os agentes pró-citotóxicos, 5-fluorocitosina e 5-fluorocitidina, em agentes citotóxicos, 5-fluorouracil e 5-fluorouridina, respectivamente. A modificação genética pode ser feita em um ou mais dos seguintes genes Saccharomyces cerevisiae Gene ID 856175, Scheffersomyces stipitis Gene ID 4839675 e 4838793, Sugiyamaella lignohabitans Gene ID: 30036201, Saccharomyces eubayanus Gene ID: 28934651, Beauveria bassiana Gene ID: 19888208, Purpureocillium lilacinumor Gene ID: 28882931, Ostreococcus tauri Gene ID: 9837926 e 9833302, bem como, seus genes ortólogos correspondentes. Alternativamente ou em combinação, a modificação genética pode ser feita em um ou mais genes que codificam as seguintes proteínas identificadas por seu Número de Acesso GenBank: NP_015387.1, AJW23097.1, AJV96709.1, EGA60101.1, ATB23854.1, EHN04073.1, AAG33626.1, EGA72733.1, SCN22162.1, AFM78648.1, XP_018219080.1, EHM99818.1, XP_003680593.1, XP_003683874.1, XP_003667919.1, SMN18141.1, XP_003674048.1, XP_001644868.1, XP_445483.1, XP_003958642.1, SCW01268.1, ABG43006.1, CUS23860.1, XP_002554144.1, SCV05713.1, SCU92348.1, XP_002496341.1, SCU81687.1, AQZ14233.1, GAV53400.1, CDH13752.1, XP_022630113.1, SCU82976.1, AQZ10489.1, XP_022465730.1, XP_451904.1, CDO92427.1, XP_022678383.1, SCV03733.1, AGO12921.1, XP_004177972.1, XP_019038655.1, NP_983768.2, XP_011272138.1, CCE84718.1, XP_001385070.2, XP_020078665.1, XP_020071353.1, XP_007377322.1, XP_018209416.1, XP_013936499.1, XP_015469400.1, ABD24095.1, OVF09408.1, OEJ85321.1, KDQ23147.1, ODV98554.1, XP_018711764.1,

EDK39700.2, XP_001484417.1, SGZ47344.1, XP_002770827.1, XP_006687734.1, ONH68939.1, XP_016213901.1, PIS48695.1, XP_018987201.1, GAT44865.1, XP_016229010.1, ORY62206.1, XP_016261374.1, OCW31955.1, CDR37774.1, GAD94373.1, XP_009546940.1, XP_018191494.1, KUL86194.1, KKY36622.1, KZP31907.1, EMR81126.1, KIW62513.1, GAM38076.1, KUI66787.1, PMD17950.1, EMG45712.1, XP_022501696.1, XP_013319060.1, XP_002150180.1, XP_002484082.1, XP_020066952.1, KKY16093.1, OAL07706.1, CAE82258.1, EKG21993.1 ou PIL30025.1. A modificação genética pode ser feita no gene FCY1 (ou no gene ortólogo FCY1), bem como, em uma ou mais cópias do gene FCY1 (ou no gene ortólogo FCY1). Em uma modalidade, a modificação genética é feita em todas as cópias do gene FCY1 (ou o gene ortólogo FCY1). Em uma modalidade, a modificação genética é uma adição genética dentro do quadro de leitura aberto do gene FCY1 (ou o gene ortólogo FCY1) de modo a interromper o quadro de leitura do gene FCY1 (ou o gene ortólogo FCY1), inibindo assim sua expressão. Em combinação com um agente pró-citotóxico, a célula hospedeira de levedura recombinante com uma modificação genética no gene FCY1 (ou um gene ortólogo FCY1) é especialmente útil para limitar a contaminação microbiana em culturas contínuas com menos de 10% de contaminação microbiana.

[00032] Em uma modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante pode carregar uma modificação genética para diminuir a expressão de uma uracil fosforribosiltransferase, tal como o gene FUR1 ou um gene ortólogo FUR1. Em Saccharomyces cerevisiae, o gene FUR1 codifica uma uracil fosforribosiltransferase capaz de metabolizar os agentes pró-citotóxicos, 5-fluorouracil em 5-fluorouridina monofosfato e 5-fluorodeoxiuridina monofosfato. A modificação genética pode ser feita em um ou mais dos seguintes genes Saccharomyces cerevisiae Gene ID: 856529, Candida albicans Gene ID: 3646348, Scheffersomyces stipitis Gene ID: 4839411, Sugiyamaella lignohabitans Gene ID: 30037338, Saccharomyces eubayanus Gene ID: 28931669, Candida auris Gene ID: 28873876, Candida orthopsilosis Gene ID: 14538621, Zymoseptoria tritici Gene ID: 13394585, bem como, seus ortólogos correspondentes. Alternativamente ou em combinação, a modificação genética pode ser feita em um ou mais genes que codificam as seguintes proteínas identificadas por seu Número de Acesso GenBank: NP_011996.2, AAA34611.1,

EGA78586.1, EJS43479.1, AAG33626.1, AAB19947.2, EJT44383.1, ATB23854.1, SCN22162.1, AFM78648.1, XP_018221908.1, EGA74672.1, XP_001646180.1, XP_003675167.1, XP_003686112.1, A5H0J4.1, XP_447193.1, XP_003668723.1, XP_022466023.1, SMN18920.1, XP_003957792.1, XP_022628074.1, SCU87814.1, SCU85479.1, XP_002498244.1, GAV55604.1, CDF91960.1, GAV50813.1, SJM86598.1, XP_003670868.1, SCU95973.1, SCV02910.1, XP_002552045.1, SCW03519.1, XP_003647576.1, XP_017986375.1, CUS22339.1, XP_003679822.1, XP_022674246.1, SCU80196.1, XP_454985.1, CDO95124.1, AGO13201.1, NP_985599.1, XP_019041613.1, XP_020049305.1, ABD19514.1, XP_002615165.1, XP_011274553.1, XP_018985203.1, ANZ74534.1, XP_015465817.1, CCE84646.1, OEJ88599.1, EHN02058.1, SGZ51144.1, XP_002489914.1, ODV98452.1, XP_001385142.1, CCE43978.1, XP_506088.1, XP_003867375.1, XP_018710073.1, ODQ68545.1, XP_018172396.2, XP_020073271.1, XP_002770455.1, XP_002420612.1, EMG46465.1, XP_006685579.1, OUM53290.1, XP_712023.1, XP_002548392.1, ONH70060.1, XP_007375441.1, XP_020064281.1, XP_001524806.1, CDR37616.1, OWB76646.1, XP_001482408.1, OWB55638.1, KGR11196.1, XP_020074370.1, XP_022457337.1, CDO55385.1, XP_013932538.1, KKA25964.1, CZR59070.1, PMD64816.1, CCD51448.1, XP_007838875.1, XP_018074385.1, XP_001598104.1, PHH51712.1, CEJ94560.1, ORY06946.1, EIF48879.1, OIW29874.1 or XP_008079195.1. A modificação genética pode ser feita no gene FUR1 (ou no gene ortólogo FUR1), bem como, em uma ou mais cópias do gene FUR1 (ou no gene ortólogo FUR1). Em uma modalidade, a modificação genética é feita em todas as cópias do gene FUR1 (ou o gene ortólogo FUR1). Em uma modalidade, a modificação genética é uma adição genética dentro do quadro de leitura aberto do gene FUR1 (ou o gene ortólogo FUR1) de modo a interromper o quadro de leitura do gene FUR1 (ou o gene ortólogo FUR1), inibindo assim sua expressão.

Em combinação com um agente pró-citotóxico, a célula hospedeira de levedura recombinante com uma modificação genética no gene FUR1 (ou um gene ortólogo FUR1) é especialmente útil para limitar a contaminação microbiana em culturas contínuas, mesmo tendo mais de 10% de contaminação microbiana.

[00033] Em ainda outra modalidade, a levedura recombinante pode carregar, pelo menos, duas modificações genéticas distintas: uma primeira para diminuir ou impedir a expressão de um gene FCY1 (ou um gene ortólogo correspondente) e uma segunda para diminuir ou impedir a expressão de um FCU1 gene (ou um gene ortólogo correspondente). Nesta modalidade, as modificações genéticas são feitas nos genes FCY1 e FUR1 (ou seus genes ortólogos correspondentes), bem como, em uma ou mais cópias dos genes FCY1 e FUR1 (ou seus genes ortólogos correspondentes). Em uma modalidade, a modificação genética é feita em todas as cópias dos genes FCY1 e FUR1 (ou seus genes ortólogos correspondentes). Em uma modalidade, a modificação genética é uma adição genética dentro do quadro de leitura aberto dos genes FCY1 e FUR1 (ou seus genes ortólogos correspondentes) de modo a interromper o quadro de leitura de ambos os genes FCY1 e FUR1 (ou seus genes ortólogos correspondentes). Em combinação com um agente pró- citotóxico, a célula hospedeira de levedura recombinante com uma modificação genética em ambos os genes FCY1 e FUR1 (ou seus genes ortólogos correspondentes) são especialmente úteis para limitar a contaminação microbiana em culturas contínuas, mesmo tendo mais de 10% de contaminação microbiana.

[00034] A célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção também pode incluir modificações genéticas adicionais, por exemplo, uma modificação genética para aumentar a atividade de uma proteína que funciona para importar glicerol e/ou uma modificação genética para diminuir sua atividade de glicerol-3-fosfato dependente de NAD em altas condições osmóticas, conforme indicado no pedido de patente PCT publicado sob o documento WO2018/215956 e depositado em 23 de Maio de 2018.

[00035] A célula hospedeira microbiana recombinante pode ter, pelo menos, uma modificação genética que permite aumentar a atividade (biológica) de uma proteína que funciona para importar glicerol (por exemplo, transportar ativamente glicerol dentro da célula) e/ou diminuir a atividade (biológica) de uma proteína que funciona para exportar glicerol (por exemplo, transportar ativamente o glicerol dentro da célula). Ainda no contexto da presente invenção, a atividade da proteína que funciona para importar/exportar glicerol na célula hospedeira microbiana recombinante é modulada em condições glicolíticas.

[00036] Em uma modalidade, as células hospedeiras microbianas recombinantes têm, pelo menos, uma modificação genética que permite aumentar a atividade (biológica) de uma proteína que funciona para importar glicerol (por exemplo, transportar ativamente glicerol dentro da célula). Ainda no contexto da presente invenção, a atividade da proteína funcionando para importar glicerol na célula hospedeira microbiana recombinante é aumentada em condições glicolíticas. A proteína STL1 é uma proteína exemplar que funciona para importar glicerol.

[00037] Em outra modalidade, as células hospedeiras microbianas recombinantes têm, pelo menos, uma modificação genética que permite diminuir a atividade (biológica) de uma proteína que funciona para exportar glicerol (por exemplo, transportar ativamente glicerol para fora da célula). Ainda no contexto da presente invenção, a atividade da proteína funcionando para exportar glicerol na célula hospedeira microbiana recombinante é diminuída em condições glicolíticas. A proteína FPS1 é uma proteína exemplar que funciona para exportar glicerol. A proteína FPS1 é uma proteína de canal localizada na membrana plasmática que controla o acúmulo e a liberação de glicerol na osmorregulação da levedura. Mutantes nulos dessa cepa acumulam grandes quantidades de glicerol intracelular, crescem muito mais devagar do que o tipo selvagem, e consomem o substrato de açúcar em uma taxa mais lenta. Como tal, a modificação genética pode incluir a redução ou deleção da expressão do gene que codifica a proteína FPS1 durante as condições glicolíticas.

[00038] Conforme usado no contexto da presente invenção, a expressão "condições glicolíticas" refere-se à presença de glicose suficiente no ambiente em torno da célula hospedeira microbiana recombinante para desencadear a absorção dessa glicose pela célula. O aumento na atividade de importação de glicerol pode ser observado em relação à mesma célula microbiana recombinante que não está sofrendo glicólise (por exemplo, durante a fase de propagação da célula microbiana recombinante ou na ausência de glicose). Este aumento também pode ser observado em relação a uma célula hospedeira microbiana recombinante correspondente sem a modificação genética. No contexto da presente invenção, não é necessário que o aumento na atividade da proteína que funciona para importar glicerol seja limitado a circunstâncias em que a célula hospedeira microbiana recombinante esteja em condições glicolíticas, mas é importante que o aumento na atividade seja observado quando a célula hospedeira microbiana recombinante é colocada em condições glicolíticas.

[00039] As células hospedeiras microbianas recombinantes da presente invenção podem incluir uma modificação genética para introduzir (uma ou mais cópias de) uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica uma proteína heteróloga funcionando para importar glicerol e/ou para substituir o promotor do gene que codifica a proteína nativa funcionando para importar glicerol com um promotor glicolítico.

[00040] A fim de aumentar a atividade da proteína que funciona para importar glicerol, é possível incluir, na célula hospedeira microbiana recombinante, uma ou mais cópias de uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a proteína que funciona para importar glicerol. Por exemplo, a célula hospedeira microbiana recombinante pode ter um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou mais cópias da molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a proteína funcionando para importar glicerol. Em uma modalidade, a célula hospedeira microbiana recombinante compreende entre quatro e oito cópias da molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a proteína que funciona para importar glicerol. Em uma modalidade, a célula hospedeira microbiana recombinante compreende, pelo menos, (e, em algumas modalidades adicionais não mais do que) duas cópias da molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a proteína funcionando para importar glicerol. Em outra modalidade, a célula hospedeira microbiana recombinante compreende, pelo menos, (e, em algumas modalidades adicionais não mais do que) três cópias da molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a proteína funcionando para importar glicerol. Em ainda outra modalidade, a célula hospedeira microbiana recombinante compreende, pelo menos, (e, em algumas modalidades adicionais não mais do que) quatro cópias da molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a proteína funcionando para importar glicerol. Em ainda outra modalidade, a célula hospedeira microbiana recombinante compreende, pelo menos, (e, em algumas modalidades adicionais não mais do que) cinco cópias da molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a proteína funcionando para importar glicerol. Em uma outra modalidade, a célula hospedeira microbiana recombinante compreende, pelo menos, (e, em algumas modalidades adicionais não mais do que) seis cópias da molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a proteína funcionando para importar glicerol. Em ainda uma outra modalidade, a célula hospedeira microbiana recombinante compreende, pelo menos, (e, em algumas modalidades adicionais não mais do que) sete cópias da molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a proteína funcionando para importar glicerol. Em ainda uma outra modalidade, a célula hospedeira microbiana recombinante compreende, pelo menos, (e, em algumas modalidades adicionais não mais do que) oito cópias da molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a proteína funcionando para importar glicerol. A molécula de ácido nucleico heteróloga pode ser independentemente replicada ou integrada na célula hospedeira microbiana recombinante. Quando a molécula de ácido nucleico heteróloga é integrada na célula hospedeira microbiana recombinante, ela é de preferência, posicionada no local de integração neutro. Quando mais de uma cópia da molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a proteína que funciona para importar glicerol é introduzida na célula hospedeira microbiana recombinante, cada uma das cópias pode ser integrada em um ou mais (iguais ou diferentes) locais de integração.

[00041] A fim de atingir a expressão (ou, em algumas modalidades, a superexpressão) da atividade da proteína funcionando para importar glicerol em condições glicolíticas, pode ser necessário incluir um promotor glicolítico para controlar a expressão do gene que codifica a proteína funcionando para importar glicerol. No contexto da presente invenção, um "promotor glicolítico" é um promotor (ou uma combinação de promotores) que permite a expressão (ou, em algumas modalidades, a superexpressão) de um gene quando a célula microbiana recombinante é colocada em condições glicolíticas. O promotor glicolítico pode ser incluído na célula hospedeira microbiana recombinante para controlar a expressão de um gene nativo e/ou heterólogo que codifica a proteína funcionando para importar glicerol. O promotor glicolítico pode ser um promotor constitutivo ou um promotor indutível por glicose. Os promotores glicolíticos excluem os promotores repressíveis pela glicose. Os promotores induzíveis por glicose são geralmente associados a genes que codificam enzimas na via glicolítica e os promotores que controlam a expressão de enzimas que são reguladas positivamente na via glicolítica podem ser usados na célula hospedeira microbiana recombinante da presente invenção. As enzimas da via glicolítica cuja expressão é regulada positivamente na presença de glicose incluem, mas não são limitadas àquelas codificadas por um gene da álcool desidrogenase, um gene da glicose-6-fosfato isomerase, um gene da fosfofrutocinase, um gene da aldolase, um gene triosefosfato isomerase, um gene da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, um gene da 3-fosfoglicerato quinase, uma fosfoglicerato mutase, um gene da enolase e da piruvato quinase. Como tal, no contexto da presente invenção, o promotor glicolítico pode ser um promotor (ou uma combinação de promotores) de um gene da álcool desidrogenase, um gene da glicose-6-fosfato isomerase, um gene da fosfofrutocinase, um gene da aldolase, um gene da triosefosfato isomerase, um gene da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, um gene da 3-fosfoglicerato quinase, uma fosfoglicerato mutase, um gene da enolase e/ou da piruvato quinase.

[00042] Em Saccharomyces cerevisiae, as enzimas da via glicolítica cuja expressão é regulada positivamente na presença de glicose incluem, mas não são limitadas àquelas codificadas por um gene ADH1, um gene PGI1, um gene PFK1, um gene PFK2, um gene FBA1, um gene TPI1, um gene TDH1, um gene TDH2, um gene TDH3, um gene PGK1, um gene GPM1, um gene ENO1, um gene ENO2, um gene PYK2 e um gene CDC19. Como tal, no contexto da presente invenção, o promotor glicolítico pode ser um promotor (ou uma combinação de promotores) de um gene ADH1 (referido como o promotor ADH1 ou adh1p), um gene PGI1 (referido como o promotor PGI1 ou pgi1p), um gene PFK1 (referido como o promotor PFK1 ou pfki1p), um gene PFK2 (referido como o promotor PFK2 ou o pfk2p), um gene FBA1 (referido como o promotor FBA1 ou fba1p), um gene TPI1 (referido como um promotor TPI1 ou tpi1p), um gene TDH1 (referido como o promotor TDH1 ou tdh1p), um gene TDH2 (referido como o promotor TDH2 ou tdh2p), um gene TDH3 (referido como o promotor TDH3 ou tdh3p), um gene PGK1 (referido como o promotor PGK1 ou pgk1p), um gene GPM1 (referido como o promotor GPM1 ou gpm1p), um gene ENO1 (referido como o promotor ENO1 ou eno1p), um gene ENO2 (referido a como o promotor ENO2 ou eno2p), um gene PYK2 (referido como o promotor PYK2 ou pyk2p) e/ou um gene CDC19 (referido como o CDC19 ou cdc19p).

