CN104634850A - 漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，更具体涉及漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用。具体是将漆酶应用于蛋白凝胶电泳中常规染色后的脱色。本发明的目的是利用漆酶进行染色蛋白凝胶的脱色，环保、快速、简便，不需要有机溶剂，节约能源，降低染料废水的污染。本发明利用漆酶进行蛋白凝胶脱色，脱色快速（2小时可获得低背景的清晰蛋白条带），操作简便（不需要沸腾或更换脱色液）且环保（不使用传统脱色液所需的有机溶剂如甲醇、乙酸，在脱色的同时实现染料降解，无废液处理问题及费用）。通过优化漆酶浓度、介体种类和浓度、脱色时间等因素，在较短时间内获得了良好的脱色效果，操作简便且绿色环保。

Description

漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用。

背景技术

漆酶（laccase, EC 1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在于高等植物、真菌和昆虫中，其中白腐真菌被认为是目前最高效的漆酶生产者。漆酶是一种绿色环保酶，漆酶通过氧化反应，使底物失去电子形成自由基，而失去的电子又传递给分子氧形成水。漆酶的底物范围很广，可以催化多种芳香族化合物的氧化，但是漆酶对不同染料的作用效果不同，取决于漆酶的性质和染料的结构。小分子漆酶介体，如ABTS（2,2-azinobis- (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)、HBT（1-hydroxybenzotriazole）、丁香醛（syringaldehyde, SYD）、乙酰丁香酮（acetosyringone, ACE）和丁香酸（syringic acid, SYA）等可以拓宽漆酶的底物范围或提高催化速度。漆酶的低底物特异性使其在废水处理、纸浆漂白、生物能源、食品加工、生物修复等领域中有着广泛而重要的应用前景。

蛋白质的聚丙烯酰胺凝电泳（polyacrylamide gel electrophoresis）是当代实验室蛋白质分析和检测最常用技术之一。电泳结束后将凝胶浸泡在染料中，随后通过溶剂洗去多余染料（“脱色”），使蛋白条带直接显示。常采用考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue, CBB）R-250或G-250进行染色。常用的染色液和脱色液中含有甲醇、冰醋酸等有机溶剂。要获得较好的脱色效果，需要较长脱色时间（过夜），并更换多次脱色液，会产生大量的（有机）染料废液，若直接排放会造成污染。到目前为止，漆酶对染料废水脱色的研究局限于水溶液环境。本发明尝试将漆酶用于蛋白凝胶（固体）的脱色，使蛋白条带在清晰背景上显示，便于观察。

发明内容

本发明提供了一种漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，利用漆酶进行染色蛋白凝胶的脱色，环保、快速、简便，不需要有机溶剂，节约能源，降低染料废水的污染。

本发明的漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，将漆酶应用于蛋白凝胶电泳中常规染色后的脱色，并在脱色的同时实现染料的降解。

漆酶的应用方式包括漆酶或漆酶/介体系统。

所述蛋白凝胶电泳包括，但不局限于十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。

所述蛋白染料包括，但不局限于考马斯亮蓝R250和G250。

所述漆酶包括，但不局限于真菌、细菌来源漆酶。

所述介体包括，但不局限于ABTS、HBT、ACE、SYA、SYD。

本发明的技术方案详述如下：

本发明涉及高产漆酶的白腐真菌齿毛菌（Cerrena sp.）HYB07菌株（参考文献：Yang J, Lin Q, Ng T B, Ye X, Lin J. Purification and characterization of a novel laccase from Cerrena sp. HYB07 with dye decolorizing ability. PLoS ONE, 2014, 9: e110834）。

本发明涉及利用齿毛菌HYB07菌株发酵生产漆酶。

本发明还涉及利用齿毛菌HYB07菌株的发酵液对蛋白凝胶进行脱色。将发酵液稀释后直接用于蛋白凝胶的脱色，在不使用有机溶剂、不更换脱色液、较低温度的条件下获得满意的脱色效果，并在脱色同时实现染料降解。

本发明的脱色条件为：在温度25 ℃-45 ℃、漆酶酶活12 -18 U/mL、介体浓度1 μM-3 μM、脱色时间1 h-2 h。

更优选的脱色条件为：在温度40 ℃、漆酶酶活15 U/mL、介体浓度2 μM、脱色时间2 h。

本发明利用漆酶进行蛋白凝胶脱色，脱色快速（2小时可获得低背景的清晰蛋白条带），操作简便（不需要沸腾或更换脱色液）且环保（不使用传统脱色液所需的有机溶剂如甲醇、乙酸，在脱色的同时实现染料降解，无废液处理问题及费用）。通过优化漆酶浓度、介体种类和浓度、脱色时间等因素，在较短时间内获得了良好的脱色效果，操作简便且绿色环保。

附图说明

图1为漆酶对不同种类染料脱色效果的影响。从1~12依次是：考马斯亮蓝R250、甲基橙、甲基红、碱性品红、溴百里香酚蓝、中性红、结晶紫、酸性品红、刚果红、溴甲酚绿、亚甲基蓝、玫瑰红B）。

