CN1607249A

CN1607249A - 棉花漆酶转基因植物及其应用

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Publication number: CN1607249A
Application number: CN 200310107907
Authority: CN
Inventors: 陈晓亚; 王国栋
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2003-10-15
Filing date: 2003-10-15
Publication date: 2005-04-20
Anticipated expiration: 2023-10-15
Also published as: CN1266272C

Abstract

本发明提供了一种新的植物基因－棉花漆酶基因及其编码蛋白。本发明还公开了编码这种漆酶基因的用途，尤其是在改良植物对酚酸类物质的抗性以及利用转基因植物清除土壤中三氯苯酚等环境污染物方面的应用。

Description

棉花漆酶转基因植物及其应用

技术领域

本发明属于植物学和植物改良基因工程领域，具体地说，本发明涉及新的亚洲棉(Gossypium arboreum)漆酶基因及其编码蛋白。本发明还公开了编码这种漆酶基因的用途，尤其是在改良植物对酚酸类物质的抗性以及利用转基因植物清除土壤中三氯苯酚等环境污染物方面的应用。

背景技术

固着生活的、同种和不同种的植物群生在一起，形成植物群落。植物间的相互作用可以分为两个方面：一是对环境生长因素——诸如对光、肥、水的竞争；二是通过向环境释放化学物质，以此影响周围植物。前者称为allelospoly——相互竞争或争夺；后者称为allelopathy——他感作用。

他感作用的准确定义是：一种植物(包括微生物)通过其本身产生、并释放到环境中去的化学物质对另一种植物(或微生物)产生直接或间接的相互排斥或促进的效应。酚酸化合物是一类植物次生代谢产物，也是高等植物所分泌的最常见的他感化合物。除了分泌，这些次生代谢物还可以通过雨水淋洗进入土壤中，植物残体分解也会产生大量的酚酸物质。它们对植物生长发育有明显的抑制作用，而且有自毒作用(Olofsdotter等，2002，Journal of Chemical Ecology 28：229-242.)。有研究表明，0.1mM的咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、五倍子酸及香草酸能明显抑制大豆的生长，主要表现在光合作用产物的减少与叶绿素含量的降低，特别是对幼苗生长发育影响较为明显，不同的酚酸对作物的抑制强度有一定的差异(Patterson，1981，Weed Science 29：53-58.)。全世界由于他感作用使农业损失估计每年达几十亿美元。在了解他感作用机理的基础上，如何利用基因工程的方法促进作物对他感化合物的抗性、提高作物产量是一个亟待解决的重要问题。

环境污染是当今人类面临的最严重的问题之一，上世纪六七十年代全球范围内过度使用农药尤其是含氯的芳香类化合物(例如三氯苯酚)，造成严重的环境污染。工业废水大量排放，仅印染行业每年要排放费染料近七万吨，对人类的生存环境造成极大的破坏。

从理论上讲，植物对外界有毒的有机物的抗性不外乎两条途径：一是植物的根系分泌一些酶采用生化降解的方法使土壤中毒性有机物质进入不到体内；二是毒性有机物被植物根系直接吸收进入体内后，植株体内的解毒机制或将毒性有机物与糖、谷胱甘肽、氨基酸、丙二酸等结合成毒性较小的物质作为其解毒机制(Coleman et al，1997)，或将毒性有机物运输到其他组织再运出体外，或在植物体内进行完全或不完全的降解。比较而言，第一种方法是更经济，更有效的，植物在保护自己不受伤害的同时还净化了土壤，这种方法被称之为植物体外修复(phytoremediation ex planta)(Anderson等，1993，Environ Sci Technol 27：2630-2636.)。植物体外修复技术具有就地处理，操作简单，处理效果好且污染物转化后无二次污染等众多优点。已有研究证明植物可以分泌许多酶，这些酶可以将解土壤中的有机污染物(Salt等，1998，Annu Rev Plant physiol Plant MolecBiol 49：643-668.)，这些酶包括漆酶，脱卤素酶，硝基还原酶，腈水解酶和过氧化物酶(Boyajian and Carreira，1997，Nat Biotechnol.15：127-128.；Alkorta andGarbisu，2001，Bioresour Technol 79：273-276.)。目前为止，尚没有利用转基因技术将漆酶用于植物修复。

漆酶是一种结合多个铜离子的蛋白，是铜蓝氧化酶蛋白家族的一员。漆酶是一种糖蛋白，肽链一般由500个左右氨基酸组成，糖配基占整个分子的10％-45％。漆酶能催化许多化合物的氧化反应，包括许多与对-二酚结构类似的化合物，如氨基苯酚、邻，对-苯二酚、多酚、多胺、木质素和芳基二胺。在反应过程中，漆酶从还原态的底物吸收电子，底物被氧化形成自由基，自由基再进行各式各样的次级反应。由于漆酶具有底物广泛、活性高、寿命长等特点，目前已被应用于造纸及印染脱色等许多行业(Mayer and Staples，2002，Phytochemistry 60：551-565.)。

综上所述，为了改良植物对酚酸类物质的抗性以及利用转基因植物清除土壤中三氯苯酚等环境污染物，本领域迫切需要开发新的漆酶以及相关的转基因植物。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新的漆酶(即棉花漆酶蛋白)及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途，尤其是改良植物对酚酸类物质的抗性以及利用转基因植物清除土壤中三氯苯酚等环境污染物。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的棉花漆酶蛋白，该多肽源自亚洲棉，它包含：具有SEQ ID NO：2中1-566或24-566位的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组：(a)具有SEQ ID NO：2中1-566或24-566位的氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO：2中1-566或24-566位的氨基酸序列经过一个或多个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有漆酶功能的由(a)衍生的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：(a)编码上述棉花漆酶蛋白的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2中1-566位(全长蛋白)或24-566位(去除信号肽的成熟蛋白)所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1中1-2000位的序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中20-1717位的序列；

