CN101023165A - 新型漆酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可从梭孢壳菌属的菌株得到的新型漆酶。本发明还涉及编码该酶的核酸序列、导入了核酸序列的重组宿主以及在重组宿主中生产该酶的方法。本发明的酶适合数种应用，尤其是增加粗斜纹布的光亮度。

Description

新型漆酶及其应用
发明领域
本发明涉及在许多应用中，特别是在粗斜纹棉布处理中，一种有用的新型漆酶。本发明还涉及编码该酶的核酸、载体、宿主细胞和用于产生该酶的方法以及包括该酶的酶制剂。此外，本发明涉及处理粗斜纹棉布的方法、清除污渍的方法、处理天然或人造纤维或木质纤维的方法、处理羊毛的方法、处理毛发的方法和漂白纸浆和染坊废水的方法、以及染料脱色的方法。本发明还涉及能用在所述应用中的各种用途和组合物。
发明背景
漆酶(EC.1.10.3.2对苯二酚：氧氧化还原酶)属于多铜氧化酶。在较高等植物、真菌、某些昆虫和细菌中，漆酶是广泛分布的酶。它们的特性是底物特异性低，能氧化各种底物，包括二酚、多酚、不同的取代酚、二胺、芳香胺、甚至是无机化合物如碘。漆酶通过单电子氧化机制氧化其底物，并且它们用分子氧作为电子受体。在漆酶中，一级序列、诱导机制、物理化学(如等电点和碳水化合物含量)以及生物化学特性是可变的。但是，漆酶的铜结合位点却是严格保守的。
之前已分离出数种漆酶蛋白和编码这些漆酶的基因。WO 01/92498描述了一种从Melanocarpus albomyces菌株中分离的漆酶。该酶的最适pH在5-8之内，工作温度在30-80℃之间，非常适合工业应用要求的高pH和温度条件，反之大多数已知的真菌漆酶在酸性pH范围内起作用，并且不是很耐热。专利EP 0765394 B1(相应的美国专利No.5,981,243)描述了嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)的漆酶基因的克隆及其在曲霉菌(Aspergillus)中的表达。漆酶的最适pH为6.5，酶的完整活性在60℃保持20分钟。美国专利No.5,750,388描述了对嗜热色串孢(Scytalidium thermophilum)的漆酶基因的克隆及其在曲霉菌中的表达。色串孢漆酶活性的pH概图对于丁香醛连氮(syringaldazine)和ABTS氧化的最适pH分别为7和4。漆酶在中性至碱性pH下比酸性pH更耐热。
漆酶有许多工业应用的潜力，如木浆的去木质作用，处理含有木质素的纤维的方法，处理木质纤维以便使其具有功能或粘合纤维的方法，从回收的原材料中生产燃料乙醇的改进，食品应用(例如烘焙或啤酒或葡萄酒的澄清)，各种生物去污(bioremediative)方法，和纺织应用如粗斜纹布处理、去除污渍、为纺织工业处理各种纤维、染料脱色的方法和处理染坊废水的方法、或用于染发组合物中、硬表面清洁中或清洁剂制剂中。
“石洗”外观或磨损的外观近年来是粗斜纹布生产者的兴趣所在。传统的用浮石进行石洗降低了织物的强度并加重了洗衣设备的负担。过去几年已经倾向于粗斜纹布的酶的整理工艺。粗斜纹布的“漂白外观”通常依靠次氯酸钠获得。迄今为止，这种“氯漂白”已经是用靛青染色的粗斜纹布的最有效的漂白方法，因为几乎所有的深浅色调都能得到。但是，次氯酸处理对环境非常有害，难以控制，并且它易于损坏织物。对于使用者，它也是非常不方便甚或有害的方法，它不能用于含有莱卡(Lycra)的产品，并且需要具有数个漂洗/清洗步骤的脱氯处理。开发生态危害较低的次氯酸钠替代物的深入研究已经进行，尤其是漆酶得到了研究。至今考虑到作用和外观，商用漆酶制剂所得的结果尚不能与“氯漂白”的结果相比。不用次氯酸钠，褪色程度重的外观非常难以达到或不可能达到。
WO 97/25468描述了漆酶在使染色的粗斜纹布成为磨损外观的方法中的应用。该方法包括纤维素酶处理，以及同时或相继的苯酚氧化酶如漆酶和增强剂如丁香酸甲酯处理。在专利公开中，长绒毛栓菌(Trametes villosa)和嗜热毁丝霉漆酶是漆酶的实例。