[00043] Proteínas exemplares capazes de funcionar para importar glicerol incluem aquaporinas, bem como, facilitadores de glicerol. A proteína

FPS1 (codificada pelo Gene ID 850683 em Saccharomyces cerevisiae) é um facilitador de glicerol capaz de importar glicerol. Como tal, a proteína capaz de funcionar para importar glicerol pode ser uma proteína FPS1 ou uma proteína codificada por um gene ortólogo FPS1. A proteína FPS1 pode ser derivada, por exemplo, de Saccharomyces cerevisiae ou um ortólogo correspondente encontrado em Pachysolen tannophilus, Komagataella pastoris, Yarrowia lipolytica e/ou Cyberlindnera jadinii.

[00044] Outra proteína exemplar capaz de funcionar para importar glicerol é o glicerol inativado por glicose/simportador de prótons STL1. A função nativa da proteína STL1 é a captação de glicerol do ambiente extracelular. STL1 é um membro da família Sugar Porter, que faz parte da Superfamília de Facilitadores Principais (MFS). STL1 transporta glicerol pelo simporte de prótons, o que significa que o glicerol e os prótons são cotransportados através de STL1 para a célula. Em S. cerevisiae, a expressão de STL1 e a captação de glicerol são tipicamente reprimidas quando existem outras fontes de carbono, tal como glicose, disponíveis. Quando as células sofrem alto choque osmótico, o STL1 é expresso para ajudar a lidar com o choque osmótico, transportando o glicerol osmoprotetor para o interior da célula e aumentando a concentração de glicerol intracelular. No contexto da presente invenção, a proteína que funciona para importar glicerol pode ser a proteína STL1, uma variante da proteína STL1 ou um fragmento da proteína STL1. Nas modalidades em que a proteína que funciona para importar glicerol é uma variante ou um fragmento da proteína STL1, a variante ou o fragmento precisa exibir, pelo menos, parte da atividade biológica da proteína STL1 nativa, ou seja, a capacidade de agir como um simporte de prótons conforme indicado acima.

[00045] A proteína heteróloga que funciona para importar glicerol pode ser codificada por um gene STL1. A proteína STL1 é nativamente expressa em leveduras e fungos, portanto, a proteína heteróloga que funciona para importar glicerol pode ser derivada de leveduras e fungos. Os genes STL1 que codificam a proteína STL1 incluem, mas não são limitados a, Saccharomyces cerevisiae Gene ID: 852149, Candida albicans, Kluyveromyces lactis Gene ID: 2896463, Ashbya gossypii Gene ID: 4620396, Eremothecium sinecaudum Gene ID: 28724161, Torulaspora delbrueckii Gene ID: 11505245, Lachancea thermotolerans Gene ID: 8290820, Phialophora attae Gene ID: 28742143,

Penicillium digitatum Gene ID: 26229435, Aspergillus oryzae Gene ID: 5997623, Aspergillus fumigatus Gene ID: 3504696, Talaromyces atroroseus Gene ID: 31007540, Rasamsonia emersonii Gene ID: 25315795, Aspergillus flavus Gene ID: 7910112, Aspergillus terreus Gene ID: 4322759, Penicillium chrysogenum Gene ID: 8310605, Alternaria alternata Gene ID: 29120952, Paraphaeosphaeria sporulosa Gene ID: 28767590, Pyrenophora tritici-repentis Gene ID: 6350281, Metarhizium robertsii Gene ID: 19259252, Isaria fumosorosea Gene ID: 30023973, Cordyceps militaris Gene ID: 18171218, Pochonia chlamydosporia Gene ID: 28856912, Metarhizium majus Gene ID: 26274087, Neofusicoccum parvum Gene ID:19029314, Diplodia corticola Gene ID: 31017281, Verticillium dahliae Gene ID: 20711921, Colletotrichum gloeosporioides Gene ID: 18740172, Verticillium albo-atrum Gene ID: 9537052, Paracoccidioides lutzii Gene ID: 9094964, Trichophyton rubrum Gene ID: 10373998, Nannizzia gypsea Gene ID: 10032882, Trichophyton verrucosum Gene ID: 9577427, Arthroderma benhamiae Gene ID: 9523991, Magnaporthe oryzae Gene ID: 2678012, Gaeumannomyces graminis var. tritici Gene ID: 20349750, Togninia minima Gene ID: 19329524, Eutypa lata Gene ID: 19232829, Scedosporium apiospermum Gene ID: 27721841, Aureobasidium namibiae Gene ID: 25414329, Sphaerulina musiva Gene ID: 27905328, bem como, Pachysolen tannophilus Números de Acesso GenBank JQ481633 e JQ481634, Saccharomyces paradoxus STL1 e Pichia sorbitophilia. Em uma modalidade, a proteína STL1 é codificada por Saccharomyces cerevisiae Gene ID: 852149.

[00046] A proteína heteróloga que funciona para importar glicerol pode ser codificada por um gene STL1 como aqui indicado ou um gene ortólogo STL1. A proteína heteróloga que funciona para importar glicerol pode ser uma proteína STL1 como aqui definida, uma variante da proteína STL1 e/ou um fragmento da proteína STL1. Além disso, quando mais de uma cópia da STL1 heteróloga é incluída na célula microbiana recombinante, a pluralidade de moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam a proteína STL1 podem ser iguais ou diferentes, integradas no mesmo ou em locais de integração diferentes.

[00047] A célula hospedeira microbiana recombinante também pode ter uma modificação adicional que lhe permite diminuir sua atividade (biológica) de glicerol-3-fosfato dependente de NAD em altas condições osmóticas. É importante notar que a célula hospedeira microbiana recombinante pode reter substancialmente a mesma atividade (biológica) de glicerol-3-fosfato dependente de NAD em condições osmóticas normais a baixas. Em ainda uma outra modalidade, a célula hospedeira microbiana recombinante da presente invenção pode expressar, pelo menos, uma proteína GPD (que pode ser nativa ou heteróloga para a célula hospedeira microbiana).

[00048] Tal como aqui utilizado, a expressão "altas condições osmóticas" refere-se à presença de uma alta pressão osmótica, geralmente causada por um aumento na concentração de soluto no ambiente em torno da célula hospedeira microbiana recombinante. Em algumas modalidades, "altas condições osmóticas" estão associadas a uma regulação positiva de HOG, uma concentração de açúcares superior a cerca de 50 g/L e/ou equivalente a, pelo menos, 1 g/L de sal (tal como, NaCl) quando a célula hospedeira microbiana recombinante é uma célula hospedeira de levedura. Esta diminuição na atividade de glicerol-3-fosfato dependente de NAD pode ser observada em relação à mesma célula recombinante em condições normais ou de baixa osmose ou em relação a uma célula hospedeira microbiana recombinante sem a modificação genética. Como também usado na presente invenção, a expressão "condições normais ou de baixa osmose" refere-se a condições que não estão associadas com alta pressão osmótica.

[00049] A maioria das células de mamíferos expressa duas diferentes glicerol-3-fosfato desidrogenases (GPDs) que são necessárias para a produção de glicerol e são expressas em resposta a diferentes sinais celulares: as proteínas GPD1 e GPD2. Ambas as proteínas compartilham 75% de identidade de aminoácidos e, embora catalisem a mesma reação, as diferenças em sua sequência de aminoácidos as tornam enzimas mais eficientes sob as condições ambientais que induzem sua expressão. GPD2 é conhecido por ser incapaz de substituir totalmente o GPD1 na produção da produção de glicerol induzida osmoticamente, sugerindo que esta enzima tem menor atividade do que GPD1 sob estresse osmótico.

[00050] As células hospedeiras microbianas recombinantes da presente invenção podem incluir uma modificação genética para inibir (pelo menos, parcialmente ou totalmente) a expressão da proteína de atividade de glicerol-3-fosfato 1 dependente de NAD (GPD1) ou um gene ortólogo GPD1. A modificação genética pode incluir a deleção, deleção ou substituição de um ou mais de um resíduo de ácido nucleico em um gene (ou um gene ortólogo) que codifica a proteína GPD1 (particularmente na sequência de codificação do gene) que causaria uma redução na atividade da proteína GPD1 em altas condições osmóticas. Em uma modalidade, a modificação genética pode incluir a deleção de toda a sequência de codificação de um gene (ou um gene ortólogo) que codifica a proteína GPD1. Alternativamente ou em combinação, a célula hospedeira microbiana recombinante pode expressar uma variante ou fragmento da proteína GPD1 heteróloga com uma atividade reduzida durante altas condições osmóticas quando comparada com a proteína GPD1 nativa.

[00051] A proteína GPD1 é expressa nativamente em leveduras, fungos, mamíferos e células de plantas. Os genes GPD1 que codificam a proteína GPD1 incluem, mas não são limitados a Saccharomyces cerevisiae, Gene ID: 851539, Schizosaccharomyces pombe Gene ID: 2540547, Schizosaccharomyces pombe Gene ID: 2540455, Neurospora crassa Gene ID: 3873099, Candida albicans Gene ID: 3643924, Scheffersomyces stipitis Gene ID: 4840320, Spathaspora passalidarum Gene ID: 18874668, Trichoderma reesei Gene ID: 18482691, Nectria haematococca Gene ID: 9668637, Candida dubliniensis Gene ID: 8046432, Chlamydomonas reinhardtii Gene ID: 5716580, Brassica napus Gene ID: 106365675, Chlorella variabilis Gene ID: 17355036, Brassica napus Gene ID: 106352802, Mus musculus Gene ID: 14555, Homo sapiens Gene ID: 2819, Rattus norvegicus Gene ID: 60666, Sus scrofa Gene ID: 100153250, Gallus gallus Gene ID: 426881, Bos taurus Gene ID: 525042, Xenopus tropicalis Gene ID: 448519, Pan troglodytes Gene ID: 741054, Canis lupus familiaris Gene ID: 607942, Callorhinchus milii Gene ID: 103188923, Columba livia Gene ID: 102088900, Macaca fascicularis Gene ID: 101865501, Myotis brandtii Gene ID: 102257341, Heterocephalus glaber Gene ID: 101702723, Nannospalax galili Gene ID: 103746543, Mustela putorius furo Gene ID: 101681348, Callithrix jacchus Gene ID: 100414900, Labrus bergylta Gene ID: 109980872, Monopterus albus Gene ID: 109969143, Castor canadensis Gene ID: 109695417, Paralichthys olivaceus Gene ID: 109635348, Bos indicus Gene ID: 109559120, Hippocampus comes Gene ID: 109507993, Rhinolophus sinicus Gene ID: 109443801, Hipposideros armiger Gene ID: 109393253, Crocodylus porosus Gene ID: 109324424, Gavialis gangeticus Gene ID: 109293349,

Panthera pardus Gene ID: 109249099, Cyprinus carpio Gene ID: 109094445, Scleropages formosus Gene ID: 108931403, Nanorana parkeri Gene ID: 108789981, Rhinopithecus bieti Gene ID: 108543924, Lepidothrix coronata Gene ID: 108509436, Pygocentrus nattereri Gene ID: 108444060, Manis javanica Gene ID: 108406536, Cebus capucinus imitator Gene ID: 108316082, Ictalurus punctatus Gene ID: 108255083, Kryptolebias marmoratus Gene ID: 108231479, Miniopterus natalensis Gene ID: 107528262, Rousettus aegyptiacus Gene ID: 107514265, Coturnix japonica Gene ID: 107325705, Protobothrops mucrosquamatus Gene ID: 107302714, Parus major Gene ID: 107215690, Marmota marmota marmota Gene ID: 107148619, Gekko japonicus Gene ID: 107122513, Cyprinodon variegatus Gene ID: 107101128, Acinonyx jubatus Gene ID: 106969233, Poecilia latipinna Gene ID: 106959529, Poecilia mexicana Gene ID: 106929022, Calidris pugnax Gene ID: 106891167, Sturnus vulgaris Gene ID: 106863139, Equus asinus Gene ID: 106845052, Thamnophis sirtalis Gene ID: 106545289, Apteryx australis mantelli Gene ID: 106499434, Anser cygnoides domesticus Gene ID: 106047703, Dipodomys ordii Gene ID: 105987539, Clupea harengus Gene ID: 105897935, Microcebus murinus Gene ID: 105869862, Propithecus coquereli Gene ID: 105818148, Aotus nancymaae Gene ID: 105709449, Cercocebus atys Gene ID: 105580359, Mandrillus leucophaeus Gene ID: 105527974, Colobus angolensis palliatus Gene ID: 105507602, Macaca nemestrina Gene ID: 105492851, Aquila chrysaetos canadensis Gene ID: 105414064, Pteropus vampyrus Gene ID: 105297559, Camelus dromedarius Gene ID: 105097186, Camelus bactrianus Gene ID: 105076223, Esox lucius Gene ID: 105016698, Bison bison bison Gene ID: 105001494, Notothenia coriiceps Gene ID: 104967388, Larimichthys crocea Gene ID: 104928374, Fukomys damarensis Gene ID: 04861981, Haliaeetus leucocephalus Gene ID: 104831135, Corvus cornix cornix Gene ID: 104683744, Rhinopithecus roxellana Gene ID: 104679694, Balearica regulorum gibbericeps Gene ID: 104630128, Tinamus guttatus Gene ID: 104575187, Mesitornis unicolor Gene ID: 104539793, Antrostomus carolinensis Gene ID: 104532747, Buceros rhinoceros silvestris Gene ID: 104501599, Chaetura pelagica Gene ID: 104385595, Leptosomus discolor Gene ID: 104353902, Opisthocomus hoazin Gene ID: 104326607, Charadrius vociferus Gene ID: 104284804, Struthio camelus australis Gene ID: 104144034, Egretta garzetta Gene ID: 104132778, Cuculus canorus Gene ID:

104055090, Nipponia nippon Gene ID: 104011969, Pygoscelis adeliae Gene ID: 103914601, Aptenodytes forsteri Gene ID: 103894920, Serinus canaria Gene ID: 103823858, Manacus vitellinus Gene ID: 103760593, Ursus maritimus Gene ID: 103675473, Corvus brachyrhynchos Gene ID: 103613218, Galeopterus variegatus Gene ID: 103598969, Equus przewalskii Gene ID: 103546083, Calypte anna Gene ID: 103536440, Poecilia reticulata Gene ID: 103464660, Cynoglossus semilaevis Gene ID: 103386748, Stegastes partitus Gene ID: 103355454, Eptesicus fuscus Gene ID: 103285288, Chlorocebus sabaeus Gene ID: 103238296, Orycteropus afer afer Gene ID: 103194426, Poecilia formosa Gene ID: 103134553, Erinaceus europaeus Gene ID: 103118279, Lipotes vexillifer Gene ID: 103087725, Python bivittatus Gene ID: 103049416, Astyanax mexicanus Gene ID: 103021315, Balaenoptera acutorostrata scammoni Gene ID: 103006680, Physeter catodon Gene ID: 102996836, Panthera tigris altaica Gene ID: 102961238, Chelonia mydas Gene ID: 102939076, Peromyscus maniculatus bairdii Gene ID: 102922332, Pteropus alecto Gene ID: 102880604, Elephantulus edwardii Gene ID: 102844587, Chrysochloris asiatica Gene ID: 102825902, Myotis davidii Gene ID: 102754955, Leptonychotes weddellii Gene ID: 102730427, Lepisosteus oculatus Gene ID: 102692130, Alligator mississippiensis Gene ID: 102576126, Vicugna pacos Gene ID: 102542115, Camelus ferus Gene ID: 102507052, Tupaia chinensis Gene ID: 102482961, Pelodiscus sinensis Gene ID: 102446147, Myotis lucifugus Gene ID: 102420239, Bubalus bubalis Gene ID: 102395827, Alligator sinensis Gene ID: 102383307, Latimeria chalumnae Gene ID: 102345318, Pantholops hodgsonii Gene ID: 102326635, Haplochromis burtoni Gene ID: 102295539, Bos mutus Gene ID: 102267392, Xiphophorus maculatus Gene ID: 102228568, Pundamilia nyererei Gene ID: 102192578, Capra hircus Gene ID: 102171407, Pseudopodoces humilis Gene ID: 102106269, Zonotrichia albicollis Gene ID: 102070144, Falco cherrug Gene ID: 102047785, Geospiza fortis Gene ID: 102037409, Chinchilla lanigera Gene ID: 102014610, Microtus ochrogaster Gene ID: 101990242, Ictidomys tridecemlineatus Gene ID: 101955193, Chrysemys picta Gene ID: 101939497, Falco peregrinus Gene ID: 101911770, Mesocricetus auratus Gene ID: 101824509, Ficedula albicollis Gene ID: 101814000, Anas platyrhynchos Gene ID: 101789855, Echinops telfairi Gene ID: 101641551, Condylura cristata Gene ID: 101622847, Jaculus jaculus Gene ID: 101609219, Octodon degus

Gene ID: 101563150, Sorex araneus Gene ID: 101556310, Ochotona princeps Gene ID: 101532015, Maylandia zebra Gene ID: 101478751, Dasypus novemcinctus Gene ID: 101446993, Odobenus rosmarus divergens Gene ID: 101385499, Tursiops truncatus Gene ID: 101318662, Orcinus orca Gene ID: 101284095, Oryzias latipes Gene ID: 101154943, Gorilla gorilla Gene ID: 101131184, Ovis aries Gene ID: 101119894, Felis catus Gene ID: 101086577, Takifugu rubripes Gene ID: 101079539, Saimiri boliviensis Gene ID: 101030263, Papio anubis Gene ID: 101004942, Pan paniscus Gene ID: 100981359, Otolemur garnettii Gene ID: 100946205, Sarcophilus harrisii Gene ID: 100928054, Cricetulus griseus Gene ID: 100772179, Cavia porcellus Gene ID: 100720368, Oreochromis niloticus Gene ID: 100712149, Loxodonta africana Gene ID: 100660074, Nomascus leucogenys Gene ID: 100594138, Anolis carolinensis Gene ID: 100552972, Meleagris gallopavo Gene ID: 100542199, Ailuropoda melanoleuca Gene ID: 100473892, Oryctolagus cuniculus Gene ID: 100339469, Taeniopygia guttata Gene ID: 100225600, Pongo abelii Gene ID: 100172201, Ornithorhynchus anatinus Gene ID: 100085954, Equus caballus Gene ID: 100052204, Mus musculus Gene ID: 100198, Xenopus laevis Gene ID: 399227, Danio rerio Gene ID: 325181, Danio rerio Gene ID: 406615, Melopsittacus undulatus Gene ID: 101872435, Ceratotherium simum simum Gene ID: 101408813, Trichechus manatus latirostris Gene ID: 101359849 e Takifugu rubripes Gene ID: 101071719). Na presente invenção, a célula microbiana recombinante pode reduzir ou inibir a expressão de um gene GPD1 (ou um gene ortólogo GPD1) que codifica uma proteína, variante ou fragmento GPD1.