(c)具有SEQ ID NO：1中89-1717位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备棉花漆酶蛋白的方法，该方法包含：(a)在适合表达的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出棉花漆酶蛋白。

在本发明的第五方面，提供了与上述的棉花漆酶蛋白特异性结合的抗体。

在本发明的第六方面，提供了抗本发明蛋白的抗体以及一种检测样品中是否存在棉花漆酶蛋白的方法，它包括：将样品与棉花漆酶蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在棉花漆酶蛋白。

在本发明的第七方面，提供了一种制备转基因植物的方法，它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有棉花漆酶蛋白DNA编码序列，所述的棉花漆酶蛋白选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2中1-566或24-566位的氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2中1-566或24-566位的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有漆酶功能的由(a)衍生的多肽；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使棉花漆酶蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入棉花漆酶蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

在本发明的第八方面，提供了转入棉花漆酶的转基因植物的用途，用于降解和/或环境中含氯的芳香类化合物(如三氯苯酚)的污染物。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1：GaLACl基因核苷酸序列(SEQ ID NO：1)及推断的蛋白质序列(SEQ IDNO：2)。SEQ ID NO：2中第1-23位为信号肽。

图2：GaLAC1与其他漆酶的同源比较(BLASTP)。结果显示GaLAC1蛋白与几个不同物种的漆酶同源性较高：与烟草(Nicotiana tabacum，JC52294)，拟南芥(Arabidopsis thaliana，T01240)，黄瓜(Cucumis sativus，A30094)和西葫芦(Cucurbita pepo，A51027)漆酶的氨基酸序列同源性分别为45％、44％、28％、28％。

图3：转基因拟南芥Northern和漆酶酶活检测，WT为未转基因拟南芥；4-2，4-3，12-5，14-2，14-5为不同的转GaLAC1基因的拟南芥阳性株系。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次从亚洲棉(Gossypium arboreum L)悬浮细胞cDNA文库中分离到一个编码漆酶的克隆，命名为GaLAC1。体外酶活分析表明，酵母表达的GaLAC1底物广泛，对阿魏酸、芥子酸、丁香酸、香草酸等酚酸类物质都有一定的催化活性。L-半胱氨酸、EDTA、NaF、SDS等铜离子螯合剂都可不同程度地抑制GaLAC1的活性。GaLAC1酶活最适pH约为4.0。

以35S启动子驱动GaLAC1在拟南芥中过量表达，发现高表达GaLAC1转基因拟南芥对芥子酸，丁香酸，香草酸及芥子酸/丁香酸，芥子酸/香草酸等组合表现出比野生型强的抗性。还对抗性产生的机理进行研究后发现，转基因拟南芥的根部可大量分泌GaLAC1，GaLAC1在植物体外可以催化酚酸类物质氧化形成毒性较小且较难进入植物体内的寡聚物。此外，还发现转基因植株对三氯苯酚的抗性增强，而且分泌的GaLAC1可降解三氯苯酚。

在本发明中，术语“棉花漆酶蛋白”、“棉花漆酶”、“GaLAC1蛋白”、“GaLAC1多肽”等可互换使用，都指具有棉花漆酶蛋白全长氨基酸序列(SEQ IDNO：2中1-566位)或成熟氨基酸序列(去除信号肽的成熟蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2中第24-566位)的蛋白或多肽。在未特别指出时，术语“漆酶”包括突变型和野生型漆酶。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的棉花漆酶蛋白或多肽”是指棉花漆酶蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化棉花漆酶蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括棉花漆酶蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然棉花漆酶蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“棉花漆酶蛋白”指具有棉花漆酶蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与漆酶功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括棉花漆酶蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与棉花漆酶蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗棉花漆酶蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含棉花漆酶蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了棉花漆酶蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有棉花漆酶蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供棉花漆酶蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然棉花漆酶蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变-级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“棉花漆酶蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码棉花漆酶蛋白的多聚核苷酸。

本发明的棉花漆酶蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或漆酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的棉花漆酶蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码棉花漆酶蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，棉花漆酶蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含棉花漆酶蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得快速生长性/抗衰老性改变的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明漆酶用多种用途，例如可作为处理土壤污染的活性成分之一，用于土壤调理剂。通常土壤调理剂含有0.01-99重量％的本发明漆酶和余量为农业上可接受的载体以及添加剂。

另一方面，本发明还包括对棉花漆酶蛋白DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段、或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的棉花漆酶蛋白基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达棉花漆酶蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用棉花漆酶蛋白基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与棉花漆酶蛋白基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗棉花漆酶蛋白的抗体可用于检测样品中的棉花漆酶蛋白。

本发明还涉及定量和定位检测棉花漆酶蛋白水平的测试方法。一种检测检测样品中是否存在棉花漆酶蛋白的方法是利用棉花漆酶蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与棉花漆酶蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在棉花漆酶蛋白。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从亚洲棉cDNA文库中分离出的，其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为2000个碱基，其开放读框位于20-1717位，编码全长为566个氨基酸的棉花漆酶蛋白(SEQID NO：2)。

本发明的棉花漆酶具有明确的漆酶活性，底物广泛，对阿魏酸、芥子酸、丁香酸、香草酸等酚酸类物质都有一定的催化活性。转入本发明漆酶基因的转基因植物的根部可大量分泌GaLAC1，GaLAC1在植物体外可以催化酚酸类物质氧化形成毒性较小且较难进入植物体内的寡聚物。此外，分泌的GaLAC1可降解三氯苯酚，导致转基因植株对三氯苯酚的抗性增强。因此，本发明为改良植物(尤其是小麦、水稻等农作物或其他品种如林草、果树、花木等)对酚酸类物质的抗性以及利用转基因植物清除土壤中三氯苯酚等环境污染物提供了新的有效途径，还为农作物克服连作障碍提供了新思路。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)或植物分子生物学-实验手册(PlantMolecular Biology-A Laboratory Mannual，Melody S.Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1棉花GaLAC1基因的克隆