尽管众多出版物描述了来自各种微生物的漆酶，但现有技术没有描述任何能用于粗斜纹布处理中以替代化学漂白剂的漆酶。因此需要具有更有效的氧化能力的新型漆酶，尤其是更有效氧化靛青的能力。
还需要在不同的应用中能更有效地发挥功能并更适合各种条件的新型漆酶。
发明概述
本发明的目的是解决至少一些与现有技术相关的问题。具体来说，本发明的目的在于提供新型漆酶，其在粗斜纹布处理中可能减量或避免使用化学漂白剂。通过应用本发明的漆酶，可能减少或避免化学漂白剂如次氯酸钠的使用。
本发明基于出人意料的发现，即本发明的漆酶能增加粗斜纹布的光亮度(lightness)，同次氯酸钠得到的水平一样多或更高。漆酶处理增加了粗斜纹布的光亮度，尤其是在粗斜纹布的正面，这也是想要的粗斜纹布处理的结果。
因此本发明的一个目的在于，在适当条件下漆酶能够增加粗斜纹布光亮度至少与次氯酸钠处理的粗斜纹布有同样多的单位，或者更高。在实验条件下，得到的本发明漆酶处理的结果与次氯酸钠得到的结果相当，实验条件代表常规的次氯酸钠漂白条件。
更具体地，本发明的漆酶由权利要求1的特征部分所陈述的内容表现其特征。
因而本发明包含漆酶，其能在实验条件下在粗斜纹布正面增加粗斜纹布的光亮度，至少与次氯酸钠有同样多的单位。出人意料的是，当仅被脱浆的粗斜纹布受到处理时，该作用既能实现。当在脱浆和纤维素酶处理的粗斜纹布上进行漆酶处理时，本发明的漆酶在实验条件下能比次氯酸钠增加至少20％，优选至少60％粗斜纹布的光亮度。
本发明的一个目的是，，粗斜纹布光亮度值(L*)在粗斜纹布的正面等于或低于32的靛青染色的粗斜纹布时，在适当条件下，当纤维素酶处理用于漆酶处理后，在单次处理中，能在粗斜纹布正面得到光亮度值(L*)至少47，优选至少50的漆酶。
本发明的一个目的是，粗斜纹布光亮度值(L*)在粗斜纹布的正面等于或低于32的靛青染色的粗斜纹布，当纤维素酶处理用于漆酶处理后，在单次处理和适当条件下，能在粗斜纹布正面增加光亮度值(L*)至少17，优选至少25的漆酶。
本发明的一个目的还是漆酶，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：12，或者当相应基因编码的全长序列被比较时，与序列SEQ ID NO：12显示出至少74％同一性的序列。
更具体地，本发明的漆酶由权利要求22特征部分陈述的内容表明特征。
本发明的新漆酶对于各种底物有高氧化活性。该酶还能在不同应用的各种条件下发挥功能。
本发明包括酶，其具有各种底物的高氧化活性，并因而适合不同的应用。本发明特别涉及对ABTS在pH4.5下比活性至少为800nkat/mg或对丁香醛连氮在pH5.5时比活性至少为200的漆酶。
该酶优选从微生物得到，更优选来自丝状真菌，特别是来自梭孢壳菌(Thielavia)属，更具体来自沙质梭孢壳菌(arenaria Thielavia)。有利的是，该酶可以从CBS 116071菌株得到，所述菌株已于2004年9月2日保藏在荷兰的Centralbureau voor Schimmelcultures，Upsalalaan 8，3584 CT，Utrecht。
本发明的漆酶在很宽的pH范围内起作用。适当条件下，该酶在pH3.5-8下发挥作用，优选pH4-7.5。最优选该酶在pH5-7下发挥作用。该酶还在很宽的温度范围内起作用。例如，在粗斜纹布处理中，该酶在30-80℃的温度下有效，优选50-70℃，最优选60-70℃。该酶也在室温下起作用(18-30℃)，虽然比温度较高时的反应速率要慢。
本发明还有一个目的是编码本发明的酶的核酸序列。该核酸序列由权利要求44的特征部分陈述的内容表明特征。
本发明另外的目的是包含本发明核酸序列的载体和包含核酸序列或载体的宿主，以及具有漆酶活性的多肽的生产方法。
本发明的另一个目的是获得包含多肽或酶的酶制剂的方法，包括的步骤是：培养包含编码本发明的酶的核酸序列的宿主细胞或培养含有包含编码本发明的酶的核酸序列的载体的宿主细胞，并回收多肽。此外，本发明的目的是包含本发明漆酶的酶制剂。
本发明的一个目的是处理粗斜纹布的方法，在水介质中将粗斜纹布与本发明的漆酶或酶制剂在适合发挥酶的功能的条件下接触。