[00052] Alternativamente ou em combinação, a modificação genética pode incluir a modificação da célula hospedeira recombinante para expressar, em altas condições osmóticas, uma proteína glicerol-3-fosfato desidrogenase 2 (GPD2) dependente de NAD. Isto pode ser feito, por exemplo, expressando um gene nativo e/ou heterólogo (ou gene ortólogo) que codifica a proteína GPD2 usando um promotor osmótico. Em tal modalidade, é importante que, pelo menos, uma única cópia nativa do gene (ou o gene ortólogo) que codifica a proteína GPD2 esteja sob o controle do promotor GPD2 nativo. No contexto da presente invenção, um "promotor osmótico" pode ser um promotor (ou uma combinação de promotores) permitindo a expressão (ou, em algumas modalidades, a superexpressão) de um gene quando a célula hospedeira microbiana recombinante é colocada em altas condições osmóticas, mas restringindo a expressão (ou, em algumas modalidades, a superexpressão) de um gene quando a célula hospedeira microbiana recombinante é colocada em condições osmóticas normais ou baixas. Nesta modalidade, o promotor osmótico pode ser um promotor induzível. Os promotores osmóticos estão geralmente associados a genes na via HOG1 e os promotores que controlam a expressão de genes que são regulados positivamente na via HOG1 podem ser usados na célula hospedeira microbiana recombinante da presente invenção. Enzimas na via HOG1 cuja expressão é regulada positivamente em altas condições osmóticas incluem, mas não são limitadas a um gene de glicerol-3-fosfato desidrogenase 1 dependente de NAD, um gene de dihidroxiacetona quinase e um gene de trealose-fosfatase. Como tal, no contexto da presente invenção, o promotor osmótico pode ser um promotor (ou uma combinação de promotores) de um gene de glicerol-3-fosfato desidrogenase 1 dependente de NAD, um gene de dihidroxiacetona quinase e/ou um gene de trealose-fosfatase. Em Saccharomyces cerevisiae, as enzimas na via HOG1 cuja expressão é regulada positivamente na presença de altas condições osmóticas incluem, mas não são limitadas a um gene GPD1, um gene DAK1 e um gene TPS2. Como tal, no contexto da presente invenção, o promotor osmótico pode ser um promotor (ou uma combinação de promotores) de um gene GPD1 (referido como o promotor GPD1 ou gpd1p), um gene DAK1 (referido como o promotor DAK1 ou dak1p) e/ou um gene TPS2 (referido como o promotor TPS2 ou tps2p).

[00053] Um "promotor osmótico" também pode ser um promotor constitutivo que permite a expressão de sequências de codificação operativamente associadas a ele durante condições osmóticas. Em algumas modalidades, é preferido que o promotor constitutivo seja um promotor constitutivo "baixo". Promotores constitutivos "baixos" exemplares podem ser associados à expressão de genes de manutenção e, por exemplo, podem incluir o promotor do gene CYC1. Em algumas modalidades, o promotor osmótico não é um alto promotor constitutivo.

[00054] Conforme indicado acima, a célula hospedeira microbiana recombinante pode expressar, pelo menos, uma cópia de uma proteína GPD nativa ou heteróloga. Em uma modalidade, a proteína GPD nativa ou heteróloga é uma proteína GPD2 nativa ou heteróloga. Na modalidade em que a, pelo menos, uma proteína GPD é a proteína GPD2, a célula hospedeira microbiana recombinante pode, em algumas modalidades, expressar uma, duas ou mais cópias de um gene heterólogo que codifica para a proteína GPD2 ou um ortólogo GPD2 correspondente. Quando uma ou mais cópias do gene GPD2 ou do gene ortólogo GPD2 estão presentes na célula hospedeira microbiana recombinante, ela pode ser expressa sob o controle de um ou mais promotores osmóticos. Em ainda uma outra modalidade, o gene heterólogo GPD2 ou o gene ortólogo GPD2 da célula hospedeira microbiana recombinante é expresso sob o controle do promotor GPD1, por exemplo, substituindo uma ou ambas as sequências de codificação do gene GPD1 pela sequência de codificação do gene GPD2 (ou o gene ortólogo GPD2.

[00055] A proteína GPD2 é expressa em bactérias, leveduras, fungos, mamíferos e células de plantas. Os genes GPD2 que codificam a proteína GPD2 incluem, mas não são limitados a Mus musculus Gene ID: 14571, Homo sapiens Gene ID: 2820, Saccharomyces cerevisiae Gene ID: 854095, Rattus norvegicus Gene ID: 25062, Schizosaccharomyces pombe Gene ID: 2541502, Mus musculus Gene ID: 14380, Danio rerio Gene ID: 751628, Caenorhabditis elegans Gene ID: 3565504, Mesocricetus auratus Gene ID: 101825992, Xenopus tropicalis Gene ID: 779615, Macaca mulatta Gene ID: 697192, Bos taurus Gene ID: 504948, Canis lupus familiaris Gene ID: 478755, Cavia porcellus Gene ID: 100721200, Gallus gallus Gene ID: 424321, Pan troglodytes Gene ID: 459670, Oryctolagus cuniculus Gene ID: 100101571, Candida albicans Gene ID: 3644563, Xenopus laevis Gene ID: 444438, Macaca fascicularis Gene ID: 102127260, Ailuropoda melanoleuca Gene ID: 100482626, Cricetulus griseus Gene ID: 100766128, Heterocephalus glaber Gene ID: 101715967, Scheffersomyces stipitis Gene ID: 4838862, Ictalurus punctatus Gene ID: 108273160, Mustela putorius furo Gene ID: 101681209, Nannospalax galili Gene ID: 103741048, Callithrix jacchus Gene ID: 100409379, Lates calcarifer Gene ID: 108873068, Nothobranchius furzeri Gene ID: 07384696, Acanthisitta chloris Gene ID: 103808746, Acinonyx jubatus Gene ID: 106978985, Alligator mississippiensis Gene ID: 102562563, Alligator sinensis Gene ID: 102380394, Anas platyrhynchos, Anolis carolinensis Gene ID: 100551888, Anser cygnoides domesticus Gene ID: 106043902, Aotus nancymaae Gene ID:

105719012, Apaloderma vittatum Gene ID: 104281080, Aptenodytes forsteri Gene ID: 103893867, Apteryx australis mantelli Gene ID: 106486554, Aquila chrysaetos canadensis Gene ID: 105412526, Astyanax mexicanus Gene ID: 103029081, Austrofundulus limnaeus Gene ID: 106535816, Balaenoptera acutorostrata scammoni Gene ID: 103019768, Balearica regulorum gibbericeps, Bison bison bison Gene ID: 104988636, Bos indicus Gene ID: 109567519, Bos mutus Gene ID: 102277350, Bubalus bubalis Gene ID: 102404879, Buceros rhinoceros silvestris Gene ID: 104497001, Calidris pugnax Gene ID: 106902763, Callorhinchus milii Gene ID: 103176409, Calypte anna Gene ID: 103535222, Camelus bactrianus Gene ID: 105081921, Camelus dromedarius Gene ID: 105093713, Camelus ferus Gene ID: 102519983, Capra hircus Gene ID: 102176370, Cariama cristata Gene ID: 104154548, Castor canadensis Gene ID: 109700730, Cebus capucinus imitator Gene ID: 108316996, Cercocebus atys Gene ID: 105576003, Chaetura pelagica Gene ID: 104391744, Charadrius vociferus Gene ID: 104286830, Chelonia mydas Gene ID: 102930483, Chinchilla lanigera Gene ID: 102017931, Chlamydotis macqueenii Gene ID: 104476789, Chlorocebus sabaeus Gene ID: 103217126, Chrysemys picta Gene ID: 101939831, Chrysochloris asiatica Gene ID: 102831540, Clupea harengus Gene ID: 105902648, Colius striatus Gene ID: 104549356, Colobus angolensis palliatus Gene ID: 105516852, Columba livia Gene ID: 102090265, Condylura cristata Gene ID: 101619970, Corvus brachyrhynchos, Coturnix japonica Gene ID: 107316969, Crocodylus porosus Gene ID: 109322895, Cuculus canorus Gene ID: 104056187, Cynoglossus semilaevis Gene ID: 103389593, Dasypus novemcinctus Gene ID: 101428842, Dipodomys ordii Gene ID: 105996090, Echinops telfairi Gene ID: 101656272, Egretta garzetta Gene ID: 104135263, Elephantulus edwardii Gene ID: 102858276, Eptesicus fuscus Gene ID: 103283396, Equus asinus Gene ID: 106841969, Equus caballus Gene ID: 100050747, Equus przewalskii Gene ID: 103558835, Erinaceus europaeus Gene ID: 103114599, Eurypyga helias Gene ID: 104502666, Falco cherrug Gene ID: 102054715, Falco peregrinus Gene ID: 101912742, Felis catus Gene ID: 101089953, Ficedula albicollis Gene ID: 101816901, Fukomys damarensis Gene ID: 104850054, Fundulus heteroclitus Gene ID: 105936523, Galeopterus variegatus Gene ID: 103586331, Gavia stellata Gene ID: 104250365, Gavialis gangeticus Gene ID: 109301301, Gekko japonicus Gene ID: 107110762,

Geospiza fortis Gene ID: 102042095, Gorilla gorilla Gene ID: 101150526, Haliaeetus albicilla Gene ID: 104323154, Haliaeetus leucocephalus Gene ID: 104829038, Haplochromis burtoni Gene ID: 102309478, Hippocampus comes Gene ID: 109528375, Hipposideros armiger Gene ID: 109379867, Ictidomys tridecemlineatus Gene ID: 101965668, Jaculus jaculus Gene ID: 101616184, Kryptolebias marmoratus Gene ID: 108251075, Labrus bergylta Gene ID: 109984158, Larimichthys crocea Gene ID: 104929094, Latimeria chalumnae Gene ID: 102361446, Lepidothrix coronata Gene ID: 108501660, Lepisosteus oculatus Gene ID: 102691231, Leptonychotes weddellii Gene ID: 102739068, Leptosomus discolor Gene ID: 104340644, Lipotes vexillifer Gene ID: 103074004, Loxodonta africana Gene ID: 100654953, Macaca nemestrina Gene ID: 105493221, Manacus vitellinus Gene ID: 103757091, Mandrillus leucophaeus Gene ID: 105548063, Manis javanica Gene ID: 108392571, Marmota marmota marmota Gene ID: 107136866, Maylandia zebra Gene ID: 101487556, Mesitornis unicolor Gene ID: 104545943, Microcebus murinus Gene ID: 105859136, Microtus ochrogaster Gene ID: 101999389, Miniopterus natalensis Gene ID: 107525674, Monodelphis domestica Gene ID: 100014779, Monopterus albus Gene ID: 109957085, Myotis brandtii Gene ID: 102239648, Myotis davidii Gene ID: 102770109, Myotis lucifugus Gene ID: 102438522, Nanorana parkeri Gene ID: 108784354, Nestor notabilis Gene ID: 104399051, Nipponia nippon Gene ID: 104012349, Nomascus leucogenys Gene ID: 100590527, Notothenia coriiceps Gene ID: 104964156, Ochotona princeps Gene ID: 101530736, Octodon degus Gene ID: 101591628, Odobenus rosmarus divergens Gene ID: 101385453, Oncorhynchus kisutch Gene ID: 109870627, Opisthocomus hoazin Gene ID: 104338567, Orcinus orca Gene ID: 101287409, Oreochromis niloticus Gene ID: 100694147, Ornithorhynchus anatinus Gene ID: 100081433, Orycteropus afer afer Gene ID: 103197834, Oryzias latipes Gene ID: 101167020, Otolemur garnettii Gene ID: 100966064, Ovis aries Gene ID: 443090, Pan paniscus Gene ID: 100970779, Panthera pardus Gene ID: 109271431, Panthera tigris altaica Gene ID: 102957949, Pantholops hodgsonii Gene ID: 102323478, Papio anubis Gene ID: 101002517, Paralichthys olivaceus Gene ID: 109631046, Pelodiscus sinensis Gene ID: 102454304, Peromyscus maniculatus bairdii Gene ID: 102924185, Phaethon lepturus Gene ID: 104624271, Phalacrocorax carbo Gene ID: 104049388, Physeter catodon Gene ID: 102978831, Picoides pubescens Gene ID: 104296936, Poecilia latipinna Gene ID: 106958025, Poecilia mexicana Gene ID: 106920534, Poecilia reticulata Gene ID: 103473778, Pongo abelii Gene ID: 100452414, Propithecus coquereli Gene ID: 105807399, Protobothrops mucrosquamatus Gene ID: 107289584, Pseudopodoces humilis Gene ID: 102109711, Pterocles gutturalis Gene ID: 104461236, Pteropus alecto Gene ID: 102879110, Pteropus vampyrus Gene ID: 105291402, Pundamilia nyererei Gene ID: 102200268, Pygocentrus nattereri Gene ID: 108411786, Pygoscelis adeliae Gene ID: 103925329, Python bivittatus Gene ID: 103059167, Rhincodon typus Gene ID: 109920450, Rhinolophus sinicus Gene ID: 109445137, Rhinopithecus bieti Gene ID: 108538766, Rhinopithecus roxellana Gene ID: 104654108, Rousettus aegyptiacus Gene ID: 107513424, Saimiri boliviensis Gene ID: 101027702, Salmo salar Gene ID: 106581822, Sarcophilus harrisii Gene ID: 100927498, Scleropages formosus Gene ID: 108927961, Serinus canaria Gene ID: 103814246, Sinocyclocheilus grahami Gene ID: 107555436, Sorex araneus Gene ID: 101543025, Stegastes partitus Gene ID: 103360018, Struthio camelus australis Gene ID: 104138752, Sturnus vulgaris Gene ID: 106861926, Sugiyamaella lignohabitans Gene ID: 30033324, Sus scrofa Gene ID: 397348, Taeniopygia guttata Gene ID: 100222867, Takifugu rubripes Gene ID: 101062218, Tarsius syrichta Gene ID: 103254049, Tauraco erythrolophus Gene ID: 104378162, Thamnophis sirtalis Gene ID: 106538827, Tinamus guttatus Gene ID: 104572349, Tupaia chinensis Gene ID: 102471148, Tursiops truncatus Gene ID: 101330605, Ursus maritimus Gene ID: 103659477, Vicugna pacos Gene ID: 102533941, Xiphophorus maculatus Gene ID: 102225536, Zonotrichia albicollis Gene ID: 102073261, Ciona intestinalis Gene ID: 100183886, Meleagris gallopavo Gene ID: 100546408, Trichechus manatus latirostris Gene ID: 101355771, Ceratotherium simum simum Gene ID: 101400784, Melopsittacus undulatus Gene ID: 101871704, Esox lucius Gene ID: 10502249 e Pygocentrus nattereri Gene ID: 108411786. Em uma modalidade, a proteína GPD2 é codificada por Saccharomyces cerevisiae Gene ID: 854095.

[00056] A proteína GPD2 heteróloga pode ser codificada por um gene GPD2 ou um gene ortólogo GPD2 conforme aqui definido. A proteína GPD2 heteróloga também pode ser uma variante da proteína GPD2 e/ou um fragmento da proteína GPD2. Além disso, quando mais de uma cópia do gene GPD2 heterólogo ou gene ortólogo é incluída na célula microbiana recombinante, a pluralidade de moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam a proteína GPD2 podem ser iguais ou diferentes, integradas no mesmo ou em diferentes locais de integração.

[00057] Em algumas modalidades, a célula hospedeira microbiana recombinante pode incluir uma ou mais modificações genéticas adicionais que codificam para uma enzima, podem ser cocultivadas com células hospedeiras recombinantes adicionais, incluindo modificações genéticas adicionais que codificam para enzimas ou podem ser usadas com enzimas heterólogas (purificadas) aqui descritas.

[00058] Por exemplo, a enzima adicional pode permitir a produção de uma glucoamilase heteróloga. Muitos micróbios produzem uma amilase para degradar os amidos extracelulares. Além de clivar as últimas ligações α(1- 4) glicosídicas na extremidade não redutora de amilose e amilopectina, produzindo glicose, a γ-amilase irá clivar as ligações α(1-6) glicosídicas. A glucoamilase heteróloga pode ser derivada de qualquer organismo. Em uma modalidade, a proteína heteróloga é derivada de uma γ-amilase, tal como, por exemplo, a glucoamilase de Saccharomycoces filbuligera (por exemplo, codificada pelo gene glu 0111). Exemplos de células hospedeiras de levedura recombinantess que expressam tais enzimas são descritos no documento WO 2011/153516, bem como, no documento WO 2017/037614 depositado em 29 de Agosto de 2016.

[00059] Em ainda outro exemplo, a enzima pode reduzir a produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para catabolizar (quebrar) o formiato. Conforme usado no contexto da presente invenção, a expressão "polipeptídeos nativos que funcionam para catabolizar formiato" refere-se a polipeptídeos que são encontrados endogenamente na célula hospedeira de levedura recombinante. As enzimas nativas que funcionam para catabolizar o formiato incluem, mas não são limitadas a polipeptídeos FDH1 e FDH2 (também referidos como FDH1 e FDH2, respectivamente). Em uma modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante carrega uma modificação genética em, pelo menos, um do gene FDH1 (que codifica o polipeptídeo FDH1), o gene FDH2 (que codifica o polipeptídeo FDH2) ou ortólogos dos mesmos. Em outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante carrega modificações genéticas em ambos o gene FDH1 (que codifica o polipeptídeo FDH1) e o gene fdh2 (que codifica o polipeptídeo FDH2) ou ortólogos dos mesmos. Exemplos de células hospedeiras de levedura recombinantess com tais modificações genéticas que levam à redução na produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para catabolizar formiato são descritos no documento WO 2012/138942. De preferência, a célula hospedeira de levedura recombinante tem modificações genéticas (tal como, uma deleção ou inserção genética) no gene FDH1 e no gene FDH2 que faria com que a célula hospedeira tivesse os genes FDH1 e FDH2 nocauteados.