根据漆酶两个保守的铜离子结合域IHWHG，GTLWHAH设计特异性引物5′-gtgccaccacagtgttcc-3′(SEQ ID NO：5)和通用引物T3，以用Stratagen公司的λ-UniZAP试剂盒制备的G.arboreum cDNA文库为模板，进行PCR扩增，PCR产物(约500bp)克隆到pGEM-T载体中，测序，进行网上序列比较表明该克隆片断是漆酶基因。

根据测序结果，合成一对专一引物gdF 5′-gcagatgtacatcactatg-3′(SEQ ID NO：3)和gdR 5′-gatagtacgattccatagg-3′(SEQ ID NO：4)，按以下方法获得棉花GaLAC1基因的克隆：将1μl(约10⁸pfu)cDNA文库梯度稀释后作PCR，确定PCR的最低工作浓度。PCR条件：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，54℃复性30秒，延伸30秒，共28个循环；最后，72℃延伸7分钟。将96孔板用70％乙醇浸泡数小时后，紫外灯照射15-30min，然后在每孔中加入200-300μl LB(含10mMMgSO₄/0.2％麦芽糖)。取适当稀释度的库溶液与400μl XL1-Blue菌液混匀，37℃温和振荡培养30min左右，在每孔中加入4μl混合物。将平板在37℃培养过夜。扩增后，每列8孔各取5μl菌液混匀，共12列做PCR。再取有扩增条带的列的各孔分别做PCR。选择阳性孔再次做下一轮筛选。经4轮筛选后，将噬菌体铺于LB平皿，提取单个噬菌斑到500μl SM溶液中，振荡，PCR鉴定，即获得阳性克隆。

将XL₁-Blue感受态细胞用10mM MgSO₄稀释至OD₆₀₀为1.0。SOLR细胞的制备类似于XL₁-Blue细胞，最后长至OD₆₀₀为0.5-1.0之间。在1.5ml离心管中加入200μl XL1-Blue细胞，200μl阳性噬菌斑SM溶液，1μl ExAssit helper phage(＞1×10⁶pfu/ml，Stratagene)，混匀，37℃温育15min。将混合液转至3ml LB中，37℃振荡培养2-2.5小时。2,000g离心15min，吸出上清。70℃温育15min，4,000g离心15min，吸出上清液。两个1.5ml离心管中各加入200μl新鲜的SOLR细胞，并分别加入上述的上清液100、10μl，37℃温育15min，各取10-50μl铺LB(含100μg/ml Amp)平板，37℃培养过夜。挑单克隆进行鉴定。测序表明该基因是亚洲棉的漆酶基因，命名为GaLAC1。

GaLAC1的序列如SEQ ID NO：1和图1所示，共2000个碱基，其开放读框位于20-1717位，编码全长为566个氨基酸的棉花漆酶蛋白(SEQ ID NO：2和图1)，预测分子量为63.34KDa。序列分析表明：GaLAC1的前23个氨基酸为信号肽，具有4个铜离子结合域，17个推断的糖基化位点。

同源比较发现，GaLAC1蛋白与几个不同物种的漆酶同源性较高：与烟草(Nicotiana tabacum，JC52294)，拟南芥(Arabidopsis thaliana，T01240)，黄瓜(Cucumis sativus，A30094)和西葫芦(Cucurbita pepo，A51027)漆酶的氨基酸序列同源性分别为45％、44％、28％、28％(图2)。

实施例2 GaLAC1在酵母中表达及GaLAC1酶蛋白制备

GaLAC1基因cDNA全长序列用如下方法获得：以抽提的亚洲棉总mRNA经反转录的cDNA为模板，用正向引物LAC1PIC9KFgcg tacgtagatgtacatcactatgaatt(SEQ ID NO：6，含Bam HI酶切位点)和反向引物LAC1PIC9KR gaatgcggccgcctaggttccaggacaacg(SEQ ID NO：7，含XhoI酶切位点)经Pfu聚合酶PCR扩增后，酶切，连接导入pIC9K质粒(购自Invitrogene公司)，测序验证，热激法转入大肠杆菌，挑选阳性克隆，摇菌提取质粒，用BglII限制性内切酶将其线性化。用电激法将线性化的质粒导入酵母菌株Pichia pastorisGS115(购自Invitrogene公司)中，并挑选His⁺Mut^s且高表达GaLAC1的菌株。

a.GaLAC1基因cDNA全长序列用正向引物LAC1PIC9KF(含Bam HI酶切位点)和反向引物LAC1PIC9KR(含XhoI酶切位点)经Pfu聚合酶PCR扩增后，酶切，连接导入pIC9K质粒，测序验证，热激法转入大肠杆菌，挑选阳性克隆，摇菌提取质粒，用BglII限制性内切酶将其线性化。用电激法(1500V，25μF，200Ω)将线性化的质粒导入酵母菌株Pichia pastoris中，在MD培养基上30℃培养2-3天。