本发明的一个目的是清除污渍的方法，包括在适合发挥酶的功能的条件下把要用该方法处理的材料与本发明的漆酶接触。
本发明还提供了通过使用本发明的漆酶漂白纸浆的方法用于处理纤维，处理羊毛的方法，处理毛发的方法，处理染坊废水的方法和染料脱色的方法。
本发明另外的目的是本发明的漆酶在各种应用和组合物中的用途。
在粗斜纹布漂白中使用本发明的漆酶，可能得到许多优势。使用本发明的漆酶，可能减少或完全避免次氯酸钠的环境危害作用。如果不用次氯酸钠，则不需要脱氯处理。还可能得到与次氯酸漂白同样的各种色调。甚至褪色很厉害的粗斜纹布外观也能得到。使用本发明的酶进行漆酶处理的一个优势是该处理不会破坏织物。漆酶也能用于处理含莱卡的产品。另外，漆酶处理对于使用者也方便。此外，该酶能在很宽的温度和pH范围内起作用。在其它应用中也能得到显著的益处。
本发明的其它特征、方面和优势将从下面的描述和所附的权利要求中变得显见。
附图简述
图1.SDS-PAGE(15％)显示梭孢壳菌漆酶(TaLccl)的提纯。泳道：1.分子量(MW)标记(175，83，62，47，32.5，25，16.5和6.5kDa)，2.培养物上清，3.DEAE Sepharose后的级分，4.-7凝胶过滤后的级分，每一泳道上点样大约3-6ug蛋白。蛋白用考马斯亮蓝(Coomassie brilliantBlue)染色。
图2.在愈创木酚(guaiacol)上测定的提纯梭孢壳菌漆酶(P TL)和粗酶(CE)的最适pH。
图3.野生型梭孢壳菌漆酶(TaL)在50℃和60℃的热稳定性。
图4.重组TaLccl的提纯，SDS-PAGE(12.5％)，泳道：1.MW标记(175，83，62，47.5，32.5，25，16.5kDa)，2.培养物上清，3.DEAESepharose后的级分，4.Resource Q后的级分，5-9.凝胶过滤后的级分。
图5.从提纯的沙质梭孢壳菌wt TaLccl获得的胰蛋白酶的肽序列以及编码该序列的可能的密码子。
图6A和B.沙质梭孢壳菌ALKO4197 Talccl基因的核苷序列和推导的氨基酸序列。终止密码子用序列下方的星号显示。推定的内含子和共有内含子剪接信号(5′GTPuNGPy，3′PyAG，内在NNCTPuAPy)的位置分别用小写字母和粗体标记。用SignalP V2.0程序分析的推定的信号肽和成熟的C-端氨基酸序列(从提纯的重组TaLccl蛋白测定)在下划线。从提纯的wt TaLccl得到的胰蛋白酶的肽序列的位置用序列下方的点划线标记。涉及铜结合的保守残基被加亮。推定的N-糖基化(N-X-S/T)位点为粗体。
图7.用于转化里氏木霉(Trichoderma reesei)原生质体以产生重组TaLccl的表达盒pALK.1667。漆酶基因在cbhl(cel7A)启动子(p cbhl)的控制下，转录的终止通过使用cbhl终止子序列(t cbhl)来保证。amdS基因作为转化标记被包括在内，cbhl 3′-侧翼区连同cbhl启动子被用于确保将表达盒通过同源重组靶向进入cbhl基因座。
图8.TaLccl漆酶制剂在不同pH值下的粗斜纹布漂白中与DeniLite II Base相比较的性能。基于织物重量，酶剂量为200nkat/g，介体(mediator)的剂量为10mg/g。
图9.TaLccl漆酶制剂在不同温度下的粗斜纹布漂白中与DeniLiteII Base相比较的性能。基于织物重量，酶剂量为200nkat/g，介体的剂量为10mg/g。
图10.用TaLccl漆酶制剂，酶剂量对粗斜纹布漂白的作用。漂白按照实施例9所描述的进行。DeniLite II Base用作对照。
图11A-D.用TaLccl漆酶漂白不同类型的粗斜纹布与用次氯酸或DeniLite II Base漂白的比较。漂白按照实施例10所描述的进行。A.对Tincan Jeans，B.Lee Cooper Jeans，C.Warrick Jeans，D.English Jeans的漂白结果。
图12A和B.TaLccl漆酶制剂在60℃下对草渍的作用与DeniLite IIBase的比较。处理在pH6下进行60分钟。A.光亮度值，B.a*值(-a*是绿色方向，+a*红色方向)。
