BR112021010778A2 - Modulação da geração de nadph por célula hospedeira de levedura recombinante durante fermentação - Google Patents

Modulação da geração de nadph por célula hospedeira de levedura recombinante durante fermentação Download PDF

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Abstract

modulação da geração de nadph por célula hospedeira de levedura recombinante durante fermentação. declaração sobre listagem de sequências. a presente invenção refere-se a células hospedeiras de levedura recombinantes com uma primeira modificação genética para regular negativamente uma primeira via metabólica que converte nadp+ em nadph, bem como uma segunda modificação genética para regular positivamente uma segunda via metabólica que converte nadp+ em nadph. a segunda modificação genética permite a expressão de uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase sem atividade de fosforilação, que pode, em algumas modalidades, ser da comissão de enzima 1.2.1.9 ou 1.2.1.90. a segunda via é distinta da primeira via metabólica. a presente invenção também refere-se a um processo para fazer e melhorar o rendimento de um produto fermentado, tal como o etanol, usando a célula hospedeira de levedura recombinante.

Description

“MODULAÇÃO DA GERAÇÃO DE NADPH POR CÉLULA HOSPEDEIRA DE LEVEDURA RECOMBINANTE DURANTE FERMENTAÇÃO” DECLARAÇÃO SOBRE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0001] A listagem de sequência associada a este pedido é fornecida em formato de texto em vez de uma cópia em papel e é aqui incorporada por referência no relatório descritivo. O nome do arquivo de texto que contém a listagem de sequência é PCT _-_ Sequence_listing_as_filed. O arquivo de texto é 310 Ko, foi criado em 6 de Dezembro de 2019 e está sendo enviado eletronicamente.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0002] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisional U.S. Número Serial 62/776.910 depositado em 7 de Dezembro de 2018 e aqui incorporado em sua totalidade.
CAMPO TECNOLÓGICO
[0003] A presente invenção refere-se a uma célula hospedeira de levedura recombinante com vias moduladas para utilização e geração de NADPH.
FUNDAMENTO
[0004] Saccharomyces cerevisiae é o biocatalisador primário usado na produção comercial de etanol combustível. Este organismo é proficiente em fermentar glicose em etanol, frequentemente em concentrações superiores a 20% (v/v). Para melhorar ainda mais este rendimento de etanol, a utilização da produção de formiato como uma alternativa ao glicerol como um reservatório de elétrons, resulta em secreção de glicerol reduzida, foi modificada em levedura (por exemplo, documento WO2012138942). Esta estratégia reduz com sucesso a produção do glicerol subproduto da fermentação e aumenta a valiosa produção de etanol pela cepa.
[0005] Seria desejável para um produtor de etanol de milho, ser fornecido com uma célula hospedeira de levedura recombinante alternativa que pudesse fornecer maiores rendimentos de etanol, ou que pudesse fornecer outros benefícios, tais como tolerância a interrupções no processo, taxa de fermentação ou atividades enzimáticas novas e/ou melhoradas, em relação às cepas atuais comercialmente disponíveis. Esta abordagem pode fornecer uma nova via metabólica alternativa, que quando expressa em levedura, resulta em um maior rendimento de etanol e um menor rendimento de glicerol durante as fermentações de pasta de milho.
SUMÁRIO
[0006] A presente invenção fornece células hospedeiras de levedura recombinantes que redirecionam NADP+ de uma primeira via metabólica para uma segunda via metabólica, de modo a regular positivamente a segunda via metabólica. A presente invenção refere-se a uma célula hospedeira de levedura recombinante tendo: i) uma ou mais de uma primeira modificação genética para regular negativamente uma primeira via metabólica; e ii) uma ou mais de uma segunda modificação genética para regular positivamente uma segunda via metabólica. A primeira via metabólica e a segunda via metabólica permitem a conversão de NADP+ em NADPH. A primeira via metabólica é distinta da segunda via metabólica.
[0007] De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira de levedura recombinante tendo: i) uma ou mais de uma primeira modificação genética para regular negativamente uma primeira via metabólica; e ii) uma ou mais de uma segunda modificação genética para regular positivamente uma segunda via metabólica, em que a uma ou mais segundas modificações genéticas permitem a expressão de uma gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase sem atividade de fosforilação, em que a gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase é da comissão enzimática (EC) 1.2.1.9 ou 1.2.1.90. A primeira via metabólica e a segunda via metabólica permitem a conversão de NADP+ em NADPH. A primeira via metabólica é distinta da segunda via metabólica. Em uma modalidade, a primeira modificação genética compreende a inativação de, pelo menos, um primeiro gene nativo. Em ainda outra modalidade, a primeira via metabólica é a via de pentose fosfato. Em ainda uma outra modalidade, o pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene zwf1 que codifica um polipeptídeo com atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase, um ortólogo do gene zwf1 ou um parálogo do gene zwf1. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo com atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, é uma variante de SEQ ID NO: 3 com atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase, ou é um fragmento de SEQ ID NO: 3 com atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase. Em outra modalidade, o pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene gnd1 que codifica um polipeptídeo com atividade de 6- fosfogluconato desidrogenase, um ortólogo do gene gnd1 ou um parálogo do gene gnd1. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo com atividade de 6- fosfogluconato desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, é uma variante da SEQ ID NO: 4 com atividade de 6-fosfogluconato desidrogenase, ou é um fragmento da SEQ ID NO: 4 com atividade de 6- fosfogluconato desidrogenase.
Em ainda outra modalidade, o pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene gnd2 que codifica um polipeptídeo com atividade de 6-fosfogluconato desidrogenase, um ortólogo do gene gnd2 ou um parálogo do gene gnd2. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo com atividade de 6-fosfogluconato desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, é uma variante da SEQ ID NO: 5 com atividade de 6- fosfogluconato desidrogenase ou é um fragmento da SEQ ID NO: 5 com atividade de 6-fosfogluconato desidrogenase.
Em outra modalidade, o pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene ald6 que codifica um polipeptídeo com atividade de aldeído desidrogenase, um ortólogo do gene ald6 ou um parálogo do gene ald6. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo com atividade de aldeído desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, é uma variante de SEQ ID NO: 6 com atividade de aldeído desidrogenase, ou é um fragmento de SEQ ID NO: 6 com atividade de aldeído desidrogenase.
Em ainda outra modalidade, o pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene idp1 que codifica um polipeptídeo com atividade de isocitrato desidrogenase, um ortólogo do gene ipd1 ou um parálogo do gene ipd1. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo com atividade de isocitrato desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, é uma variante de SEQ ID NO: 7 com atividade de isocitrato desidrogenase, ou é um fragmento de SEQ ID NO: 7 com atividade de isocitrato desidrogenase.
Em outra modalidade, o pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene idp2 que codifica um polipeptídeo com atividade de isocitrato desidrogenase, um ortólogo do gene ipd2 ou um parálogo do gene ipd2. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo com atividade de isocitrato desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, é uma variante da SEQ ID NO: 8 com atividade de isocitrato desidrogenase, ou é um fragmento de SEQ ID NO: 8 com atividade de isocitrato desidrogenase.
Em outra modalidade, o pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene idp3 que codifica um polipeptídeo com atividade de isocitrato desidrogenase, um ortólogo do gene ipd3 ou um parálogo do gene ipd3. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo com atividade de isocitrato desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, é uma variante de SEQ ID NO: 9 com atividade de isocitrato desidrogenase, ou é um fragmento de SEQ ID NO: 9 com atividade de isocitrato desidrogenase.
Em ainda outra modalidade, a uma ou mais segundas modificações genéticas compreendem a introdução de uma ou mais segundas moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase.
Em uma modalidade, o recombinante tem uma ou mais segundas moléculas de ácido nucleico heterólogas em um quadro de leitura aberto do primeiro gene nativo.
Em outra modalidade, o pelo menos, um primeiro gene nativo tem um promotor nativo.
Em uma outra modalidade, a uma ou mais segundas moléculas de ácido nucleico heterólogas estão sob o controle do promotor nativo de, pelo menos, um primeiro gene nativo.
Em ainda outra modalidade, a uma ou mais segundas moléculas de ácido nucleico heterólogas estão sob o controle de um promotor heterólogo.
Em algumas modalidades, o promotor heterólogo compreende o promotor do gene ADH1, GPD1, HXT3, QCR8, PGI1, PFK1, FBA1, TDH2, PGK1, GPM1, ENO2, CDC19, ZWF1, HOR7 e/ou TPI1. Em ainda outra modalidade, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase é de EC 1.2.1.90. Em uma modalidade específica, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase é GAPN que pode ser derivado de Streptococcus sp. e, em ainda outra modalidade, de Streptococcus mutans.
Em algumas modalidades, GAPN tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86, é uma variante da SEQ ID NO: 2, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86 com atividade de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, ou é um fragmento de SEQ ID NO: 2, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86 com atividade de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase.
Em outra modalidade, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase é de EC 1.2.1.9. Em algumas modalidades, o pelo menos, um primeiro gene nativo tem um primeiro promotor.
Em ainda outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante tem iii) uma ou mais de uma terceira modificação genética para regular positivamente uma terceira via metabólica, em que a terceira via metabólica permite a conversão de NADH em NAD+. Em uma modalidade, o um ou mais da terceira modificação genética compreende introduzir uma ou mais terceiras moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam um ou mais do terceiro polipeptídeo.
Em ainda outra modalidade, a terceira via metabólica permite a produção de etanol.
Em uma outra modalidade, o um ou mais terceiros polipeptídeos compreendem um polipeptídeo com atividade de álcool/aldeído desidrogenase bifuncional (que pode ter, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, ser uma variante de SEQ ID NO: 10 com atividade de álcool/aldeído desidrogenase bifuncional, ou ser um fragmento de SEQ ID NO: 10 com atividade de álcool/aldeído desidrogenase bifuncional). Em outra modalidade, o um ou mais terceiros polipeptídeos compreendem um polipeptídeo com atividade de glutamato desidrogenase (que pode ter, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, ser uma variante de SEQ ID NO: 11 com atividade de glutamato desidrogenase, ou ser um fragmento de SEQ ID NO: 11 com atividade de glutamato desidrogenase). Em outra modalidade, o um ou mais terceiros polipeptídeos compreendem um polipeptídeo com atividade de álcool desidrogenase (que pode ter, por exemplo, a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 12 a 18, ser uma variante de qualquer uma das SEQ ID NO: 12 a 18 com atividade de álcool desidrogenase dependente de NADH, ou ser um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NO: 12 a 18 com atividade de álcool desidrogenase dependente de NADH). Em uma modalidade, a terceira via metabólica permite a produção de 1,3-propanodiol.
Nesta modalidade específica, o um ou mais terceiros polipeptídeos heterólogos compreendem um polipeptídeo com atividade de 1,3-propanodiol desidrogenase, opcionalmente em combinação com um polipeptídeo com atividade de glicerol desidratase ativase e um polipeptídeo com atividade de glicerol desidratase.
Por exemplo, o polipeptídeo com atividade de glicerol desidratase ativase pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 com atividade de glicerol desidratase ativase, ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 com atividade de glicerol desidratase ativase.
Em ainda outro exemplo, o polipeptídeo com atividade de glicerol desidratase pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 com atividade de glicerol desidratase, ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 com atividade de glicerol desidratase.
Em ainda outro exemplo, o polipeptídeo com atividade de 1,3-propanodiol desidrogenase pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 com atividade de 1,3-propanodiol desidrogenase, ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 com atividade de 1,3-propanodiol desidrogenase.
Em outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante possui ainda iv) uma ou mais de uma quarta modificação genética para regular positivamente uma quarta via metabólica, em que a quarta via metabólica permite a conversão de NAPDH em NADP+. Em uma modalidade, a uma ou mais quarta modificação genética compreende introduzir uma ou mais quartas moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam um ou mais quartos polipeptídeos.
Em outra modalidade, o um ou mais quartos polipeptídeos compreendem um polipeptídeo com atividade de aldose redutase.
Em uma outra modalidade, o polipeptídeo com atividade de aldose redutase compreende um polipeptídeo com atividade de manitol desidrogenase (que pode ter, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, ser uma variante de SEQ ID NO: 19 com atividade de aldose redutase, ou ser um fragmento de SEQ ID NO: 19 com atividade de aldose redutase). Em uma outra modalidade, o polipeptídeo com atividade de aldose redutase compreende um polipeptídeo com atividade de sorbitol desidrogenase (que pode ter, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 21, ser uma variante de SEQ ID NO: 20 ou 21 tendo atividade de sorbitol desidrogenase, ou ser um fragmento de SEQ ID NO: 20 ou 21 tendo atividade de sorbitol desidrogenase). Em uma outra modalidade, o um ou mais quartos polipeptídeos compreendem um polipeptídeo com atividade de álcool desidrogenase dependente de NADP+ (que pode ter, por exemplo, a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 17 ou 18, ser uma variante de qualquer uma da SEQ ID NO: 17 ou 18 tendo atividade de álcool desidrogenase dependente de NADP+, ou ser um fragmento de qualquer uma da SEQ ID NO: 17 ou 18 tendo atividade de álcool desidrogenase dependente de NADP+). Em outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante tem ainda v) uma quinta modificação genética para expressar um quinto polipeptídeo para aumentar a atividade sacarolítica.
Em uma modalidade, o quinto polipeptídeo compreende uma enzima com atividade de alfa-amilase e/ou uma enzima com atividade de glucoamilase.
Em uma modalidade, a enzima com atividade de glucoamilase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou 40, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou 40 com atividade de glucoamilase, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou 40 com atividade de glucoamilase.
Em uma outra modalidade, o quinto polipeptídeo heterólogo compreende uma enzima com atividade de trealase.
Por exemplo, a enzima com atividade de trealase pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, pode ser uma variante ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 com atividade de trealase, ou pode ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 com atividade de trealase.
Em ainda outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante tem ainda vi) uma sexta modificação genética para expressar um sexto polipeptídeo heterólogo para reduzir a produção de glicerol ou facilitar o transporte de glicerol na célula hospedeira de levedura recombinante.
Em uma modalidade, o sexto polipeptídeo heterólogo compreende um polipeptídeo STL1 com atividade simportadora de prótons de glicerol.
Por exemplo, o polipeptídeo STL1 pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, ser uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 com atividade simportadora de prótons de glicerol, ou ser um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 com atividade simportadora de prótons de glicerol.
Em ainda outra modalidade, o sexto polipeptídeo heterólogo compreende um polipeptídeo GLT1 com atividade de glutamato sintase dependente de NAD(+) e um polipeptídeo GLN1 com atividade de glutamina sintetase.
Em uma modalidade, o polipeptídeo GLT1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 com atividade de glutamato sintase dependente de NAD(+) ou é um fragmento de SEQ ID NO: 43 com atividade de glutamato sintase dependente de NAD(+). Em ainda outra modalidade, o polipeptídeo GLN1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 com atividade de glutamina sintetase ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 com atividade de glutamina sintetase.
Em uma modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante é do gênero
Saccharomyces e, em algumas modalidades adicionais, da espécie Saccharomyces cerevisiae.
[0008] De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção fornece um processo para converter uma biomassa em um produto de fermentação, o processo compreende colocar em contato a biomassa com a célula hospedeira de levedura recombinante aqui definida para permitir a conversão de, pelo menos, uma parte da biomassa no produto de fermentação. Em uma modalidade, a biomassa compreende milho. Em outra modalidade, o milho é fornecido como uma pasta. Em ainda outra modalidade, o produto de fermentação é etanol. Em ainda uma outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante aumenta a produção de etanol em comparação com uma célula hospedeira de levedura nativa correspondente sem a primeira modificação genética e a segunda modificação genética. Em outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante diminui ainda mais a produção de glicerol em comparação com uma célula hospedeira de levedura nativa correspondente sem a primeira modificação genética e a segunda modificação genética.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0009] Tendo assim descrito genericamente a natureza da invenção, referência será feita agora aos desenhos anexos, mostrando a título de ilustração, uma modalidade preferida da mesma, e na qual:
[00010] A Figura 1 mostra uma via esquemática detalhando a regeneração de NADPH por GAPN em células de levedura nocaute zwf1 (zwf1Δ). GAPN usa o cofator NADP+ para converter gliceraldeído-3-fosfato em 3-fosfoglicerato (grande seta curva). O zwf1 nativo também usa o cofator NADP+ e permite a conversão de glicose-6-fosfato em gluconato-6-fosfato.
[00011] A Figura 2 mostra os produtos de fermentação resultantes de cepas de Saccharomyces cerevisiae de tipo selvagem e recombinante fermentadas em meio de Verduyn. Os resultados são mostrados como o título de etanol (barras, eixo direito, g/L) e a concentração de glicerol (●, eixo esquerdo em g/L) para as cepas M2390, M18646, M7153 e M18913.
[00012] A Figura 3 mostra uma via esquemática detalhando a conversão de gliceraldeído-3-fosfato em 3-fosfoglicerato por GAPN (EC1.2.1.9) e a conversão de gliceraldeído-3-fosfato em 3-fosfo-D-gliceroil-fosfato por GDP1 (EC1 .2.1.13). Na reação apresentada nesta figura, GAPN é uma gliceraldeído-
3-fosfato desidrogenase (GAPDH) não fosforilada com ΔrG'm estimado de -36,1 ± 1,1 kJ/mol e, portanto, sendo termodinamicamente muito favorável. O GDP1 é um GAPDH de fosforilação com ΔrG'm estimado em 25,9 ± 1,0 kJ/mol e, portanto, sendo termodinamicamente muito desfavorável.
[00013] A Figura 4 mostra uma comparação da termodinâmica de várias gliceraldeído-3-fosfato desidrogenases (EC 1.2.1.9, EC 1.2.1.13 e EC
1.2.1.12) e ZWF1 (EC 1.1.1.49).
[00014] As Figuras 5A e 5B mostram uma comparação de (Fig. 5A) um esquema da via de glicólise nativa que produz duas moléculas líquidas de ATP por molécula de glicose, e (Fig. 5B) esquema da via de glicólise usando GDP1 (EC 1.2.1.13) que também produz duas moléculas líquidas de ATP por molécula de glicose. Os nomes das moléculas contêm letras maiúsculas para ilustrar os componentes.
[00015] As Figuras 6A e 6B mostram uma comparação de (Fig. 6A) um esquema da via de glicólise nativa que produz duas moléculas líquidas de ATP por molécula de glicose e (Fig. 6B) esquema da via de glicólise usando GAPN (EC 1.2.1.9) que não resulta em qualquer ganho líquido de ATP por molécula de glicose. Os nomes das moléculas contêm letras maiúsculas para ilustrar os componentes.