b.用无菌牙签挑选转化长出的单克隆菌株点于MM(含0.2mM ABTS和100mM CuCl₂)和MM培养基上，挑选约200个克隆。30℃培养2-3天。

c.在MD培养基上长势良好，MM培养基上生长缓慢而且克隆周围呈现绿色的即为His⁺Mut^s且高表达GaLAC1的菌株。

制备GaLAC1粗酶蛋白

a.挑选高表达的单克隆菌株于300mL BMGY液体培养基中，28℃培养至OD₆₀₀≈2-6。

b.3000×g离心5分钟收菌，重悬于50mL的BMMY液体培养基中，28℃继续培养，每24小时补加250μl的甲醇诱导蛋白表达。

c.6天后，10000×g离心10分钟，取上清。

d.上清用透析袋方法浓缩50倍，所得即为GaLAC1粗制酶，用于酶活分析。

上述步骤中所用的培养基成分如下：

MD：1.34％YNB，4×10^-5％生物素，2％葡萄糖。

MM：1.34％YNB，4×10^-5％生物素，0.5％甲醇。

BMGY：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾pH 6.0，1％甘油。

BMMY：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾pH 6.0，0.5％甲醇。

结果：

在本实施例中选用Pichia pastoris GS115表达系统，一是因为Pichia酵母是真核表达系统，二是因为该系统可将目的蛋白分泌到培养液中。为了检测GaLAC1分泌表达效率，构建了两个表达载体：pPIC9K/GaLAC1和pPIC3K/GaLAC1，其中pPIC9K/GaLAC1表达载体是将GaLAC1 N-端信号肽序列去除并与载体自身信号肽序列融合，而pPIC3K/GaLAC1则含有GaLAC1 N-端信号肽序列而载体自身无信号肽。将两个载体转入Pichiapastoris GS115后，挑选获得了His⁺Mut^s高表达GaLAC1的菌株。表达的棉花漆酶分子量约75KDa，比预测值大，这是因为表达产物为糖蛋白。

ABTS被氧化成自由基后将形成绿色，便于检测，是漆酶研究中常用的特异性底物。以ABTS为底物检测漆酶活性，发现所构建的两个表达菌株的分泌物都可以催化ABTS生成绿色，而与之对应的空载体菌株的培养基则检测不到漆酶活性。

测定GaLAC1的各种酶学特征常数，结果表明：GaLAC1的最佳反应pH值为4.0。GaLAC1对芥子酸(sinapic acid)，丁香酸(syringic acid)等化合物的活性较高，对阿魏酸(ferulic acid)，香草酸(vanillic acid)有较低的活性，而对邻二酚未检测到活性。L-半胱氨酸、EDTA、NaF、SDS等一些铜离子螯合剂对GaLACl酶活有不同程度的抑制。

实施例3 CaMV35S::GaLAC1正义载体构建和农杆菌电转化

用于转化拟南芥的GaLAC1基因由组成型表达的启动子35S驱动。按实施例3相同方法，用正向引物LAC1PIC9KF 5′-gcgtacgtagatgtacatcactatgaatt-3′(SEQ IDNO：6，含Bam HI酶切位点)和反向引物LAC121R 5′-cgcgagctccaagaagagggcacagg-3′(SEQ ID NO：8，含Xho I酶切位点)经Pfu聚合酶PCR扩增后，酶切，连接导入pBI121质粒(购自CLONTECH公司)，热激法转入大肠杆菌，挑选阳性克隆，摇菌提取质粒，测序验证。

-70℃储存的农杆菌GV3101(MP90)(购自CLONTECH公司)，划菌LB平板(Rif100μg/μl，Gentamycin50μg/μl)，28℃培养2天；挑取单菌落于LB液体培养基中，过夜190rpm培养，第二天，放大二十倍，摇至OD＝0.5时(约5-6小时)，4℃5000rpm5分钟收菌，分别用1000毫升，500毫升，50毫升无菌水洗菌，最后收集的菌体重悬于1毫升无菌水中，加入10％甘油，每管40微升分装，-70℃保存。

电转化GV3101感受态细胞冰上解冻后，分别加入质粒混匀转入预冷的电转化杯电击，加入500毫升LB，28℃190RPM摇3小时，涂三抗LB平板(Rif100μg/μl，Kan50μg/μl，Gentamycin50μg/μl)，28℃培养，约三天后挑菌培养并PCR鉴定。

实施例4拟南芥转化及转基因后代的筛选

拟南芥的转化按常规方法，方法如下：生长状况良好的植株用于转化，转化前一天浇足营养液。含目的基因的根瘤农杆菌GV3101在28℃过夜培养到OD₆₀₀≈2.0，5500g离心10min，沉淀溶于新鲜配制的5％蔗糖溶液中至OD₆₀₀≈0.8。再加入0.02％SilwetL-77混匀。每3个pots需要100-200mL上述菌液。转化时地上部分浸于菌液中5秒，确保全部的花苞都被浸泡过。转化过的植株平放于一个密封的小室内以保持湿度，黑暗过夜。第二天即在可正常条件下生长。得到的T0代的种子经20％清洁剂消毒，水洗数遍后，铺于含50μg/mLKan的1/2MS的固体平板上(含0.8％琼脂)。4℃春化48小时，移到人工气候室24小时连续光照条件下生长一周，卡那抗性苗移到土中继续生长。取叶片提取基因组DNA经PCR检测得到阳性苗，再经二代筛选得到转基因的纯系，用于进一步的分析。

结果：

用于转化拟南芥的GaLAC1 cDNA由组成型表达的启动子35S驱动，利用农杆菌介导转入拟南芥后，得到20个纯合株系，

实施例5转基因拟南芥的分子生物学鉴定

在本实施例中，选取实施例4获得的T3代纯合株系(LAC 4-2，LAC 4-3，LAC12-5，LAC 14-2和LAC 14-5)，用包括卡那霉素筛选、PCR、Nouthern杂交，转基因拟南芥的漆酶酶活分析等对转基因拟南芥进行验证。

a.PCR分析

取植物组织0.3g，用液氮磨成细粉，加入裂解缓冲液0.6毫升，充分混匀。加入0.5mL酚氯仿，放置30秒；12000rpm×5分钟，上清转入另一离心管，加50微升的3MNaAc(pH5.2)和600微升的异丙醇。混匀。离心10分钟，溶液溶于100微升含RANase中，37℃处理1小时后用酚：氯仿：异戊醇抽提除去蛋白，上清重新沉淀，离心后沉淀用70％的酒精洗。沉淀最后溶于50微升的TE中。应用引物gdF(SEQ ID NO：3)和gdR(SEQ ID NO：4)进行PCR，复性温度为54℃，35个循环后，电泳检测。