图13A和B.TaLccl漆酶制剂在60℃下对茶渍的作用与DeniLite IIBase的比较。处理在pH6下进行60分钟。A.光亮度值，B.a*值(-a*是绿色方向，+a*红色方向)。
图14A和B.TaLccl漆酶制剂不同剂量在40℃下对草渍的作用。处理在pH6下进行60分钟。DeniLite II Base和介体对照用作对比。A.光亮度值，B.a*值(-a*是绿色方向，+a*红色方向)。
图15A和B.TaLccl漆酶制剂不同剂量在40℃下对茶渍的作用。处理在pH6下进行60分钟。DeniLite II Base和介体对照用作对比。A.光亮度值，B.a*值(-a*是绿色方向，+a*红色方向)。
序列表
SEQ ID NO：1肽1的序列，来自沙质梭孢壳菌ALKO4197 Talccl蛋白的胰蛋白酶肽。
SEQ ID NO：2肽2的序列，来自沙质梭孢壳菌ALKO4197 Talccl蛋白的胰蛋白酶肽。
SEQ ID NO：3肽3的序列，来自沙质梭孢壳菌ALKO4197 Talccl蛋白的胰蛋白酶肽。
SEQ ID NO：4寡核苷酸引物POX26的序列。
SEQ JD NO：5寡核苷酸引物POX27的序列。
SEQ ID NO：6寡核苷酸引物POX28的序列。
SEQ ID NO：7寡核苷酸引物POX29的序列。
SEQ ID NO：8寡核苷酸引物POX30的序列。
SEQ ID NO：9寡核苷酸引物POX31的序列。
SEQ ID NO：10用引物POX27和POX31得到的PCR片段的序列。
SEQ ID NO：11沙质梭孢壳菌ALKO4197漆酶1基因(Talccl)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：12推导出的沙质梭孢壳菌ALKO4197漆酶1(Talccl)的氨基酸序列。
保藏
沙质梭孢壳菌ALKO4197(Thielavia arenaria ALKO4197)于2004年9月2日保藏在荷兰的Centralbureau Voor Schimmelcultures，Upsalalaan 8，3584 CT，Utrecht，分配的保藏号是CBS 116071。
包含质粒pALK1342的大肠杆菌(E.coli)菌株RF5473于2003年3月7日保藏在德国Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH (DSMZ)，Mascheroder Weg 1 b，D-38124Braunschweig，分配的保藏号为DSM 15484。
发明详述
本发明提供了漆酶，其在适当条件下，能增加粗斜纹布光亮度至少与化学漂白剂，尤其是次氯酸钠处理的粗斜纹布有同样多的单位，或者更多。
“本发明的漆酶”此处意味着权利要求所限定的和本文所描述的漆酶群组。
与本发明有关的“漆酶”意即用酶分类法分类为EC 1.10.3.2的酶。漆酶可以源自包括植物的任何生物体，优选其可以源自微生物。它可以源自细菌，例如选自杆状菌属、螺旋菌属和链霉菌属。优选该酶源自真菌(包括丝状真菌和酵母)，例如选自梭孢壳菌属(Thielavia)、球毛壳菌属(Chaetomium)、Achaetomium、曲霉菌属(Aspergillus)、灰霉菌属(Botrytis)、金钱菌属(Collybia)、层孔菌属(Fomes)、腐质霉属(Humicola)、肉座菌属(Hypocrea)、香菇属(Lentinus)、Melanocarpus、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌属(Neurospora)、射脉菌属(Phlebia)、侧耳菌属(Pleurotus)、孢壳菌属(Podospora)、多孔菌属(Polyporus)、丝核菌属(Rhizoctonia)、密孔菌属(Pycnoporus)、栓菌属(Trametes)和木霉属(Trichoderma)。