[00016] As Figuras 7A e 7B mostram uma comparação de (Fig. 7A) de um esquema da via de glicólise nativa que produz duas moléculas líquidas de ATP por molécula de glicose e (Fig. 7B) esquema da via de produção de glicerol que consome duas moléculas de ATP por molécula de glicose. Os nomes das moléculas contêm letras maiúsculas para ilustrar os componentes.
[00017] A Fig. 8 fornece uma representação esquemática da via de pentose fosfato.
[00018] A Fig. 9 fornece os produtos de fermentação resultantes de uma fermentação de pasta de milho realizada sob condições permissivas. Os resultados são mostrados como etanol (g/L, barras, eixo esquerdo), glicose (g/L, ▲, eixo direito) e glicerol (g/L, ●, eixo direito) em função da cepa testada.
[00019] A Fig. 10 fornece os produtos de fermentação resultantes de uma fermentação de pasta de milho realizada sob condições permissivas. Os resultados são apresentados como etanol (g/L, barras, eixo esquerdo), glicose (g/L, ▲, eixo direito) e glicerol (g/L, ●, eixo direito) em função da cepa testada.
[00020] A Fig. 11 fornece os produtos de fermentação resultantes de uma fermentação de pasta de milho realizada sob condições permissivas. Os resultados são apresentados como etanol (g/L, barras, eixo esquerdo), glicose (g/L, ▲, eixo direito) e glicerol (g/L, ●, eixo direito) em função da cepa testada.
[00021] As Figuras 12A a 12C fornecem os produtos de fermentação resultantes de uma fermentação de pasta de milho realizada sob (Fig. 12A) condições permissivas, (Fig. 12B) de ácido lático ou (Fig. 12C) de alta temperatura. Os resultados são apresentados como etanol (g/L, barras, eixo esquerdo), glicose (g/L, ▲, eixo direito) e glicerol (g/L, ●, eixo direito) em função da cepa testada.
[00022] As Figuras 13A a 13C fornecem a concentração de (Fig. 13A) etanol (g/L), (Fig. 13B) glicerol (g/L) e (Fig. 13C) glicose (g/L) de uma fermentação de pasta de milho após 18 h (barras brancas), 27 h (barras diagonais), 48 h (barras cinzas) e 65 h (barras pretas).
[00023] As Figuras 14A a 14C fornecem o rendimento de fermentação resultante (Fig. 14A) (g de etanol/g de glicose), (Fig. 14B) glicerol produzido por levedura (g/L) e (Fig. 14C) peso celular seco de uma cultura de várias cepas de levedura em meio Verduyn.
[00024] As Figuras 15A a 15D fornecem o rendimento de fermentação resultante (Figuras 15A e 15C) (g de etanol/g de glicose) e (Figuras 15B e 15D) glicerol produzido por levedura (g/L) de uma cultura de várias cepas de levedura em meio Verduyn.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00025] A presente invenção fornece uma alternativa para reduzir o glicerol, desviando mais fluxo de carbono para o piruvato, introduzindo um gene de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase heterólogo na célula hospedeira de levedura recombinante. Esta enzima dependente de NADP+ resulta na redução de glicerol e o rendimento de etanol aumenta quando modificado em levedura (Zhang et al., 2013). No entanto, o potencial total desta via não é realizado se a disponibilidade de cofator NADP+ e/ou NAD+ for insuficiente. Para evitar isso, a presente invenção fornece a modificação de um genoma hospedeiro de levedura, incluindo a inativação de, pelo menos, genes que codificam para enzimas responsáveis para a produção de NADPH. Ao inativar as enzimas geradoras de NADPH e expressar gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP+ heterólogo, é possível criar um fluxo glicolítico aumentado, resultando na formação de glicerol reduzida e títulos de etanol aumentados durante a fermentação de levedura.
[00026] A presente invenção fornece, assim, uma célula hospedeira de levedura recombinante que regula negativamente uma primeira via metabólica (que, em sua forma nativa inalterada permite a conversão de NADP+ em NADPH) e regula positivamente uma segunda via metabólica que também permite a conversão de NADP+ em NADPH por expressar gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase que converte NADP+ em NADPH, de modo a aumentar o rendimento de fermentação. Em uma modalidade, quando uma biomassa (por exemplo, compreendendo milho) é fermentada pela célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção, na conclusão de uma fermentação, o meio de fermentação tem menos de 10 g/L, 9 g/L, 8 g/L, 7 g/L, 6 g/L, 5 g/L, 4 g/L, 3 g/L, 2 g/L ou 1 g/L de glicerol. Alternativamente ou em combinação, quando uma biomassa (por exemplo, compreendendo milho) é fermentada pela célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção, na conclusão de uma fermentação, o meio de fermentação tem menos de 120 g/L, 110 g/L, 100 g/L, 90 g/L, 80 g/L, 70 g/L, 60 g/L, 50 g/L, 40 g/L, 30 g/L, 20 g/L ou 10 g/L de glicose. Alternativamente ou em combinação, quando uma biomassa (por exemplo, compreendendo milho) é fermentada pela célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção, na conclusão de uma fermentação permissiva, o meio de fermentação tem pelo menos 100 g/L, 105 g/L, 110 g/L, 115 g/L, 120 g/L, 125 g/L, 130 g/L, 135 g/L ou 140 g/L de etanol. Alternativamente ou em combinação, quando uma biomassa (por exemplo, compreendendo milho) é fermentada pela célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção, na conclusão de uma fermentação de estresse, o meio de fermentação tem pelo menos 50 g/L, 55 g/L, 60 g/L, 65 g/L, 70 g/L, 75 g/L, 80 g/L, 85 g/L ou 90 g/L de etanol. Célula hospedeira de levedura recombinante
[00027] A presente invenção refere-se a células hospedeiras de levedura recombinantes obtidas pela introdução de, pelo menos, duas modificações genéticas em uma célula hospedeira de levedura nativa correspondente. As modificações genéticas na célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção compreendem uma ou mais de uma primeira modificação genética para regular negativamente uma primeira via para conversão de NADP+ em NADPH, e uma ou mais de uma segunda modificação genética para regular positivamente uma segunda via de conversão de NADP+ em NADPH que é distinta da primeira via. A segunda modificação genética permite a expressão de uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase sem atividade de fosforilação, conforme aqui descrito para a conversão de NADP+ em NADPH.
[00028] Em uma modalidade, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase não tem atividade de fosforilação e pode ser de EC 1.2.1.90 ou
1.2.1.9. As gliceraldeído-3-fosfato desidrogenases de EC 1.2.1.9 também são conhecidas como triosefosfato desidrogenases que catalisam a seguinte reação: D-gliceraldeído 3-fosfato + NADP+ + H2O <=> 3-fosfo-D-glicerato + NADPH
[00029] Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de EC 1.2.1.90 também é conhecida como gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de não fosforilação e catalisa a seguinte reação: D-gliceraldeído 3-fosfato + NAD(P)+ + H2O <=> 3-fosfo-D-glicerato + NAD(P)H
[00030] Em algumas modalidades, as modificações genéticas na célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção compreendem ou consistem essencialmente em ou consistem em uma primeira modificação genética para regular negativamente uma primeira via para a conversão de NADP+ em NADPH, e um ou mais de uma segunda modificação genética para regular positivamente uma segunda via para a conversão de NADP+ em NADPH que é distinta da primeira via. A segunda modificação genética permite a expressão de uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase sem atividade de fosforilação, conforme aqui descrito, para a conversão de NADP+ em NADPH. Em uma modalidade, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase é de EC 1.2.1.9 ou 1.2.1.90. No contexto da presente invenção, a expressão "as modificações genéticas no hospedeiro de levedura recombinante consistem essencialmente em uma primeira modificação genética para regular negativamente uma primeira via de conversão de NADP+ em NADPH, e um ou mais de uma segunda modificação genética” refere-se ao fato de que a célula hospedeira de levedura recombinante inclui apenas essas modificações genéticas para modular os níveis de NADPH, mas pode, no entanto, incluir outras modificações genéticas que não estão relacionadas com a geração de NADPH.
[00031] Em algumas modalidades, as modificações genéticas na célula hospedeira de levedura recombinante compreendem ainda uma ou mais de uma terceira modificação genética para regular positivamente uma terceira via metabólica para a conversão de NADH em NAD+. Em algumas modalidades alternativas, as modificações genéticas na célula hospedeira de levedura recombinante compreendem ou consistem essencialmente em uma primeira modificação genética, uma segunda modificação genética e uma terceira modificação genética.
[00032] Em algumas modalidades, as modificações genéticas na célula hospedeira de levedura recombinante compreendem ainda uma ou mais de uma quarta modificação genética para regular positivamente uma quarta via metabólica para a conversão de NADPH em NADP+. Em algumas modalidades alternativas, as modificações genéticas na célula hospedeira de levedura recombinante compreendem ou consistem essencialmente em uma primeira modificação genética, uma segunda modificação genética e uma quarta modificação genética (opcionalmente em combinação com uma terceira modificação genética).
[00033] Em algumas modalidades, as modificações genéticas na célula hospedeira de levedura recombinante compreendem ainda uma ou mais de uma quinta modificação genética para expressar um quinto polipeptídeo com atividade sacarolítica. Em algumas modalidades alternativas, as modificações genéticas na célula hospedeira de levedura recombinante compreendem ou consistem essencialmente em uma primeira modificação genética, uma segunda modificação genética e uma quinta modificação genética (opcionalmente em combinação com uma terceira e/ou quarta modificações genéticas).
[00034] Em algumas modalidades, as modificações genéticas na célula hospedeira de levedura recombinante compreendem ainda uma ou mais de uma sexta modificação genética para expressar um sexto polipeptídeo para facilitar o transporte de glicerol na célula hospedeira de levedura recombinante. Em algumas modalidades alternativas, as modificações genéticas na célula hospedeira de levedura recombinante compreendem ou consistem essencialmente em uma primeira modificação genética, uma segunda modificação genética e uma sexta modificação genética (opcionalmente em combinação com uma terceira, quarta e/ou quinta modificações genéticas).
[00035] Quando a modificação genética tem como objetivo reduzir ou inibir a expressão de um gene alvo específico (que é endógeno à célula hospedeira), as modificações genéticas podem ser feitas em uma, duas ou todas as cópias dos genes alvo. Quando a modificação genética tem como objetivo aumentar a expressão de um gene alvo específico, a modificação genética pode ser feita em uma ou várias localizações genéticas. No contexto da presente invenção, quando células hospedeiras de levedura recombinantes são qualificadas como sendo "geneticamente modificadas", entende-se que elas foram manipuladas para adicionar, pelo menos, um ou mais resíduos de ácido nucleico heterólogos ou exógenos e/ou remover, pelo menos, um resíduo de ácido nucleico endógeno (ou nativo). Em algumas modalidades, o um ou mais resíduos de ácido nucleico que são adicionados podem ser derivados de uma célula heteróloga ou da própria célula hospedeira de levedura recombinante. No último cenário, os resíduos de ácido nucleico são adicionados em uma localização genômica que é diferente da localização genômica nativa. As manipulações genéticas não ocorreram na natureza e são resultados de manipulações in vitro da célula hospedeira de levedura nativa.
[00036] Quando expressos em uma célula hospedeira de levedura recombinante, os polipeptídeos (incluindo as enzimas) aqui descritos são codificados em uma ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas. Em algumas modalidades, os polipeptídeos (incluindo as enzimas) aqui descritos são codificados em uma molécula de ácido nucleico heteróloga, duas moléculas de ácido nucleico heterólogas ou cópias, três moléculas de ácido nucleico heterólogas ou cópias, quatro moléculas de ácido nucleico heterólogas ou cópias, cinco moléculas de ácido nucleico heterólogas ou cópias, seis moléculas de ácido nucleico heterólogas ou cópias, sete moléculas de ácido nucleico heterólogas ou cópias, ou oito ou mais moléculas de ácido nucleico heterólogas ou cópias. O termo "heterólogo", quando usado em referência a uma molécula de ácido nucleico (tal como um promotor ou uma sequência de codificação), refere-se a uma molécula de ácido nucleico que não é encontrada nativamente na célula hospedeira recombinante. "Heterólogo" também inclui uma região de codificação nativa, ou porção da mesma, que foi removida do organismo (que pode, em algumas modalidades, ser um organismo fonte) e subsequentemente reintroduzida no organismo em uma forma que é diferente do gene nativo correspondente, por exemplo, não em sua localização natural no genoma do organismo. A molécula de ácido nucleico heteróloga é propositalmente introduzida na célula hospedeira recombinante. O termo "heterólogo", tal como aqui utilizado, também refere-se a um elemento (ácido nucleico ou polipeptídeo) que é derivado de uma fonte diferente da fonte endógena. Assim, por exemplo, um elemento heterólogo pode ser derivado de uma cepa diferente de célula hospedeira, ou de um organismo de um grupo taxonômico diferente (por exemplo, reino diferente, filo, classe, ordem, gênero familiar ou espécie, ou qualquer subgrupo dentro de uma dessas classificações). O termo "heterólogo" também é usado como sinônimo aqui com o termo "exógeno".
[00037] Quando uma molécula de ácido nucleico heteróloga está presente na célula hospedeira de levedura recombinante, ela pode ser integrada no genoma da célula hospedeira de levedura. O termo "integrado", tal como aqui utilizado, refere-se a elementos genéticos que são colocados, por meio de técnicas de biologia molecular, no genoma de uma célula hospedeira. Por exemplo, os elementos genéticos podem ser colocados nos cromossomos da célula hospedeira em oposição a um vetor, tal como um plasmídeo transportado pela célula hospedeira. Métodos para integrar elementos genéticos no genoma de uma célula hospedeira são bem conhecidos na técnica e incluem recombinação homóloga. A molécula de ácido nucleico heteróloga pode estar presente em uma ou mais cópias no genoma da célula hospedeira de levedura. Alternativamente, a molécula de ácido nucleico heteróloga pode se replicar independentemente do genoma da célula hospedeira. Em tal modalidade, a molécula de ácido nucleico pode ser estável e autorreplicante.
[00038] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico heterólogas que podem ser introduzidas nas células hospedeiras de levedura recombinantes são otimizadas por códons em relação à célula hospedeira de levedura recombinante pretendida. Conforme aqui usado, o termo "região de codificação otimizada para códons" significa uma região de codificação de ácido nucleico que foi adaptada para expressão nas células de um determinado organismo, substituindo pelo menos, um, ou mais de um, códons por um ou mais códons que são usados com mais frequência nos genes desse organismo. Em geral, genes altamente expressos em um organismo são polarizados para códons que são reconhecidos pelas espécies de tRNA mais abundantes naquele organismo. Uma medida dessa polarização é o "índice de adaptação do códon" ou "CAI", que mede até que ponto os códons usados para codificar cada aminoácido em um gene particular são aqueles que ocorrem com mais frequência em um conjunto de referência de genes altamente expressos de um organismo. O CAI da molécula de ácido nucleico heteróloga otimizada por códons aqui descrito corresponde a entre cerca de 0,8 e 1,0, entre cerca de 0,8 e 0,9, ou cerca de 1,0.
[00039] As moléculas de ácido nucleico heterólogas da presente invenção podem compreender uma região de codificação para um ou mais polipeptídeos (incluindo enzimas) a serem expressos pela célula hospedeira recombinante e/ou uma ou mais regiões regulatórias. Uma "região de codificação" de DNA ou RNA é uma molécula de DNA ou RNA que é transcrita e/ou traduzida em um polipeptídeo em uma célula in vitro ou in vivo quando colocada sob o controle de sequências regulatórias apropriadas. "Regiões regulatórias" referem-se a regiões de ácido nucleico localizadas a montante (sequências não codificantes 5'), dentro ou a jusante (sequências não codificantes 3') de uma região de codificação, e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA ou tradução da região de codificação associada. As regiões regulatórias podem incluir promotores, sequências líderes de tradução, locais de processamento de RNA, locais de ligação efetores e estruturas em grampo. Os limites da região de codificação são determinados por um códon de início no terminal 5' (amino) e um códon de parada da tradução no terminal 3' (carboxil). Uma região de codificação pode incluir, mas não está limitada a regiões procarióticas, cDNA de mRNA, moléculas de DNA genômicas, moléculas de DNA sintéticas ou moléculas de RNA. Se a região de codificação é destinada para expressão em uma célula eucariótica, um sinal de poliadenilação e a sequência de terminação da transcrição estarão geralmente localizados na região de codificação 3'. Em uma modalidade, a região de codificação pode ser referida como um quadro de leitura aberto. "Quadro de leitura aberto" é abreviado para ORF e significa um comprimento de ácido nucleico, seja DNA, cDNA ou RNA, que compreende um sinal de início de tradução ou códon de início, tal como um ATG ou AUG, e um códon de terminação e pode ser potencialmente traduzido em uma sequência polipeptídica.
[00040] As moléculas de ácido nucleico aqui descritas podem compreender uma região não codificante, por exemplo, uma região de controle da transcrição e/ou tradução. "Regiões de controle transcripcional e translacional" são regiões regulatórias de DNA, tais como promotores, intensificadores, terminadores e similares, que fornecem a expressão de uma região de codificação em uma célula hospedeira. Em células eucarióticas, os sinais de poliadenilação são regiões de controle.
[00041] A molécula de ácido nucleico heteróloga pode ser introduzida e opcionalmente mantida na célula hospedeira usando um vetor. Um "vetor", por exemplo, um "plasmídeo", "cosmídeo" ou "cromossomo artificial" (tal como, por exemplo, um cromossomo artificial de levedura) refere-se a um elemento cromossômico extra e geralmente está na forma de uma molécula de DNA de filamento duplo circular. Tais vetores podem ser sequências de replicação autônoma, sequências de integração de genoma, sequências de fago ou nucleotídeos, lineares, circulares ou superenroladas, de um DNA ou RNA de filamento único ou duplo, derivado de qualquer fonte, em que uma série de sequências de nucleotídeos foi unida ou recombinada em uma construção única que é capaz de introduzir um fragmento promotor e sequência de DNA para um produto de gene selecionado junto com a sequência 3' não traduzida apropriada em uma célula hospedeira.
