CN109060926A - 漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用 - Google Patents

漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用 Download PDF

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杨捷
杨晓丹
林娟
叶秀云
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本发明属于生物技术领域，更具体涉及漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用。具体是将漆酶应用于蛋白凝胶电泳中常规染色后的脱色。本发明的目的是利用漆酶进行染色蛋白凝胶的脱色，环保、快速、简便，不需要有机溶剂，节约能源，降低染料废水的污染。本发明利用漆酶进行蛋白凝胶脱色，脱色快速(2小时可获得低背景的清晰蛋白条带)，操作简便(不需要沸腾或更换脱色液)且环保(不使用传统脱色液所需的有机溶剂如甲醇、乙酸，在脱色的同时实现染料降解，无废液处理问题及费用)。通过优化漆酶浓度、介体种类和浓度、脱色时间等因素，在较短时间内获得了良好的脱色效果，操作简便且绿色环保。

Description

漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用
本申请是申请号为201510068601.0，发明名称为“漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用”、申请日为2015年02月10日的母案申请的分案申请。
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体涉及漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用。
背景技术
漆酶(laccase,EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在于高等植物、真菌和昆虫中，其中白腐真菌被认为是目前最高效的漆酶生产者。漆酶是一种绿色环保酶，漆酶通过氧化反应，使底物失去电子形成自由基，而失去的电子又传递给分子氧形成水。漆酶的底物范围很广，可以催化多种芳香族化合物的氧化，但是漆酶对不同染料的作用效果不同，取决于漆酶的性质和染料的结构。小分子漆酶介体，如ABTS(2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)、HBT(1-hydroxybenzotriazole)、丁香醛(syringaldehyde,SYD)、乙酰丁香酮(acetosyringone,ACE)和丁香酸(syringic acid,SYA)等可以拓宽漆酶的底物范围或提高催化速度。漆酶的低底物特异性使其在废水处理、纸浆漂白、生物能源、食品加工、生物修复等领域中有着广泛而重要的应用前景。
蛋白质的聚丙烯酰胺凝电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis)是当代实验室蛋白质分析和检测最常用技术之一。电泳结束后将凝胶浸泡在染料中，随后通过溶剂洗去多余染料(“脱色”)，使蛋白条带直接显示。常采用考马斯亮蓝(CoomassieBrilliantBlue,CBB)R-250或G-250进行染色。常用的染色液和脱色液中含有甲醇、冰醋酸等有机溶剂。要获得较好的脱色效果，需要较长脱色时间(过夜)，并更换多次脱色液，会产生大量的(有机)染料废液，若直接排放会造成污染。到目前为止，漆酶对染料废水脱色的研究局限于水溶液环境。本发明尝试将漆酶用于蛋白凝胶(固体)的脱色，使蛋白条带在清晰背景上显示，便于观察。
发明内容
本发明提供了一种漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，利用漆酶进行染色蛋白凝胶的脱色，环保、快速、简便，不需要有机溶剂，节约能源，降低染料废水的污染。
本发明的漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，将漆酶应用于蛋白凝胶电泳中常规染色后的脱色，并在脱色的同时实现染料的降解。
漆酶的应用方式包括漆酶或漆酶/介体系统。
所述蛋白凝胶电泳包括，但不局限于十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
所述蛋白染料包括，但不局限于考马斯亮蓝R250和G250。
所述漆酶包括，但不局限于真菌、细菌来源漆酶。
所述介体包括，但不局限于ABTS、HBT、ACE、SYA、SYD。
本发明的技术方案详述如下：
本发明涉及高产漆酶的白腐真菌齿毛菌(Cerrena sp.)HYB07菌株(参考文献：Yang J,Lin Q,Ng T B,Ye X,Lin J.Purification and characterization of a novellaccase from Cerrena sp.HYB07with dye decolorizing ability.PLoS ONE,2014,9:e110834)。
本发明涉及利用齿毛菌HYB07菌株发酵生产漆酶。
本发明还涉及利用齿毛菌HYB07菌株的发酵液对蛋白凝胶进行脱色。将发酵液稀释后直接用于蛋白凝胶的脱色，在不使用有机溶剂、不更换脱色液、较低温度的条件下获得满意的脱色效果，并在脱色同时实现染料降解。
本发明的脱色条件为：在温度25℃-45℃、漆酶酶活12-18U/mL、介体浓度1μM-3μM、脱色时间1h-2h。
更优选的脱色条件为：在温度40℃、漆酶酶活15U/mL、介体浓度2μM、脱色时间2h。