[00060] Em ainda outro exemplo, a enzima pode aumentar a produção de uma enzima heteróloga que funciona para anabolizar (formar) formiato. Conforme usado no contexto da presente invenção, "uma enzima que funciona para anabolizar o formiato" refere-se a polipeptídeos que podem ou não ser endogenamente encontrados na célula hospedeira de levedura recombinante e que são propositalmente introduzidos nas células hospedeiras de levedura recombinantes. Em algumas modalidades, a enzima heteróloga que funciona para anabolizar formiato é uma piruvato formiato liase heteróloga (PFL), uma acetaldeído desidrogenase heteróloga, uma álcool desidrogenase heteróloga, e/ou uma acetilaldeído/álcool desidrogenase heteróloga bifuncional (AADH), tais como aquelas descritas na Patente U.S. Número Serial 8.956.851 e no documento WO 2015/023989. Mais especificamente, as enzimas PFL e AADH para uso nas células hospedeiras de levedura recombinantess podem vir de uma fonte bacteriana ou eucariótica. A PFL heteróloga da presente invenção inclui, mas não está limitada a polipeptídeo PFLA, um polipeptídeo codificado por um gene ortólogo PFLA, o polipeptídeo PFLB ou um polipeptídeo codificado por um gene ortólogo PFLB. As AADHs heterólogas da presente invenção incluem, mas não são limitadas a polipeptídeos ADHE ou um polipeptídeo codificado por um gene ortólogo ADHE. Em uma modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção compreende, pelo menos, uma das seguintes enzimas heterólogas que funcionam para anabolizar formiato: o polipeptídeo PFLA, o polipeptídeo PFLB e/ou o polipeptídeo ADHE. Em uma modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção compreende, pelo menos, duas das seguintes enzimas heterólogas que funcionam para anabolizar formiato: o polipeptídeo PFLA, o polipeptídeo PFLB e/ou o polipeptídeo ADHE. Em outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção compreende as seguintes enzimas heterólogas que funcionam para anabolizar formiato: o polipeptídeo PFLA, o polipeptídeo PFLB e o polipeptídeo ADHE.

[00061] Em algumas modalidades, a enzima envolvida na clivagem ou hidrólise de seu substrato (por exemplo, uma enzima lítica e, em algumas modalidades, uma enzima sacarolítica). Em ainda outra modalidade, a enzima pode ser uma glicosídeo hidrolase. No contexto da presente invenção, o termo "glicosídeo hidrolase" refere-se a uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólises de carboidratos, incluindo amilases, celulases, hemicelulases, enzimas acessórias celulolíticas e amilolíticas, inulinases, levanases, trealases, pectinases, dextranases e açúcar pentose utilizando enzimas. Em outra modalidade, a enzima pode ser uma protease. No contexto da presente invenção, o termo "protease" refere-se a uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólises de proteína. Em ainda outra modalidade, a enzima pode ser uma esterase. No contexto da presente invenção, o termo "esterase" refere-se a uma enzima envolvida na hidrólise de um éster de um ácido ou um álcool, incluindo fosfatases, tais como fitases.

[00062] A enzima adicional pode ser uma “enzima amilolítica”, uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólises de amilose. O termo "amilase" refere-se a uma enzima que quebra o amido em açúcar. Todas as amilases são glicosídeo hidrolases e atuam nas ligações α-1,4-glicosídicas. Algumas amilases, tal como a γ-amilase (glucoamilase), também atuam nas ligações α-1,6-glicosídicas. As enzimas amilases incluem α-amilase (EC

3.2.1.1), β-amilase (EC 3.2.1.2) e γ-amilase (EC 3.2.1.3). As α-amilases são metaloenzimas de cálcio, incapazes de funcionar na ausência de cálcio. Ao agir em locais aleatórios ao longo da cadeia de amido, a α-amilase quebra os carboidratos de cadeia longa, resultando em maltotriose e maltose da amilose, ou maltose, glicose e “dextrina limite” da amilopectina. Como pode atuar em qualquer parte do substrato, a α-amilase tende a ser mais rápida do que a β- amilase. Em uma modalidade, a proteína heteróloga é derivada de uma α- amilase tal como, por exemplo, da α-amilase de Bacillus amyloliquefacens. Outra forma de amilase, a β-amilase, também é sintetizada por bactérias, fungos e plantas. Trabalhando a partir da extremidade não redutora, a β-amilase catalisa a hidrólise da segunda ligação α-1,4 glicosídica, clivando duas unidades de glicose (maltose) de cada vez. Outra enzima amilolítica é a α-glucosidase que atua sobre a maltose e outros malto-oligossacarídeos curtos produzidos pelas α- , β- e γ-amilases, convertendo-os em glicose. Outra enzima amilolítica é a pululanase. A pululanase é um tipo específico de glucanase, uma exoenzima amilolítica que degrada pululano. Pululano é considerado como uma cadeia de unidades de maltotriose ligadas por ligações alfa-1,6-glicosídicas. A pululanase (EC 3.2.1.41) também é conhecida como pululan-6-glucanohidrolase (enzima de desramificação). Outra enzima amilolítica, a isopululanase, hidrolisa o pululano em isopanose (6-alfa-maltosilglicose). A isopululanase (EC 3.2.1.57) também é conhecida como pululano 4-glucanohidrolase. Uma "amilase" pode ser qualquer enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise da amilase, incluindo α-amilase, β-amilase, glucoamilase, pululanase, isopululanase e alfa- glucosidase.

[00063] A enzima adicional pode ser uma dextranase. Dextrano é um polissacarídeo ramificado complexo composto de unidades monoméricas de glicose. O mesmo contém uma cadeia linear de ligações α-1,6 glicosídicas e ramificações ligadas por ligações glicosídicas α-1,2, α-1,3 ou α-1,4. Várias enzimas participam da degradação do dextrano. A dextranase (EC 3.2.1.11), também conhecida como alfa-1,6-glucan-6-glucanohidrolase, é uma enzima que realiza a endohidrólise das ligações glicosídicas α-1,6 no dextrano. Outras enzimas que atuam para quebrar o dextrano incluem: glucano-1,6-α-D- glucosidases (EC3.2.1.70), glucan-1,6-α-isomaltosidases (EC3.2.1.94), dextrano 1,6-α-isomaltotriosidases (EC3.2.1.95), dextrano ramificado exo-1,2-α- glucosidases (EC3.2.1.115), α-glucosidase (EC3.2.1.20) e Cicloisomaltooligossacarídeo glucanotransferase (CITase).

[00064] A enzima adicional pode ser uma “enzima celulolítica”, uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólises da celulose. O termo "celulase" refere-se a uma classe de enzimas que catalisam a celulólise (ou seja, a hidrólise) da celulose. Vários tipos diferentes de celulases são conhecidos, que diferem estrutural e mecanicamente. Existem tipos gerais de celulases com base no tipo de reação catalisada: a endocelulase quebra as ligações internas para romper a estrutura cristalina da celulose e expor cadeias polissacarídicas de celulose individuais; a exocelulase cliva 2-4 unidades das extremidades das cadeias expostas produzidas pela endocelulase, resultando nos tetrassacarídeos ou dissacarídeos, tal como a celobiose. Existem dois tipos principais de exocelulases (ou celobiohidrolases, abreviatura CBH) - um tipo trabalhando processivamente a partir da extremidade redutora e um tipo trabalhando processivamente na extremidade não redutora da celulose; a celobiase ou beta-glucosidase hidrolisa o produto de exocelulase em monossacarídeos individuais; celulases oxidativas que despolimerizam a celulose por meio de reações radicais, como por exemplo, a celobiose desidrogenase (aceptor); celulose fosforilases que despolimerizam a celulose usando fosfatos em vez de água. No caso mais familiar da atividade da celulase, o complexo de enzima decompõe a celulose em beta-glicose. Uma "celulase" pode ser qualquer enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólises da celulose, incluindo uma endoglucanase, glucosidase, celobiohidrolase, xilanase, glucanase, xilosidase, xilano esterase, arabinofuranosidase, galactosidase, celobiose fosforilase, celodextrin fosforilase, mananase, manosidase, xiloglucanase, endoxilanase, glucuronidase, acetilxilanesterase, arabinofuranohidrolase, inchaço, glucuronil esterase, expansina, pectinase e proteína feruoil esterase.

[00065] A enzima adicional pode ter “atividade hemicelulolítica”, uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólises da hemicelulose. O termo "hemicelulase" refere-se a uma classe de enzimas que catalisam as hidrólises da celulose. Vários tipos diferentes de enzimas são conhecidos por terem atividade hemicelulolítica incluindo, mas não limitada a xilanases e mananases.

[00066] A enzima adicional pode ter “atividade xilanolítica”, uma enzima com a capacidade de hidrolisar ligações glicosídicas em oligopentoses e polipentoses. O termo “xilanase” é o nome dado a uma classe de enzimas que degrada o polissacarídeo linear beta-1,4-xilano em xilose, quebrando assim a hemicelulose, um dos principais componentes das paredes celulares das plantas. As xilanases incluem aquelas enzimas que correspondem ao Número da Comissão da Enzima 3.2.1.8. A proteína heteróloga também pode ser uma "enzima que metaboliza xilose", uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólises da xilose, incluindo uma xilose isomerase, xiluloquinase, xilose redutase, xilose desidrogenase, xilitol desidrogenase, xilonato desidratase, xilose transcetolase e uma proteína xilose transaldolase. Um "açúcar pentose que utiliza enzima" pode ser qualquer enzima envolvida na digestão,

metabolismo e/ou hidrólises do açúcar pentose, incluindo xilanase, arabinase, arabinoxilanase, arabinosidase, arabinofuranosidase, arabinoxilanase, arabinosidase e arabinofuranosidase, arabinose isomerase, ribulose-5-fosfato 4- epimerase, xilose isomerase, xiluloquinase, xilose redutase, xilose desidrogenase, xilitol desidrogenase, xilonato desidratase, xilose transcetolase e/ou xilose transaldolase.

[00067] A enzima adicional pode ter "atividade manânica", uma enzima com a capacidade de hidrolisar os resíduos β-D-manose terminais, não redutores em β-D-manosídeos. As mananases são capazes de quebrar a hemicelulose, um dos principais componentes das paredes celulares das plantas. As xilanases incluem aquelas enzimas que correspondem ao Número da Comissão da Enzima 3.2.25.

[00068] A enzima adicional pode ser uma “pectinase”, uma enzima, tais como pectoliase, pectozima e poligalacturonase, comumente referida na fermentação como enzimas pécticas. Essas enzimas quebram a pectina, um substrato polissacarídeo que é encontrado nas paredes celulares das plantas.

[00069] A enzima adicional pode ter “atividade fitolítica”, uma enzima que catalisa a conversão de ácido fítico em fósforo inorgânico. As fitases (EC

3.2.3) podem pertencer a ácido de histidina fosfatases, β-propulsor fitases, ácidos roxos fosfastases ou família das fitases do tipo proteína tirosina fosfatase.

[00070] A enzima adicional pode ter "atividade proteolítica", uma enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólises de proteínas, incluindo serina proteases, treonina proteases, cisteína proteases, aspartato proteases, ácido glutâmico proteases e metaloproteases.

[00071] Quando a célula hospedeira de levedura recombinante expressa uma proteína heteróloga, ela pode ser posteriormente modificada para aumentar sua robustez em altas temperaturas. Modificações genéticas para aumentar a robustez de uma célula hospedeira de levedura recombinante geneticamente modificada são descritas em PCT/IB2016/055162 depositado em 29 de Agosto de 2016.

[00072] Em algumas modalidades, as células hospedeiras microbianas recombinantes da presente invenção não têm (por exemplo, excluem) uma modificação genética em seu gene de glutamato sintase que consome NADH. Em Saccharomyces cerevisiae, o gene de glutamato sintase que consome NADH é conhecido como GLT1 (conforme descrito em Wang et al., 2013).

[00073] Em ainda outra modalidade, as células hospedeiras microbianas recombinantes da presente invenção não (por exemplo, excluem) modificações genéticas em genes que codificam enzimas heterólogas que funcionam em uma ou mais vias metabólicas modificadas para converter uma fonte de carboidrato em um álcool, tais como as descritas no documento WO2015/023989. Prevenir ou limitar a contaminação microbiana durante culturas contínuas

[00074] A presente invenção também fornece um processo para prevenir ou limitar a contaminação microbiana durante uma cultura contínua. Conforme indicado, uma "cultura contínua" da célula hospedeira de levedura recombinante refere-se a uma cultura que dura, pelo menos, um ciclo de fermentação e está sujeita à absorção de micro-organismos contaminantes de tipo selvagem, tais como, por exemplo, por leveduras de tipo selvagem. Culturas contínuas são realizadas, por exemplo, nos processos de biocombustíveis brasileiros, bem como, em outros processos de etanol de longa duração. Os micro-organismos contaminantes que causam a contaminação microbiana incluem, mas não são limitados a leveduras contaminantes (tais como, por exemplo, de Saccharomyces sp. (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae), a Dekkera sp. (por exemplo, Dekkera bruxellensis), a Candida sp. (por exemplo, Candida krusei) e/ou Schizosaccharomyces sp. (por exemplo, Schizosaccharomyces pombe), bem como, bactérias. Em uma modalidade, os micro-organismos contaminantes são leveduras. Em outra modalidade de levedura, os micro-organismos contaminantes compreendem a maioria das leveduras de Saccharomyces sp. e uma minoria de leveduras de não Saccharomyces sp. (tais como, por exemplo, de Dekkera sp., Candida sp. e/ou Schizosaccharomyces sp.). Em ainda outra modalidade, os micro-organismos contaminantes compreendem, pelo menos, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% ou mais de leveduras de Saccharomyces sp.. Em ainda outra modalidade, os micro-organismos contaminantes compreendem não mais do que 40%, 30%, 20%, 10%, 5% ou menos de leveduras do grupo não Saccharomyces sp.

[00075] Em sua modalidade mais ampla, o processo compreende a cultura da célula hospedeira de levedura recombinante na presença do agente pró-citotóxico. O agente pró-citotóxico pode ser incluído no meio de cultura contínua antes da cultura da célula hospedeira de levedura recombinante (por exemplo, em uma maneira profilática). Por exemplo, o agente pró-citotóxico pode ser incluído no mosto (cana-de-açúcar) antes da fermentação. Alternativamente ou complementarmente, o agente citotóxico pode ser colocado em contato com a célula hospedeira de levedura recombinante durante a cultura contínua. O processo também pode incluir colocar em contato uma vez ou em uma pluralidade de ocasiões o agente pró-citotóxico com a célula hospedeira de levedura recombinante durante a cultura contínua. O processo pode ainda compreender adicionar o agente pró-citotóxico ao meio da cultura contínua, antes e/ou durante a cultura da célula hospedeira de levedura recombinante.

[00076] Em uma modalidade, o processo aqui descrito fornece a limitação da extensão da contaminação microbiana entre 0,1-10% da população microbiana total do meio (ou em uma amostra do mesmo, conforme medido por CFU ou o número total de células). Em uma modalidade, o processo pode ser usado para limitar a contaminação microbiana a níveis iguais ou inferiores a cerca de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1 %, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3% ou 0,2% em relação à população microbiana total do meio (ou em uma amostra do mesmo). Em outra modalidade, o processo pode ser usado para limitar a contaminação microbiana a níveis entre cerca de 0,1% e 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% em relação à população microbiana total do meio (ou em uma amostra do mesmo). Em ainda outra modalidade, o processo pode ser usado para limitar a contaminação microbiana a níveis entre cerca de 0,1% e 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 2 %, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% ou 9% em relação à população microbiana total do meio (ou em uma amostra do mesmo). Em ainda outra modalidade, o processo pode ser usado para limitar a contaminação microbiana a níveis entre cerca de 0,1% e 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 2 %, 3%, 4%, 5%, 6%, 7% ou 8% em relação à população microbiana total do meio (ou em uma amostra do mesmo). Em ainda outra modalidade, o processo pode ser usado para limitar a contaminação microbiana a níveis entre cerca de 0,1% e 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%,

0,8%, 0,9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% ou 7% em relação à população microbiana total do meio (ou em uma amostra do mesmo). Em outra modalidade, o processo pode ser usado para limitar a contaminação microbiana a níveis entre cerca de 0,1% e 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5% ou 6% em relação à população microbiana total do meio (ou em uma amostra do mesmo). Em ainda outra modalidade, o processo pode ser usado para limitar a contaminação microbiana a níveis entre cerca de 0,1% e 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 2%, 3%, 4% ou 5% em relação à população microbiana total do meio (ou em uma amostra do mesmo). Em uma outra modalidade, o processo pode ser usado para limitar a contaminação microbiana a níveis entre cerca de 0,1% e 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 2%, 3% ou 4% em relação à população microbiana total do meio (ou em uma amostra do mesmo). Em ainda outra modalidade, o processo pode ser usado para limitar a contaminação microbiana a níveis entre cerca de 0,1% e 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 2% ou 3% em relação à população microbiana total do meio (ou em uma amostra do mesmo). Em outra modalidade, o processo pode ser usado para limitar a contaminação microbiana a níveis entre cerca de 0,1% e 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1% ou 2% em relação à população microbiana total do meio (ou em uma amostra do mesmo). Em ainda outra modalidade, o processo pode ser usado para limitar a contaminação microbiana a níveis entre cerca de 0,1% e 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1% em relação à população microbiana total do meio (ou em uma amostra do mesmo). Em uma outra modalidade, o processo pode ser usado para limitar a contaminação microbiana a níveis entre cerca de 0,1% e 1% em relação à população microbiana total do meio (ou em uma amostra do mesmo). Em culturas contínuas, tais como por exemplo nas fermentações de etanol combustível brasileiras, a contaminação microbiana pode causar condições de fermentação desfavoráveis (espuma e floculação, por exemplo), bem como, diminuição da produtividade. Portanto, ao limitar a presença de contaminação microbiana a um certo nível, um aumento na produtividade pode ser observado.