[00042] Na molécula de ácido nucleico heteróloga aqui descrita, o promotor e a molécula de ácido nucleico que codificam para um ou mais polipeptídeos (incluindo enzimas) podem ser operativamente ligados um ao outro. No contexto da presente invenção, as expressões "operativamente ligado" ou "operativamente associado" referem-se ao fato de que o promotor está fisicamente associado à molécula de ácido nucleotídico que codifica para uma ou mais enzimas de uma maneira que permite, sob certas condições, para a expressão de uma ou mais enzimas da molécula de ácido nucleico. Em uma modalidade, o promotor pode estar localizado a montante (5') da sequência de ácido nucleico que codifica para uma ou mais enzimas. Em ainda outra modalidade, o promotor pode estar localizado a jusante (3') da sequência de ácido nucleico que codifica para uma ou mais enzimas. No contexto da presente invenção, um ou mais de um promotor pode ser incluído na molécula de ácido nucleico heteróloga. Quando mais de um promotor é incluído na molécula de ácido nucleico heteróloga, cada um dos promotores está operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico que codifica para uma ou mais enzimas. Os promotores podem estar localizados, em vista da molécula de ácido nucleico que codifica para um ou mais polipeptídeos, a montante, a jusante, bem como, a montante e a jusante.
[00043] A expressão "promotor" refere-se a um fragmento de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência de codificação ou RNA funcional. O termo "expressão", tal como aqui utilizado, refere-se à transcrição e acumulação estável de sentido (mRNA) da molécula de ácido nucleico heteróloga aqui descrita. A expressão também pode se referir à tradução de mRNA em um polipeptídeo. Os promotores podem ser derivados em sua totalidade de um gene nativo, ou ser compostos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreender segmentos de DNA sintéticos. É entendido por aqueles versados na técnica que diferentes promotores podem direcionar a expressão em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas. Os promotores que fazem com que um gene seja expresso na maioria das células, na maioria das vezes em um nível substancialmente similar, são comumente referidos como "promotores constitutivos". É ainda reconhecido que, uma vez que na maioria dos casos os limites exatos das sequências regulatórias não foram completamente definidos, fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem ter atividade promotora idêntica. Um promotor é geralmente limitado em seu terminal 3' pelo local de iniciação da transcrição e se estende a montante (direção 5') para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição em níveis detectáveis acima do anterior. Dentro do promotor será encontrado um local de iniciação da transcrição (convenientemente definido por exemplo, por mapeamento com nuclease S1), bem como, domínios de ligação de polipeptídeo (sequências de consenso) responsáveis pela ligação da polimerase.
[00044] O promotor pode ser heterólogo para a molécula de ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptídeos. O promotor pode ser heterólogo ou derivado de uma cepa do mesmo gênero ou espécie que a célula hospedeira de levedura recombinante. Em uma modalidade, o promotor é derivado do mesmo gênero ou espécie da célula hospedeira de levedura e o polipeptídeo heterólogo é derivado de gêneros diferentes que a célula hospedeira.
[00045] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se à expressão de um ou mais polipeptídeos (incluindo uma enzima), uma variante do mesmo ou um fragmento do mesmo em uma célula hospedeira recombinante. Uma variante compreende, pelo menos, uma diferença de aminoácidos quando comparada à sequência de aminoácidos do polipeptídeo nativo e exibe uma atividade biológica substancialmente similar ao polipeptídeo nativo. As "variantes" do polipeptídeo têm pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ao polipeptídeo aqui descrito. O termo "porcentagem de identidade", como conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências polipeptídicas ou duas ou mais sequências polinucleotídicas, conforme determinado pela comparação das sequências. O nível de identidade pode ser determinado convencionalmente usando programas de computador conhecidos. A identidade pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos, incluindo mas não limitados aos descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A.M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991). Os métodos preferidos para determinar a identidade são projetados para fornecer a melhor correspondência entre as sequências testadas. Métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Alinhamentos de sequência e cálculos de porcentagem de identidade podem ser realizados usando o programa Megalign do pacote de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wis.). Múltiplos alinhamentos das sequências aqui descritas foram realizados usando o método de alinhamento Clustal (Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5: 151-153) com os parâmetros padrão (GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PEN ALT Y = 10). Os parâmetros padrão para alinhamentos em pares usando o método Clustal foram KTUPLB 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 e DIAGONALS SAVED = 5.
[00046] O polipeptídeo variante aqui descrito pode ser (i) um, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos são substituídos por um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (de preferência, um resíduo de aminoácido conservado) e tal resíduo de aminoácido substituído pode ou não pode ser um codificado pelo código genético, ou (ii) um, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos incluem um grupo substituinte, ou (iii) um, em que o polipeptídeo maduro é fundido com outro composto, tal como um composto para aumentar a meia-vida do polipeptídeo (por exemplo, polietileno glicol), ou (iv) um, em que os aminoácidos adicionais são fundidos ao polipeptídeo maduro para purificação do polipeptídeo.
[00047] Uma "variante" do polipeptídeo pode ser uma variante conservativa ou uma variante alélica. Tal como aqui utilizado, uma variante conservativa refere-se a alterações na sequência de aminoácidos que não afetam adversamente as funções biológicas da enzima. Diz-se que uma substituição, inserção ou deleção afeta adversamente o polipeptídeo quando a sequência alterada previne ou interrompe uma função biológica associada à enzima. Por exemplo, a carga geral, estrutura ou propriedades hidrofóbicas- hidrofílicas do polipeptídeo podem ser alteradas sem afetar adversamente uma atividade biológica. Desta maneira, a sequência de aminoácidos pode ser alterada, por exemplo, para tornar o peptídeo mais hidrofóbico ou hidrofílico, sem afetar adversamente as atividades biológicas da enzima.
[00048] O polipeptídeo pode ser um fragmento de polipeptídeo ou fragmento de um polipeptídeo variante. Um fragmento de polipeptídeo compreende, pelo menos, um resíduo de aminoácido a menos quando comparado com a sequência de aminoácidos do mesmo e ainda possui uma atividade biológica substancialmente similar ao polipeptídeo de comprimento total nativo ou variante de polipeptídeo. Os "fragmentos" de polipeptídeo têm pelo menos 100, 200, 300, 400, 500 ou mais aminoácidos consecutivos do polipeptídeo ou da variante do polipeptídeo. Os "fragmentos" de polipeptídeo têm pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ao polipeptídeo aqui descrito. Em algumas modalidades, fragmentos dos polipeptídeos podem ser empregados para a produção da enzima de comprimento total correspondente por sínteses de peptídeos. Portanto, os fragmentos podem ser empregados como intermediários para a produção de polipeptídeos de comprimento total.
[00049] Em algumas modalidades adicionais, a presente invenção também fornece a expressão de um polipeptídeo codificado por um gene ortólogo de um gene conhecido por codificar o polipeptídeo. Um “gene ortólogo” é entendido como um gene em uma espécie diferente que evoluiu de um gene ancestral comum por especiação. No contexto da presente invenção, um gene ortólogo codifica o polipeptídeo que exibe uma atividade biológica substancialmente similar ao polipeptídeo nativo.
[00050] Em algumas outras modalidades, a presente invenção também fornece a expressão de um polipeptídeo codificado por um gene parálogo de um gene conhecido por codificar o polipeptídeo. Um "gene parálogo" é entendido como um gene relacionado por duplicação dentro do genoma. No contexto da presente invenção, um gene parálogo codifica um polipeptídeo que pode exibir funções biológicas adicionais quando comparado ao polipeptídeo nativo.
[00051] No contexto da presente invenção, a célula hospedeira de levedura recombinante/nativa/adicional é uma levedura. As células hospedeiras de levedura adequadas podem ser, por exemplo, do gênero Saccharomyces, Kluyveromyces, Arxula, Debaryomyces, Candida, Pichia, Phaffia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces ou Yarrowia. As espécies de levedura adequadas podem incluir, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bulderi, Saccharomyces barnetti, Saccharomyces exiguus, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces diastaticus, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus ou Kluyveromyces fragilis. Em algumas modalidades, a levedura é selecionada a partir do grupo que consiste em Saccharomyces cerevisiae, Schizzosaccharomyces pombe, Candida albicans, Pichia pastoris, Pichia stipitis, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Phaffia rhodozyma, Candida utilis, Arxula adeninivorans, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polymorphus, Schizosaccharomyces pombe e Schwanniomyces occidentalis. Em uma modalidade particular, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em algumas modalidades, a célula hospedeira pode ser uma célula de levedura oleaginosa. Por exemplo, a célula hospedeira de levedura oleaginosa pode ser do gênero Blakeslea, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidum, Rhodotorula, Trichosporon ou Yarrowia. Em algumas modalidades alternativas, a célula hospedeira pode ser uma célula hospedeira de microalgas oleaginosas (por exemplo, do gênero Thraustochytrium ou Schizochytrium). Em uma modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante é do gênero Saccharomyces e, em algumas modalidades adicionais, da espécie Saccharomyces cerevisiae.
[00052] Uma vez que a célula hospedeira de levedura recombinante pode ser usada para a fermentação de uma biomassa e a geração de produto de fermentação, é contemplado aqui que ela tem a capacidade de converter uma biomassa em um produto de fermentação sem incluir as modificações genéticas adicionais aqui descritas. Em uma modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante tem a capacidade de converter amido em etanol durante a fermentação, conforme descrito abaixo. Modificação genética para regular negativamente a produção de NADPH
[00053] A fim de criar um fluxo glicolítico aumentado, é necessário que haja cofatores e/ou reagentes suficientes necessários para a glicólise. No contexto da presente invenção, a regulação negativa de uma primeira via metabólica para a conversão de NADP+ em NADPH e a regulação positiva de uma segunda via metabólica para a conversão de NADP+ em NADPH compreende reduzir o consumo de NADP+ pela primeira via metabólica e, assim, torná-lo disponível para a segunda via metabólica. Sem desejar estar ligado à teoria, a segunda via metabólica favorece a produção de um ou mais produtos fermentados (tal como, etanol), o que resulta em menor disponibilidade de substrato para a produção de outro produto fermentado, tal como glicerol. Em algumas modalidades, a primeira via é a via da pentose fosfato, também conhecida como a via da pentose fosfato oxidativa ou o estágio oxidativo da via da pentose fosfato. Em uma modalidade, a primeira via é a via da pentose fosfato oxidativa citosólica. Em uma modalidade, a primeira via é a derivação de hexose monofosfato (ou ciclo). Em uma modalidade, a primeira via é a via do fosfogluconato.
[00054] A presente invenção fornece uma primeira modificação genética que compreende a inativação de, pelo menos, um primeiro gene nativo,
para regular negativamente da primeira via. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira de levedura recombinante é fornecida tendo fontes nativas de regeneração de NADPH reguladas negativamente em relação a esta primeira via (quando comparada a uma célula hospedeira de levedura correspondente sem a primeira modificação genética). Em algumas outras modalidades, a célula hospedeira de levedura recombinante tem, pelo menos, um gene inativado que codifica para um polipeptídeo capaz de produzir NADPH.
[00055] Existem três reações durante o estágio oxidativo da via da pentose fosfato. A primeira reação é a oxidação da glicose-6-fosfato em 6- fosfogluconato pela glicose-6-fosfato desidrogenase (ZWF1) usando NADP+ como um cofator. A segunda reação é a conversão de 6-fosfogluconolactona em 6-fosfogluconato pela gluconolactonase. A terceira reação é a oxidação do 6- fosfogluconato em ribulose-5-fosfato pela 6-fosfogluconato desidrogenase (GND1 e/ou GND2) usando NADP+ como um cofator. A maior parte do consumo de NADP+ de uma célula ou regeneração de NADPH vem dessa primeira reação por ZWF1. Como tal, em uma modalidade, a primeira modificação genética compreende a inativação do gene que codifica ZWF1.
[00056] Alternativamente ou em combinação, a primeira modificação genética pode incluir a inativação de outro gene que codifica um polipeptídeo capaz de produzir NADPH. Por exemplo, a primeira modificação genética inclui a inativação de, pelo menos, um dos seguintes genes nativos: glicose-6-fosfato desidrogenase (ZWF1), 6-fosfogluconato desidrogenase (GND1 e/ou GND2), NAD(P) aldeído desidrogenase (ALD6) e/ou isocitrato desidrogenase dependente de NADP (IDP1, IDP2 e/ou IDP3). Por exemplo, uma série de outras enzimas também consome NADP+ para regenerar NADPH e está resumida na Tabela 1. Como tal, em ainda outra modalidade, a primeira modificação genética compreende a inativação de um gene que codifica um ou mais polipeptídeos, conforme listado na Tabela 1. Tabela 1. Enzimas de modalidades que convertem NADP+ em NADPH. A sequência de aminoácidos fornecida refere-se à sequência de Saccharomyces cerevisiae Gene Enzima SEQ ID NO ZWF1 Glicose-6-fosfato desidrogenase 3 GND1 6-fosfogluconato desidrogenase 4
GND2 6-fosfogluconato desidrogenase 5 ALD6 aldeído desidrogenase NAD(P) 6 isocitrato desidrogenase dependente de IDP1 7
NADP isocitrato desidrogenase dependente de IDP2 8
NADP isocitrato desidrogenase dependente de IDP3 9
NADP
[00057] Em uma modalidade, o pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene zwf1, um ortólogo do gene zwf1 ou um parálogo do gene zwf1. O gene zwf1 codifica um polipeptídeo com atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase. Em uma modalidade, o polipeptídeo com atividade de glicose-6- fosfato desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; é uma variante da SEQ ID NO: 3, ou é um fragmento da SEQ ID NO: 3.
[00058] Em uma modalidade, o pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene gnd1, um ortólogo do gene gnd1 ou um parálogo do gene gnd1. O gene gnd1 codifica um polipeptídeo com atividade de 6-fosfogluconato desidrogenase. Em uma modalidade, o polipeptídeo com atividade de 6- fosfogluconato desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; é uma variante da SEQ ID NO: 4, ou é um fragmento da SEQ ID NO: 4.
[00059] Em uma modalidade, o pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene gnd2, um ortólogo do gene gnd2 ou um parálogo do gene gnd2. O gene gnd2 codifica um polipeptídeo com atividade de 6-fosfogluconato desidrogenase. Em uma modalidade, o polipeptídeo com atividade de 6- fosfogluconato desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; é uma variante da SEQ ID NO: 5, ou é um fragmento da SEQ ID NO: 5.
[00060] Em uma modalidade, o pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene ald6, um ortólogo do gene ald6 ou um parálogo do gene ald6. O gene ald6 codifica um polipeptídeo com atividade de aldeído desidrogenase. Em uma modalidade, o polipeptídeo com atividade de aldeído desidrogenase possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; é uma variante da SEQ ID NO: 6, ou é um fragmento da SEQ ID NO: 6.
[00061] Em uma modalidade, o pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene idp1, um ortólogo do gene idp1 ou um parálogo do gene idp1. O gene idp1 codifica um polipeptídeo com atividade de isocitrato desidrogenase. Em uma modalidade, o polipeptídeo com atividade de isocitrato desidrogenase possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; é uma variante da SEQ ID NO: 7, ou é um fragmento da SEQ ID NO: 7.
[00062] Em uma modalidade, o pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene idp2, um ortólogo do gene idp2 ou um parálogo do gene idp2. O gene idp2 codifica um polipeptídeo com atividade de isocitrato desidrogenase. Em uma modalidade, o polipeptídeo com atividade de isocitrato desidrogenase possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; é uma variante da SEQ ID NO: 8, ou é um fragmento da SEQ ID NO: 8.
[00063] Em uma modalidade, o pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene ipd3, um ortólogo do gene ipd3 ou um parálogo do gene ipd3. O gene ipd3 codifica um polipeptídeo com atividade de isocitrato desidrogenase. Em uma modalidade, o polipeptídeo com atividade de isocitrato desidrogenase possui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; é uma variante da SEQ ID NO: 9, ou é um fragmento da SEQ ID NO: 9.
[00064] Em uma modalidade, conforme descrito na Figura 1, verificou-se que combinar a expressão do gene GAPN e inativar o gene zwf1 (zwf1Δ) fornece uma maneira eficaz de aumentar o fluxo glicolítico, com GAPN atuando como um gerador NADPH substituto. Quando expresso em células zwf1Δ, GAPN é capaz de regenerar NADPH a partir de NADP+ catalisando a reação de gliceraldeído-3-fosfato em 3-fosfoglicerato, adicionando assim o fluxo glicolítico em direção ao piruvato. Esta atividade adicional em combinação com zwf1Δ mantém a integridade e funcionalidade das vias glicolíticas nativas enquanto reduz a produção de glicerol e aumenta o rendimento de etanol. Além disso, a via zwf1Δ-GAPN não resulta na produção de intermediários tóxicos, subprodutos ou produtos finais, reduzindo o risco de autotoxicidade em células modificadas. Em algumas modalidades, esta via de zwf1Δ-GAPN não requer nenhuma modificação nos genes de glicerol-3-fosfato desidrogenase (GPD) ou nos genes de glicerol-3-fosfato fosfatase (GPP). Como mostrado na Figura 2, a fermentação com células hospedeiras de levedura recombinantes com esta via zwf1Δ-GAPN exibe rendimento de etanol aumentado em comparação com a levedura de tipo selvagem. Ao mesmo tempo, esta célula hospedeira de levedura recombinante zwf1Δ-GAPN também diminuiu significativamente o GAPN introduzido por zwf1 ainda ativo (fcy1Δ-GAPN).
[00065] Em algumas modalidades, a primeira modificação genética compreendendo a inativação de um primeiro gene nativo e a segunda modificação genética são empregadas dependentes uma da outra. Por exemplo, a segunda modificação genética pode ser feita de tal forma que a molécula de ácido nucleico heteróloga compreendendo uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase seja posicionada para estar sob o controle do primeiro promotor do primeiro gene nativo. Como tal, ao introduzir a molécula de ácido nucleico heteróloga dentro do primeiro gene nativo, o primeiro gene nativo é inativado. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico heteróloga compreendendo uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase está em um quadro de leitura aberto do primeiro gene nativo.