本发明利用漆酶进行蛋白凝胶脱色，脱色快速(2小时可获得低背景的清晰蛋白条带)，操作简便(不需要沸腾或更换脱色液)且环保(不使用传统脱色液所需的有机溶剂如甲醇、乙酸，在脱色的同时实现染料降解，无废液处理问题及费用)。通过优化漆酶浓度、介体种类和浓度、脱色时间等因素，在较短时间内获得了良好的脱色效果，操作简便且绿色环保。
附图说明
图1为漆酶对不同种类染料脱色效果的影响。从1～12依次是：考马斯亮蓝R250、甲基橙、甲基红、碱性品红、溴百里香酚蓝、中性红、结晶紫、酸性品红、刚果红、溴甲酚绿、亚甲基蓝、玫瑰红B)。
图2为考马斯亮蓝R250经漆酶脱色处理前后的UV-visible全波长扫描。
图3为不同介体对蛋白凝胶脱色效果的影响。从1～5依次是：ACE(20μM)、SYA(20μM)、HBT(20μM)、ABTS(2μM)、SYD(20μM)。
图4为漆酶/ABTS系统中不同温度对蛋白凝胶脱色效果的影响。从1～6依次是：20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃。
图5为漆酶/ABTS系统中漆酶酶活对蛋白凝胶脱色效果的影响。从1～6依次是：酶浓度3U/mL、6U/mL、9U/mL、12U/mL、15U/mL、18U/mL。
图6为介体ABTS浓度对蛋白凝胶脱色效果的影响。从1～6依次是：ABTS浓度0.5μM、1μM、1.5μM、2μM、3μM、4μM。
图7为漆酶/ABTS系统中漆酶脱色时间对蛋白凝胶脱色效果的影响。从1～4依次是：0.5h、1h、1.5h、2h。
图8为漆酶/ABTS脱色系统的检测灵敏性。从1～9依次是：1000ng、500ng、250ng、100ng、80ng、60ng、40ng、20ng、10ng。
图9为漆酶/ABTS脱色系统与不同脱色体系试验对比。从1～5依次是：柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(pH 7.0)、40℃、漆酶酶活15U/mL、ABTS 2μM、脱色2h；dH2O、温度40℃、漆酶酶活15U/mL、ABTS 2μM、脱色2h；Dong et al.(2011)中描述的试验方案(蛋白凝胶染色后置于dH2O中煮沸30～60s，更换dH2O后再次煮沸，并重复多次)；在dH2O、40℃条件下脱色2h；在柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(pH 7.0)、40℃条件下脱色2h。
图10为漆酶/ABTS对大肠杆菌裂解液总蛋白电泳的脱色。1，蛋白marker；2，IPTG诱导前BL21大肠杆菌裂解液总蛋白；3，IPTG诱导后BL21大肠杆菌裂解液总蛋白。
具体实施方式
以下根据具体的实施例充分说明本发明，但是本发明不仅限于此。
1.菌株
菌株来源于白腐真菌齿毛菌(Cerrena unicolor)HYB07菌株(参考文献：Yang J,Lin Q,Ng T B,Ye X,Lin J.Purification and characterization ofa novel laccasefrom Cerrena sp.HYB07with dye decolorizing ability.PLoS ONE,2014,9:e110834)。大肠杆菌BL21购自北京全式金生物技术有限公司。
2.试剂
蛋白marker购自宝生物工程(大连)有限公司，ABTS购自Sigma-Aldrich公司，考马斯亮蓝R250购自生工生物工程(上海)股份有限公司，BSA购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
3.培养基
种子培养基：PDA液体培养基。
液体产酶培养基(g/L)：麦芽糊精60，蛋白胨15，酒石酸铵2，KH2PO46，MgSO4·7H2O4.14，CaCl20.3，NaCl 0.18，CuSO4·5H2O 0.0625，ZnSO4·7H2O0.018，and vitaminB10.015。
4.本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均参照以下实验手册中的相关章节或部分进行，包括：[美]J.莎姆布鲁克等，分子克隆实验指南(第三版)；沈萍等，微生物学实验(第三版)。
5.漆酶活性采用以下方法检测：反应体系4.0mL，其中含1.95mL 0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 3.0)、2.00mL 0.5mmol/L ABTS溶液和50μL酶液。30℃恒温水浴反应，测定反应前5min反应体系在420nm处吸光度的增加值ΔOD。以灭活的酶液作为空白对照。酶活定义：在上述条件下，每min催化氧化1μmol ABTS所需的酶量为1个酶活力单位(U)。
6.漆酶发酵液的获得参照以下进行：取斜面保藏的Cerrena unicolor HYB07菌株接种于PDA固体平板，30℃恒温培养，活化3d。菌株经PDA平板活化后，用5mm打孔器打出5块菌饼，接种于液体种子培养基(装液量为100mL/250mL)，200r/min，30℃培养2d，制成一级种子液。将一级种子液以6％(v/v)的接种量接入到二级种子液培养基中，装液量为150mL/500mL，200r/min，30℃恒温培养2d。将二级种子液以6％(v/v)的接种量接入到液体产酶培养基中，装液量为50mL/250mL，30℃,200r/min恒温摇瓶发酵6d。采用8000r/min离心5min分离菌丝体和发酵液。
7.SDS-PAGE：使用美国Bio-Rad的Mini-PROTEAN蛋白电泳系统。浓缩胶5％，分离胶12％。