图2为考马斯亮蓝R250经漆酶脱色处理前后的UV-visible全波长扫描。

图3为不同介体对蛋白凝胶脱色效果的影响。从1~5依次是：ACE（20 μM）、SYA（20 μM）、HBT（20 μM）、ABTS（2 μM）、SYD（20 μM）。

图4为漆酶/ABTS系统中不同温度对蛋白凝胶脱色效果的影响。从1~6依次是：20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40℃、45℃。

图5为漆酶/ABTS系统中漆酶酶活对蛋白凝胶脱色效果的影响。从1~6依次是：酶浓度3 U/mL、6 U/mL、9 U/mL、12 U/mL、15 U/mL、18 U/mL。

图6为介体ABTS浓度对蛋白凝胶脱色效果的影响。从1~6依次是：ABTS浓度 0.5 μM、1 μM、1.5 μM、2 μM、3 μM、4 μM。

图7为漆酶/ABTS系统中漆酶脱色时间对蛋白凝胶脱色效果的影响。从1~4依次是：0.5 h、1 h、1.5 h、2 h。

图8为漆酶/ABTS脱色系统的检测灵敏性。从1~9依次是：1000 ng、500 ng、250 ng、100 ng、80 ng、60 ng、40 ng、20 ng、10 ng。

图9为漆酶/ABTS脱色系统与不同脱色体系试验对比。从1~5依次是：柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液（pH 7.0）、40 ℃、漆酶酶活15 U/mL、ABTS 2 μM、脱色2h；dH₂O、温度40 ℃、漆酶酶活15 U/mL、ABTS 2 μM、脱色2h；Dong et al. (2011)中描述的试验方案（蛋白凝胶染色后置于dH₂O中煮沸30~60s，更换dH₂O后再次煮沸，并重复多次）；在dH₂O、40 ℃条件下脱色2 h；在柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液（pH 7.0）、40 ℃条件下脱色2 h。

图10为漆酶/ABTS对大肠杆菌裂解液总蛋白电泳的脱色。1，蛋白marker；2，IPTG诱导前BL21大肠杆菌裂解液总蛋白；3，IPTG诱导后BL21大肠杆菌裂解液总蛋白。

具体实施方式

以下根据具体的实施例充分说明本发明，但是本发明不仅限于此。

1. 菌株

菌株来源于白腐真菌齿毛菌（Cerrena unicolor）HYB07菌株（参考文献：Yang J, Lin Q, Ng T B, Ye X, Lin J. Purification and characterization of a novel laccase from Cerrena sp. HYB07 with dye decolorizing ability. PLoS ONE, 2014, 9: e110834）。大肠杆菌BL21购自北京全式金生物技术有限公司。

2. 试剂

蛋白marker购自宝生物工程(大连)有限公司，ABTS购自Sigma-Aldrich公司，考马斯亮蓝R250购自生工生物工程(上海)股份有限公司，BSA购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

3. 培养基

种子培养基：PDA液体培养基。

液体产酶培养基（g/L）：麦芽糊精60，蛋白胨15，酒石酸铵2，KH₂PO₄ 6，MgSO₄·7H₂O 4.14， CaCl₂ 0.3，NaCl 0.18，CuSO₄·5H₂O 0.0625，ZnSO₄·7H₂O 0.018，and vitamin B1 0.015。

4. 本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均参照以下实验手册中的相关章节或部分进行，包括：[美]J.莎姆布鲁克等，分子克隆实验指南（第三版）；沈萍等，微生物学实验（第三版）。

5. 漆酶活性采用以下方法检测：反应体系4.0 mL，其中含1.95 mL 0.1 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 3.0）、2.00 mL 0.5 mmol/L ABTS溶液和50 μL酶液。30°C恒温水浴反应，测定反应前5 min反应体系在420 nm处吸光度的增加值ΔOD。以灭活的酶液作为空白对照。酶活定义：在上述条件下，每min催化氧化1 μmol ABTS所需的酶量为1个酶活力单位(U)。

6. 漆酶发酵液的获得参照以下进行：取斜面保藏的Cerrena unicolor HYB07菌株接种于PDA固体平板，30 ℃恒温培养，活化3 d。菌株经PDA平板活化后，用5 mm打孔器打出5块菌饼，接种于液体种子培养基（装液量为100 mL/250 mL），200 r/min，30 ℃培养2 d，制成一级种子液。将一级种子液以6 %(v/v)的接种量接入到二级种子液培养基中，装液量为150 mL/500 mL，200 r/min，30℃恒温培养2 d。将二级种子液以6%(v/v)的接种量接入到液体产酶培养基中，装液量为50 mL/250 mL，30 ℃, 200 r/min恒温摇瓶发酵6 d。采用8000 r/min离心5 min分离菌丝体和发酵液。

7. SDS-PAGE：使用美国Bio-Rad的Mini-PROTEAN蛋白电泳系统。浓缩胶5 %，分离胶12 %。

8. 蛋白凝胶染色：将考马斯亮蓝CBB溶于蒸馏水配制成浓度为0.5 g/L的染色液。将蛋白凝胶置于染色液中煮沸1 min。（参考文献：Dong WH, Wang TY, Wang F, Zhang JH. Simple, time-saving dye staining of proteins for sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis using Coomassie blue. PLoS ONE, 2011, 8: e22394）。