[00066] Em uma modalidade, a primeira modificação genética compreendendo zwf1Δ e a segunda modificação genética compreendendo GAPN são empregadas dependentes uma da outra. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico heteróloga compreendendo o gene GAPN é posicionada para ser colocada sob o controle do primeiro promotor do gene zwf1 nativo. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico heteróloga que compreende o gene GAPN está em um quadro de leitura aberto do gene zwf1 nativo. Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase não fosforilante
[00067] No contexto da presente invenção, a regulação negativa de uma primeira via para conversão de NADP+ em NADPH e a regulação positiva de uma segunda via para a conversão de NADP+ em NADPH compreendem, de preferência, para fornecer NADP+ à segunda via. Em algumas modalidades, a segunda via é uma via glicolítica. Em uma modalidade, o aumento do fluxo glicolítico resulta na redução da formação de glicerol e no aumento dos títulos de etanol durante a fermentação da levedura. A presente invenção fornece uma segunda modificação genética que compreende a superexpressão de um polipeptídeo heterólogo, para regular positivamente a segunda via. Em algumas modalidades, a segunda modificação genética compreende a introdução de uma molécula de ácido nucleico heteróloga na célula hospedeira de levedura recombinante. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico heteróloga codifica uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. Conforme mostrado na Figura 1, em algumas modalidades adicionais, a gliceraldeído-3-
fosfato desidrogenase ignora as reações catalisadas por TDH1, THD2, TDH3 e PGK1 na primeira via metabólica. Em Saccharomyces cerevisiae, a enzima TDH1 pode ter o aminoácido de SEQ ID NO: 22, a enzima TDH2 pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e/ou a enzima TDH3 pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico heteróloga codifica GAPN.
[00068] A introdução e expressão de uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase heteróloga na célula hospedeira de levedura recombinante, conforme aqui descrito, permite a catálise da reação de gliceraldeído-3-fosfato a 3-fosfoglicerato em glicólise, usando NADP+ como um cofator. Em algumas modalidades, a regeneração de NADPH e/ou NADH por meio de uma via glicolítica usando gliceraldeído-3-fosfato também melhora a produção de etanol e reduz a produção de glicerol.
[00069] A presente invenção fornece uma célula hospedeira de levedura recombinante que expressa gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase heteróloga. Esta enzima catalisa a conversão de gliceraldeído-3-fosfato em 3- fosfoglicerato, usando NADP+ como um cofator. Em algumas modalidades, o gliceraldeído-3-fosfato também pode usar NAD+ como um cofator. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase é uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase não fosforilada, por exemplo, é incapaz de mediar uma reação de fosforilação. Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase é da classe 1.2.1 da comissão enzimática (EC), no entanto, ela exclui as enzimas capazes de mediar uma reação de fosforilação. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase da presente invenção exclui especificamente enzimas capazes de usar ou gerar diretamente fosfato de 3- fosfo-D-gliceroil, tais como enzimas de EC 1.2.1.13. As enzimas de EC 1.2.1.13 catalisam a seguinte reação: D-gliceraldeído 3-fosfato + fosfato + NADP+ <=> 3-fosfo-D-gliceroil fosfato +
NADPH
[00070] Em uma modalidade, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase é dependente de NADP+ (EC1.2.1.9) e permite a conversão de NADP+ em NADPH. As enzimas de EC1.2.1.9 só podem usar NADP+ como um cofator.
[00071] Em uma modalidade, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase é dependente de NADP+/NAD+ bifuncional (EC1.2.1.90) e permite a conversão de NADP+ em NADPH e/ou NAD+ em NAD+. As enzimas de EC1.2.1.90 podem usar NADP+ ou NAD+ como um cofator. Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase usa NADP+ e/ou NAD+ como um cofator. Em uma modalidade, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase é codificada por um gene GAPN. Em uma modalidade, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase é GAPN.
[00072] No contexto da presente invenção, a segunda modificação genética pode incluir a introdução de uma ou mais cópias de uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase.
[00073] Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser derivada de uma bactéria, por exemplo, do gênero Streptococcus e, em alguns casos, da espécie Strepotococcus mutans. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser codificada pelo gene GAPN de Streptococcus mutans, ou um gene ortólogo GAPN ou um gene parálogo GAPN. Em uma modalidade, o gene GAPN compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, é uma variante da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 ou é um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o GAPN tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, é uma variante do aminoácido da SEQ ID NO: 2 ou é um fragmento da SEQ ID NO: 2.
[00074] Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser derivada de uma bactéria, por exemplo, do gênero Lactobacillus e, em alguns casos, da espécie Lactobacillus delbrueckii. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser codificada pelo gene GAPN de Lactobacillus delbrueckii, ou um gene ortólogo GAPN, ou um gene parálogo GAPN. Em uma modalidade, o gene GAPN compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 46, é uma variante da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 46 ou é um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 46. Em uma modalidade, o GAPN tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, é uma variante do aminoácido da SEQ ID NO: 47 ou é um fragmento da SEQ ID NO: 47.
[00075] Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser derivada de uma bactéria, por exemplo, do gênero Streptococcus e, em alguns casos, da espécie Strepotococcus thermophilus. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser codificada pelo gene GAPN de Streptococcus thermophilus, ou um gene ortólogo GAPN ou um gene parálogo GAPN. Em uma modalidade, o gene GAPN compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 48, é uma variante da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 48 ou é um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 48. Em uma modalidade, o GAPN tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, é uma variante do aminoácido da SEQ ID NO: 49 ou é um fragmento da SEQ ID NO: 49.
[00076] Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser derivada de uma bactéria, por exemplo, do gênero Streptococcus e, em alguns casos, da espécie Strepotococcus macacae. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser codificada pelo gene GAPN de Streptococcus macacae, ou um gene ortólogo GAPN ou um gene parálogo GAPN. Em uma modalidade, o gene GAPN compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 50, é uma variante da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 50 ou é um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 50. Em uma modalidade, o GAPN tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, é uma variante do aminoácido da SEQ ID NO: 51 ou é um fragmento da SEQ ID NO: 51.
[00077] Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser derivada de uma bactéria, por exemplo, do gênero Streptococcus e, em alguns casos, da espécie Strepotococcus hyointestinalis. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser codificada pelo gene GAPN de Streptococcus hyointestinalis, ou um gene ortólogo GAPN ou um gene parálogo GAPN. Em uma modalidade, o gene GAPN compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 52, é uma variante da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 52 ou é um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 52. Em uma modalidade, o GAPN tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, é uma variante do aminoácido da SEQ ID NO: 53 ou é um fragmento da SEQ ID NO: 53.
[00078] Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser derivada de uma bactéria, por exemplo, do gênero Streptococcus e, em alguns casos, da espécie Strepotococcus urinalis. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser codificada pelo gene GAPN de Streptococcus urinalis, ou um gene ortólogo GAPN ou um gene parálogo GAPN. Em uma modalidade, o gene GAPN compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 54, é uma variante da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 54 ou é um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 54. Em uma modalidade, o GAPN tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, é uma variante do aminoácido da SEQ ID NO: 55 ou é um fragmento da SEQ ID NO: 55.
[00079] Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser derivada de uma bactéria, por exemplo, do gênero Streptococcus e, em alguns casos, da espécie Strepotococcus canis. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser codificada pelo gene GAPN de Streptococcus canis, ou um gene ortólogo GAPN ou um gene parálogo GAPN. Em uma modalidade, o gene GAPN compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 56, é uma variante da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 56 ou é um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 56. Em uma modalidade, o GAPN tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, é uma variante do aminoácido da SEQ ID NO: 57 ou é um fragmento da SEQ ID NO: 57.
[00080] Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser derivada de uma bactéria, por exemplo, do gênero Streptococcus e, em alguns casos, da espécie Strepotococcus thoraltensis. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser codificada pelo gene GAPN de Streptococcus thoraltensis, ou um gene ortólogo GAPN ou um gene parálogo GAPN. Em uma modalidade, o gene GAPN compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 58, é uma variante da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 58 ou é um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 58. Em uma modalidade, o GAPN tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, é uma variante do aminoácido da SEQ ID NO: 59 ou é um fragmento da SEQ ID NO: 59.
[00081] Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser derivada de uma bactéria, por exemplo, do gênero Streptococcus e, em alguns casos, da espécie Strepotococcus dysgalactiae. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser codificada pelo gene GAPN de Streptococcus dysgalactiae, ou um gene ortólogo GAPN ou um gene parálogo GAPN. Em uma modalidade, o gene GAPN compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 60, é uma variante da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 60 ou é um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 60. Em uma modalidade, o GAPN tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, é uma variante do aminoácido da SEQ ID NO: 61 ou é um fragmento da SEQ ID NO: 61.
[00082] Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser derivada de uma bactéria, por exemplo, do gênero Streptococcus e, em alguns casos, da espécie Strepotococcus pyogenes. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser codificada pelo gene GAPN de Streptococcus pyogenes, ou um gene ortólogo GAPN ou um gene parálogo GAPN. Em uma modalidade, o gene GAPN compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 71, é uma variante da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 71 ou é um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 71. Em uma modalidade, o GAPN tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72, é uma variante do aminoácido da SEQ ID NO: 72 ou é um fragmento da SEQ ID NO: 72.
[00083] Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser derivada de uma bactéria, por exemplo, do gênero Streptococcus e, em alguns casos, da espécie Strepotococcus ictaluri. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser codificada pelo gene GAPN de Streptococcus ictaluri, ou um gene ortólogo GAPN ou um gene parálogo GAPN. Em uma modalidade, o gene GAPN compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 73, é uma variante da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 73 ou é um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 73. Em uma modalidade, o GAPN tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74, é uma variante do aminoácido da SEQ ID NO: 74 ou é um fragmento da SEQ ID NO: 74.
[00084] Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser derivada de uma bactéria, por exemplo, do gênero Clostridium e, em alguns casos, da espécie Clostridium perfringens. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser codificada pelo gene GAPN de Clostridium perfringens, ou um gene ortólogo GAPN ou um gene parálogo GAPN. Em uma modalidade, o gene GAPN compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 75, é uma variante da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 75 ou é um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 75. Em uma modalidade, o GAPN tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76, é uma variante do aminoácido da SEQ ID NO: 76 ou é um fragmento da SEQ ID NO: 76.
[00085] Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser derivada de uma bactéria, por exemplo, do gênero Clostridium e, em alguns casos, da espécie Clostridium chromiireducens. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser codificada pelo gene GAPN de Clostridium chromiireducens, ou um gene ortólogo GAPN ou um gene parálogo GAPN. Em uma modalidade, o gene GAPN compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 77, é uma variante da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 77 ou é um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 77. Em uma modalidade, o GAPN tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78, é uma variante do aminoácido da SEQ ID NO: 78 ou é um fragmento da SEQ ID NO: 78.
[00086] Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser derivada de uma bactéria, por exemplo, do gênero Clostridium e, em alguns casos, da espécie Clostridium botulinum. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser codificada pelo gene GAPN de Clostridium botulinum, ou um gene ortólogo GAPN ou um gene parálogo GAPN. Em uma modalidade, o gene GAPN compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 79, é uma variante da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 79 ou é um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 79. Em uma modalidade, o GAPN tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80, é uma variante do aminoácido da SEQ ID NO: 80 ou é um fragmento da SEQ ID NO: 80.
[00087] Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser derivada de uma bactéria, por exemplo, do gênero Bacillus e, em alguns casos, da espécie Bacillus cereus. A gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase pode ser codificada pelo gene GAPN de Bacillus cereus, ou um gene ortólogo GAPN ou um gene parálogo GAPN. Em uma modalidade, o gene GAPN compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 81, é uma variante da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 81 ou é um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 81. Em uma modalidade, o GAPN tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82, é uma variante do aminoácido da SEQ ID NO: 82 ou é um fragmento da SEQ ID NO:
82.
[00088] Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser derivada de uma bactéria, por exemplo, do gênero Bacillus e, em alguns casos, da espécie Bacillus anthracis. A gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase pode ser codificada pelo gene GAPN de Bacillus anthracis, ou um gene ortólogo GAPN ou um gene parálogo GAPN. Em uma modalidade, o gene GAPN compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 83, é uma variante da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 83 ou é um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 83. Em uma modalidade, o GAPN tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84, é uma variante do aminoácido da SEQ ID NO: 84 ou é um fragmento da SEQ ID NO:
84.
[00089] Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser derivada de uma bactéria, por exemplo, do gênero Bacillus e, em alguns casos, da espécie Bacillus thuringiensis. A gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase pode ser codificada pelo gene GAPN de Bacillus thuringiensis, ou um gene ortólogo GAPN ou um gene parálogo GAPN. Em uma modalidade, o gene GAPN compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 85, é uma variante da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 85 ou é um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 85. Em uma modalidade, o GAPN tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86, é uma variante do aminoácido da SEQ ID NO: 86 ou é um fragmento da SEQ ID NO:
86.
[00090] Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser derivada de uma bactéria, por exemplo, do gênero Pyrococcus e, em alguns casos, da espécie Pyrococcus furiosus. A gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode ser codificada pelo gene GAPN de Pyrococcus furiosus, ou um gene ortólogo GAPN ou um gene parálogo GAPN. Em uma modalidade, o gene GAPN compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 87, é uma variante da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 87 ou é um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 87. Em uma modalidade, o GAPN tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 88, é uma variante do aminoácido da SEQ ID NO: 88 ou é um fragmento da SEQ ID NO: 88. As modalidades da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase também podem ser derivadas, sem limitação, do seguinte (o número entre colchetes corresponde ao número do Gene ID): Triticum aestivum (543435); Streptococcus mutans (1028095); Streptococcus agalactiae (1013627); Streptococcus pyogenes (901445); Clostridioides difficile (4913365); Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC str. (2744894); Streptococcus pneumoniae (933338); Streptococcus sanguinis (4807521); Acinetobacter pittii (11638070); Clostridium botulinum A str. (5185508); [Bacillus thuringiensis] serovar konkukian str. (2857794); Bacillus anthracis str. Ames (1088724); Phaeodactylum tricornutum (7199937); Emiliania huxleyi (17251102); Zea mays (542583); Helianthus annuus (110928814); Streptomyces coelicolor (1101118); Burkholderia pseudomallei (3097058, 3095849); variantes dos mesmos, bem como, fragmentos dos mesmos.
[00091] Modalidades adicionais de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase também podem ser derivadas, sem limitação, do seguinte (o número entre parênteses corresponde ao número de Acesso Pubmed): Streptococcus macacae (WP_003081126.1), Streptococcus hyointestinalis (WP_115269374.1), Streptococcus urinalis (WP_006739074.1), Streptococcus canis (WP_003044111.1), Streptococcus pluranimalium (WP_104967491.1), Streptococcus equi (WP_012678132.1), Streptococcus thoraltensis (WP_018380938.1), Streptococcus dysgalactiae (WP_138125971.1), Streptococcus halotolerans (WP_062707672.1), Streptococcus pyogenes (WP_136058687.1), Streptococcus ictaluri (WP_008090774.1), Clostridium perfringens (WP_142691612.1), Clostridium chromiireducens
(WP_079442081.1), Clostridium botulinum (WP_012422907.1), Bacillus cereus (WP_000213623.1), Bacillus anthracis (WP_098340670.1), Bacillus thuringiensis (WP_087951472.1), Pyrococcus furiosus (WP_011013013.1), bem como, variantes dos mesmos e fragmentos dos mesmos.
[00092] Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase codificada pelo gene GAPN (GAPN) compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 ou 61 é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 ou 61 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 ou 61. Em algumas modalidades, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase é expressa intracelularmente.
[00093] No contexto da presente invenção, GAPN inclui variantes da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de SEQ ID NO: 2, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 ou 61 (também aqui referidas como variantes de GAPN). Uma variante compreende, pelo menos, uma diferença de aminoácidos (substituição ou adição) quando comparada à sequência de aminoácidos da gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase de SEQ ID NO: 2, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, ou 61. As variantes de GAPN exibem atividade de GAPN. Em uma modalidade, a variante de GAPN exibe pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de SEQ ID NO: 2. As variantes de GAPN também têm pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 ou 61. O termo “porcentagem de identidade”, como conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais sequências polipeptídicas, conforme determinado pela comparação das sequências. O nível de identidade pode ser determinado convencionalmente usando programas de computador conhecidos. A identidade pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos, incluindo mas não limitados aos descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A.M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991).
Os métodos preferidos para determinar a identidade são projetados para fornecer a melhor correspondência entre as sequências testadas. Métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Alinhamentos de sequência e cálculos de porcentagem de identidade podem ser realizados usando o programa Megalign do pacote de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wis.). Múltiplos alinhamentos das sequências aqui descritas foram realizados usando o método de alinhamento Clustal (Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5: 151-153) com os parâmetros padrão (GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PEN ALT Y = 10). Os parâmetros padrão para alinhamentos em pares usando o método Clustal foram KTUPLB 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 e DIAGONALS SAVED = 5.
[00094] A variante de GAPN aqui descrita pode ser (i) uma, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos são substituídos por um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (de preferência, um resíduo de aminoácido conservado) e tal resíduo de aminoácido substituído pode ou não pode ser um codificado pelo código genético, ou (ii) uma, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos inclui um grupo substituinte, ou (iii) uma, em que o polipeptídeo maduro é fundido com outro composto, tal como um composto para aumentar a meia-vida do polipeptídeo (por exemplo, polietileno glicol), ou (iv) uma, em que os aminoácidos adicionais são fundidos ao polipeptídeo maduro para purificação do polipeptídeo. As substituições conservativas incluem tipicamente a substituição de um aminoácido por outro com características similares, por exemplo, substituições dentro dos seguintes grupos: valina, glicina; glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina. Outras substituições de aminoácidos conservativas são conhecidas na técnica e estão incluídas aqui. As substituições não conservativas, tal como a substituição de um aminoácido básico por um hidrofóbico, também são bem conhecidas na técnica.
[00095] Uma variante de GAPN também pode ser uma variante conservativa ou uma variante alélica. Tal como aqui utilizado, uma variante conservativa refere-se a alterações na sequência de aminoácidos que não afetam adversamente as funções biológicas de GAPN. Diz-se que uma substituição, inserção ou deleção afeta adversamente o polipeptídeo quando a sequência alterada previne ou interrompe uma função biológica associada a GAPN (por exemplo, glicólise). Por exemplo, a carga geral, estrutura ou propriedades hidrofóbicas-hidrofílicas do polipeptídeo podem ser alteradas sem afetar adversamente uma atividade biológica. Desta maneira, a sequência de aminoácidos pode ser alterada, por exemplo, para tornar o peptídeo mais hidrofóbico ou hidrofílico, sem afetar adversamente as atividades biológicas de GAPN.
[00096] A presente invenção também fornece fragmentos do GAPN e variantes aqui descritas. Um fragmento compreende, pelo menos, um resíduo de aminoácido a menos quando comparado com a sequência de aminoácidos do GAPN ou variante e ainda possui a atividade enzimática do GAPN de comprimento total. Em uma modalidade, o fragmento de GAPN exibe pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase de comprimento total da SEQ ID NO: 2, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 ou 61. Os fragmentos de GAPN também podem ter pelo menos 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 ou 61. O fragmento pode ser, por exemplo, um truncamento de um ou mais resíduos de aminoácidos no terminal amino, terminal carbóxi ou ambos os terminais de GAPN ou variante. Alternativamente ou em combinação, o fragmento pode ser gerado a partir da remoção de um ou mais resíduos de aminoácidos internos. Em uma modalidade, o fragmento de GAPN tem pelo menos 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou mais aminoácidos consecutivos de GAPN ou a variante.