结果：卡那霉素抗性植株扩增出特异条带。

b.Northern分析

取所需的组织用液氮磨成细粉，加1ml Trizol试剂(Invitrogen公司)，混匀并室温静置5分钟。再加入0.2mL氯仿混匀，室温静置3分钟。4℃12000g离心10分钟，上清移至新管加0.5mL异丙醇室温放置10分钟以沉淀RNA，12000g离心10分钟。沉淀用70％乙醇稍洗，RNA溶于一定体积的DEPC处理的水中。

RNA样品处理参考(Ausubel et al.1995)。样品中加入溴乙锭，以便在电泳结束后初步观察同时调整RNA的上样量。每泳道加样量为10μg总RNA，电泳使用1.2％的琼脂糖，1×MOPS电泳缓冲液，电场强度8V/cm，至染料迁移至凝胶的一半时结束。凝胶经20×SSC(氯化钠175.3g/L，柠檬酸钠88.2g/L，用1MHCl调至pH 7.0)平衡45min后，加筑转移平台，在20×SSC中，将RNA转移到Hybond-XL膜上(24小时)。转移结束后，用铅笔在膜上标记出加样孔的位置，并剪去膜的左上角作为标记。膜经6×SSC溶液短暂漂洗后，夹在两层滤纸之间，在80℃烘烤2小时后，密封保存或直接用于杂交。

探针标记

将实施例2的PCR产物经电泳、割胶纯化后，取25ng作为模板标记探针。探针的标记使用Prime-a-Gene Labeling System(Promega)，标记体系为50μL(掺入α-³²P-dCTP)，37℃温浴1小时。标记的探针以QIAquickNucleotide Removal Kit纯化。

预杂交和杂交

将转有总RNA硝酸纤维素膜，浸入10mL预杂交液(成分：50％(W/V)甲酰胺，5×SSC，5×Denhardt试剂，1％(W/V)SDS，100μg/ml变性的鱼精DNA)中，在杂交炉中42℃预杂交2-4小时。将变性后的探针，全部加入上述预杂交液中，42℃杂交24小时。

洗膜与压片

杂交结束后，倒出杂交液。按照以下程序洗膜：

1)2×SSC，0.1％SDS室温洗涤两次，每次5min，

2)0.2×SSC，0.1％SDS室温洗涤两次，每次5min，

3)0.2×SSC，0.1％SDS，42℃洗涤两次，每次15min，

4)2×SSC，室温短暂漂洗。

将膜置于纸巾上，以除去大部分液体。将膜用保鲜膜包裹，平整压于X光片下，附加增感屏，-70℃曝光合适的时间，一般2-3天。按照常规方法冲洗X光片。

结果：对根部的Northern发现，在5个被分析的转基因株系中，LAC 4-3GaLAC1基因表达量稍偏低，其余均较高(图3)。

c.酶活分析

以在平板上生长一周的拟南芥幼苗为材料(约100棵)，只取其根部组织，用液氮磨碎，加入蛋白抽提缓冲液(25mM MOPS，200mM CaCl₂，pH 7.0)，4℃放置4小时，期间轻轻摇动。4℃12000g离心10分钟，上清即为蛋白粗提物，考马斯亮兰法进行蛋白含量测定。以ABTS为底物，测定漆酶活性。

酶活反应条件：在0.5mL的反应体系中，加酶前先加入1000单位的过氧化氢酶，放置2小时后(除去反应体系中的过氧化氢，消除过氧化物酶干扰)，加入10μL的粗制酶，30℃反应30min后，加入50μL的冰醋酸终止反应，用分光光度计在特定的波长下检测反应速度。反应缓冲液为：50mM NaAc，pH 4.5；100μM CuCl₂。

结果：

对根部的酶活检测发现，转GaLAC1拟南芥根部漆酶活性明显提高：LAC4-3株系提高了7倍，其他株系提高了约15倍(图3)。

实施例6垂直板方法分析转基因拟南芥对酚酸类物质和三氯苯酚的抗性

将野生型和转基因种子先在1/2MS培养基上春化两天后置于人工气候室萌发四天(22℃，24小时光照)，用尖头镊子将长势良好的小苗从培养基上轻轻拔出，避免伤根，移至含有不同酚酸类物质和三氯苯酚培养基的垂直板上(含有30μM的铜离子)，在人工气候室先平放1天后，将平板垂直，10天后观察，拍照。

结果：

过量表达GaLAC1拟南芥对酚酸类物质和三氯苯酚表现出高抗性

转基因拟南芥对0.5mM芥子酸，0.5mM丁香酸，0.3mM香草酸豆表现出程度不同的抗性。与野生型相比，转基因拟南芥幼苗在含有酚酸类物质的培养基上根伸长较快。在进行丁香酸的抗性试验时，野生型幼苗被抑制得几乎停止生长，大部分在处理10天后仍只有两片子叶，转基因幼苗(LAC4-2)不但根生长相对较快，而且除子叶外已长出4~5片真叶。在含有同样浓度芥子酸的培养基中生长10天后，转基因幼苗(LAC 4-2)根的长度与空白对照(不含酚酸类)相差无几，而野生型幼苗根的长度不到对照的一半。

漆酶活性强的植株(LAC 4-2，LAC 12-5，LAC 14-5)表现出对酚酸类物质的抗性也强，对丁香酸根的相对伸长率分别是野生型幼苗的3.97，4.67和4.19倍，对芥子酸分别为3.35，3.18和3.15倍，而漆酶活性较弱的株系(LAC 4-3)所表现出的抗性也弱，对丁香酸和芥子酸根的相对伸长率分别是野生型拟南芥幼苗的2.30和2.83倍。

因为在自然界中，他感化合物(allelochemicals)常常是以混合的形式存在的，所以又将几种酚酸类物质进行不同组合做抗性分析。结果转基因植株同样表现出比野生型强出许多的抗性。