[00077] O processo da presente invenção pode compreender alternar entre dois meios para limitar a contaminação microbiana: um primeiro meio sem um agente pró-citotóxico e um segundo meio com o agente pró-

citotóxico. O processo pode ser realizado com um primeiro meio sem o agente pró-citotóxico ou um segundo meio compreendendo o agente pró-citotóxico. Mesmo assim, uma referência é feita a um "primeiro" meio e um "segundo" meio, a presente invenção contempla o uso de qualquer meio antes do outro. Em uma modalidade, o segundo meio é usado antes do primeiro meio e vice-versa.

[00078] O agente pró-citotóxico a ser usado no processo é selecionado em função da célula hospedeira de levedura recombinante usada em tal processo e mais especificamente em função da modificação genética que foi feita na célula hospedeira de levedura recombinante. Conforme aqui indicado, a célula hospedeira de levedura recombinante inclui, pelo menos, uma modificação genética para diminuir ou impedir a expressão de, pelo menos, um gene nocivo. Tal gene nocivo, presente e expresso nos micro-organismos contaminantes, codifica um polipeptídeo capaz de metabolizar o agente pró- citotóxico (que não possui citotoxicidade para as células hospedeiras de levedura recombinantess e os micro-organismos contaminantes em um agente citotóxico (que é citotóxico para os micro-organismos contaminantes, mas não para as células hospedeiras de levedura recombinantess). Como tal, o tipo de agente pró-citotóxico usado é com base nas modificações genéticas da célula hospedeira de levedura recombinante presente no meio. Por exemplo, quando a primeira célula hospedeira de levedura recombinante foi geneticamente modificada de modo a não expressar o gene FCY1 e/ou o gene FUR1 (ou seus genes ortólogos correspondentes), o agente pró-citotóxico pode ser 5-FC e/ou 5-FU.

[00079] Em uma modalidade, o processo aqui descrito fornece a alternância entre os dois meios em função de um primeiro limite (máximo) de contaminação microbiana e um segundo limite (mínimo) de contaminação microbiana. O primeiro limite é usado de modo a limitar a contaminação microbiana antes de sua aquisição da cultura. O segundo limite é usado de modo a limitar o uso/custos do agente pró-citotóxico. A cultura pode ser iniciada na ausência do agente pró-citotóxico, embora seja possível nesta fase da cultura incluir o agente pró-citotóxico no meio (especialmente, se a cultura for uma repetição de numerosos ciclos de fermentação e o o ciclo de fermentação anterior incluir uma contaminação microbiana importante, por exemplo, acima ou perto do primeiro limite). Alternativamente, a cultura pode ser iniciada na presença do agente pró-citotóxico, embora seja possível nesta fase da cultura excluir o agente pró-citotóxico no meio (especialmente, se a cultura for uma repetição de numerosos ciclos de fermentação e o ciclo de fermentação anterior incluir uma contaminação microbiana mínima, por exemplo, inferior ao segundo limite). Como o processo aqui descrito é destinado para ser usado durante culturas contínuas que são esperas ser contaminadas com micro-organismos contaminantes, quando o primeiro limite de contaminação microbiana é excedido, o processo fornece, em algumas modalidades, cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante no segundo meio compreendendo o agente pró-citotóxico. A célula hospedeira de levedura recombinante pode ser cultivada na presença do agente pró-citotóxico até que o segundo limite seja atingido. Nesse ponto, a célula hospedeira de levedura recombinante pode ser cultivada na ausência do agente pró-citotóxico até que o primeiro limite seja excedido novamente.

[00080] Assim, o processo pode compreender a cultura da célula hospedeira de levedura recombinante em um primeiro meio sem o agente pró- citotóxico, até que o primeiro limite de contaminação microbiana seja excedido. Conforme indicado acima, se o primeiro limite de contaminação microbiana é excesso no início da cultura ou durante a etapa de propagação inicial da cultura, o processo pode incluir cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante no segundo meio na presença do agente pró-citotóxico. Além disso, se o primeiro limite nunca for excedido durante a cultura, é contemplado que a célula hospedeira de levedura recombinante pode ser cultivada apenas na ausência do agente pró-citotóxico. O primeiro limite corresponde a um nível de contaminação que pode ser controlado pela adição do agente citotóxico. Em uma modalidade, o primeiro limite está acima de cerca de 0,1% de micro-organismos contaminantes quando comparado com a população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo. Em uma modalidade, o primeiro limite está acima de cerca de 0,2% de micro-organismos contaminantes quando comparado com a população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo. Em uma modalidade, o primeiro limite está acima de cerca de 0,3% de micro-organismos contaminantes quando comparado com a população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo. Em uma modalidade, o primeiro limite está acima de cerca de 0,4% dos micro-organismos contaminantes quando comparado com a população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo.

Em uma modalidade, o primeiro limite está acima de cerca de 0,5% dos micro-organismos contaminantes quando comparado com a população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo.

Em uma modalidade, o primeiro limite está acima de cerca de 0,6% de micro-organismos contaminantes quando comparado com a população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo.

Em uma modalidade, o primeiro limite está acima de cerca de 0,7% de micro-organismos contaminantes quando comparado com a população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo.

Em uma modalidade, o primeiro limite está acima de cerca de 0,8% de micro-organismos contaminantes quando comparado com a população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo.

Em uma modalidade, o primeiro limite está acima de cerca de 0,9% de micro-organismos contaminantes quando comparado com a população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo.

Em uma modalidade, o primeiro limite está acima de cerca de 1% de micro-organismos contaminantes quando comparado com a população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo.

Em uma modalidade, o primeiro limite está acima de cerca de 2% de micro-organismos contaminantes quando comparado com a população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo.

Em uma modalidade, o primeiro limite está acima de cerca de 3% dos micro-organismos contaminantes quando comparado com a população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo.

Em uma modalidade, o primeiro limite está acima de cerca de 4% dos micro-organismos contaminantes quando comparado com a população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo.

Em uma modalidade, o primeiro limite está acima de cerca de 5% de micro-organismos contaminantes quando comparado com a população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo.

Em uma modalidade, o primeiro limite está acima de cerca de 6% de micro-organismos contaminantes quando comparado com a população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo.

Em uma modalidade, o primeiro limite está acima de cerca de 7% de micro-organismos contaminantes quando comparado com a população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo.

Em uma modalidade, o primeiro limite está acima de cerca de 8% de micro-organismos contaminantes quando comparado com a população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo.

Em uma modalidade, o primeiro limite está acima de cerca de 9% de micro-organismos contaminantes quando comparado com a população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo. Em uma modalidade, o primeiro limite está acima de cerca de 10% de micro-organismos contaminantes quando comparado com a população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo. Em ainda outra modalidade, o primeiro limite corresponde a entre cerca de 0,1-1%, 0,1-10%, 0,1-9%, 0,1-8%, 0,1-7%, 0,1-6%, 0,1-5%, 0,1- 4%, 0,1-3% ou 0,1-2% em relação à população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo. Em ainda outra modalidade, o primeiro limite corresponde a entre cerca de 2-10%, 2-9%, 2-8%, 2-7%, 2-6%, 2-5%, 2-4% ou 2-3% em relação à população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo. Em ainda outra modalidade, o primeiro limite corresponde a entre cerca de 3-10%, 3-9%, 3-8%, 3-7%, 3-6%, 3-5% ou 3-4% em relação à população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo. Em ainda outra modalidade, o primeiro limite corresponde a entre cerca de 4-10%, 4-9%, 4-8%, 4-7%, 4-6% ou 4-5% em relação à população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo. Em ainda outra modalidade, o primeiro limite corresponde a entre cerca de 5-10%, 5-9%, 5-8%, 5-7% ou 5-6% em relação à população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo. Em ainda outra modalidade, o primeiro limite corresponde a entre cerca de 6-10%, 6-9%, 6-8% ou 6-7% em relação à população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo. Em ainda outra modalidade, o primeiro limite corresponde a entre cerca de 7-10%, 7-9% ou 7-8% em relação à população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo. Em ainda outra modalidade, o primeiro limite corresponde a entre cerca de 8-10% ou 8-9% em relação à população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo. Em ainda outra modalidade, o primeiro limite corresponde a entre cerca de 9-10% em relação à população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo. Em ainda outra modalidade, o primeiro limite corresponde a entre cerca de 0,1-1% em relação à população microbiana total do meio ou da amostra do mesmo.

[00081] O processo também pode compreender cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante em um segundo meio compreendendo o agente pró-citotóxico até que um segundo limite de contaminação microbiana seja atingido. O segundo limite de contaminação microbiana é necessariamente inferior ao primeiro limite de contaminação. Se o segundo limite de contaminação microbiana não for atingido durante a cultura, o processo fornece cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante na presença do agente citotóxico durante todo o comprimento da cultura.

Como tal, em algumas modalidades, o processo fornece cultivar as células hospedeiras de levedura recombinantess apenas em um meio compreendendo o agente pró-citotóxico.

O segundo limite corresponde a um nível de contaminação microbiano igual ou inferior a cerca de 0,1%, 0,09%, 0,08%, 0,07%, 0,06%, 0,05%, 0,04%, 0,03%, 0,02%, 0,01% ou inferior em relação à população microbiana total do meio ou uma amostra do mesmo.

Em algumas modalidades, um nível de contaminação microbiano igual ou inferior a cerca de 0,1% em relação à população microbiana total do meio ou uma amostra do mesmo.

Em outras modalidades, o segundo limite corresponde a um nível de contaminação microbiano igual ou inferior a cerca de 0,09% em relação à população microbiana total do meio ou uma amostra do mesmo.

Em outras modalidades, o segundo limite corresponde a um nível de contaminação microbiano igual ou inferior a cerca de 0,08% em relação à população microbiana total do meio ou uma amostra do mesmo.

Em outras modalidades, o segundo limite corresponde a um nível de contaminação microbiano igual ou inferior a cerca de 0,07% em relação à população microbiana total do meio ou uma amostra do mesmo.

Em outras modalidades, o segundo limite corresponde a um nível de contaminação microbiano igual ou inferior a cerca de 0,06% em relação à população microbiana total do meio ou uma amostra do mesmo.

Em outras modalidades, o segundo limite corresponde a um nível de contaminação microbiano igual ou inferior a cerca de 0,05% em relação à população microbiana total do meio ou uma amostra do mesmo.

Em outras modalidades, o segundo limite corresponde a um nível de contaminação microbiano igual ou inferior a cerca de 0,04% em relação à população microbiana total do meio ou uma amostra do mesmo.

Em outras modalidades, o segundo limite corresponde a um nível de contaminação microbiano igual ou inferior a cerca de 0,03% em relação à população microbiana total do meio ou uma amostra do mesmo.

Em outras modalidades, o segundo limite corresponde a um nível de contaminação microbiano igual ou inferior a cerca de 0,02% em relação à população microbiana total do meio ou uma amostra do mesmo.

Em outras modalidades, o segundo limite corresponde a um nível de contaminação microbiano igual ou inferior a cerca de 0,01% em relação à população microbiana total do meio ou uma amostra do mesmo.

[00082] As etapas aqui descritas podem ser repetidas mais de uma vez e, como tal, a célula hospedeira de levedura recombinante pode alternar, durante todo o curso da cultura contínua, entre um meio compreendendo e sem um agente pró-citotóxico, dependendo do nível de contaminação microbiano. Em um exemplo, as etapas do processo aqui descritas podem ser repetidas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 ou 52 vezes por ano. Em algumas modalidades, as etapas do processo aqui descritas podem ser repetidas uma, duas ou três vezes por ano.

[00083] Uma modalidade do processo da presente invenção é fornecida na Figura 1. Na modalidade da Figura 1, uma cultura contínua é fornecida e, na etapa 010, a população microbiana total é cultivada na ausência do agente pró-citotóxico e está sendo monitorada quanto à presença e extensão de uma contaminação por micro-organismos contaminantes. Conforme usado no contexto da presente invenção, uma etapa de monitoramento refere-se a uma etapa que é realizada mais de uma vez em dois pontos de tempo diferentes. A etapa de monitoramento pode informar se uma contaminação microbiana está presente, ausente, aumentando, persistindo ou diminuindo. O monitoramento pode ser feito, por exemplo, avaliando, o número de micro-organismos contaminantes, a porcentagem ou relação de micro-organismos contaminantes em função da população microbiana total do meio de cultura (ou uma amostra do mesmo). Isso também pode ser feito avaliando o número de células hospedeiras de levedura recombinantes, a porcentagem ou relação de células hospedeiras de levedura recombinantes em função da população microbiana total do meio de cultura (ou uma amostra do mesmo). Na modalidade mostrada na Figura 1, a mesma é a porcentagem de micro-organismos contaminantes em função da população microbiana total do meio de cultura ou da amostra do mesmo que está sendo monitorada. O monitoramento pode ser realizado várias vezes durante o processo de cultura contínuo, por exemplo, pode ser feito mensalmente ou semanalmente. Se a etapa de monitoramento 010 prevê que uma contaminação microbiana está presente no meio de cultura e que esta contaminação microbiana excede um primeiro limite (por exemplo, 10% na modalidade mostrada na Figura 1), em seguida, o processo inclui uma etapa 020 de cultivar as células hospedeiras de levedura recombinantes na presença do agente pró-citotóxico em um esforço para reduzir a contaminação microbiana. Se a etapa de monitoramento 010 fornece que uma contaminação microbiana está presente no meio de cultura e que esta contaminação microbiana é igual ou inferior a um primeiro limite (por exemplo, 10% na modalidade mostrada na Figura 1), em seguida, as células hospedeiras de levedura recombinantess continuam a ser cultivadas na ausência do agente pró-citotóxico. Entende-se que, se no início ou nos estágios iniciais da cultura, for determinado que o nível de contaminação microbiano excede o primeiro limite (por exemplo, quando uma determinação de contaminação microbiana é feita na cultura inicial), o meio inicial da cultura pode incluir o agente pró-citotóxico (não mostrado na Figura 1).

[00084] Uma vez que a célula hospedeira de levedura recombinante é cultivada na presença de agente pró-citotóxico, o meio é ainda monitorado, na etapa 030, para determinar a presença e a extensão de uma contaminação por micro-organismos contaminantes até que um segundo limite seja atingido (por exemplo 0,1% na modalidade mostrada na Figura 1). O monitoramento pode ser realizado várias vezes durante o processo de cultura contínuo, por exemplo, pode ser feito mensalmente ou semanalmente. Se a etapa de monitoramento 030 prevê que uma contaminação microbiana está presente no meio de cultura e que esta contaminação microbiana é inferior a um segundo limite (por exemplo 0,1% na modalidade mostrada na Figura 1), em seguida, o processo inclui uma etapa 040 de cultivar as células hospedeiras de levedura recombinantes na ausência do agente pró-citotóxico. Por outro lado, se a etapa de monitoramento 030 prevê que uma contaminação microbiana está presente no meio de cultura e que esta contaminação microbiana excede um segundo limite (por exemplo, 0,1% na modalidade mostrada na Figura 1), em seguida, o processo prevê a continuação de cultivar, na etapa 020, as células hospedeiras de levedura recombinantes na presença do agente pró-citotóxico. Entende-se que, se em qualquer momento da cultura, for determinado que o nível de contaminação microbiano é igual ou inferior ao segundo limite, as células hospedeiras de levedura recombinantes devem ser cultivadas em um meio sem o agente pró- citotóxico (não mostrado na Figura 1).

[00085] Será entendido que o processo mostrado na Figura 1 é uma abordagem cíclica e que o processo aqui descrito pode começar em qualquer etapa.

[00086] Em algumas modalidades alternativas, o processo pode compreender cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante na presença do agente pró-citotóxico em toda a cultura contínua de modo a prevenir uma contaminação microbiana.

[00087] Na presente invenção, uma célula hospedeira de levedura recombinante com uma modificação genética que causa a redução ou a inibição da expressão do gene nocivo FCY1 pode ser usada nos processos em combinação com 5-fluorocitosina (5-FC) e/ou 5-fluorouracil (5-FU) como o agente pró-citotóxico. Opcionalmente, a célula hospedeira de levedura recombinante pode incluir ainda uma modificação genética adicional causando a redução ou a inibição da expressão do gene nocivo FUR1. Alternativamente, uma célula hospedeira de levedura recombinante com uma modificação genética causando a redução ou inibição da expressão do gene nocivo FUR1 pode ser usada nos processos em combinação com 5-fluorocitosina (5-FC) e/ou 5- fluorouracil (5- FU) como o agente pró-citotóxico.

[00088] Em uma modalidade do processo, uma cultura contínua pode ser fornecida e a população microbiana total está sendo monitorada, por exemplo, mensalmente ou semanalmente, quanto à presença e extensão de uma contaminação por micro-organismos contaminantes. Em tal modalidade mostrada, é a porcentagem de micro-organismos contaminantes em função da população microbiana total do meio de cultura ou da amostra do mesmo que está sendo monitorada. Se a etapa de monitoramento prevê que uma contaminação microbiana está presente no meio de cultura e que esta contaminação microbiana excede um primeiro limite (por exemplo, 10%), em seguida, o processo inclui uma etapa de cultivar as células hospedeiras de levedura recombinantes na presença de 5-FC/5-FU em um esforço para reduzir a contaminação microbiana. Uma vez que, em uma modalidade, as células hospedeiras de levedura recombinantess não expressam o gene FCY1 e/ou o gene FUR1 (ou seus ortólogos correspondentes), elas não podem metabolizar 5-FC/5-FU em um composto citotóxico e podem continuar a crescer. Além disso, uma vez que os micro-organismos contaminantes, especialmente se forem leveduras contaminantes, expressam o gene FCY1 e/ou o gene FUR1 (ou seus ortólogos correspondentes) que codificam a proteína FCY1 e/ou a proteína FUR1, são capazes de metabolizar 5-FC/5-FU em um composto citotóxico, seu crescimento ou viabilidade será limitado. Em uma modalidade, o processo compreende adicionar ao primeiro meio, pelo menos, cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou 500 ppm de 5-FC/5-FU para fornecer o segundo meio. Em outra modalidade, o processo compreende o fornecimento de um segundo meio compreendendo, pelo menos, cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou 500 ppm de 5-FC/5-FU. Em uma modalidade, o processo compreende adicionar ao primeiro meio não mais do que cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou 500 ppm de 5-FC/5-FU para fornecer o segundo meio. Em outra modalidade, o processo compreende o fornecimento de um segundo meio compreendendo não mais do que cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou 500 ppm de 5-FC/5-FU. Em uma modalidade, o processo compreende adicionar ao primeiro meio entre cerca de 10 a 500 ppm de 5-FC/5- FU para fornecer o segundo meio. Em outra modalidade, o processo compreende o fornecimento de um segundo meio compreendendo entre cerca de 10 a 500 ppm de 5-FC/5-FU.