[00097] O ácido nucleico heterólogo que codifica a gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase pode ser posicionado no quadro de leitura aberto do primeiro gene nativo e pode usar o promotor do primeiro gene nativo para conduzir sua expressão.
[00098] Alternativamente ou em combinação, a molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase pode incluir um promotor heterólogo. No contexto da presente invenção, o promotor heterólogo que controla a expressão da molécula de ácido nucleico heteróloga pode ser um promotor constitutivo (tal como, por exemplo, tef2p (por exemplo, o promotor do gene TEF2), cwp2p (por exemplo, o promotor do gene CWP2),
ssa1p (por exemplo, o promotor do gene SSA1), eno1p (por exemplo, o promotor do gene ENO1), hxk1 (por exemplo, o promotor do gene HXK1), pgi1p (por exemplo, o promotor do gene PGI1), pfk1p (por exemplo, o promotor do gene PFK1), fba1p (por exemplo, o promotor do gene FBA1), gpm1p (por exemplo, o promotor do gene GPM1) e/ou pgk1p (por exemplo, o promotor do gene PGK1). No entanto, em algumas modalidades, é preferível limitar a expressão do polipeptídeo heterólogo. Como tal, o promotor que controla a expressão da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase heteróloga pode ser um promotor indutível ou modulado, tais como, por exemplo, um promotor regulado por glicose (por exemplo, o promotor do gene HXT7 (referido como hxt7p)), um promotor da via da pentose fosfato (por exemplo, o promotor do gene ZWF1 (zwf1p)) ou um promotor regulado por sulfito (por exemplo, o promotor do gene GPD2 (referido como gpd2p) ou o promotor do gene FZF1 (referido como fzf1p)), o promotor do gene SSU1 (referido como ssu1p), o promotor do gene SSU1-r (referido como ssur1-rp). Em uma modalidade, o promotor é um promotor regulado de forma anaeróbia, tal como, por exemplo, tdh1p (por exemplo, o promotor do gene TDH1), pau5p (por exemplo, o promotor do gene PAU5), hor7p (por exemplo, o promotor do gene HOR7), adh1p (por exemplo, o promotor do gene ADH1), tdh2p (por exemplo, o promotor do gene TDH2), tdh3p (por exemplo, o promotor do gene tdh3), gpd1p (por exemplo, o promotor do gene GPD1), cdc19p (por exemplo, o promotor do gene CDC19), eno2p (por exemplo, o promotor do gene ENO2), pdc1p (por exemplo, o promotor do gene PDC1), hxt3p (por exemplo, o promotor do gene HXT3), dan1 (por exemplo, o promotor do gene DAN1) e tpi1p (por exemplo, o promotor do gene TPI1). Em ainda outra modalidade, o promotor é um citocromo de promotor da cadeia de transporte de elétron mitocondrial, tais como, por exemplo, o cyc1p (por exemplo, o promotor do gene CYC1) e/ou o qcr8p (por exemplo, o promotor do gene QCR8). Em uma modalidade, o promotor heterólogo é gpd1p, por exemplo, o promotor do gene GPD1. Em outra modalidade, o promotor heterólogo é zwf1, por exemplo, o promotor do gene ZWF1. Um ou mais promotores podem ser usados para permitir a expressão de cada polipeptídeo heterólogo na célula hospedeira de levedura recombinante.
[00099] Em uma modalidade, o segundo polipeptídeo é expresso intracelularmente e, se necessário, a sequência de sinal é removida da sequência nativa.
Caracterização e comparação de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenases
[000100] Como é conhecido na técnica, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenases (GAPDH) podem ter atividade de fosforilação ou falta de atividade de fosforilação (por exemplo, não fosforilação), e também podem ser dependente de NAD+ e/ou NADP+ (ver, por exemplo, EC1.2.1.9, EC1.2.1.12, EC1.2.1.13, EC1.2.1.59, EC1.2.1.9). Como mostrado na Figura 3, GAPN é um dependente de NAPDH que não possui atividade de fosforilação (por exemplo, não fosforilação) e catalisa a reação de gliceraldeído-3-fosfato em 3- fosfoglicerato sem gerar qualquer ATP (ver Figura 6). Uma vez que nenhum ATP é gerado, a reação catalisada por GAPN é termodinamicamente muito favorável. Por outro lado, GDP1 é um GAPDH de fosforilação dependente de NADP+, e a reação de glicólise gera duas moléculas de ATP ao converter gliceraldeído-3- fosfato em 3-fosfoglicerato (ver Figura 5). Como o ATP será gerado, a reação catalisada por GDP1 não é termodinamicamente favorável. Da mesma forma, GAPDH de fosforilação dependente de NAD+ (EC 1.2.1.12) também gera ATP e também é termodinamicamente desfavorável.
[000101] A termodinâmica de GAPN (EC1.2.1.9), GDP1 (EC1.2.1.13) e GAPDH de fosforilação dependente de NAD+ (EC 1.2.1.12) estão resumidos na Figura 4 e na Tabela 2. Conforme mostrado na Tabela 2, a inativação de zwf1 também tem um valor negativo de Gibbs Energy. Em uma cepa de nocaute de zwf1, a perda de regeneração de NADPH por zwf1 deve ser compensada por outras enzimas. Além disso, para a fermentação ideal por um nocaute de zwf1, cepa que expressa GAPN, a taxa de regeneração de NADPH por GAPN devem complementar a taxa de regeneração de NADPH por zwf1. Tabela 2. Valor estimado de Gibbs Energy das reações catalisadas por GAPN e Δzwf1 Enzima ΔrG'm estimado GAPN (EC1.2.1.9) -36,1 ± 1,1 kJ/mol GDP1 (EC1.2.1.13) 25,9 ± 1,0 kJ/mol GAPDH de fosforilação dependente de NAD+ 24,9 ± 0,8 kJ/mol (EC1.2.1.12) Δzwf1 -2,3 ± 2,6 kJ/mol
[000102] Além disso, a produção de glicerol também consome duas moléculas de ATP (ver Figura 7). A produção ou consumo líquido de ATP durante a glicólise e a produção de glicerol estão resumidos na Tabela 3. Uma vez que a glicólise por GDP1 ou por GAPDH de fosforilação dependente de NAD+ é termodinamicamente desfavorável, a via de produção de glicerol pode ser favorecida em relação à glicólise. Usar o GAPDH não fosforilado (GAPN) resulta em consumo líquido de ATP zero e, como tal, é termodinamicamente favorável. Portanto, a superexpressão de GAPN pode favorecer a via da glicólise em relação à via de produção de glicerol, reduzindo assim a produção de glicerol. Tabela 3. Valor estimado de Gibbs Energy das reações catalisadas por GAPN e Δzwf1 Produção ou Via de reação consumo líquido de ATP Glicólise usando GAPN 0 ATP (EC1.2.1.9) Glicólise usando GDP1 +2ATP (EC1.2.1.13) Glicólise usando GAPDH de fosforilação +2ATP dependente de NAD+ (EC1.2.1.12) Produção de glicerol -2ATP
[000103] A fermentação do milho para a produção de etanol é um processo metabolicamente estressante para Saccharomyces cerevisiae, onde a cinética de fermentação rápida e a tolerância a interrupções no processo são importantes. Blomberg (2000) sugeriu que um ciclo fútil de ATP pode ser uma parte importante da via de resposta ao estresse de Saccharomyces cerevisiae. Um ciclo fútil ocorre quando duas vias metabólicas funcionam simultaneamente em direções opostas; por exemplo, glicólise (isto é, conversão de glicose em piruvato) e gliconeogênese (isto é, conversão de piruvato de volta em glicose) sendo ativas ao mesmo tempo. O efeito geral é o consumo de ATP. Portanto, durante condições de estresse (ou seja, fermentação), pode ser preferível evitar níveis mais elevados de formação de ATP. Modificação genética para a conversão de regulação positiva de NADH em NAD+
[000104] Além das duas modificações genéticas apresentadas acima, pode ser útil regular positivamente uma atividade adicional a jusante do piruvato para evitar a perda de carbono para subprodutos indesejáveis (isto é, butanodiol). No contexto da presente invenção, uma célula hospedeira de levedura recombinante pode ainda ter uma ou mais de uma terceira modificação genética para regular positivamente uma terceira via metabólica para a conversão de NADH em NAD+. Em uma modalidade, a terceira via metabólica permite ou está envolvida na produção de etanol.
[000105] Em algumas modalidades, a terceira modificação genética compreende a introdução de uma ou mais terceiras moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam um ou mais de um terceiro polipeptídeo. O terceiro polipeptídeo pode ser um polipeptídeo heterólogo ou um polipeptídeo nativo da célula hospedeira de levedura. Em outras modalidades, a terceira modificação genética compreende a regulação positiva da terceira via metabólica, aumentando a expressão nativa de um terceiro polipeptídeo. Em uma modalidade, a terceira modificação genética compreende a introdução e expressão de, pelo menos, uma de uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica, pelo menos, um do seguinte terceiro polipeptídeo: um álcool/aldeído desidrogenase (ADHE), uma glutamato desidrogenase ligada a NAD (GDH2) e/ou uma álcool desidrogenase (ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6 e/ou ADH7). Exemplos do terceiro polipeptídeo estão listados na Tabela 4. Algumas dessas enzimas estão envolvidas em vias que permitem a produção de etanol. Por exemplo, álcool/aldeído desidrogenase bifuncional produzem etanol diretamente do piruvato. Tabela 4. Exemplo de sequências de enzimas que convertem NADH em NAD+. Para SEQ ID NO: 10 a 18, a sequência de aminoácidos fornecida refere-se à sequência de Saccharomyces cerevisiae. A sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 é de Entamoeba histolytica, de SEQ ID NO: 68 é de Entamoeba nuttalli e/ou SEQ ID NO: 70 é de Entamoeba dispar Gene Enzima SEQ ID NO ADHE álcool/aldeído desidrogenase 10 glutamate desidrogenase ligada a GDH2 11
NAD ADH1 álcool desidrogenase 12 ADH2 álcool desidrogenase 13 ADH3 álcool desidrogenase 14 ADH4 álcool desidrogenase 15 ADH5 álcool desidrogenase 16 ADH6 álcool desidrogenase 17 ADH7 álcool desidrogenase 18
ADH álcool desidrogenase 66 ADH álcool desidrogenase 68 ADH álcool desidrogenase 70
[000106] Em uma modalidade, o terceiro polipeptídeo compreende um polipeptídeo com atividade de álcool/aldeído desidrogenase bifuncional e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; é uma variante da SEQ ID NO: 10, ou é um fragmento da SEQ ID NO: 10.
[000107] Em uma modalidade, o terceiro polipeptídeo compreende um polipeptídeo com atividade de glutamato desidrogenase ligada a NAD e possui, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; é uma variante da SEQ ID NO: 11, ou é um fragmento da SEQ ID NO: 11.
[000108] Em uma modalidade, o terceiro polipeptídeo compreende um polipeptídeo com atividade de álcool desidrogenase que usa NADH como um cofator. A atividade da álcool desidrogenase dependente de NADH pode ter, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 a 18, 66, 68 ou 70; é uma variante da SEQ ID NO: 12 a 18, 66, 68 ou 70, ou é um fragmento da SEQ ID NO: 12 a 18, 66, 68 ou 70.
[000109] Em outra modalidade, a terceira via metabólica permite a produção de 1,3-propanodiol a partir da fermentação de glicerol. Isso pode ser alcançado expressando uma via de fermentação de glicerol. Em Clostridium butyricum, a via de fermentação de glicerol também é referida como a via da reuterina. Essa via consiste em três genes que codificam as seguintes enzimas: uma glicerol desidratase (EC 4.2.1.30), uma proteína ativadora da glicerol desidratase e uma 1,3-propanodiol desidrogenase (1.1.1.202). Essa via converte o glicerol em 1,3-propanodiol, produzindo uma água e um NAD+. Quando acoplado com a via de produção de glicerol de levedura nativa, 2 NADH são oxidados a 2 NAD+, dobrando efetivamente o poder da célula de reoxidar o NADH citosólico em excesso resultante da produção de biomassa durante o crescimento anaeróbico. Em última análise, a produção de glicerol ligada à biomassa é reduzida por meio do aumento da oxidação de NADH através da fermentação de glicerol em 1,3-propanodiol. Um benefício adicional desta terceira via metabólica é a capacidade de desintoxicar a reuterina produzida por bactérias contaminantes em uma fermentação de etanol de milho. Em solução aquosa, 3-hidroxipropionaldeído (3-HPA) existe em equilíbrio dinâmico com hidrato de 3-HPA, dímero de 3-HPA e acroleína. Esse sistema é conhecido como reuterina e demonstrou ser tóxico para muitos micróbios, incluindo leveduras. A engenharia de uma célula hospedeira de levedura para reduzir 3-HPA a 1,3-PDO por meio da atividade de 1,3-propanodiol desidrogenase evitaria o acúmulo de 3-HPA e, portanto, de reuterina, minimizando a ameaça de interrupção do processo por contaminação por bactérias produtoras de reuterina.
[000110] Como tal, o um ou mais terceiros polipeptídeos heterólogos podem incluir um polipeptídeo com atividade de glicerol desidratase ativase. O polipeptídeo com atividade de glicerol desidratase ativase pode ser de Clostridium sp., por exemplo, de Clostridium butyricum. Em uma modalidade, o polipeptídeo com atividade de glicerol desidratase ativase pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, ser uma variante da mesma ou ser um fragmento da mesma.
[000111] O um ou mais terceiros polipeptídeos heterólogos também podem incluir um polipeptídeo com atividade de glicerol desidratase. O polipeptídeo com atividade de glicerol desidratase pode ser de Clostridium sp., por exemplo, de Clostridium butyricum. Em uma modalidade, o polipeptídeo com atividade de glicerol desidratase pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, ser uma variante da mesma ou ser um fragmento da mesma.
[000112] O um ou mais terceiros polipeptídeos heterólogos também podem incluir um polipeptídeo com atividade de 1,3-propanodiol desidrogenase. O polipeptídeo com atividade de 1,3-propanodiol desidrogenase pode ser de Clostridium sp., por exemplo, de Clostridium butyricum. Em uma modalidade, o polipeptídeo com atividade de 1,3-propanodiol desidrogenase pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, ser uma variante da mesma ou ser um fragmento da mesma.
[000113] Em algumas modalidades, o terceiro polipeptídeo é expresso intracelularmente e, se necessário, é modificado para remover sua sequência de sinal nativa. Modificação genética para a conversão de regulação positiva de NADPH em NADP+
[000114] A presente invenção também fornece células hospedeiras de levedura recombinantes ainda complementadas com a regulação positiva de enzimas que convertem NADPH em NADP+, permitindo maior regeneração de
NADP+ para uso como cofator para a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. No contexto da presente invenção, uma célula hospedeira de levedura recombinante pode ainda ter uma ou mais de uma quarta modificação genética para regular positivamente uma quarta via metabólica para a conversão de NADPH em NADP+.
[000115] Em algumas modalidades, a quarta modificação genética compreende a introdução de uma ou mais quartas moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam um ou mais de um quarto polipeptídeo. O quarto polipeptídeo pode ser um polipeptídeo heterólogo ou um polipeptídeo nativo da célula hospedeira de levedura. Em outras modalidades, a quarta modificação genética compreende a regulação positiva da quarta via metabólica, aumentando a expressão nativa de um quarto polipeptídeo. Em uma modalidade, a quarta modificação genética compreende a introdução e expressão de um gene que codifica, pelo menos, um do seguinte quarto polipeptídeo: manitol desidrogenase (DSF1), sorbitol desidrogenase (SOR1 e/ou SOR2) e/ou álcool desidrogenase dependente de NADPH (ADH6 e/ou ADH7). Exemplos do quarto polipeptídeo estão listados na Tabela 5A. Tabela 5. Exemplo de enzimas que convertem NADPH em NADP+. A sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, 20, 21, 17 e 18 refere-se à sequência de Saccharomyces cerevisiae. A sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 é de Entamoeba histolytica, de SEQ ID NO: 68 é de Entamoeba nuttalli e/ou SEQ ID NO: 70 é de Entamoeba dispar Gene Enzima SEQ ID NO DSF1 Manitol desidrogenase 19 SOR1 Sorbitol dehydrogenase 20 SOR2 Sorbitol desidrogenase 21 ADH6 Álcool desidrogenase 17 ADH7 Álcool desidrogenase 18 ADH Álcool desidrogenase 66 ADH Álcool desidrogenase 68 ADH Álcool desidrogenase 70
[000116] Em algumas modalidades, o quarto polipeptídeo compreende um polipeptídeo com atividade de aldose redutase. Em uma modalidade, o polipeptídeo com atividade de aldose redutase é um polipeptídeo com atividade de manitol desidrogenase e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; é uma variante da SEQ ID NO: 19, ou é um fragmento da SEQ ID NO: 19. Em outra modalidade, o polipeptídeo com atividade de aldose redutase é um polipeptídeo com atividade de sorbitol desidrogenase e tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 21, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 21 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 21.
[000117] Em uma modalidade, o quarto polipeptídeo é um polipeptídeo com atividade de álcool desidrogenase que usa NADPH como um cofator. A atividade da álcool desidrogenase dependente de NADPH tem, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou 18; é uma variante da SEQ ID NO: 17, 18, 66, 68 ou 70, ou é um fragmento da SEQ ID NO: 17, 18, 66, 68 ou 70.