9. 除非特殊说明，蛋白凝胶脱色体系含50 mL脱色液，脱色条件为40℃、50 r/min，脱色时间2 h。

实施例1 HYB07漆酶对不同染料的脱色

（1）将HYB07漆酶用于12种不同染料（考马斯亮蓝R250、甲基橙、甲基红、碱性品红、溴百里香酚蓝、中性红、结晶紫、酸性品红、刚果红、溴甲酚绿、亚甲基蓝、玫瑰红B）的脱色。脱色体系2 mL，含有50 mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH 6.0）、染料（25-200 mg/L）和酶（2 U/mL），室温下脱色24 h。从图1可知，经漆酶处理后，考马斯亮蓝脱色率最高，达92.37%。

（2）对漆酶脱色前后的考马斯亮蓝R250溶液进行全波长扫描。从图2可见，脱色后染料的吸收峰降低。

实施例2 利用漆酶/介体系统进行蛋白凝胶的脱色

（1）介体种类对蛋白凝胶脱色的影响

在pH 7.0、20 U/mL漆酶、条件下，检测不同漆酶介体，包括ACE (20 μM)、SYA (20 μM)、HBT (20 μM)、ABTS (2 μM)和SYD (20 μM)对蛋白凝胶脱色的影响。从图3 可知，ABTS作为介体效果最好。

（2）温度对蛋白凝胶脱色的影响

在pH 7.0、酶浓度20 U/mL，ABTS 2 μM条件下，研究不同温度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40℃、45℃）对蛋白凝胶脱色的影响。从图4可知，40 ℃为脱色最适温度。

（3）漆酶酶活对蛋白凝胶脱色的影响

在pH 7.0、温度40 ℃条件下，研究漆酶酶活（3 U/mL、6 U/mL、9 U/mL、12 U/mL、15 U/mL、18 U/mL）对蛋白凝胶脱色的影响。从图5中可知，15 U/mL 条件下脱色效果最好。

（4）介体浓度对蛋白凝胶脱色的影响

在pH 7.0、温度40 ℃、漆酶酶活15 U/mL条件下，研究不同介体浓度（0.5 μM、1 μM、1.5 μM、2 μM、3 μM、4 μM）对蛋白凝胶脱色的影响。从图6中可知，介体浓度为2 μM脱色效果最好。

（5）脱色时间对蛋白凝胶脱色的影响

在pH 7.0、温度40 ℃、漆酶酶活15 U/mL、ABTS 2 μM条件下，研究不同脱色时间（0.5 h、1 h、1.5 h、2 h）对蛋白凝胶脱色的影响。从图7可知，脱色2 h条件下脱色效果最好。

实施例3 漆酶/介体脱色系统的检测灵敏性

（1）在pH 7.0、温度40 ℃、漆酶酶活15 U/mL、ABTS 2 μM条件下脱色2h，检测漆酶/介体脱色系统的检测灵敏性。从图8可知，BSA低至10 ng仍能检测到。

（2）比较不同脱色方法的效果。从图9可以看出，漆酶/介体脱色系统脱色效果最好，脱色液用缓冲液或蒸馏水配制差别不大。直接采用水煮沸脱色，易造成蛋白信号的损失。40 ℃下只用水或缓冲液脱色2 h，背景较高，表明，漆酶不仅只降解溶液中的R-250，也有加速蛋白凝胶脱色的效果。与蛋白质结合的染料，不易被漆酶降解，从而使蛋白条带可以在清晰背景上显示。

实施例4 漆酶/介体系统对复杂蛋白条带的脱色

在实施例2中的优化条件下，利用漆酶/介体系统检测BL21大肠杆菌裂解液蛋白。从图10可知，漆酶/介体系统对复杂蛋白样品凝胶电泳的脱色也具有较好的效果。

Claims (9)

1.一种漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，其特征在于：将漆酶应用于蛋白凝胶电泳中常规染色后的脱色。

2.根据权利要求1所述的漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，其特征在于：所述漆酶的应用方式为漆酶或漆酶/介体系统。

3.根据权利要求1所述的漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，其特征在于：所述染色所用染料包括考马斯亮蓝R250和G250。

4.根据权利要求1所述的漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，其特征在于：所述蛋白凝胶电泳包括十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。

5.根据权利要求2所述的漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，其特征在于：所述介体包括ABTS、HBT、ACE、SYA、SYD。

6.根据权利要求1所述的漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，其特征在于：所述介体为ABTS。

7.根据权利要求1所述的漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，其特征在于：所述漆酶来源于白腐真菌齿毛菌（Cerrena sp.）HYB07。

8.根据权利要求1所述的漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，其特征在于：脱色条件为：在温度25 ℃-45 ℃、漆酶酶活12 -18 U/mL、介体浓度1 μM-3 μM、脱色时间1 h-2 h。

9.根据权利要求8所述的漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，其特征在于：脱色条件为：在温度40 ℃、漆酶酶活15 U/mL、介体浓度2 μM、脱色时间2 h。