[00089] Uma vez que a célula hospedeira de levedura recombinante é cultivada na presença de agente pró-citotóxico, o meio é ainda monitorado para determinar a presença e a extensão de uma contaminação por micro-organismos contaminantes até que um segundo limite seja atingido (por exemplo 0,1%). Se a etapa de monitoramento prevê que uma contaminação microbiana está presente no meio de cultura e que esta contaminação microbiana é inferior a um segundo limite (por exemplo 0,1%), em seguida, o processo inclui uma etapa de cultivar as células hospedeiras de levedura recombinantes na ausência de 5- FC/5-FU. Por outro lado, se a etapa de monitoramento fornece que uma contaminação microbiana está presente no meio de cultura e que esta contaminação microbiana excede um segundo limite (por exemplo, 0,1%), em seguida, o processo inclui a continuação de cultivar as células hospedeiras de levedura recombinantes na presença de 5-FC/5-FU. Processos de fabricação de um produto fermentado

[00090] O processo de limitar a contaminação microbiana aqui descrito pode ser aplicado especificamente a processos para fazer produtos fermentados a partir de um substrato. Em tal modalidade, o meio da cultura contínua compreende uma fonte de carboidrato (por exemplo, um primeiro e/ou um segundo meio compreendendo um carboidrato) permitindo a produção de produtos fermentados. Durante a cultura, o primeiro e/ou segundo meio estão sendo fermentados pela célula hospedeira de levedura recombinante para fazer um produto fermentado. O produto fermentado pode ser um álcool, tal como, por exemplo, etanol, isopropanol, n-propanol, 1-butanol, metanol, acetona, 1, 2 propanodiol ou um polipeptídeo heterólogo que é expresso em uma forma recombinante pela célula hospedeira de levedura recombinante. Em sua modalidade mais ampla, o processo compreendendo cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante na presença do agente pró-citotóxico. O agente pró- citotóxico pode ser incluído no primeiro e/ou no segundo meio antes do processo de fermentação. Alternativamente ou complementarmente, o agente citotóxico pode ser colocado em contato com a célula hospedeira de levedura recombinante antes ou durante o processo de fermentação contínuo. O processo também pode incluir colocar em contato uma vez ou em uma pluralidade de ocasiões o agente pró-citotóxico com a célula hospedeira de levedura recombinante durante o processo de fermentação. O processo pode ainda compreender adicionar o agente pró-citotóxico ao primeiro meio antes e/ou durante o processo de fermentação.

[00091] Em algumas modalidades do processo de fermentação, as células hospedeiras de levedura recombinantes são submetidas a culturas contínuas que são suscetíveis de serem absorvidas por micro-organismos contaminantes de tipo selvagem, tais como, por exemplo, por leveduras de tipo selvagem. Essas fermentações incluem, mas não são limitadas a processos de biocombustíveis brasileiros, bem como, em outros processos de etanol de longa duração. Conforme aqui indicado, os micro-organismos contaminantes que causam a contaminação microbiana incluem, mas não são limitados a leveduras e bactérias contaminantes.

[00092] Em uma modalidade, durante a fermentação, e conforme aqui descrito, o processo pode compreender alternar entre dois meios de fermentação para limitar a contaminação microbiana: um primeiro meio de fermentação compreendendo um carboidrato e sem um agente pró-citotóxico e um segundo meio de fermentação compreendendo um carboidrato e tendo o agente pró-citotóxico. O agente pró-citotóxico a ser usado no processo é selecionado em função da célula hospedeira de levedura recombinante usada em tal processo e mais especificamente em função da modificação genética que foi feita na célula hospedeira de levedura recombinante. Conforme aqui indicado, a célula hospedeira de levedura recombinante inclui, pelo menos, uma modificação genética para diminuir ou impedir a expressão de, pelo menos, um gene nocivo. Tal gene nocivo, presente e expresso nos micro-organismos contaminantes, codifica um polipeptídeo capaz de metabolizar o agente pró- citotóxico (que não possui citotoxicidade para as células hospedeiras de levedura recombinantes e os micro-organismos contaminantes) em um agente citotóxico (que é citotóxico para os micro-organismos contaminantes, mas não para as células hospedeiras de levedura recombinantes). Como tal, o tipo de agente pró-citotóxico usado é com base nas modificações genéticas da célula hospedeira de levedura recombinante presente no meio de fermentação. Por exemplo, quando a primeira célula hospedeira de levedura recombinante foi geneticamente modificada de modo a não expressar o gene FCY1 e/ou o gene FUR1 (ou seus ortólogos correspondentes), o agente pró-citotóxico pode ser 5- FC e/ou 5- FU.

[00093] Em uma modalidade, o processo fornece alternância entre os dois meios de fermentação em função de um primeiro limite (máximo) de contaminação microbiana e um segundo limite (mínimo) de contaminação microbiana como descrito acima. O primeiro limite é usado de modo a limitar a contaminação microbiana antes de sua aquisição da cultura. O segundo limite é usado de modo a limitar o uso/custos do agente pró-citotóxico. A fermentação pode ser iniciada na ausência do agente pró-citotóxico, embora seja possível nesta fase da fermentação incluir o agente pró-citotóxico no meio de fermentação (especialmente, se a cultura for uma repetição de vários ciclos de fermentação e o ciclo de fermentação anterior incluiu uma contaminação microbiana importante, por exemplo, acima ou próximo do primeiro limite). Como o processo aqui descrito é destinado a ser usado durante fermentações contínuas e é esperado que seja contaminado com micro-organismos contaminantes, quando o primeiro limite de contaminação microbiana é excedido, o processo fornece fermentar a célula hospedeira de levedura recombinante no segundo meio de fermentação compreendendo o agente pró-citotóxico. A célula hospedeira de levedura recombinante fermenta o segundo meio de fermentação na presença do agente pró-citotóxico até que o segundo limite seja atingido. Nesse ponto, a célula hospedeira de levedura recombinante pode ser cultivada na ausência do agente pró-citotóxico até que o primeiro limite seja atingido.

[00094] Em algumas modalidades, e conforme aqui indicado para o processo de cultura contínuo, o processo de fermentação aqui descrito fornece a limitação da extensão da contaminação microbiana entre 0,1 a 10% da população microbiana total do meio (ou em uma amostra do mesmo). Por exemplo, a célula hospedeira de levedura recombinante pode ser cultivada em um primeiro meio (fermentação) até que um primeiro limite de contaminação seja excedido e, em algumas modalidades, em um segundo meio (fermentação) até que um segundo limite de contaminação seja atingido. Alternativamente, a célula hospedeira de levedura recombinante pode ser cultivada em um segundo meio (fermentação) até que um segundo limite de contaminação seja atingido e, em algumas modalidades, em um primeiro meio (fermentação) até que um primeiro limite de contaminação seja excedido. O primeiro limite de contaminação é necessariamente maior do que o segundo limite de contaminação. O primeiro limite pode ser usado de modo a limitar a contaminação microbiana antes de sua retomada da cultura. O segundo limite pode ser usado de modo a limitar o uso/custos do agente pró-citotóxico. O primeiro limite de contaminação pode ser, como aqui indicado, entre cerca de 1 a 10%. O segundo limite de contaminação pode ser, conforme aqui indicado, igual ou inferior a cerca de 0,1%.

[00095] As etapas aqui descritas podem ser repetidas mais de uma vez e, como tal, a célula hospedeira de levedura recombinante pode alternar, durante todo o curso da fermentação, entre um meio compreendendo e sem um agente pró-citotóxico, dependendo do nível de contaminação microbiano. Em um exemplo, as etapas do processo aqui descritas podem ser repetidas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 ou 52 vezes por ano. Em algumas modalidades, as etapas do processo aqui descritas podem ser repetidas uma, duas ou três vezes por ano.

[00096] A modalidade do processo mostrado na Figura 1 pode ser aplicada ao processo de fermentação da presente invenção, desde que o primeiro e/ou o segundo meio compreendam uma fonte de carboidrato. Conforme aqui indicado para o processo de cultura contínuo, o processo de fermentação também pode ser submetido a uma etapa de monitoramento para determinar a presença e a extensão de uma contaminação por micro-organismos contaminantes.

[00097] Na presente invenção, uma célula hospedeira de levedura recombinante com uma modificação genética que causa a redução ou a inibição da expressão do gene nocivo FCY1 e/ou FUR 1 (ou seus ortólogos correspondentes) pode ser usada nos processos de fermentação em combinação com 5-FC e/ou 5-FU como o agente pró-citotóxico. Em uma modalidade, uma fermentação pode ser fornecida e a população microbiana total pode ser monitorada, por exemplo, mensalmente ou semanalmente, quanto à presença e extensão de uma contaminação por micro-organismos contaminantes. Em tal modalidade mostrada, é a porcentagem de micro- organismos contaminantes em função da população microbiana total do meio de fermentação ou da amostra do mesmo que está sendo monitorada. Se a etapa de monitoramento prevê que uma contaminação microbiana está presente no meio de fermentação e que esta contaminação microbiana excede um primeiro limite (por exemplo, 10%), em seguida, o processo inclui uma etapa de cultivar as células hospedeiras de levedura recombinantes na presença de 5-FC/5-FU em um esforço para reduzir a contaminação microbiana. Uma vez que as células hospedeiras de levedura recombinantess não expressam o gene FCY1 e/ou o gene FUR1 (ou seus ortólogos correspondentes), elas não podem metabolizar 5-FC/5-FU e podem continuar a crescer. Além disso, uma vez que os micro- organismos contaminantes, especialmente se forem leveduras contaminantes, expressam o gene FCY1 e o gene FUR1 (ou seus ortólogos correspondentes) que codificam a proteína FCY1 e a proteína FUR1 que são capazes de metabolizar 5-FC/5-FU em um composto citotóxico, seu crescimento ou viabilidade será limitado. Em uma modalidade, o processo compreende adicionar ao primeiro meio, pelo menos, cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou 500 ppm de 5-FC/5-FU para fornecer o segundo meio. Por exemplo, o processo pode compreender adicionar ao primeiro meio, pelo menos, cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ppm de 5-FC/5-FU. Em ainda outro exemplo, o processo pode compreender adicionar entre cerca de 0,1 e 10 ppm ao primeiro meio para obter o segundo meio. Em outra modalidade, o processo pode compreender o fornecimento de um segundo meio compreendendo, pelo menos, cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou 500 ppm de 5-FC/5-FU. Por exemplo, o processo pode compreender o fornecimento de um segundo meio compreendendo, pelo menos, cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ppm. Em ainda outro exemplo, o processo pode compreender o fornecimento de um segundo meio compreendendo entre cerca de 0,1 e 10 ppm de 5-FC/5-FU.

[00098] Em uma modalidade, o processo compreende adicionar ao primeiro meio não mais do que cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou 500 ppm de 5-FC/5-FU para fornecer o segundo meio. Em outra modalidade, o processo compreende adicionar ao primeiro meio não mais do que cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ppm de 5-FC/5-FU para obter o segundo meio. Em outra modalidade, o processo compreende o fornecimento de um segundo meio compreendendo não mais do que cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou 500 ppm de 5-FC/5-FU. Em ainda outra modalidade, o processo compreende o fornecimento de um segundo meio compreendendo não mais do que cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ppm de 5- FC/5-FU. Em uma modalidade, o processo compreende adicionar ao primeiro meio entre cerca de 0,1 a 500 ppm de 5-FC/5-FU para fornecer o segundo meio. Em outra modalidade, o processo compreende o fornecimento de um segundo meio compreendendo entre cerca de 0,1 a 500 ppm de 5-FC/5-FU. Em uma modalidade, o processo compreende adicionar ao primeiro meio entre cerca de 0,1 a 10 ppm de 5-FC/5-FU para fornecer o segundo meio. Em outra modalidade, o processo compreende o fornecimento de um segundo meio compreendendo entre cerca de 0,1 a 10 ppm de 5-FC/5-FU. Em uma modalidade, o processo compreende adicionar ao primeiro meio entre cerca de 0,1 a 5 ppm de 5-FC/5-

FU para fornecer o segundo meio. Em outra modalidade, o processo compreende o fornecimento de um segundo meio compreendendo entre cerca de 0,1 a 5 ppm de 5-FC/5-FU. Em uma modalidade, o processo compreende adicionar ao primeiro meio entre cerca de 0,1 a 3 ppm de 5-FC/5-FU para fornecer o segundo meio. Em outra modalidade, o processo compreende o fornecimento de um segundo meio compreendendo entre cerca de 0,1 a 3 ppm de 5-FC/5-FU. Em uma modalidade, o processo compreende adicionar ao primeiro meio entre cerca de 0,2 a 3 ppm de 5-FC/5-FU para fornecer o segundo meio. Em outra modalidade, o processo compreende o fornecimento de um segundo meio compreendendo entre cerca de 0,2 a 30 ppm de 5-FC/5-FU.

[00099] Uma vez que a célula hospedeira de levedura recombinante é cultivada na presença de agente pró-citotóxico, o meio pode ser monitorado adicionalmente para determinar a presença e a extensão de uma contaminação por micro-organismos contaminantes até que um segundo limite seja atingido (por exemplo, 0,1%). Se a etapa de monitoramento prevê que uma contaminação microbiana está presente no meio de fermentação e que esta contaminação microbiana é inferior a um segundo limite (por exemplo, 0,1%), em seguida, o processo inclui uma etapa de cultivar as células hospedeiras de levedura recombinantes na ausência de 5-FC. Por outro lado, se a etapa de monitoramento fornece que uma contaminação microbiana está presente no meio de cultura e que esta contaminação microbiana excede um segundo limite (por exemplo, 0,1%), em seguida, o processo inclui a continuação de cultivar as células hospedeiras de levedura recombinantes na presença de 5-FC/5-FU.

[000100] A modificação genética da célula hospedeira de levedura recombinante selecionada para conduzir a fermentação, de preferência, não altera substancialmente o desempenho de fermentação (tal como, por exemplo, a taxa de fermentação, o crescimento, a viabilidade e/ou a robustez) da célula hospedeira de levedura recombinante quando comparado ao desempenho de fermentação de uma célula hospedeira de levedura correspondente sem a modificação genética. Conforme usado no contexto da presente invenção, o desempenho de fermentação das células hospedeiras de levedura recombinantes não é substancialmente alterado (e, em algumas modalidades, pode ser aumentado) quando comparado com os desempenhos de fermentação de uma célula hospedeira correspondente sem a modificação genética.

Conforme usado no contexto da presente invenção, o termo "não está substancialmente alterado" refere-se ao fato de que os desempenhos de fermentação da célula hospedeira de levedura recombinante podem ser reduzidos em no máximo 1, 2, 5, 10, 15, 20 ou 25% quando comparado com os desempenhos de fermentação da célula hospedeira correspondente sem a modificação genética. O desempenho durante a fermentação de uma célula de levedura pode ser medido determinando a taxa de fermentação (quanto maior a taxa de fermentação, melhor o desempenho), o consumo de açúcar ou a taxa de consumo de açúcar (quanto maior o consumo de açúcar ou a taxa de consumo de açúcar, melhor o desempenho), o rendimento medido pelo etanol (por exemplo, a produção de etanol ou a taxa de produção de etanol (quanto maior a produção de etanol ou a taxa de produção de etanol, melhor o desempenho)) ou produção de gás (CO2, por exemplo, a produção de gás ou a taxa de produção de gás (quanto maior a produção de gás ou a taxa de produção de gás, melhor o desempenho)), o acúmulo de biomassa de levedura ou a taxa de acúmulo de biomassa de levedura (um acúmulo de biomassa de levedura apropriado ou uma taxa de acúmulo de biomassa de levedura, permitindo a propagação e fermentação, ao mesmo tempo que limita a produção de glicerol) e/ou tolerância a condições ambientais tóxicas (por exemplo, tolerância a compostos tóxicos, temperatura elevada, pH acídico ou básico (quanto maior a tolerância, melhores são os desempenhos)).

[000101] Em algumas modalidades adicionais, o desempenho dos métodos de preparação de um produto fermentado não é substancialmente alterado quando comparado ao desempenho de fermentação de um método conduzido com uma célula hospedeira de levedura correspondente sem a modificação genética. Conforme usado no contexto da presente invenção, o desempenho de fermentação não é considerado ser substancialmente alterado (e, em algumas modalidades, pode ser aumentado) quando comparado com os desempenhos de fermentação de um método conduzido com uma célula hospedeira de levedura correspondente sem a modificação genética. Conforme usado no contexto da presente invenção, o termo "não está substancialmente alterado" refere-se ao fato de que o desempenho de fermentação pode ser reduzido em no máximo 1, 2, 5, 10, 15, 20 ou 25% em comparação com o desempenho de fermentação de um método conduzido com uma célula hospedeira correspondente sem a modificação genética. O desempenho durante a fermentação pode ser medido pela determinação da taxa de fermentação (quanto maior a taxa de fermentação, melhor será o desempenho), o consumo de açúcar ou a taxa de consumo de açúcar (quanto maior o consumo de açúcar ou a taxa de consumo de açúcar, melhor será o desempenho), o rendimento medido pelo etanol (por exemplo, a produção de etanol ou a taxa de produção de etanol (quanto maior a produção de etanol ou a taxa de produção de etanol, melhor o desempenho)) ou produção de gás (CO2, por exemplo, a produção de gás ou a taxa de produção de gás (quanto maior a produção de gás ou a taxa de produção de gás, melhor o desempenho)), o acúmulo de biomassa de levedura ou a taxa de acúmulo de biomassa de levedura (um acúmulo de biomassa de levedura apropriado ou taxa de acúmulo de biomassa de levedura, permitindo a propagação e fermentação ao mesmo tempo limitando a produção de glicerol) e/ou tolerância a condições ambientais tóxicas (por exemplo, tolerância a compostos tóxicos, temperatura elevada, pH acídico ou básico (quanto maior a tolerância, melhores são os desempenhos)).