[000118] Em algumas modalidades, o quarto polipeptídeo é expresso intracelularmente e, se necessário, é modificado para remover sua sequência de sinal nativa. Modificação genética para regular positivamente a atividade sacarolítica
[000119] Em algumas modalidades, a célula hospedeira de levedura recombinante pode incluir uma quinta modificação genética permitindo a expressão de uma enzima sacarolítica heteróloga. Conforme usado no contexto da presente invenção, uma "enzima sacarolítica" pode ser qualquer enzima envolvida na digestão, metabolismo e/ou hidrólise de carboidratos, incluindo amilases, celulases, hemicelulases, enzimas acessórias celulolíticas e amilolíticas, inulinases, levanases e açúcar pentose utilizando enzimas, enzima amilolítica. Em uma modalidade, a enzima sacarolítica é uma enzima amilolítica. Tal como aqui utilizado, a expressão "enzima amilolítica" refere-se a uma classe de enzimas capaz de hidrolisar amido ou amido hidrolisado. As enzimas amilolíticas incluem, mas não são limitadas a alfa-amilases (EC 3.2.1.1, às vezes referida como alfa-amilase fúngica, ver abaixo), amilase maltogênica (EC
3.2.1.133), glucoamilase (EC 3.2.1.3), glucano 1, 4-alfa-maltotetraohidrolase (EC
3.2.1.60), pululanase (EC 3.2.1.41), isoamilase (EC 3.2.1.68) e amilomaltase (EC 2.4.1.25). Em uma modalidade, a uma ou mais enzimas amilolíticas podem ser uma alfa-amilase de Aspergillus oryzae, uma alfa-amilase maltogênica de Geobacillus stearothermophilus, uma glucoamilase de Saccharomycopsis fibuligera, uma glucano 1,4-alfa-maltotetraohidrolase de Pseudomonas saccharophila, uma pululanase de Bacillus naganoensis, uma pululanase de Bacillus acidopullulyticus, uma isoamilase de Pseudomonas amyloderamosa, e/ou amilomaltase de Thermus thermophilus. Algumas enzimas amilolíticas foram descritas no documento WO2018/167670 e são aqui incorporadas por referência.
[000120] Em modalidades específicas, a célula hospedeira de levedura recombinante pode carregar uma ou mais modificações genéticas que permitem a produção de uma glucoamilase heteróloga como a enzima sacarolítica/amilolítica heteróloga. Muitos micróbios produzem uma amilase para degradar os amidos extracelulares. Além de clivar as últimas ligações α(1-4) glicosídicas na extremidade não redutora da amilose e amilopectina, produzindo glicose, a γ-amilase irá clivar as ligações α(1-6) glicosídicas. A glucoamilase heteróloga pode ser derivada de qualquer organismo. Em uma modalidade, o polipeptídeo heterólogo é derivado de uma γ-amilase, tal como, por exemplo, a glucoamilase de Saccharomycoces filbuligera (por exemplo, codificado pelo gene glu 0111). O polipeptídeo com atividade de glucoamilase pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, ser uma variante da mesma ou ser um fragmento da mesma. O polipeptídeo com atividade de glucoamilase pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, ser uma variante da mesma ou um fragmento da mesma. Exemplos adicionais de células hospedeiras de levedura recombinantes portadoras dessas quintas modificações genéticas são descritos no documento WO 2011/153516, bem como, no documento WO 2017/037614 e aqui incorporados em sua totalidade.
[000121] Em modalidades específicas, a célula hospedeira de levedura recombinante pode carregar uma ou mais modificações genéticas que permitem a produção de uma trealase heteróloga como a enzima sacarolítica heteróloga. Como é conhecido na técnica, trealases são glicosídeos hidrolases capazes de converter trealose em glicose (E.C. 3.2.1.28). A trealase heteróloga pode ser derivada de qualquer organismo. Em uma modalidade, a trealase heteróloga é de Achlya sp., por exemplo, Achlya hypogyna, Ashbya sp., por exemplo, Ashbya gossypii, Aspergillus sp., por exemplo, de Aspergillus clavatus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus lentulus, Aspergillus ochraceoroseus, de Escovopsis sp., por exemplo, de Escovopsis weberi, Fusarium sp., por exemplo, de Fusarium oxysporum, Kluyveromyces sp., por exemplo, de Kluyveromyces marxianus, Komagataella sp., por exemplo, de Komagataella phaffii, Metarhizium sp., por exemplo, de Metarhizium anisopliae, de Microsporum sp., por exemplo, de Microsporum gypseum, Neosartorya sp., por exemplo, de Neosartorya udagawae, Neurospora sp., por exemplo, de Neurospora crassa, Ogataea sp., por exemplo, de Ogataea parapolymorpha, Rhizoctonia sp., por exemplo, de Rhizoctonia solani, Schizopora sp., por exemplo, de Schizopora paradoxa, ou Thielavia sp., por exemplo, de Thielavia terrestris. Em algumas modalidades específicas, a trealase heteróloga tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, é uma variante da mesma ou um fragmento da mesma. Produção e transporte de glicerol
[000122] A célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção pode incluir uma sexta modificação genética opcional para limitar a produção de glicerol e/ou facilitar o transporte (e em uma modalidade, a exportação) de glicerol.
[000123] As enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol incluem, mas não são limitadas a GPD1 e o polipeptídeo GPD2 (também referido como GPD1 e GPD2, respectivamente), bem como, os polipeptídeos GPP1 e GPP2 (também referidos como GPP1 e GPP2, respectivamente). Em uma modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante carrega uma modificação genética em, pelo menos, um do gene gpd1 (que codifica o polipeptídeo GPD1), o gene gpd2 (que codifica o polipeptídeo GPD2), o gene gpp1 (que codifica o polipeptídeo GPP1) ou o gene gpp2 (que codifica o polipeptídeo GPP2). Em outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante carrega uma modificação genética em, pelo menos, dois do gene gpd1 (que codifica o polipeptídeo GPD1), o gene gpd2 (que codifica o polipeptídeo GPD2), o gene gpp1 (que codifica o polipeptídeo GPP1) ou o gene gpp2 (que codifica o polipeptídeo GPP2). Exemplos de células hospedeiras de levedura recombinantes portadoras de tais modificações genéticas que levam à redução na produção de uma ou mais enzimas nativas que funcionam para produzir glicerol são descritos no documento WO 2012/138942. Em algumas modalidades, a célula hospedeira de levedura recombinante tem uma modificação genética (tal como uma exclusão ou inserção genética) apenas em uma enzima que funciona para produzir glicerol, no gene gpd2, o que faria com que a célula hospedeira tivesse um gene nocauteado gpd2. Em algumas modalidades, a célula hospedeira de levedura recombinante pode ter uma modificação genética no gene gpd1 e o gene gpd2 resultante é uma célula hospedeira de levedura recombinante sendo nocauteada para o gene gpd1 e o gene gpd2. Em algumas modalidades específicas, a célula hospedeira de levedura recombinante pode ser um nocaute para o gene gpd1 e ter cópias duplicadas do gene gpd2 (em algumas modalidades, sob o controle do promotor gpd1). Em ainda outra modalidade (em combinação ou alternativa à modificação genética descrita acima). Em ainda outra modalidade, a célula hospedeira de levedura recombinante carrega uma modificação genética nos genes GPP/GDP e inclui seus genes nativos que codificam para os polipeptídeos GPP/GDP.
[000124] Enzimas adicionais capazes de limitar a produção de glicerol incluem, mas não são limitadas a polipeptídeo GLT1 (tendo atividade de glutamato sintase dependente de NAD(+)) e o polipeptídeo GLN1 (tendo atividade de glutamina sintetase). Os genes GLT1 e GLN1 fazem parte da via de assimilação do amônio. A expressão dos genes GLT1 e GLN1 heterólogos utiliza o NADH, que pode resultar na limitação da produção de glicerol. Na modalidade em que a célula hospedeira de levedura recombinante expressa um polipeptídeo GLT1 heterólogo e polipeptídeo GLN1, a célula hospedeira de levedura recombinante também pode incluir uma inativação (por exemplo, deleção) no gene GDH1 nativo. Em um exemplo, o polipeptídeo GLT1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 com atividade de glutamato sintase dependente de NAD(+) ou é um fragmento de SEQ ID NO: 43 com atividade de glutamato sintase dependente de NAD(+). Em outro exemplo, o polipeptídeo GLN1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 com atividade de glutamina sintetase ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 com atividade de glutamina sintetase.
[000125] As enzimas nativas que funcionam para transportar as sínteses de glicerol incluem, mas não são limitadas a polipeptídeo FPS1, bem como, o polipeptídeo STL1. O polipeptídeo FPS1 é um exportador de glicerol e as funções do polipeptídeo STL1 para importar glicerol na célula hospedeira de levedura recombinante. Ao reduzir ou inibir a expressão do polipeptídeo FPS1 e/ou aumentar a expressão do polipeptídeo STL1, é possível controlar, até certo ponto, o transporte de glicerol.
[000126] O polipeptídeo STL1 é expresso nativamente em leveduras e fungos, portanto, o polipeptídeo heterólogo funcionando para importar glicerol pode ser derivado de leveduras e fungos. Os genes STL1 que codificam o polipeptídeo STL1 incluem, mas não são limitados a, Saccharomyces cerevisiae Gene ID: 852149, Candida albicans, Kluyveromyces lactis Gene ID: 2896463, Ashbya gossypii Gene ID: 4620396, Eremothecium sinecaudum Gene ID: 28724161, Torulaspora delbrueckii Gene ID: 11505245, Lachancea thermotolerans Gene ID: 8290820, Phialophora attae Gene ID: 28742143, Penicillium digitatum Gene ID: 26229435, Aspergillus oryzae Gene ID: 5997623, Aspergillus fumigatus Gene ID: 3504696, Talaromyces atroroseus Gene ID: 31007540, Rasamsonia emersonii Gene ID: 25315795, Aspergillus flavus Gene ID: 7910112, Aspergillus terreus Gene ID: 4322759, Penicillium chrysogenum Gene ID: 8310605, Alternaria alternata Gene ID: 29120952, Paraphaeosphaeria sporulosa Gene ID: 28767590, Pyrenophora tritici-repentis Gene ID: 6350281, Metarhizium robertsii Gene ID: 19259252, Isaria fumosorosea Gene ID: 30023973, Cordyceps militaris Gene ID: 18171218, Pochonia chlamydosporia Gene ID: 28856912, Metarhizium majus Gene ID: 26274087, Neofusicoccum parvum Gene ID:19029314, Diplodia corticola Gene ID: 31017281, Verticillium dahliae Gene ID: 20711921, Colletotrichum gloeosporioides Gene ID: 18740172, Verticillium albo-atrum Gene ID: 9537052, Paracoccidioides lutzii Gene ID: 9094964, Trichophyton rubrum Gene ID: 10373998, Nannizzia gypsea Gene ID: 10032882, Trichophyton verrucosum Gene ID: 9577427, Arthroderma benhamiae Gene ID: 9523991, Magnaporthe oryzae Gene ID: 2678012, Gaeumannomyces graminis var. tritici Gene ID: 20349750, Togninia minima Gene ID: 19329524, Eutypa lata Gene ID: 19232829, Scedosporium apiospermum Gene ID: 27721841, Aureobasidium namibiae Gene ID: 25414329, Sphaerulina musiva Gene ID: 27905328, bem como, Pachysolen tannophilus Números de Acesso GenBank JQ481633 e JQ481634, Saccharomyces paradoxus STL1 e Pichia sorbitophilia. Em uma modalidade, o polipeptídeo STL1 é codificado por Saccharomyces cerevisiae Gene ID: 852149. Em uma modalidade, o polipeptídeo STL1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 26, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. Processo para conversão de biomassa
[000127] As células hospedeiras de levedura recombinantes aqui descritas podem ser usadas para melhorar o rendimento de fermentação durante a fermentação. Em algumas modalidades, a célula hospedeira de levedura recombinante da presente invenção mantém sua robustez durante a fermentação na presença de um estressor, tais como, por exemplo, ácido lático, ácido fórmico e/ou contaminação bacteriana (que pode estar associada, em algumas modalidades, a um aumento no ácido láctico durante a fermentação), um aumento no pH, uma redução na aeração, temperaturas elevadas ou combinações. O produto fermentado pode ser um álcool, tais como, por exemplo, etanol, isopropanol, n-propanol, 1-butanol, metanol, acetona e/ou 1,2 propanodiol. Em uma modalidade, o produto fermentado é etanol. Como mostrado nos exemplos, a regulação negativa de uma primeira via envolvida no consumo de NAPD+ e a regulação positiva de uma segunda via também envolvida no consumo de NADP+, resultaram no aumento do rendimento de etanol sem aumentar o rendimento de glicerol em comparação com a fermentação usando células hospedeiras de levedura nativas sem as primeira e segunda modificações genéticas.
[0001] A biomassa que pode ser fermentada com as células hospedeiras de levedura recombinantes ou coculturas, conforme aqui descrita, inclui qualquer tipo de biomassa conhecido na técnica e aqui descrito. Por exemplo, a biomassa pode incluir, mas não está limitada a amido, açúcar e materiais lignocelulósicos. Os materiais de amido podem incluir, mas não são limitados a pastas, tal como milho, trigo, centeio, cevada, arroz ou milo. Os materiais de açúcar podem incluir, mas não são limitados à beterraba sacarina, tubérculos de alcachofra, sorgo doce, melaço ou cana-de-açúcar. Os termos "material lignocelulósico", "substrato lignocelulósico" e "biomassa celulósica" significam qualquer tipo de biomassa compreendendo celulose, hemicelulose, lignina ou combinações dos mesmos, tais como, mas não limitados à biomassa lenhosa, gramíneas forrageiras, culturas energéticas herbáceas, biomassa não lenhosa de planta, perdas agrícolas e/ou resíduos agrícolas, resíduos florestais e/ou perdas florestais, lama de produção de papel e/ou lama de papel residual,
lama de tratamento de águas residuais, resíduos sólidos municipais, fibra de milho de plantas de etanol de milho moído seco e úmido e resíduos do processamento de açúcar. Os termos "hemicelulósicos", "porções hemicelulósicas" e "frações hemicelulósicas" significam a não lignina, elementos não celulósicos de material lignocelulósico, tais como, mas não limitados à hemicelulose (isto é, compreendendo xiloglucano, xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, manano, glucomanano e galactoglucomanano), pectinas (por exemplo, homogalacturonanos, ramnogalacturonanos I e II, e xilogalacturonano) e proteoglicanos (por exemplo, polipeptídeo arabinogalactano, extensina e polipeptídeos ricos em pró-linhagem).
[000128] Em um exemplo não limitativo, o material lignocelulósico pode incluir, mas não está limitado à biomassa lenhosa, tais como fibra de polpa de madeira reciclada, serragem, madeira dura, madeira macia e combinações das mesmas; gramíneas, tais como grama, grama de cordão, grama de centeio, caniço-malhado, miscanto, ou uma combinação dos mesmos; resíduos do processamento de açúcar, tais como, mas não limitados ao bagaço da cana-de- açúcar; resíduos agrícolas, tais como, mas não limitados à palha de arroz, casca de arroz, palha de cevada, espigas de milho, palha de cereal, palha de trigo, palha de canola, palha de aveia, casca de aveia e fibra de milho; caules e folhas, tais como, mas não limitados a caules e folhas de soja, caules e folhas de milho; suculentas, tais como, mas não limitados a agave; e resíduos florestais, tais como, mas não limitados à fibra de polpa de madeira reciclada, serragem, madeira dura (por exemplo, choupo, carvalho, bordo, bétula, salgueiro), madeira macia ou qualquer combinação dos mesmos. O material lignocelulósico pode compreender uma espécie de fibra; alternativamente, o material lignocelulósico pode compreender uma mistura de fibras que se originam de diferentes materiais lignocelulósicos. Outros materiais lignocelulósicos são resíduos agrícolas, como palha de cereais, incluindo palha de trigo, palha de cevada, palha de canola e palha de aveia; fibra de milho; caules e folhas, tais como caules e folhas de milho e caules e folhas de soja; gramíneas, tais como grama, caniço-malhado, grama de cordão e miscanto; ou combinações dos mesmos.
[000129] Os substratos para ensaios de atividade da celulose podem ser divididos em duas categorias, solúveis e insolúveis, com base em sua solubilidade em água. Substratos solúveis incluem celodextrinas ou derivados,
carboximetil celulose (CMC) ou hidroxietil celulose (HEC). Substratos insolúveis incluem celulose cristalina, celulose microcristalina (Avicel), celulose amorfa, tal como celulose inchada com ácido fosfórico (PASC), celulose tingida ou fluorescente e biomassa lignocelulósica pré-tratada. Esses substratos são geralmente material celulósico altamente ordenado e, portanto, apenas moderadamente solúvel.
[000130] Será apreciado que o material lignocelulósico adequado pode ser qualquer matéria-prima que contenha celulose solúvel e/ou insolúvel, onde a celulose insolúvel pode estar em uma forma cristalina ou não cristalina. Em várias modalidades, a biomassa lignocelulósica compreende, por exemplo, madeira, milho, caules e folhas de milho, serragem, casca, melaço, cana-de- açúcar, folhas, resíduos agrícolas e florestais, gramíneas, tal como gramas, produtos de digestão de ruminantes, resíduos municipais, efluentes de fábrica de papel, jornal, papelão ou combinações dos mesmos.
[000131] A lama de papel também é uma matéria-prima viável para a produção de lactato ou acetato. A lama de papel é um resíduo sólido proveniente da polpação e da fabricação de papel e normalmente é removida da água residual do processo em um clarificador primário. O custo de descarte da lama úmida é um incentivo significativo para converter o material para outros usos, tal como a conversão em etanol. Os processos fornecidos pela presente invenção são amplamente aplicáveis. Além disso, os produtos de sacarificação e/ou fermentação podem ser usados para produzir etanol ou produtos químicos de maior valor agregado, tais como ácidos orgânicos, aromáticos, ésteres, acetona e intermediários poliméricos.
[000132] O processo da presente invenção colocando em contato as células hospedeiras recombinantes aqui descritas com uma biomassa, de modo a permitir a conversão de, pelo menos, uma parte da biomassa no produto de fermentação (por exemplo, um álcool, tal como etanol). Em uma modalidade, a biomassa ou substrato a ser hidrolisado é uma biomassa lignocelulósica e, em algumas modalidades, compreende amido (em uma forma gelatinizada ou bruta). O processo pode incluir, em algumas modalidades, o aquecimento da biomassa lignocelulósica antes da fermentação para fornecer amido em uma forma gelatinizada.