8.蛋白凝胶染色：将考马斯亮蓝CBB溶于蒸馏水配制成浓度为0.5g/L的染色液。将蛋白凝胶置于染色液中煮沸1min。(参考文献：Dong WH,Wang TY,Wang F,ZhangJH.Simple,time-saving dye staining ofproteins for sodium dodecyl sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis using Coomassie blue.PLoS ONE,2011,8:e22394)。
9.除非特殊说明，蛋白凝胶脱色体系含50mL脱色液，脱色条件为40℃、50r/min，脱色时间2h。
实施例1HYB07漆酶对不同染料的脱色
(1)将HYB07漆酶用于12种不同染料(考马斯亮蓝R250、甲基橙、甲基红、碱性品红、溴百里香酚蓝、中性红、结晶紫、酸性品红、刚果红、溴甲酚绿、亚甲基蓝、玫瑰红B)的脱色。脱色体系2mL，含有50mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 6.0)、染料(25-200mg/L)和酶(2U/mL)，室温下脱色24h。从图1可知，经漆酶处理后，考马斯亮蓝脱色率最高，达92.37％。
(2)对漆酶脱色前后的考马斯亮蓝R250溶液进行全波长扫描。从图2可见，脱色后染料的吸收峰降低。
实施例2利用漆酶/介体系统进行蛋白凝胶的脱色
(1)介体种类对蛋白凝胶脱色的影响
在pH 7.0、20U/mL漆酶、条件下，检测不同漆酶介体，包括ACE(20μM)、SYA(20μM)、HBT(20μM)、ABTS(2μM)和SYD(20μM)对蛋白凝胶脱色的影响。从图3可知，ABTS作为介体效果最好。
(2)温度对蛋白凝胶脱色的影响
在pH 7.0、酶浓度20U/mL，ABTS 2μM条件下，研究不同温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃)对蛋白凝胶脱色的影响。从图4可知，40℃为脱色最适温度。
(3)漆酶酶活对蛋白凝胶脱色的影响
在pH 7.0、温度40℃条件下，研究漆酶酶活(3U/mL、6U/mL、9U/mL、12U/mL、15U/mL、18U/mL)对蛋白凝胶脱色的影响。从图5中可知，15U/mL条件下脱色效果最好。
(4)介体浓度对蛋白凝胶脱色的影响
在pH 7.0、温度40℃、漆酶酶活15U/mL条件下，研究不同介体浓度(0.5μM、1μM、1.5μM、2μM、3μM、4μM)对蛋白凝胶脱色的影响。从图6中可知，介体浓度为2μM脱色效果最好。
(5)脱色时间对蛋白凝胶脱色的影响
在pH 7.0、温度40℃、漆酶酶活15U/mL、ABTS 2μM条件下，研究不同脱色时间(0.5h、1h、1.5h、2h)对蛋白凝胶脱色的影响。从图7可知，脱色2h条件下脱色效果最好。
实施例3漆酶/介体脱色系统的检测灵敏性
(1)在pH 7.0、温度40℃、漆酶酶活15U/mL、ABTS 2μM条件下脱色2h，检测漆酶/介体脱色系统的检测灵敏性。从图8可知，BSA低至10ng仍能检测到。
(2)比较不同脱色方法的效果。从图9可以看出，漆酶/介体脱色系统脱色效果最好，脱色液用缓冲液或蒸馏水配制差别不大。直接采用水煮沸脱色，易造成蛋白信号的损失。40℃下只用水或缓冲液脱色2h，背景较高，表明，漆酶不仅只降解溶液中的R-250，也有加速蛋白凝胶脱色的效果。与蛋白质结合的染料，不易被漆酶降解，从而使蛋白条带可以在清晰背景上显示。
实施例4漆酶/介体系统对复杂蛋白条带的脱色
在实施例2中的优化条件下，利用漆酶/介体系统检测BL21大肠杆菌裂解液蛋白。从图10可知，漆酶/介体系统对复杂蛋白样品凝胶电泳的脱色也具有较好的效果。

Claims (9)

1.一种漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，其特征在于：将漆酶应用于蛋白凝胶电泳中常规染色后的脱色。
2.根据权利要求1所述的漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，其特征在于：所述漆酶的应用方式为漆酶或漆酶/介体系统。
3.根据权利要求1所述的漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，其特征在于：所述染色所用染料包括考马斯亮蓝R250和G250。
4.根据权利要求1所述的漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，其特征在于：所述蛋白凝胶电泳包括十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。
5.根据权利要求2所述的漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，其特征在于：所述介体包括ABTS、HBT、ACE、SYA、SYD。
6.根据权利要求1所述的漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，其特征在于：所述介体为ABTS。
7.根据权利要求1所述的漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，其特征在于：所述漆酶来源于白腐真菌齿毛菌(Cerrena sp.)HYB07。
8.根据权利要求1所述的漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，其特征在于：脱色条件为：在温度25℃-45℃、漆酶酶活12-18U/mL、介体浓度1μM-3μM、脱色时间1h-2h。
9.根据权利要求8所述的漆酶在蛋白凝胶脱色中的应用，其特征在于：脱色条件为：在温度40℃、漆酶酶活15U/mL、介体浓度2μM、脱色时间2h。
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