[000102] Em algumas modalidades adicionais, o desempenho dos métodos de preparação de um produto fermentado não é substancialmente alterado quando comparado ao desempenho de fermentação de um método conduzido com a célula hospedeira recombinante, mas na ausência do agente pró-citotóxico. Conforme usado no contexto da presente invenção, o desempenho de fermentação não é considerado ser substancialmente alterado (e, em algumas modalidades, pode ser aumentado) quando comparado com os desempenhos de fermentação de um método conduzido com uma célula hospedeira de levedura recombinante, mas na ausência do agente pró- citotóxico. Conforme usado no contexto da presente invenção, o termo "não está substancialmente alterado" refere-se ao fato de que o desempenho de fermentação pode ser reduzido em no máximo 1, 2, 5, 10, 15, 20 ou 25% quando comparado com o desempenho de fermentação de um método conduzido com uma célula hospedeira recombinante na ausência do agente pró-citotóxico. O desempenho durante a fermentação pode ser medido pela determinação da taxa de fermentação (quanto maior a taxa de fermentação, melhor será o desempenho), o consumo de açúcar ou a taxa de consumo de açúcar (quanto maior o consumo de açúcar ou a taxa de consumo de açúcar, melhor será o desempenho), o rendimento como medido pelo etanol (por exemplo, a produção de etanol ou a taxa de produção de etanol (quanto maior a produção de etanol ou a taxa de produção de etanol, melhor o desempenho)) ou produção de gás (CO2, por exemplo, a produção de gás ou a taxa de produção de gás (quanto maior a produção de gás ou a taxa de produção de gás, melhor o desempenho)), o acúmulo de biomassa de levedura ou a taxa de acúmulo de biomassa de levedura (um acúmulo de biomassa de levedura apropriado ou taxa de acúmulo de biomassa de levedura, permitindo a propagação e fermentação ao mesmo tempo limitando a produção de glicerol) e/ou tolerância a condições ambientais tóxicas (por exemplo, tolerância a compostos tóxicos, temperatura elevada, pH acídico ou básico (quanto maior a tolerância, melhores são os desempenhos)).

[000103] A biomassa que pode ser fermentada para fazer o produto fermentado com a célula hospedeira de levedura recombinante inclui qualquer tipo de biomassa conhecido na técnica e aqui descrito. Por exemplo, a biomassa pode incluir, mas não está limitada a amido, açúcar e materiais lignocelulósicos. Os materiais de amido podem incluir, mas não são limitados a pastas, tal como milho, trigo, centeio, cevada, arroz ou milo. Os materiais de açúcar podem incluir, mas não são limitados à beterraba sacarina, tubérculos de alcachofra, sorgo doce, melaço ou caldo de cana-de-açúcar. Os termos "material lignocelulósico", "substrato lignocelulósico" e "biomassa celulósica" significam qualquer tipo de biomassa compreendendo celulose, hemicelulose, lignina ou combinações dos mesmos, tais como, mas não limitados à biomassa lenhosa, gramíneas forrageiras, culturas energéticas herbáceas, biomassa não lenhosa de planta, perdas agrícolas e/ou resíduos agrícolas, resíduos florestais e/ou perdas florestais, lama de produção de papel e/ou lama de papel residual, lama de tratamento de águas residuais, resíduos sólidos municipais, plantas de etanol de milho moído seco e úmido e resíduos do processamento de açúcar. Os termos "hemicelulósicos", "porções hemicelulósicas" e "frações hemicelulósicas" significam a não lignina, elementos não celulósicos de material lignocelulósico, tais como, mas não limitados à hemicelulose (isto é, compreendendo xiloglucano, xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, manano, glucomanano e galactoglucomanano), pectinas (por exemplo, homogalacturonanos, ramnogalacturonanos I e II, e xilogalacturonano) e proteoglicanos (por exemplo, proteína arabinogalactano, extensina e proteínas ricas em pró-linhagem).

[000104] Em um exemplo não limitativo, o material lignocelulósico pode incluir, mas não está limitado à biomassa lenhosa, tal como fibra de polpa de madeira reciclada, serragem, madeira dura, madeira macia e combinações das mesmas; gramíneas, tais como grama, grama de cordão, grama de centeio, caniço-malhado, miscanto, ou uma combinação dos mesmos; resíduos do processamento de açúcar, tais como, mas não limitados ao bagaço da cana-de- açúcar; resíduos agrícolas, tais como, mas não limitados à palha de arroz, casca de arroz, palha de cevada, espigas de milho, palha de cereal, palha de trigo, palha de canola, palha de aveia, casca de aveia e fibra de milho; caules e folhas, tais como, mas não limitados a caules e folhas de soja, caules e folhas de milho; suculentas, tais como, mas não limitados a agave; e resíduos florestais, tais como, mas não limitados à fibra de polpa de madeira reciclada, serragem, madeira dura (por exemplo, choupo, carvalho, bordo, bétula, salgueiro), madeira macia ou qualquer combinação dos mesmos. O material lignocelulósico pode compreender uma espécie de fibra; alternativamente, o material lignocelulósico pode compreender uma mistura de fibras que se originam de diferentes materiais lignocelulósicos. Outros materiais lignocelulósicos são resíduos agrícolas, como palha de cereais, incluindo palha de trigo, palha de cevada, palha de canola e palha de aveia; fibra de milho; caules e folhas, tais como caules e folhas de milho e caules e folhas de soja; gramíneas, tais como grama, caniço-malhado, grama de cordão e miscanto; ou combinações dos mesmos.

[000105] Os substratos para ensaios de atividade da celulose podem ser divididos em duas categorias, solúveis e insolúveis, com base em sua solubilidade em água. Substratos solúveis incluem celodextrinas ou derivados, carboximetil celulose (CMC) ou hidroxietil celulose (HEC). Substratos insolúveis incluem celulose cristalina, celulose microcristalina (Avicel), celulose amorfa, tal como celulose inchada com ácido fosfórico (PASC), celulose tingida ou fluorescente e biomassa lignocelulósica pré-tratada. Esses substratos são geralmente material celulósico altamente ordenado e, portanto, apenas moderadamente solúvel.

[000106] Será apreciado que o material lignocelulósico adequado pode ser qualquer matéria-prima que contenha celulose solúvel e/ou insolúvel, onde a celulose insolúvel pode estar em uma forma cristalina ou não cristalina. Em várias modalidades, a biomassa lignocelulósica compreende, por exemplo,

madeira, milho, caules e folhas de milho, serragem, casca, melaço, cana-de- açúcar, folhas, resíduos agrícolas e florestais, gramíneas, tais como gramas, produtos de digestão de ruminantes, resíduos municipais, efluentes de fábrica de papel, jornal, papelão ou combinações dos mesmos.

[000107] A lama de papel também é uma matéria-prima viável para a produção de lactato ou acetato. A lama de papel é um resíduo sólido proveniente da polpação e da fabricação de papel, e normalmente é removida da água residual do processo em um clarificador primário. O custo de descarte da lama úmida é um incentivo significativo para converter o material para outros usos, tal como a conversão em etanol. Os processos fornecidos pela presente invenção são amplamente aplicáveis. Além disso, os produtos de sacarificação e/ou fermentação podem ser usados para produzir etanol ou produtos químicos de maior valor agregado, tais como ácidos orgânicos, aromáticos, ésteres, acetona e intermediários poliméricos.

[000108] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece método para hidrolisar um substrato que compreende a biomassa como descrito acima, por exemplo, um substrato compreendendo melaço, cana-de-açúcar ou um derivado do mesmo (que pode ser referido como um "mosto"), colocar em contato o substrato com uma célula hospedeira microbiana recombinante aqui descrita. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método para hidrolisar um substrato, por exemplo, substrato compreendendo melaço, cana-de-açúcar ou um derivado do mesmo, colocando em contato o substrato com uma cocultura compreendendo as células hospedeiras microbianas recombinantes descritas e outro micro-organismo, tal como, por exemplo, um micro-organismo não modificado geneticamente. Em algumas modalidades, o método também pode compreender incluir uma enzima purificada para permitir ou facilitar a hidrólise do substrato ou de um produto intermediário feito pela célula hospedeira microbiana recombinante da presente invenção.

[000109] A produção de etanol pode ser realizada, por exemplo, a temperaturas de, pelo menos, cerca de 20°C, cerca de 21°C, cerca de 22°C, cerca de 23°C, cerca de 24°C, cerca de 25°C, cerca de 26°C, cerca de 27°C, cerca de 28°C, cerca de 29°C, cerca de 30°C, cerca de 31°C, cerca de 32°C, cerca de 33°, cerca de 34°C, cerca de 35°C, cerca de 36°C, cerca de 37°C, cerca de 38°C, cerca de 39°C, cerca de 40°C, cerca de 41°C, cerca de 42°C, cerca de

43°C, cerca de 44°C, cerca de 45°C, cerca de 46°C, cerca de 47°C, cerca de 48°C, cerca de 49°C ou cerca de 50°C. Em algumas modalidades, a produção de etanol a partir da celulose pode ser realizada, por exemplo, a temperaturas acima de cerca de 30°C, cerca de 31°C, cerca de 32°C, cerca de 33°C, cerca de 34°C, cerca de 35°C, cerca de 36°C, cerca de 37°C, cerca de 38°C, cerca de 39°C, cerca de 40°C, cerca de 41°C, cerca de 42°C, ou cerca de 43°C, ou cerca de 44°C, ou cerca de 45°C, ou cerca de 50°C. Em algumas modalidades, a célula hospedeira microbiana recombinante pode produzir etanol a partir da celulose a temperaturas de cerca de 30°C a 60°C, cerca de 30°C a 55°C, cerca de 30°C a 50°C, cerca de 40°C a 60°C, cerca de 40°C a 55°C ou cerca de 40°C a 50°C.

[000110] Em algumas modalidades, a produção de etanol (ou outros produtos e coprodutos) pode ainda ser realizada de acordo com o "processo do Brasil". No "processo do Brasil", o caldo de cana-de-açúcar não esterilizado e/ou melaço são fermentados em um alto inóculo para obter fermentações rápidas. Durante o processo de fermentação, a levedura é repetidamente reciclada ao longo da safra de 200 dias, centrifugando as células e lavando-as em ácido sulfúrico para diminuir a contaminação e quebrar a floculação das células. Cepas industriais isoladas de fermentações de etanol no Brasil demonstraram ter características que as permitem sobreviver às condições de lavagem ácida e fermentação melhores do que a levedura de laboratório típica ou outros isolados de levedura industrial. PE-2, é um isolado selvagem da fermentação do etanol da cana-de-açúcar. PE-2 e outras cepas industriais produzem uma média de 4,5 g/L de glicerol. Em algumas modalidades, a cepa PE-2, ou uma versão modificada da mesma, é usada como o organismo hospedeiro. Em certas modalidades, o etanol é produzido por meio da fermentação de uma célula hospedeira de levedura recombinante de acordo com o processo do Brasil. Em algumas modalidades, a célula hospedeira de levedura recombinante é usada para fermentar uma fonte de carboidrato, em que as leveduras são reutilizadas após uma ou mais fermentações (por exemplo, ciclos), e em que as leveduras são lavadas com um ácido (por exemplo, lavagem com ácido) após cada fermentação. Em algumas modalidades, o ácido tem um pH entre 2,0 e 2,2. Em certas modalidades, o ácido é ácido sulfúrico. Em algumas modalidades adicionais, o ciclo de lavagem com ácido pode ser repetido mais de uma vez, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30,

35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais ciclos de lavagem com ácido podem ser realizados. Em algumas modalidades, os métodos de produção de etanol podem compreender colocar em contato o substrato com uma célula hospedeira de levedura recombinante ou cocultura como aqui descrito e, adicionalmente, colocar em contato o substrato com enzimas produzidas externamente que podem ser fornecidas em uma forma purificada. Enzimas exemplares produzidas externamente incluem, mas não são limitadas a enzimas de degradação de amido, enzimas de degradação de dextrano, fitase, protease, celulases e/ou xilose isomerase. Enzimas específicas produzidas externamente (e, opcionalmente purificadas) incluem, mas não são limitadas a trealases, glucoamilases, alfa-amilases, alfa-glucosidases, glucanases (endo/exo), pululanases, fitases e/ou proteases.

[000111] O processo da presente invenção pode incluir uma etapa de inoculação da célula hospedeira de levedura recombinante em um meio compreendendo uma fonte de carboidrato (e, opcionalmente um agente pró- citotóxico). Um meio inoculado pode ser referido como um mosto. Em algumas modalidades, o mosto pode ser obtido a partir de uma cana-de-açúcar. Após a célula hospedeira de levedura recombinante ter sido inoculada no primeiro meio, ela é submetida a uma etapa de fermentação para gerar um produto de fermentação. O processo também pode incluir, uma vez que a fermentação tenha sido completada ou parada, dissociar a porção sólida (células hospedeiras de levedura recombinantes e outros sólidos associados) da porção líquida do meio fermentado. Esta etapa de dissociação pode ser atingida, por exemplo, usando centrifugação e/ou filtração. A porção sólida e/ou líquida pode ser tratada adicionalmente, por exemplo, para purificar (pelo menos em parte), a produção de fermentação a partir da porção sólida e/ou líquida do produto de fermentação. O processo pode incluir ainda o tratamento da porção sólida compreendendo a célula hospedeira de levedura recombinante com uma ou mais lavagens ácidas. Em algumas modalidades, o agente pró-citotóxico pode ser adicionalmente adicionado às células hospedeiras de levedura recombinantes antes, durante ou logo após a etapa de lavagem com ácido. Em processos que incluem uma etapa de lavagem com ácido, as células hospedeiras de levedura recombinantes lavadas com ácido podem ser adicionadas a um meio adicional (que pode incluir opcionalmente o agente pró-citotóxico) e submetidas a um ciclo de fermentação adicional.

[000112] Em modalidades nas quais as células hospedeiras de levedura recombinantes são utilizadas para produzir etanol de acordo com o processo brasileiro, o processo para limitar a contaminação microbiana pode ser adaptado para ser realizado em coordenação. Por exemplo, o processo pode ser conduzido antes ou depois da etapa de lavagem com ácido. Em ainda outro exemplo, o processo pode ser conduzido em cada ciclo de fermentação, uma vez a cada dois ciclos de fermentação, uma vez a cada três ciclos de fermentação, uma vez a cada quatro ciclos de fermentação, uma vez a cada cinco ciclos de fermentação ou uma vez a cada seis ciclos de fermentação, etc. Em ainda outro exemplo, o processo pode ser semanalmente ou mensalmente. Todas as etapas do processo para limitar a contaminação microbiana podem ser necessárias para serem concluídas, no entanto, em alguns casos, é contemplado que apenas o monitoramento será necessário (ou porque o primeiro limite não foi excedido ou o segundo limite não foi atingido).

[000113] Em algumas modalidades, os métodos compreendem a produção de etanol a uma taxa particular. Por exemplo, em algumas modalidades, o etanol é produzido a uma taxa de, pelo menos, cerca de 0,1 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,25 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,5 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,75 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 1,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 2,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 5,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 10 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 15 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 20,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 25 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 30 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 50 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 100 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 200 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 300 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 400 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 500 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 600 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 700 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 800 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 900 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 1 g por hora por litro, pelo menos cerca de 1,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 2 g por hora por litro, pelo menos cerca de 2,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 3 g por hora por litro, pelo menos cerca de 3,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 4 g por hora por litro, pelo menos cerca de 4,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 5,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 6 g por hora por litro, pelo menos cerca de 6,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 7 g por hora por litro, pelo menos cerca de 7,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 8 g por hora por litro, pelo menos cerca de 8,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 9 g por hora por litro, pelo menos cerca de 9,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 10 g por hora por litro, pelo menos cerca de 10,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 11 g por hora por litro, pelo menos cerca de 11,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 12 g por hora por litro, pelo menos cerca de 12,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 13 g por hora por litro, pelo menos cerca de 13,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 14 g por hora por litro, pelo menos cerca de 14,5 g por hora por litro ou pelo menos cerca de 15 g por hora por litro. Em algumas modalidades, o etanol pode ser produzido na ausência de quaisquer celulases adicionadas externamente.

[000114] A produção de etanol pode ser medida usando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a quantidade de etanol em amostras de fermentação pode ser avaliada usando análises de HPLC. Muitos kits de ensaio de etanol estão comercialmente disponíveis que usam, por exemplo, ensaios com base em enzima álcool oxidase.

[000115] A presente invenção será mais facilmente compreendida referindo-se aos seguintes exemplos que são dados para ilustrar a invenção em vez de limitar o seu escopo. EXEMPLO I - DESCRIÇÃO DA CEPA

[000116] As seguintes cepas foram usadas nos Exemplos: Cepa Descrição PE-2 Nenhuma Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada M10682 Cepa parental PE-2 ime1Δ::STL1 (4x) fcy1Δ::STL1 (4x) gpd1Δ::GPD2

Cepa Descrição M15980 Cepa parental PE-2 ime1Δ::STL1 (4x) fcy1Δ::STL1 (4x) gpd1Δ::GPD2 fur1Δ EXEMPLO II - ENSAIO PARA MONITORAMENTO DE

CONTAMINAÇÃO

[000117] As cepas M10682 e PE-2 foram cultivadas individualmente em YPD, misturadas em várias relações (conforme indicado na breve descrição da seção de desenhos para a Figura 2A) e plaqueadas em placas de ágar YPD sem e tendo 500 μg/mL de 5-FC. Todas as cepas de levedura foram capazes de crescer nas placas de ágar YPD na ausência de 5-FC (Figura 2A, painéis superiores). Apenas a cepa M10682 foi capaz de crescer nas placas de ágar YPD contendo 5-FC (Figura 2A, painéis de fundo).

[000118] Colônias M10682 individuais foram isoladas e inoculadas em 600 μL de YPD em uma placa de 96 cavidades. Três microlitros foram aplicados em placas de ágar YPD e em placas de ágar 5-FC de YPD + 500 μg/mL. As placas foram incubadas a 35°C durante a noite. Os controles são mostrados na caixa. A cepa PE-2 mostrou crescimento normal em ágar YPD, mas não foi capaz de crescer em placas contendo 5-FC (Figura 2B). A cepa M10682 foi capaz de crescer nas placas de ágar YPD e 5-FC (Figura 2B). As outras 40 colônias mostradas na Figura 2B (ii) são isolados M10682 que foram cultivados por 65 gerações antes da detecção e mostram que a capacidade de crescer neste meio 5-FC é um fenótipo estável e pode ser usado consistentemente para detectar M10682.