[000133] O processo de fermentação pode ser realizado a temperaturas de pelo menos cerca de 20°C, cerca de 21°C, cerca de 22°C, cerca de 23°C, cerca de 24°C, cerca de 25°C, cerca de 26°C, cerca de 27°C, cerca de 28°C, cerca de 29°C, cerca de 30°C, cerca de 31°C, cerca de 32°C, cerca de 33°, cerca de 34°C, cerca de 35°C, cerca de 36°C, cerca de 37°C, cerca de 38°C, cerca de 39°C, cerca de 40°C, cerca de 41°C, cerca de 42°C, cerca de 43°C, cerca de 44°C, cerca de 45°C, cerca de 46°C, cerca de 47°C, cerca de 48°C, cerca de 49°C ou cerca de 50°C. Em algumas modalidades, a produção de etanol a partir da celulose pode ser realizada, por exemplo, a temperaturas acima de cerca de 30°C, cerca de 31°C, cerca de 32°C, cerca de 33°C, cerca de 34°C, cerca de 35°C, cerca de 36°C, cerca de 37°C, cerca de 38°C, cerca de 39°C, cerca de 40°C, cerca de 41°C, cerca de 42°C, ou cerca de 43°C, ou cerca de 44°C, ou cerca de 45°C, ou cerca de 50°C. Em algumas modalidades, a célula hospedeira microbiana recombinante pode produzir etanol a partir da celulose a temperaturas de cerca de 30°C a 60°C, cerca de 30°C a 55°C, cerca de 30°C a 50°C, cerca de 40°C a 60°C, cerca de 40°C a 55°C ou cerca de 40°C a 50°C.
[000134] Em algumas modalidades, o processo pode ser usado para produzir etanol a uma taxa específica. Por exemplo, em algumas modalidades, o etanol é produzido a uma taxa de, pelo menos, cerca de 0,1 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,25 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,5 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 0,75 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 1,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 2,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 5,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 10 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 15 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 20,0 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 25 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 30 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 50 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 100 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 200 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 300 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 400 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 500 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 600 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 700 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 800 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 900 mg por hora por litro, pelo menos cerca de 1 g por hora por litro, pelo menos cerca de 1,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 2 g por hora por litro, pelo menos cerca de 2,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de
3 g por hora por litro, pelo menos cerca de 3,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 4 g por hora por litro, pelo menos cerca de 4,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 5,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 6 g por hora por litro, pelo menos cerca de 6,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 7 g por hora por litro, pelo menos cerca de 7,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 8 g por hora por litro, pelo menos cerca de 8,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 9 g por hora por litro, pelo menos cerca de 9,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 10 g por hora por litro, pelo menos cerca de 10,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 11 g por hora por litro, pelo menos cerca de 11,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 12 g por hora por litro, pelo menos cerca de 12,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 13 g por hora por litro, pelo menos cerca de 13,5 g por hora por litro, pelo menos cerca de 14 g por hora por litro, pelo menos cerca de 14,5 g por hora por litro ou pelo menos cerca de 15 g por hora por litro.
[000135] A produção de etanol pode ser medida usando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, a quantidade de etanol em amostras de fermentação pode ser avaliada usando análises de HPLC. Muitos kits de ensaio de etanol estão comercialmente disponíveis que usam, por exemplo, ensaios com base em enzima álcool oxidase.
[000136] A presente invenção será mais facilmente compreendida referindo-se aos seguintes exemplos que são dados para ilustrar a invenção em vez de limitar o seu escopo. EXEMPLO I - PRODUÇÃO DE ETANOL E GLICEROL DE CÉLULAS DE LEVEDURA RECOMBINANTES DE ZWF1∆:: GAPN
[000137] O desempenho de fermentação de cepas de Saccharomyces cerevisiae recombinantes do Exemplo I foi avaliado em meio Verduyn com 20 g/L de glicose em pH 5,0. Os vasos de fermentação foram selados, purgados com nitrogênio e equipados com válvulas unidirecionais. A fermentação foi realizada com agitação a 35°C durante 24 horas, e as amostras foram analisadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC). Como controle positivo, o nocaute de fcy1 (fcy1∆) no GAPN anterior foi usado. As descrições das cepas incluídas neste estudo de fermentação são descritas na Tabela 6. Os resultados deste estudo de fermentação são fornecidos na Figura 2, e a mudança relativa na produção de etanol e glicerol das cepas está resumida na Tabela 7. Sob as condições experimentais usadas, os títulos mais altos de etanol (33,1 g/L) e os mais baixos de glicerol (2,7 g/L) são obtidos quando GAPN é expresso em combinação com zwf1∆ na cepa M18913. Tabela 6. Descrição das manchas avaliadas para desempenho de fermentação Genes Genes Cepa superexpressos Descrição inativados ou introduzidos M2390 N.D. N.D. Cepa de tipo selvagem M18646 zwf1 N.D. Deleção zwf1 GAPN GAPN integrado ao locus fcy1; M7153 fcy1 (SEQ ID NO: 1) zwf1 intacto GAPN GAPN integrado ao locus zwf1; M18913 zwf1 (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado Tabela 7. Resumo da mudança na produção de etanol e glicerol, em relação à cepa de tipo selvagem como referência Cepa Genótipo ∆Etanol ∆Glicerol M2390 WT 0,0% 0,0% M18646 zwf1∆ -33,5% -32,9% M7153 fcy1∆::GAPN 0,5% -26,0% M18913 zwf1∆::GAPN 1,9% -33,2%
[000138] A cepa M7153 expressa o gene GAPN em fcy1∆, mantendo ZWF1 intacto, e nesta cepa o glicerol é reduzido em 26%, com um aumento de 0,5% no título de etanol. Quando GAPN é expresso com zwf1 deletado (M18913), o glicerol é reduzido em 33% acompanhado por um aumento de 1,9% no título de etanol. Uma cepa deficiente em zwf1 (M18646) exibe auxotrofia para metionina, e é incapaz de terminar a fermentação nessas condições. EXEMPLO II - CARACTERIZAÇÃO DE CÉLULAS DE LEVEDURA RECOMBINANTES DE ZWF1∆:: GAPN
[000139] Propagação de cepas. As cepas de levedura foram corrigidas em placas de ágar contendo 1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 4% de glicose e 2% de ágar (YPD40) de estoques de glicerol e foram incubadas durante a noite a 35ºC. No dia seguinte, uma alça de células foi inoculada em 30 mL de meio YPD40 e cultivada durante a noite a 35ºC. As culturas durante a noite foram adicionadas à fermentação a uma concentração de 0,06 g/L de peso celular seco (DCW).
[000140] Fermentação Verduyn. As culturas de YPD durante a noite foram lavadas 1x com ddH2O e inoculadas em 25 mL de meio verduyn contendo 4% de glicose, pH 4,2. O gás de escape de CO2 foi medido usando um sistema de monitoramento de pressão (ACAN). As amostras de critério de avaliação foram analisadas para metabólitos por HPLC e por DCW.
[000141] Fermentação de pasta. Culturas YPD (25 a 50 g) foram inoculadas em 30-32,5% de sólidos totais (TS) de pasta de milho contendo lactrol (7 mg/kg) e penicilina (9 mg/kg) em frascos de 125 mL equipados com válvulas unidirecionais. A ureia foi adicionada a uma concentração de 0-300 ppm de ureia dependendo do substrato usado. Glucoamilase exógena foi adicionada a 100% = 0,6A de GU/gTS e 50-65% para cepas que expressam uma glucoamilase. As cepas foram incubadas a 33ºC durante 18 h - 48 h, seguidas de 31ºC para fermentação permissiva, 36ºC mantidas em alta temperatura ou 34ºC mantidas para fermentação láctica, agitando a 150 RPM. 0,38% p/v de lático foi adicionado a T = 18 h. As amostras foram coletadas a 18 - 68 h, dependendo do experimento e os metabólitos foram medidos usando HPLC.
[000142] As características de fermentação das cepas de Saccharomyces cerevisiae descritas na Tabela 8 foram determinadas sob fermentações permissivas e estressantes. Tabela 8. Descrição das manchas avaliadas para desempenho de fermentação. STL1 refere-se ao polipeptídeo STL1 de Saccharomyces cerevisiae com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. MP1152 refere- se a uma glucoamilase de Saccharomycopsis fibuligera com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28. MP1139 refere-se a uma glicerol desidratase ativase de Clostridium butyricum com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. MP1140 refere-se a uma glicerol desidratase de Clostridium butyricum com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. MP1141 refere-se a 1,3- propanodiol desidrogenase de Clostridium butyricum com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34. ADHE refere-se à álcool desidrogenase bifuncional de Bifidobacterium adolescentis com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36. A trealase é de Neurospora crassa e tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38. MP743 refere-se a uma glucoamilase de Saccharomycopsis fibuligera com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
41. GLT1 é uma glutamato sintase dependente de NAD (+) (GOGAT) de
Saccharomyces cerevisiae com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43. GLN1 é uma glutamina sintetase de Saccharomyces cerevisiae com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45. GAPN Lb é uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP de Lactobacillus delbrueckii com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47. GAPN St é uma gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase dependente de NADP de Streptococcus thermophilus com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49. GAPN Sm é um gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP de Streptococcus macacae com o número de aminoácidos de SEQ ID NO: 51. GAPN Sh é um gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP de Streptococcus hyointestinalis com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53. GAPN Su é um gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP de Streptococcus urinalis com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55. GAPN Sc é uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP de Streptococcus canis com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57. GAPN Sth é uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP de Streptococcus thoraltensis com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59. GAPN Sd é uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP de Streptococcus dysgalactiae com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
61. TSL1 é a grande subunidade do complexo trealose 6-fosfato sintase/fosfatase de Saccharomyces cerevisiae com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64. GAPN Spy é uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP de Streptococcus pyogenes com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 72. GAPN Spi é uma gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase dependente de NADP de Streptococcus ictaluri com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 74. GAPN Cp é uma gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase dependente de NADP de Clostridium perfringens com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 76. GAPN Cc é uma gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase dependente de NADP de Clostridium chromiireducens com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78. GAPN Cb é uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP de Clostridium botulinum com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 80. GAPN Bc é uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP de Bacillus cereus com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82. GAPN Ba é uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP de Bacillus anthracis com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 84. GAPN Bt é uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase dependente de NADP de Bacillus thuringiensis com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 86
Genes Genes Cepa Fundamento superexpressos ou Promotor Terminador Descrição inativados introduzidos M2390 N.D.
Cepa de tipo selvagem M8279 N.D.
Cepa de tipo selvagem 2 cópias de STL1 (SEQ M19506 M8279 adh1p idp1t STL1 superexpresso ID NO: 25) 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; M18913 M2390 zwf1 tpi1p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; tpi1p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado M19687 M2390 zwf1 4 cópias de STL1 (SEQ adh1p/stl1p idp1t/pdc1t STL1 superexpresso ID NO: 25) 4 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; tpi1p idp1t/fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado M22889 M8279 zwf1 2 cópias de STL1 (SEQ adh1p idp1t STL1 superexpresso ID NO: 25) 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; tpi1p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 2 cópias de STL1 (SEQ M20170 M2390 zwf1 adh1p idp1t/pdc1t STL1 superexpresso ID NO: 25) 4 cópias de ADHE pfk1p/tpi1p hxt2t/fba1t ADHE superexpresso (SEQ ID NO: 35) 2 cópias de GAPN tpi1p fba1t GAPN integrado no locus zwf1 (SEQ ID NO: 1) 2 cópias de MP1139 adh1p pdc1t MP1139 superexpresso (SEQ ID NO: 29) 2 cópias de MP1140 M20365 M2390 zwf1 eno1p eno1t MP1140 superexpresso (SEQ ID NO: 31) 2 cópias de MP1141 pfk1p hxt2t MP1141 superexpresso (SEQ ID NO: 33) 2 cópias de STL1 (SEQ adh1p/stl1p idp1t/pdc1t STL1 superexpresso ID NO: 25)
Genes Genes Cepa Fundamento superexpressos ou Promotor Terminador Descrição inativados introduzidos 1 cópia de GAPN GAPN superexpresso, integrado tefp adh3t (SEQ ID NO: 1) no local adicional 4 cópias de MP1152 hxt3p/qcr8p idp1t/pgk1t MP1152 superexpresso (SEQ ID NO: 27) 2 cópias de GAPN tpi1p fba1t GAPN integrado no locus zwf1 (SEQ ID NO: 1) 4 cópias de STL1 (SEQ M19994 M2390 zwf1 adh1p/stl1p idp1t/pdc1t STL1 superexpresso ID NO: 25) 4 cópias de MP1152 hxt3p/qcr8p idp1t/pgk1t MP1152 superexpresso (SEQ ID NO: 27)
4 cópias de STL1 (SEQ tef2p/adh1p adh3t/pdc1t STL1 integrado no locus ime1 ID NO: 25) 2 cópias de trehalase tef2p adh3t Trehalase superexpressa (SEQ ID NO: 37) tsl1p 2 cópias de TSL1 (SEQ mutante M20576 M8279 zwf1 tsl1t TSL1 superexpresso ID NO: 63) (SEQ ID NO: 62) 8 cópias de MP743 tdh1p/hor7p pgk1t/idp1t MP743 superexpresso (SEQ ID NO: 40) 4 cópias de ADHE pfk1p/tpi1p hxt2t/fba1t ADHE superexpresso (SEQ ID NO: 35) 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; tpi1p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; M20922 M2390 zwf1 adh1p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; M20923 M2390 zwf1 gpd1p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; M20924 M2390 zwf1 hxt3p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; M20925 M2390 zwf1 qcr8p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado
Genes Genes Cepa Fundamento superexpressos ou Promotor Terminador Descrição inativados introduzidos 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; M20926 M2390 zwf1 pgi1p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; M20927 M2390 zwf1 pfk1p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; M20928 M2390 zwf1 fba1p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; M20929 M2390 zwf1 tpi1p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; M20930 M2390 zwf1 tdh2p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; M20931 M2390 zwf1 pgk1p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado GAPN GAPN integrado no locus zwf1; M20932 M2390 zwf1 gpm1p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; M20933 M2390 zwf1 eno2p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; M20934 M2390 zwf1 cdc19p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; M20935 M2390 zwf1 zwf1p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; M20936 M2390 zwf1 hor7p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 8 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; zwf1p/gpd1p idp1t/fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 2 cópias de STL1 (SEQ adh1p idp1t STL1 superexpresso ID NO: 25) M23526 M8279 zwf1 2 cópias de GLT1 (SEQ hxt3p idp1t GLT1 superexpresso ID NO: 42) 2 cópias de GLN1 qcr8p pgk1t GLN1 superexpresso (SEQ ID NO: 44) 8 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; M23358 M8279 zwf1 zwf1p/gpd1p idp1t/fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado
Genes Genes Cepa Fundamento superexpressos ou Promotor Terminador Descrição inativados introduzidos 2 cópias de STL1 (SEQ adh1p idp1t STL1 superexpresso ID NO: 25) 4 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; M22882 M8279 zwf1 zwf1p/gpd1p idp1t/fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; tpi1p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 1 cópia de MP1139 adh1p pdc1t MP1139 superexpresso (SEQ ID NO: 29) M20032 M2390 zwf1 1 cópia de MP1140 eno1p eno1t MP1140 superexpresso (SEQ ID NO: 31) 1 cópia de MP1141 pfk1p hxt2t MP1141 superexpresso (SEQ ID NO: 33) 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; tpi1p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 1 cópia de MP1139 adh1p pdc1t MP1139 superexpresso (SEQ ID NO: 29) 1 cópia de MP1140 M20296 M2390 zwf1 eno1p eno1t MP1140 superexpresso (SEQ ID NO: 31) 1 cópia de MP1141 pfk1p hxt2t MP1141 superexpresso (SEQ ID NO: 33) 4 cópias de STL1 (SEQ adh1p/stl1p idp1t/pdc1t STL1 superexpresso ID NO: 25) 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; tpi1p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 1 cópia de MP1139 adh1p pdc1t MP1139 superexpresso (SEQ ID NO: 29) 1 cópia de MP1140 M20300 M2390 zwf1 eno1p eno1t MP1140 superexpresso (SEQ ID NO: 31) 1 cópia de MP1141 pfk1p hxt2t MP1141 superexpresso (SEQ ID NO: 33) 2 cópias de STL1 (SEQ adh1p/stl1p idp1t/pdc1t STL1 superexpresso ID NO: 25)
Genes Genes Cepa Fundamento superexpressos ou Promotor Terminador Descrição inativados introduzidos 1 cópia de GAPN GAPN superexpresso, integrado tefp adh3t (SEQ ID NO: 1) no local adicional 8 cópias de GAPN Ld GAPN Ld integrado no locus M22883 M8279 zwf1 zwf1p/gpd1p idpt1t/fba1t (SEQ ID NO: 46) zwf1; zwf1 deletado 8 cópias de GAPN St GAPN St integrado no locus M22886 M8279 zwf1 zwf1p/gpd1p idpt1t/fba1t (SEQ ID NO: 48) zwf1; zwf1 deletado 2 cópias de STL1 (SEQ adh1p idp1t STL1 superexpresso ID NO: 25) M22889 M8279 zwf1 2 cópias de GAPN GAPN integrado no locus zwf1; tpi1p fba1t (SEQ ID NO: 1) zwf1 deletado 2 cópias de STL1 (SEQ adh1p idp1t STL1 superexpresso ID NO: 25) M22890 M8279 zwf1 2 cópias de GAPN Ld GAPN Ld integrado no locus tpi1p fba1t (SEQ ID NO: 46) zwf1; zwf1 deletado 2 cópias de STL1 (SEQ adh1p idp1t STL1 superexpresso ID NO: 25) M22891 M8279 zwf1 2 cópias de GAPN St GAPN St integrado no locus tpi1p fba1t (SEQ ID NO: 48) zwf1; zwf1 deletado Pelo menos uma cópia GAPN Sm integrado no locus M23688 M2390 zwf1 de GAPN Sm (SEQ ID gpd1p idp1t/fba1t zwf1; zwf1 deletado NO: 50) 2 cópias de GAPN Sh GAPN Sh integrado no locus M23692 M2390 zwf1 gpd1p idp1t/fba1t (SEQ ID NO: 52) zwf1; zwf1 deletado Pelo menos uma cópia GAPN Su integrado no locus M23693 M2390 zwf1 de GAPN Su (SEQ ID gpd1p idp1t/fba1t zwf1; zwf1 deletado NO: 54) 2 cópias de GAPN Sc GAPN Sc integrado no locus M23696 M2390 zwf1 gpd1p idp1t/fba1t (SEQ ID NO: 56) zwf1; zwf1 deletado 2 cópias de GAPN Sth GAPN Sth integrado no locus M23700 M2390 zwf1 gpd1p idp1t/fba1t (SEQ ID NO: 58) zwf1; zwf1 deletado 2 cópias de GAPN Sd GAPN Sd integrado no locus M23702 M2390 zwf1 gpd1p idp1t/fba1t (SEQ ID NO: 60) zwf1; zwf1 deletado
Genes Genes Cepa Fundamento superexpressos ou Promotor Terminador Descrição inativados introduzidos Pelo menos uma cópia GAPN Spy integrado no locus M23704 M2390 zwf1 de GAPN Spy (SEQ ID gpd1p idp1t/fba1t zwf1; zwf1 deletado NO: 71) 2 cópias de GAPN Spi GAPN Spi integrado no locus M23706 M2390 zwf1 gpd1p idp1t/fba1t (SEQ ID NO: 73) zwf1; zwf1 deletado 2 cópias de GAPN Cp GAPN Cp integrado no locus M23708 M2390 zwf1 gpd1p idp1t/fba1t (SEQ ID NO: 75) zwf1; zwf1 deletado Pelo menos uma cópia GAPN Cc integrado no locus M23711 M2390 zwf1 de GAPN Cc (SEQ ID gpd1p idp1t/fba1t zwf1; zwf1 deletado NO: 77) 2 cópias de GAPN Cb GAPN Cb integrado no locus M23713 M2390 zwf1 gpd1p idp1t/fba1t (SEQ ID NO: 79) zwf1; zwf1 deletado 2 cópias de GAPN Bc GAPN Bc integrado no locus M23714 M2390 zwf1 gpd1p idp1t/fba1t (SEQ ID NO: 81) zwf1; zwf1 deletado 2 cópias de GAPN Ba GAPN Ba integrado no locus M23716 M2390 zwf1 gpd1p idp1t/fba1t (SEQ ID NO: 83) zwf1; zwf1 deletado 2 cópias de GAPN Bt GAPN Bt integrado no locus M23719 M2390 zwf1 gpd1p idp1t/fba1t (SEQ ID NO: 85) zwf1; zwf1 deletado
Tela do promotor
[000143] O GAPN foi expresso com diferentes promotores e as cepas resultantes foram submetidas à fermentação. Mais especificamente, as culturas YPD (25 a 50 g) foram inoculadas em 32,5% de sólidos totais (TS) de pasta de milho contendo 165 ppm de uréia, lactrol (7 mg/kg) e penicilina (9 mg/kg) em frascos de 125 mL contendo válvulas unidirecionais. Glucoamilase exógena foi adicionada a 100% = 0,6 de AGU/gTS. As cepas foram incubadas a 33ºC durante 48 h com agitação (150 RPM). A perda de peso foi medida às 24 h e 48 h. Os metabólitos dos critérios de avaliação foram medidos usando HPLC. Conforme mostrado na Figura 9, o uso dos promotores dos genes gpd1 (M20923) e zwf1 (cepa M20935) resultou em um bom rendimento de etanol, enquanto o uso do promotor gpd1 (M20923) reduziu a produção de glicerol. STL1
[000144] Foi, em seguida, determinado se a coexpressão de STL1 com GAPN poderia aumentar ainda mais o rendimento de fermentação em uma fermentação de pasta de milho. Quando STL1 é coexpresso com GAPN, uma melhora no rendimento de etanol e uma redução na produção de glicerol são observadas (quando comparadas à cepa parental). Isso é visto na Figura 10, quando STL1 é coexpresso com uma glucoamilase (cepas M19994 e M20365), bem como, na Figura 11 quando STL1 é expresso com GAPN (cepa M19687), ADHE (M20170) ou em combinação com o complexo de reuterina (cepas M20296 e M20300). Trehalase
[000145] Também foi determinado se a coexpressão de uma trealase com GAPN poderia aumentar o rendimento de fermentação em uma fermentação de pasta de milho. Quando uma trealase é coexpressa com GAPN (cepa 20576), um aumento no rendimento de etanol e uma diminuição na produção de glicerol são observados em fermentações permissivas (Figura 12A), de ácido lático (Figura 12B) e de alta temperatura (Figura 12C). GLT1/GLN1
[000146] Foi determinado se a coexpressão de GLT1/GLN1 com GAPN poderia modificar a cinética de fermentação de uma fermentação de pasta de milho. A coexpressão de GLT1/GLN1 com GAPN (cepa M23526) aumenta o rendimento de etanol (Figura 13A) enquanto diminui a produção de glicerol (Figura 13B) em uma fermentação de pasta de milho. Tela GAPN
[000147] Polipeptídeos GAPN adicionais (de Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii) foram rastreados em diferentes origens de levedura. Resumidamente, as cepas de levedura foram corrigidas em placas de ágar contendo 1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 4% de glicose e 2% de ágar (YPD40) de estoques de glicerol e foram incubadas durante a noite a 35ºC. No dia seguinte, uma alça de células foi inoculada em 30 mL de meio YPD40 e cultivada durante a noite a 35ºC. As culturas durante a noite foram adicionadas à fermentação a uma concentração de 0,06 g/L de peso celular seco (DCW). As culturas de YPD durante a noite foram lavadas 1x com ddH 2O e inoculadas em 25 mL de meio Verduyn contendo 4% de glicose, pH 4,2. O gás de escape de CO2 foi medido usando um sistema de monitoramento de pressão (ACAN). As amostras do critério de avaliação foram analisadas quanto a metabólitos por HPLC e por DCW. Todas as diferentes cepas testadas que expressam GAPN aumentaram o rendimento de etanol (Figuras 14A, 15A, 15C) e reduziram a produção de glicerol (Figuras 14B, 15B, 15D) quando comparadas às cepas parentais nas condições testadas.