用200mg/L的三氯苯酚处理在土中生长两周的植物时，发现转基因植株对三氯苯酚也表现出相当明显的抗性。在第一次喷洒后3天观察，就发现WT拟南芥幼苗有死亡现象，而过量表达GaLAC1拟南芥幼苗则生长状况较好。第一次喷洒后5天喷洒第二次，两周后观察：WT拟南芥植株矮小，结实少，转基因植株虽然也受到一定程度的毒害，但生长状况较野生型要好出许多。

高表达GaLAC1拟南芥对酚酸类物质的抗性机理探讨

GaLAC1是一个胞外漆酶。这些分泌出来的漆酶可以催化游离的芥子酸形成寡聚物，使得植物周围(培养基)中的游离的芥子酸浓度减少，也使得可进入植物体内的芥子酸有效浓度减小，从而达到保护植株的目的。由于漆酶的底物专一性相对较低，对丁香酸，香草酸，阿魏酸都有一定的活性，因此可以将此机制推广到高表达GaLAC1转基因拟南芥对其它酚酸类物质的抗性，诸如丁香酸，香草酸和混合酚酸类物质。推测在土壤中转基因植物的根系可以分泌大量的漆酶，漆酶的存在可以消除土壤中某些酚酸类物质的对植物生长的抑制作用。事实正是如此：种植在土壤中的高表达GaLAC1转基因植物对2mM的丁香酸的抗性较野生型明显增强，从一个方面证实了我们的推测。酚酸化合物是一类植物次生代谢产物，也是常见的他感化合物，当土壤中的酚酸类化合物达到一定浓度时，它们对植物生长发育有明显的抑制作用。关于酚酸类物质抑制植物生长的机理相关报道不多，一是直接作用，植物从土壤中吸收酚酸类物质产生毒害；二是间接作用，土壤中的酚酸类物质影响植物对氮，磷，钾等物质的吸收。

本发明试验结果表明分泌的漆酶可以催化氧化游离的酚酸类物质，从直接作用讲降低了酚酸类物质的有效浓度，从而减少了植物对其的吸收；从间接作用上讲，游离酚酸类物质的降低，也减少了酚酸类物质影响植物对氮，磷，钾等物质的吸收，使得转基因植物对酚酸类物质产生抗性。

实施例7 GaLAC1降解三氯苯酚的活性

在本实施例中，以三氯苯酚为底物，用浓缩的实施例2获得的Pichia培养液进行酶活分析。

HPLC结果表明，GaLAC1对三氯苯酚有明显的生物催化活性。培养24小时后，加入转基因菌株培养液的三氯苯酚降解了75％，而对照菌株培养液蛋白只降解了21.5％。这表明GaLAC1可有效降解三氯苯酚等含氯的芳香类农用化合物。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>棉花漆酶转基因植物及其应用

<130>035739

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2000

<212>DNA

<213>亚洲棉(Gossypium arboreum)

<220>

<221>CDS

<222>(20)..(1717)

<223>

<400>1

aattcggcac gagggagaa atg ggt tta cag caa ggt tta gtg aca tgg ttt 52

Met Gly Leu Gln Gln Gly Leu Val Thr Trp Phe

1 5 10

gta ggg gtt cta ttt cta agc act ttg ctc ctt tcc aat gca gat gta 100

Val Gly Val Leu Phe Leu Ser Thr Leu Leu Leu Ser Asn Ala Asp Val

15 20 25

cat cac tat gaa ttc ttt gtg cga gag tca aat ttt act aag ctg tgc 148

His His Tyr Glu Phe Phe Val Arg Glu Ser Asn Phe Thr Lys Leu Cys

30 35 40

aac aca acg aca ttg ctg gtc gta aac gac agc tat cca ggg cct gag 196

Asn Thr Thr Thr Leu Leu Val Val Asn Asp Ser Tyr Pro Gly Pro Glu

45 50 55

att cgg gtt cac aga ggt gat act gtc ttc gtt aat gtc cac aat caa 244

Ile Arg Val His Arg Gly Asp Thr Val Phe Val Asn Val His Asn Gln

60 65 70 75

gga aac tac ggc ttc acc att cac tgg cac ggc gtg aaa caa ccg agg 292

Gly Asn Tyr Gly Phe Thr Ile His Trp His Gly Val Lys Gln Pro Arg

80 85 90

aat cca tgg tcc gac ggt ccc gag ttc gta acg cag tgc ccc atc caa 340

Asn Pro Trp Ser Asp Gly Pro Glu Phe Val Thr Gln Cys Pro Ile Gln

95 100 105

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Pro Gly Thr Asn Phe Thr Tyr Glu Ile Val Leu Ser Asp Glu Ile Gly