[000119] Também foi mostrado que a cepa M10682 também pode ser detectada especificamente em meio líquido contendo 5-FC. Amostras de fermentações industriais em escala reduzida em PE-2 e M10682 foram inoculadas diretamente em um meio YPD ou um YPD suplementado com 500 μg/mL de 5-FC (YPD + 5-FC). Ambas as cepas foram capazes de crescer no meio de base, conforme detectado pelo pélete de células de levedura no fundo do tubo, bem como, a mudança de cor (roxo para amarelo) do líquido que é indicativo de crescimento de levedura e uma diminuição no pH do meio (Figura 2C (i)). Em YPD + 5FC, PE-2 foi incapaz de crescer enquanto o crescimento de

M10682 foi detectado pelo pélete de célula de levedura e mudança de cor do meio (roxo para amarelo) (Figura 2C (ii)). EXEMPLO III - LIMITANDO A CONTAMINAÇÃO DURANTE A FERMENTAÇÃO COM UMA DELEÇÃO FCY1

[000120] A cepa M10682 foi misturada com 1%, 5% ou 10% da cepa PE-2. Cada uma das populações mistas de levedura M10682 + PE-2 completou quatro rodadas de fermentação e reciclagem de célula de levedura no presente de 0, 1 ou 4 ppm de 5-FC. No final de cada ciclo de fermentação, a levedura cresceu por sete gerações, o DNA foi extraído da população total e qPCR foi usado para determinar a abundância relativa de M10682 e PE-2. Conforme mostrado na Figura 3, a adição de 5-FC ao meio durante a fermentação reduziu substancialmente a contaminação pela cepa PE-2. Mesmo os 10% de contaminação de PE-2 podem ser eliminados em 2 ciclos de tratamento com 4 ppm de 5-FC ou 4 ciclos de tratamento com 1 ppm de 5-FC (Figura 3C). EXEMPLO IV - LIMITANDO A CONTAMINAÇÃO DURANTE A FERMENTAÇÃO COM UMA DELEÇÃO FCY1/FUR1

[000121] Uma deleção suplementar foi introduzida no gene fur1 (por exemplo, cepa M15980, ver Tabela 1 acima). As fermentações foram conduzidas em mosto de origem comercial com 0 (cinza escuro) ou 50 (cinza claro) ppm de 5-FU. As cepas foram cultivadas sozinhas ou em misturas conforme indicado. As concentrações de etanol finais foram determinadas por HPLC. Como mostrado na Figura 4, em meio suplementado com 5-FU, a produção de etanol de PE-2 e M10682 foi severamente inibida. No entanto, a produção de etanol de uma cepa compreendendo uma deleção em ambos os genes fcy1 e fur1 foi mantida na presença e na ausência de 5-FU.

[000122] As cepas M10682 e M15980 foram, cada uma, misturadas com 10%, 50% ou 75% de corante contaminante de tipo selvagem PE-2. As fermentações foram conduzidas em um mosto de origem comercial com 0 (cinza escuro) ou 10 (cinza claro) ppm de 5-FC. As cepas foram cultivadas sozinhas ou em misturas conforme indicado. Na ausência de 5-FC, a cepa M15980 teve um desempenho similar à cepa M10682 quando desafiada com a cepa de tipo selvagem contaminante PE-2 (Figura 5A). No entanto, na presença de 5-FC, as cepas tiveram um desempenho diferente: a cepa 10682 não sobreviveu ao tratamento com 5-FC, enquanto a cepa M15980 prosperou após o tratamento com 5-FC (Figura 5B). Sem querer se limitar à teoria, é estipulado que, em altos níveis de contaminação com a cepa PE-2 (por exemplo, acima de 10%), a cepa PE-2 converteu o 5-FC no citotóxico 5-FU que era prejudicial às cepas PE-2 e M10682. No entanto, com os mesmos altos níveis de contaminação com a cepa PE-2, o 5-FC convertido em 5-FU foi prejudicial apenas para a cepa PE-2 e não para a cepa M15980. O teste de população determinou que 10 ppm de 5-FC matou todas as leveduras nas misturas de fermentação M10682 + PE-2 (nenhuma colônia formada na permissão da placa seletiva), mas que as culturas de PE-2 que foram misturadas com 88%, 47% ou 24% de M15980 tornaram-se 100%, 98% e 89% da cepa M15980 no final do tratamento com 5-FC.

[000123] Como mostrado na Figura 6, espera-se que uma deleção do gene FUR1 sozinho (∆Fur1) forneça resistência e desempenho similares como uma deleção dupla de FCY1 e FUR1 (∆FCY1 ∆Fur1).

[000124] Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com modalidades específicas da mesma, será entendido que o escopo das reivindicações não deve ser limitado pelas modalidades preferidas estabelecidas nos exemplos, mas deve ser dada a interpretação mais ampla consistente com a descrição como um todo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para prevenir ou limitar uma contaminação microbiana causada por micro-organismos contaminantes durante uma cultura contínua de uma célula hospedeira de levedura recombinante, o processo sendo CARACTERIZADO pelo fato de compreender cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante na presença de um agente pró-citotóxico, em que a célula hospedeira de levedura recombinante tem uma modificação genética para reduzir a expressão de um gene nocivo, e em que a modificação genética impede a conversão do agente pró-citotóxico em um agente citotóxico.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a modificação genética compreende interromper o quadro de leitura aberto do gene nocivo.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a modificação genética compreende aumentar a expressão de um gene que codifica um inibidor da expressão do gene nocivo.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: a. cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante em um primeiro meio sem o agente pró-citotóxico até que um primeiro limite de micro- organismos contaminantes seja excedido, em que o primeiro meio compreende uma primeira população microbiana total e o primeiro limite de micro-organismos contaminantes é, pelo menos, acima de cerca de 0,1% da primeira população microbiana total; b. quando o primeiro limite de micro-organismos contaminantes é atingido no primeiro meio, cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante em um segundo meio possuindo o agente pró-citotóxico até que um segundo limite de micro-organismos contaminantes seja atingido, em que o segundo meio tem uma segunda população microbiana total e o segundo limite ≤ 0,1% da segunda população microbiana total; e c. se ou quando o segundo limite de micro-organismos contaminantes for atingido no segundo meio, cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante no primeiro meio sem o agente pró-citotóxico.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante no primeiro meio quando o segundo limite é atingido.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: a. cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante em um segundo meio possuindo o agente pró-citotóxico até que um segundo limite de micro-organismos contaminantes seja atingido, em que o segundo meio compreende uma segunda população microbiana total e o segundo limite de micro-organismos contaminantes é ≤ 0,1% da segunda população microbiana total; b. quando o segundo limite de micro-organismos contaminantes é atingido no segundo meio, cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante em um primeiro meio sem o agente pró-citotóxico até que um primeiro limite de micro-organismos contaminantes seja excedido, em que o primeiro meio tem uma primeira população microbiana total e o primeiro limite é acima de cerca de 0,1% da primeira população microbiana total; e c. se ou quando o primeiro limite de micro-organismos contaminantes for excedido no primeiro meio, cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante no segundo meio sem o agente pró-citotóxico.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante no segundo meio quando o primeiro limite é excedido.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que as etapas (a) e (b) são repetidas após a etapa (c).

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de compreender monitorar, no primeiro meio, a porcentagem de micro-organismos contaminantes em relação à primeira população microbiana total.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende monitorar, no segundo meio, a porcentagem de micro-organismos contaminantes em relação à segunda população microbiana total.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o monitoramento é feito, pelo menos, uma vez por mês.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o monitoramento é feito, pelo menos, uma vez por semana.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o monitoramento compreende avaliar o número de unidades formadoras de colônias dos micro-organismos contaminantes para monitorar a porcentagem de micro-organismos contaminantes.

14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de compreender adicionar o agente pró- citotóxico ao primeiro meio para obter o segundo meio.

15. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a abstenção de adicionar o agente pró-citotóxico ao segundo meio para obter o primeiro meio.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante em um segundo meio possuindo o agente pró-citotóxico durante a cultura contínua.

17. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o gene nocivo é, pelo menos, um de FCY1, FUR1, URA3, LYS2, LEU2, TRP1, HIS3, MET15 ou ADE2.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o gene nocivo compreende FCY1.

19. Processo, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente pró-citotóxico é 5-fluorocitosina (5- FC).

20. Processo, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o gene nocivo é FUR1.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o gene nocivo compreende FCY1 e FUR1.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente pró-citotóxico é 5-fluorocitosina (5- FC) ou 5-fluorouracil (5-FU).

23. Processo, de acordo com a reivindicação 18 a 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a concentração de 5-FC ou 5-FU está entre cerca de 0,1 e cerca de 500 ppm no segundo meio.

24. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, CARACTERIZADO pelo fato de compreender colocar em contato o agente pró-citotóxico com a célula hospedeira de levedura recombinante pelo menos uma, duas ou três vezes por ano.

25. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, CARACTERIZADO pelo fato de que os micro-organismos contaminantes compreendem leveduras.

26. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira de levedura recombinante é de Saccharomyces sp.

27. Processo, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira de levedura recombinante é de Saccharomyces cerevisiae.

28. Processo para fazer um produto de fermentação a partir de um primeiro e/ou um segundo meio de fermentação compreendendo um carboidrato, o processo sendo CARACTERIZADO pelo fato de compreender cultivar uma célula hospedeira de levedura recombinante na presença de um agente pró-citotóxico sob condições de modo a permitir a fabricação do produto de fermentação, em que a célula hospedeira de levedura recombinante tem uma modificação genética para reduzir a expressão de um gene nocivo, e em que a modificação genética impede a conversão do agente pró-citotóxico em um agente citotóxico.

29. Processo, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que a modificação genética compreende interromper o quadro de leitura aberto do gene nocivo.

30. Processo, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, CARACTERIZADO pelo fato de que a modificação genética compreende aumentar a expressão de um gene que codifica um inibidor da expressão do gene nocivo.

31. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: a. colocar em contato a célula hospedeira recombinante com o primeiro meio de fermentação compreendendo um carboidrato e sem o agente pró-citotóxico sob condições para promover a produção do produto de fermentação e até que um primeiro limite de micro-organismos contaminantes seja excedido, em que o primeiro meio de fermentação compreende uma primeira população microbiana total e o primeiro limite de micro-organismos contaminantes está acima de cerca de 0,1% da primeira população microbiana total; b. quando o primeiro limite de micro-organismos contaminantes for excedido no primeiro meio de fermentação, cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante no segundo meio de fermentação possuindo o carboidrato e o agente pró-citotóxico até que um segundo limite de micro- organismos contaminantes seja atingido, em que o segundo meio de fermentação tem uma segunda população microbiana total e o segundo limite é ≤ 0,1% da segunda população microbiana total; e c. se ou quando o segundo limite de micro-organismos contaminantes for atingido no segundo meio de fermentação, cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante no primeiro meio de fermentação.

32. Processo, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de compreender cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante no primeiro meio de fermentação quando o segundo limite é atingido.

33. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: a. cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante em um segundo meio de fermentação possuindo um carboidrato e o agente pró- citotóxico até que um segundo limite de micro-organismos contaminantes seja atingido, em que o segundo meio de fermentação compreende uma segunda população microbiana total e o segundo limite de micro-organismos contaminantes é ≤ 0,1% da segunda população microbiana total;

b. quando o segundo limite de micro-organismos contaminantes é atingido no segundo meio de fermentação, cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante em um primeiro meio de fermentação compreendendo o carboidrato e sem o agente pró-citotóxico até que um primeiro limite de micro- organismos contaminantes seja excedido, em que o primeiro meio de fermentação tem uma primeira população microbiana total e o primeiro limite está entre cerca de 1-10% da primeira população microbiana total; e c. se ou quando o primeiro limite de micro-organismos contaminantes for excedido no primeiro meio de fermentação, cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante no segundo meio de fermentação.

34. Processo, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de compreender cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante no segundo meio de fermentação quando o primeiro limite é excedido.

35. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 34, CARACTERIZADO pelo fato de compreender repetir as etapas (a) e (b) após a etapa (c).

36. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 32, CARACTERIZADO pelo fato de compreender monitorar, no primeiro meio de fermentação, a porcentagem de micro-organismos contaminantes em relação à primeira população microbiana total.

37. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 33, CARACTERIZADO pelo fato de compreender monitorar, no segundo meio de fermentação, a porcentagem de micro-organismos contaminantes em relação à segunda população microbiana total.

38. Processo, de acordo com a reivindicação 36 ou 37, CARACTERIZADO pelo fato de que o monitoramento é feito, pelo menos, uma vez por mês.

39. Processo, de acordo com a reivindicação 36 ou 37, CARACTERIZADO pelo fato de que o monitoramento é feito, pelo menos, uma vez por semana.

40. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 39, CARACTERIZADO pelo fato de que o monitoramento compreende avaliar o número de unidades formadoras de colônias dos micro-organismos contaminantes para monitorar a porcentagem de micro-organismos contaminantes.

41. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 40, CARACTERIZADO pelo fato de compreender adicionar o agente pró- citotóxico ao primeiro meio de fermentação para obter o segundo meio de fermentação.

42. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 40, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a abstenção de adicionar o agente pró-citotóxico ao segundo meio de fermentação para obter o primeiro meio de fermentação.

43. Processo, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de compreender cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante em um segundo meio possuindo o agente pró-citotóxico durante a cultura contínua.

44. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o gene nocivo é, pelo menos, um de FCY1, FUR1, URA3, LYS2, LEU2, TRP1, HIS3, MET15 ou ADE2.

45. Processo, de acordo com a reivindicação 44, CARACTERIZADO pelo fato de que o gene nocivo compreende FCY1.

46. Processo, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente pró-citotóxico é 5-fluorocitosina (5- FC).

47. Processo, de acordo com a reivindicação 44, CARACTERIZADO pelo fato de que o gene nocivo é FUR1.

48. Processo, de acordo com a reivindicação 44, CARACTERIZADO pelo fato de que o gene nocivo compreende FCY1 e FUR1.

49. Processo, de acordo com a reivindicação 47 ou 48, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente pró-citotóxico é 5-fluorocitosina (5- FC) ou 5-fluorouracil (5-FU).

50. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 49, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo meio de fermentação compreende entre cerca de 0,1 e cerca de 500 ppm de 5-FC ou 5-FU.

51. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 50, CARACTERIZADO pelo fato de compreender colocar em contato o agente pró-citotóxico com a célula hospedeira de levedura recombinante pelo menos uma, duas ou três vezes por ano.

52. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 50, CARACTERIZADO pelo fato de que os micro-organismos contaminantes compreendem leveduras.

53. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 52, CARACTERIZADO pelo fato de que o carboidrato é um caldo de cana- de-açúcar, um derivado de cana-de-açúcar, milho, um derivado de milho, melaço e/ou um derivado de melaço.

54. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 53, CARACTERIZADO pelo fato de que o produto de fermentação é etanol, isopropanol, n-propanol, 1-butanol, metanol, acetona, 1, 2 propanodiol ou um polipeptídeo heterólogo.

55. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 54, CARACTERIZADO pelo fato de compreender ainda colocar em contato o agente procitotóxico com a célula hospedeira de levedura recombinante antes de cultivar a célula hospedeira de levedura recombinante.

56. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 55, CARACTERIZADO pelo fato de compreender ainda, pelo menos, um ciclo de fermentação compreendendo a lavagem com ácido da célula hospedeira de levedura recombinante presente no primeiro e/ou no segundo meio de fermentação para obter uma célula hospedeira microbiana recombinante lavada com ácido e colocar em contato a célula hospedeira de levedura recombinante lavada com ácido com o primeiro e/ou o segundo meio de fermentação para promover a produção do produto de fermentação.

57. Processo, de acordo com a reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de compreender ainda, pelo menos, dois ou mais ciclos de fermentação.

58. Processo, de acordo com a reivindicação 56 ou 57, CARACTERIZADO pelo fato de compreender realizar as etapas (a), (b) e (c) antes da lavagem com ácido.

59. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 58, CARACTERIZADO pelo fato de compreender realizar as etapas (a), (b) e (c), pelo menos, uma vez em cada ciclo de fermentação.

60. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 59, CARACTERIZADO pelo fato de que a modificação genética do gene nocivo não altera substancialmente o desempenho de fermentação da célula hospedeira de levedura recombinante quando comparado ao desempenho de fermentação de uma célula hospedeira de levedura correspondente sem a modificação genética.

61. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 60, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira de levedura recombinante é de Saccharomyces sp.

62. Processo, de acordo com a reivindicação 61, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira de levedura recombinante é de Saccharomyces cerevisiae.

63. Método para determinar a presença de micro-organismos contaminantes em um espécime possuindo uma população microbiana total, e compreendendo uma célula hospedeira de levedura recombinante, a célula hospedeira de levedura recombinante possuindo uma modificação genética para reduzir a expressão de um gene nocivo, e em que a modificação genética impede a conversão de um agente pró-citotóxico em um agente citotóxico, o método sendo CARACTERIZADO pelo fato de compreender: a. cultivar uma primeira amostra do espécime em um meio seletivo compreendendo o agente pró-citotóxico para determinar a presença de células hospedeiras de levedura recombinantes no espécime; b. cultivar uma segunda amostra do espécime em um meio permissivo sem o agente pró-citotóxico para determinar a população microbiana total do espécime; e c. determinar a presença de micro-organismos contaminantes no espécime com base na determinação feita nas etapas (a) e (b).

64. Método, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADO pelo fato de que o gene nocivo é FCY1.

65. Método, de acordo com a reivindicação 64, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente pró-citotóxico é 5-fluorocitosina (5- FC).

66. Método, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADO pelo fato de que o gene nocivo é FUR1.

67. Método, de acordo com a reivindicação 66, CARACTERIZADO pelo fato de que o gene nocivo compreende FCY1 e FUR1.

68. Método, de acordo com a reivindicação 66 ou 67, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente pró-citotóxico é 5-fluorocitosina (5- FC) ou 5-fluorouracil (5-FU).