REFERÊNCIAS
[000148] Blomberg, Anders. Metabolic surprises in Saccharomyces cerevisiae during adaptation to saline conditions: questions, some answers and a model. FEMS Microbiol Lett. 2000 Jan 1; 182(1):1-8.
[000149] Verho et al., Engineering Redox Cofactor Regeneration for Improved Pentose Fermentation in Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology, Oct. 2003, p. 5892–5897.
[000150] Zhang et al., Improving the ethanol yield by reducing glycerol formation using cofactor regulation in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Lett (2011) 33:1375–1380.
[000151] Zhang et al., Engineering of the glycerol decomposition pathway and cofactor regulation in an industrial yeast improves ethanol production. J Ind Microbiol Biotechnol (2013) 40:1153–1160.
[000152] US8956851
[000153] CA2506195
[000154] CN100363490

Claims (72)

REIVINDICAÇÕES
1. Célula hospedeira de levedura recombinante, CARACTERIZADA pelo fato de ter: a) uma ou mais de uma primeira modificação genética para regular negativamente uma primeira via metabólica; e b) uma ou mais de uma segunda modificação genética para regular positivamente uma segunda via metabólica, em que a uma ou mais segunda modificação genética permitem a expressão de uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase sem atividade de fosforilação, em que a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase é de comissão enzimática (EC) 1.2.1.9 ou 1.2.1.90; em que a primeira via metabólica e a segunda via metabólica permitem a conversão de NADP+ em NADPH; e em que a primeira via metabólica é distinta da segunda via metabólica.
2. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a primeira modificação genética compreende a inativação de, pelo menos, um primeiro gene nativo.
3. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a primeira via metabólica é a via da pentose fosfato.
4. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, CARACTERIZADA pelo fato de que o, pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene zwf1 que codifica um polipeptídeo com atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase, um ortólogo do gene zwf1 ou um parálogo do gene zwf1.
5. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo com atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 com atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3 com atividade de glicose-6-fosfato desidrogenase.
6. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, CARACTERIZADA pelo fato de que o, pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene gnd1 que codifica um polipeptídeo com atividade de 6-fosfogluconato desidrogenase, um ortólogo do gene gnd1 ou um parálogo do gene gnd1.
7. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo com atividade de 6-fosfogluconato desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 com atividade de 6-fosfogluconato desidrogenase, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 com atividade de 6-fosfogluconato desidrogenase.
8. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o, pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene gnd2 que codifica um polipeptídeo com atividade de 6-fosfogluconato desidrogenase, um ortólogo do gene gnd2 ou um parálogo do gene gnd2.
9. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo com atividade de 6-fosfogluconato desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 com atividade de 6-fosfogluconato desidrogenase, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 com atividade de 6-fosfogluconato desidrogenase.
10. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 9, CARACTERIZADA pelo fato de que o, pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene ald6 que codifica um polipeptídeo com atividade de aldeído desidrogenase, um ortólogo do gene ald6 ou um parálogo do gene ald6.
11. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo com atividade de aldeído desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 com atividade de aldeído desidrogenase, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 com atividade de aldeído desidrogenase.
12. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 11, CARACTERIZADA pelo fato de que o, pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene idp1 que codifica um polipeptídeo com atividade de isocitrato desidrogenase, um ortólogo do gene ipd1 ou um parálogo do gene ipd1.
13. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo com atividade de isocitrato desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 com atividade de isocitrato desidrogenase, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 com atividade de isocitrato desidrogenase.
14. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 13, CARACTERIZADA pelo fato de que o, pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene idp2 que codifica um polipeptídeo com atividade de isocitrato desidrogenase, um ortólogo do gene ipd2 ou um parálogo do gene ipd2.
15. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo com atividade de isocitrato desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 com atividade de isocitrato desidrogenase, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 com atividade de isocitrato desidrogenase.
16. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 15, CARACTERIZADA pelo fato de que o, pelo menos, um primeiro gene nativo compreende um gene idp3 que codifica um polipeptídeo com atividade de isocitrato desidrogenase, um ortólogo do gene ipd3 ou um parálogo do gene ipd3.
17. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo com atividade de isocitrato desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 com atividade de isocitrato desidrogenase, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 com atividade isocitrato desidrogenase.
18. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, CARACTERIZADA pelo fato de que a uma ou mais segundas modificações genéticas compreendem a introdução de uma ou mais segundas moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase.
19. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que possui uma ou mais segundas moléculas de ácido nucleico heterólogas em um quadro de leitura aberto do primeiro gene nativo.
20. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, CARACTERIZADA pelo fato de que, pelo menos, um primeiro gene nativo tem um promotor nativo.
21. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato de que a uma ou mais segundas moléculas de ácido nucleico heterólogas estão sob o controle do promotor nativo de, pelo menos, um primeiro gene nativo.
22. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, CARACTERIZADA pelo fato de que uma ou mais segundas moléculas de ácido nucleico heterólogas estão sob o controle de um promotor heterólogo.
23. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADA pelo fato de que o promotor heterólogo compreende o promotor do gene ADH1, GPD1, HXT3, QCR8, PGI1, PFK1, FBA1, TDH2, PGK1, GPM1, ENO2, CDC19, ZWF1, HOR7 e/ou TPI1.
24. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, CARACTERIZADA pelo fato de que a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase é de EC 1.2.1.90.
25. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADA pelo fato de que a gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase é GAPN.
26. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADA pelo fato de que GAPN tem: a) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86; b) é uma variante da SEQ ID NO: 2, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86 com atividade de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; ou c) é um fragmento de SEQ ID NO: 2, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 ou 86 com atividade de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase.
27. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, CARACTERIZADA pelo fato de que a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase é de EC 1.2.1.9.
28. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, CARACTERIZADA pelo fato de que ainda tem: iii) uma ou mais de uma terceira modificação genética para regular positivamente uma terceira via metabólica, em que a terceira via metabólica permite a conversão de NADH em NAD+.
29. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que o um ou mais das terceiras modificações genéticas compreendem introduzir uma ou mais terceiras moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam um ou mais dos terceiros polipeptídeos heterólogos.
30. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, CARACTERIZADA pelo fato de que a terceira via metabólica permite a produção de etanol.
31. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, CARACTERIZADA pelo fato de que o um ou mais terceiros polipeptídeos heterólogos compreendem um polipeptídeo com atividade de álcool/aldeído desidrogenase bifuncional.
32. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo com atividade de álcool/aldeído desidrogenase bifuncional tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 com atividade de álcool/aldeído desidrogenase bifuncional, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 com atividade de álcool/aldeído desidrogenase bifuncional.
33. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 32, CARACTERIZADA pelo fato de que um ou mais terceiros polipeptídeos heterólogos compreendem um polipeptídeo com atividade de glutamato desidrogenase.
34. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo com atividade de glutamato desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 com atividade de glutamato desidrogenase, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 com atividade de glutamato desidrogenase.
35. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 34, CARACTERIZADA pelo fato de que um ou mais terceiros polipeptídeos heterólogos compreendem um polipeptídeo com atividade de álcool desidrogenase.
36. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo com atividade de álcool desidrogenase dependente de NADH tem a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 12 a 18, é uma variante de qualquer uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 a 18 com atividade de álcool desidrogenase dependente de NADH, ou é um fragmento de qualquer uma das sequências de aminoácidos com SEQ ID NO: 12 a 18 com atividade de álcool desidrogenase dependente de NADH.
37. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 36, CARACTERIZADA pelo fato de que a terceira via metabólica permite a produção de 1,3-propanodiol.
38. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que o um ou mais terceiros polipeptídeos heterólogos compreendem um polipeptídeo com atividade de 1,3-propanodiol desidrogenase.
39. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADA pelo fato de que o um ou mais terceiros polipeptídeos heterólogos compreendem um polipeptídeo com atividade de glicerol desidratase ativase e um polipeptídeo com atividade de glicerol desidratase.
40. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo com atividade de glicerol desidratase ativase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 com atividade de glicerol desidratase ativase, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 com atividade de glicerol desidratase ativase.
41. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 38 ou 39, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo com atividade de glicerol desidratase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 com atividade de glicerol desidratase, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 com atividade de glicerol desidratase.
42. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 41, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo com atividade de 1,3-propanodiol desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 com atividade de 1,3-propanodiol desidrogenase, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 com atividade de 1,3-propanodiol desidrogenase.
43. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42, CARACTERIZADA pelo fato de que ainda tem: iv) uma ou mais de uma quarta modificação genética para regular positivamente uma quarta via metabólica, em que a quarta via metabólica permite a conversão de NAPDH em NADP+.
44. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADA pelo fato de que a uma ou mais quartas modificações genéticas compreendem introduzir uma ou mais quartas moléculas de ácido nucleico heterólogas que codificam um ou mais quartos polipeptídeos heterólogos.
45. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 43 ou 44, CARACTERIZADA pelo fato de que o um ou mais quartos polipeptídeos heterólogos compreendem um polipeptídeo com atividade de aldose redutase.
46. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo com atividade de aldose redutase compreende um polipeptídeo com atividade de manitol desidrogenase.
47. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo com atividade de manitol desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 com atividade de aldose redutase, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 com atividade de aldose redutase.
48. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 47, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo com atividade de aldose redutase compreende um polipeptídeo com atividade de sorbitol desidrogenase.
49. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo com atividade de sorbitol desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 com atividade de sorbitol desidrogenase, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 com atividade de sorbitol desidrogenase.
50. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 48 ou 49, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo com atividade de sorbitol desidrogenase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 com atividade de sorbitol desidrogenase, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 com atividade de sorbitol desidrogenase.
51. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 50, CARACTERIZADA pelo fato de que o um ou mais quartos polipeptídeos heterólogos compreendem um polipeptídeo com atividade de álcool desidrogenase dependente de NADP+.
52. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 51, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo com atividade de álcool desidrogenase dependente de NADP+ tem a sequência de aminoácidos de qualquer uma da SEQ ID NO: 17 ou 18, é uma variante de qualquer uma da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou 18 com atividade de álcool desidrogenase dependente de NADP+, ou é um fragmento de qualquer uma da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou 18 com atividade de álcool desidrogenase dependente de NADP+.
53. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 52, CARACTERIZADA pelo fato de que ainda tem: v) uma quinta modificação genética para expressar um quinto polipeptídeo heterólogo com atividade sacarolítica.
54. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADA pelo fato de que o quinto polipeptídeo heterólogo compreende uma enzima com atividade de alfa-amilase.
55. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 53 ou 54, CARACTERIZADA pelo fato de que o quinto polipeptídeo heterólogo compreende uma enzima com atividade de glucoamilase.
56. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 55, CARACTERIZADA pelo fato de que a enzima com atividade de glucoamilase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou 40, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou 40 com atividade de glucoamilase, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou 40 com atividade de glucoamilase.
57. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 56, CARACTERIZADA pelo fato de que o quinto polipeptídeo heterólogo compreende uma enzima com atividade de trealase.
58. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 57, CARACTERIZADA pelo fato de que a enzima com atividade de trealase tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, é uma variante ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 com atividade de trealase, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 com atividade de trealase.
59. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 58, CARACTERIZADA pelo fato de que ainda tem: vi) uma sexta modificação genética para expressar um sexto polipeptídeo heterólogo para reduzir a produção de glicerol ou facilitar o transporte de glicerol na célula hospedeira de levedura recombinante.
60. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADA pelo fato de que o sexto polipeptídeo heterólogo compreende um polipeptídeo STL1 com atividade simportadora de prótons de glicerol.
61. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 60, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo STL1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 com atividade simportadora de prótons de glicerol, ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 com atividade simportadora de prótons de glicerol.
62. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 61, CARACTERIZADA pelo fato de que o sexto polipeptídeo heterólogo compreende um polipeptídeo GLT1 com atividade de glutamato sintetase dependente de NAD(+) e um polipeptídeo GLN1 com atividade de glutamina sintetase.
63. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 62, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo GLT1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 com atividade de glutamato sintase dependente de NAD(+) ou é um fragmento de SEQ ID NO: 43 com atividade de glutamato sintase dependente de NAD(+).
64. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 62 ou 63, CARACTERIZADA pelo fato de que o polipeptídeo GLN1 tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, é uma variante da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 com atividade de glutamina sintetase ou é um fragmento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 com atividade de glutamina sintetase.
65. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 64, CARACTERIZADA pelo fato de ser do gênero Saccharomyces.
66. Célula hospedeira de levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 65, CARACTERIZADA pelo fato de ser da espécie Saccharomyces cerevisiae.
67. Processo para converter uma biomassa em um produto de fermentação, o processo sendo CARACTERIZADO pelo fato de compreender colocar em contato a biomassa com a célula hospedeira de levedura recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 64 para permitir a conversão de, pelo menos, uma parte da biomassa no produto de fermentação.
68. Processo, de acordo com a reivindicação 67, CARACTERIZADO pelo fato de que a biomassa compreende milho.
69. Processo, de acordo com a reivindicação 68, CARACTERIZADO pelo fato de que o milho é fornecido como uma pasta.
70. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67 a 69, CARACTERIZADO pelo fato de que o produto da fermentação é etanol.
71. Processo, de acordo com a reivindicação 70, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira de levedura recombinante aumenta a produção de etanol em comparação com uma célula hospedeira de levedura nativa correspondente sem a primeira modificação genética e a segunda modificação genética.
72. Processo, de acordo com a reivindicação 70 ou 71, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira de levedura recombinante diminui ainda mais a produção de glicerol em comparação com uma célula hospedeira de levedura nativa correspondente sem a primeira modificação genética e a segunda modificação genética.
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