110 115 120

aca ctg tgg tgg cac gca cac agt gac tgg act cgc ggt tcc gtc cat 436

Thr Leu Trp Trp His Ala His Ser Asp Trp Thr Arg Gly Ser Val His

125 130 135

gga gcc ttc gtc att ttg ccg gcc aag aaa gaa act tat ccg ttc ccc 484

Gly Ala Phe Val Ile Leu Pro Ala Lys Lys Glu Thr Tyr Pro Phe Pro

140 145 150 155

acg cca gac gcc gat caa act atc ata ctt gaa tca tgg tac gat ggg 532

Thr Pro Asp Ala Asp Gln Thr Ile Ile Leu Glu Ser Trp Tyr Asp Gly

160 165 170

gac tac aag caa att att gat gac gca ctt gcc gcc ggt gtc tct cct 580

Asp Tyr Lys Gln Ile Ile Asp Asp Ala Leu Ala Ala Gly Val Ser Pro

175 180 185

cgc caa cca agt gct tat gct atc agt gga cac gtc gga gac aca tat 628

Arg Gln Pro Ser Ala Tyr Ala Ile Ser Gly His Val Gly Asp Thr Tyr

190 195 200

gga tgc ccc aat gat aca ata ttc cgt atg caa gtt gat tct gag aag 676

Gly Cys Pro Asn Asp Thr Ile Phe Arg Met Gln Val Asp Ser Glu Lys

205 210 215

ata tac ctt ctc cga ata att aac gct gca atg aac gaa cat ttt ttc 724

Ile Tyr Leu Leu Arg Ile Ile Asn Ala Ala Met Asn Glu His Phe Phe

220 225 230 235

ttc acc atc gcg aac cac acc ctc aca gtc gtc gca caa gat gcc tcc 772

Phe Thr Ile Ala Asn His Thr Leu Thr Val Val Ala Gln Asp Ala Ser

240 245 250

tat gtt cga agg ttt acg agg gac tat ata ttg ata agc cct ggc caa 820

Tyr Val Arg Arg Phe Thr Arg Asp Tyr Ile Leu Ile Ser Pro Gly Gln

255 260 265

acc atg gat gtt ttg gtc tct gcc aat cga aac gtt ggc caa tat tac 868

Thr Met Asp Val Leu Val Ser Ala Asn Arg Asn Val Gly Gln Tyr Tyr

270 275 280

atg gct att agg cct ttc tct gat tcc tct gct gca cct gtt gac aac 916

Met Ala Ile Arg Pro Phe Ser Asp Ser Ser Ala Ala Pro Val Asp Asn

285 290 295

atc act act ggc att ttt gaa tat aca aac agt gag ggc gga ttg aat 964

Ile Thr Thr Gly Ile Phe Glu Tyr Thr Asn Ser Glu Gly Gly Leu Asn

300 305 310 315

gct tcc ttg ata acg ttg ccc gta atg aac gat aca gat gct atg att 1012

Ala Ser Leu Ile Thr Leu Pro Val Met Asn Asp Thr Asp Ala Met Ile

320 325 330

aac ttc cta aac caa att cgg aac acg aaa gtc tcc cag aat ccg cgg 1060

Asn Phe Leu Asn Gln Ile Arg Asn Thr Lys Val Ser Gln Asn Pro Arg

335 340 345

ata aat gtg ccg gca gat aag gat att aaa aga cga gtg ttc atg aca 1108

Ile Asn Val Pro Ala Asp Lys Asp Ile Lys Arg Arg Val Phe Met Thr

350 355 360

ctc gcg gta aac aac ttg cct tgc aac acc tgt gtt gta ggc agc aga 1156

Leu Ala Val Asn Asn Leu Pro Cys Asn Thr Cys Val Val Gly Ser Arg

365 370 375

ctt gtt gca agt ttg aac aat gta agc tat gtt tcc cca agt att gac 1204

Leu Val Ala Ser Leu Asn Asn Val Ser Tyr Val Ser Pro Ser Ile Asp

380 385 390 395

att ctc caa gca tac tac aac agg aac atg agt ggt gtt tac acc gaa 1252

Ile Leu Gln Ala Tyr Tyr Asn Arg Asn Met Ser Gly Val Tyr Thr Glu

400 405 410

gat ttt cca ttg aat ccc cca gta atc tat gat ttc act gga aac ttg 1300

Asp Phe Pro Leu Asn Pro Pro Val Ile Tyr Asp Phe Thr Gly Asn Leu

415 420 425

act aat ctc aat acc cct gtt gag gaa ggg acg agg gta ata gtg gta 1348

Thr Asn Leu Asn Thr Pro Val Glu Glu Gly Thr Arg Val Ile Val Val

430 435 440

aat tat ggg gaa gga gtt gag atg gtg ctg caa gca acc cag atg ggg 1396

Asn Tyr Gly Glu Gly Val Glu Met Val Leu Gln Ala Thr Gln Met Gly

445 450 455

gct ggt gga agt cac cca atc cat ttg cac ggt tct agc ttc tat tgg 1444

Ala Gly Gly Ser His Pro Ile His Leu His Gly Ser Ser Phe Tyr Trp

460 465 470 475

gtg gga aca ggt ttc gga aat ttc aac aat aag aca gac cca agg act 1492

Val Gly Thr Gly Phe Gly Asn Phe Asn Asn Lys Thr Asp Pro Arg Thr

480 485 490

tat aat ctg gtt gat cca cca ctc att aac act gtc cat gtt cct ggt 1540

Tyr Asn Leu Val Asp Pro Pro Leu Ile Asn Thr Val His Val Pro Gly

495 500 505

aga aga tgg gtt gcc atc aga ttt ttt gct acc aat ccc gga gta tgg 1588

Arg Arg Trp Val Ala Ile Arg Phe Phe Ala Thr Asn Pro Gly Val Trp

510 515 520

ttt atg cat tgc cat ttg gag agg cat agt agc tgg gga atg gac act 1636

Phe Met His Cys His Leu Glu Arg His Ser Ser Trp Gly Met Asp Thr

525 530 535

gtt ctc atc gtg agg aat ggt aaa acc aag aaa aca agc atc cgc cca 1684

Val Leu Ile Val Arg Asn Gly Lys Thr Lys Lys Thr Ser Ile Arg Pro

540 545 550 555

ccg cca tct acc atg cct cgt tgt cct gga acc tagaactact acaagcatag 1737

Pro Pro Ser Thr Met Pro Arg Cys Pro Gly Thr

560 565

aattaacaca tacatacata cacacaagta gtttctagat ttacattttt aataagaata 1797

aaattcctgt gccctcttct tggtccacca atcttttttc acatgtgtac aagtaaatga 1857

atagagttga taatgttttt cgtctccaga aaactttagc ctctgggcac aatttatttt 1917

ctgggtttta tgtattcttt taactcatca tctaaatttc aattttaaga aatcatcttt 1977

ctatcaaaaa aaaaaaaaaa aaa 2000

<210>2

<211>566

<212>PRT

<213>亚洲棉(Gossypium arboreum)

<400>2

Met Gly Leu Gln Gln Gly Leu Val Thr Trp Phe Val Gly Val Leu Phe

1 5 10 15

Leu Ser Thr Leu Leu Leu Ser Asn Ala Asp Val His His Tyr Glu Phe

20 25 30

Phe Val Arg Glu Ser Ash Phe Thr Lys Leu Cys Ash Thr Thr Thr Leu

35 40 45

Leu Val Val Asn Asp Ser Tyr Pro Gly Pro Glu Ile Arg Val His Arg

50 55 60

Gly Asp Thr Val Phe Val Asn Val His Asn Gln Gly Asn Tyr Gly Phe

65 70 75 80

Thr Ile His Trp His Gly Val Lys Gln Pro Arg Asn Pro Trp Ser Asp

85 90 95

Gly Pro Glu Phe Val Thr Gln Cys Pro Ile Gln Pro Gly Thr Asn Phe

100 105 110

Thr Tyr Glu Ile Val Leu Ser Asp Glu Ile Gly Thr Leu Trp Trp His

115 120 125

Ala His Ser Asp Trp Thr Arg Gly Ser Val His Gly Ala Phe Val Ile

130 135 140

Leu Pro Ala Lys Lys Glu Thr Tyr Pro Phe Pro Thr Pro Asp Ala Asp

145 150 155 160

Gln Thr Ile Ile Leu Glu Ser Trp Tyr Asp Gly Asp Tyr Lys Gln Ile

165 170 175

Ile Asp Asp Ala Leu Ala Ala Gly Val Ser Pro Arg Gln Pro Ser Ala

180 185 190

Tyr Ala Ile Ser Gly His Val Gly Asp Thr Tyr Gly Cys Pro Asn Asp

195 200 205

Thr Ile Phe Arg Met Gln Val Asp Ser Glu Lys Ile Tyr Leu Leu Arg

210 215 220

Ile Ile Asn Ala Ala Met Asn Glu His Phe Phe Phe Thr Ile Ala Asn

225 230 235 240

His Thr Leu Thr Val Val Ala Gln Asp Ala Ser Tyr Val Arg Arg Phe

245 250 255

Thr Arg Asp Tyr Ile Leu Ile Ser Pro Gly Gln Thr Met Asp Val Leu

260 265 270

Val Ser Ala Asn Arg Asn Val Gly Gln Tyr Tyr Met Ala Ile Arg Pro

275 280 285

Phe Ser Asp Ser Ser Ala Ala Pro Val Asp Asn Ile Thr Thr Gly Ile

290 295 300

Phe Glu Tyr Thr Asn Ser Glu Gly Gly Leu Asn Ala Ser Leu Ile Thr

305 310 315 320

Leu Pro Val Met Asn Asp Thr Asp Ala Met Ile Asn Phe Leu Asn Gln

325 330 335

Ile Arg Asn Thr Lys Val Ser Gln Asn Pro Arg Ile Ash Val Pro Ala

340 345 350

Asp Lys Asp Ile Lys Arg Arg Val Phe Met Thr Leu Ala Val Asn Asn

355 360 365

Leu Pro Cys Asn Thr Cys Val Val Gly Ser Arg Leu Val Ala Ser Leu

370 375 380

Asn Asn Val Ser Tyr Val Ser Pro Ser Ile Asp Ile Leu Gln Ala Tyr

385 390 395 400

Tyr Asn Arg Asn Met Ser Gly Val Tyr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Asn

405 410 415

Pro Pro Val Ile Tyr Asp Phe Thr Gly Asn Leu Thr Asn Leu Asn Thr

420 425 430

Pro Val Glu Glu Gly Thr Arg Val Ile Val Val Asn Tyr Gly Glu Gly

435 440 445

Val Glu Met Val Leu Gln Ala Thr Gln Met Gly Ala Gly Gly Ser His

450 455 460

Pro Ile His Leu His Gly Ser Ser Phe Tyr Trp Val Gly Thr Gly Phe

465 470 475 480

Gly Asn Phe Asn Asn Lys Thr Asp Pro Arg Thr Tyr Asn Leu Val Asp

485 490 495

Pro Pro Leu Ile Asn Thr Val His Val Pro Gly Arg Arg Trp Val Ala

500 505 510

Ile Arg Phe Phe Ala Thr Asn Pro Gly Val Trp Phe Met His Cys His

515 520 525

Leu Glu Arg His Ser Ser Trp Gly Met Asp Thr Val Leu Ile Val Arg

530 535 540

Asn Gly Lys Thr Lys Lys Thr Ser Ile Arg Pro Pro Pro Ser Thr Met

545 550 555 560

Pro Arg Cys Pro Gly Thr

565

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<223>引物

<400>3

gcagatgtac atcactatg 19

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<223>引物

<400>4

gatagtacga ttccatagg 19

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(18)

<223>引物

<400>5

gtgccaccac agtgttcc 18

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(29)

<223>引物

<400>6

gcgtacgtag atgtacatca ctatgaatt 29

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(30)

<223>引物

<400>7

gaatgcggcc gcctaggttc caggacaacg 30

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(26)

<223>引物

<400>8

cgcgagctcc aagaagaggg cacagg 26

Claims

1.一种分离的棉花漆酶蛋白，其特征在于，它是含有SEQ ID N0：2中1-566或24-566位的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽。

2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，该蛋白选自下组：

(a)具有SEQ ID N0：2中1-566或24-566位的氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID N0：2中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有漆酶功能的由(a)衍生的多肽。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列编码权利要求1所述的蛋白。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO：2中1-566或24-566位所示氨基酸序列的多肽。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1中1-2000位的序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中20-1717位的序列；

(c)具有SEQ ID NO：1中89-1717位的序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体或基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。

8.一种棉花漆酶蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出棉花漆酶蛋白。

9.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，它包括步骤：

(a)具有SEQ ID N0：2中1-566或24-566位的氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID N0：2中1-566或24-566位的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有漆酶功能的由(a)衍生的多肽；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

10.用如权利要求9所述方法获得的转基因植物的用途，其特征在于，用于降解和/或环境中三氯苯酚污染物。