根据本发明的优选实施方案，本发明的漆酶得自梭孢壳菌属，更优选来自沙质梭孢壳菌。根据本发明最优选的实施方案，该酶得自在Centraalbureau voor Schimmelcultures保藏，编号为CBS 116071的菌株。
本发明的漆酶的来源不局限于梭孢壳菌属或菌种T.arenaria。通过运用本文提供的说明，本领域的技术人员能从其它真菌属、其它微生物、还有较高等的生物体如植物中发现并提取本发明的漆酶。
本发明的漆酶能从产生漆酶的任何生物体中分离。优选本发明的漆酶分离自微生物源。能产生漆酶的生物体可被筛选，对各种底物的活性可被测定，并且酶被表述特征。例如，酶起作用的pH和温度范围，最适pH和温度，以及酶在各种温度下的稳定性可被测定。另外，在本文的实施例中，各种生物体内编码漆酶的基因可以分离，该基因编码的氨基酸序列可以与分离的漆酶的氨基酸序列进行比较并表述特征。这包括从环境样本的直接克隆。
“漂白外观”意味着效果，在现有技术中，其在粗斜纹布织物上的获得是依靠漂白化学品，如次氯酸钠。“氯漂白”是迄今为止靛青染色的粗斜纹布的最有效漂白方法，因为几乎所有的色调可以用其得到。如果想要“白色漂白”效果，漂白需要相继在不同的处理浴槽中进行2至3次，或者使用高浓度次氯酸钠。已有建议用葡萄糖、亚磺酸(sulphinic acid)衍生物、漆酶漂白处理粗斜纹布，代替次氯酸钠。但是现有技术中，它们无一能得到与次氯酸钠相同的效果。
为了粗斜纹布织物“增加光亮度”，根据现有技术，用各种漂白化学品或酶进行处理。漂白经常在用纤维素酶或浮石或其二者处理后完成。
“脱浆”通常是牛仔裤的首次湿处理，意在清除通常用于经纱上的淀粉或其它上浆剂，以防止在编织过程中受损。α-淀粉酶用于清除淀粉基的浆料，以改善和均匀湿处理工艺。脱浆后牛仔裤通常用水漂洗。
术语“磨损”此处意指粗斜纹布已被纤维素酶或石洗或二者处理后呈现出的外观。不均匀清除染色的结果是，染色区域和染色被清除的区域之间出现对比。同义的表达有“石洗外观”或“磨损外观”。纤维素酶处理可以用中性或酸性纤维素酶或二者进行。如果织物没有被纤维素酶处理或石洗，织物的外观据说将“呆滞”，因为缺少了时尚的对比。
粗斜纹布“增加光亮度”本文意指粗斜纹布织物的光亮度可见和可测量的增加。光亮度的增加被测作漆酶处理后织物的光亮度单位L*减去漆酶处理前的光亮度单位L*。粗斜纹布“增加光亮度”特别是指在粗斜纹布正面增加粗斜纹布光亮度。该增加可以通过例如用实施例7-10中所描述的L*a*b*色彩空间坐标，以分光光度计(spectrofotometer)测定颜色作为反射率数值来测定。
本发明的漆酶能够在适当的条件下经过单次处理使得粗斜纹布正面增加的光亮度与次氯酸钠处理的斜纹布至少有同样多的单位，或超过。漆酶处理在适合酶起作用的条件下进行。在常规漂白条件下，漆酶处理的结果与次氯酸钠得到的结果相比较。实验条件可以选择下列漂白条件：在25ml/l的10％次氯酸钠(NaOCl)溶液中、在40℃温度下、在高于10.5的pH下处理织物，处理时间15分钟。液体比率为大约1∶15。该处理可以在通常用于纺织工业中湿处理的设备中进行，如洗衣机。准确的实验条件描述于实施例10。漂白后，清除剩余的次氯酸，如以偏亚硫酸氢钠或硫代硫酸钠处理，随后是数个漂洗/洗涤步骤。
与在所述的次氯酸钠实验条件下得到的结果相比，本发明的漆酶在适当条件下单次处理，增加脱浆粗斜纹布的粗斜纹布正面的光亮度，与次氯酸钠至少有同样多的单位。“脱浆”在本文中指“只是脱浆”，没有纤维素酶处理。如果漆酶处理在脱浆并且纤维素酶处理的粗斜纹布上进行，则增加的光亮度通常超过实验条件下以次氯酸钠处理的粗斜纹布的20-70％，优选40-115％。
使用纤维素酶处理的、粗斜纹布正面的光亮度值(L*)低于32的粗斜纹布，在靛青染色时，用本发明的漆酶，可能在单次处理和适当条件下，在粗斜纹布的正面，得到的光亮度值(L*)为47至50甚至更高。
使用纤维素酶处理的、粗斜纹布正面的光亮度值(L*)低于32的粗斜纹布，在靛青染色时，用本发明的漆酶，可能在单次处理和适当条件下，在粗斜纹布的正面，得到光亮度值(L*)的增加为17至25甚或更高。
用本发明的漆酶处理粗斜纹布织物，可能得到与次氯酸钠所得的类似的漂白效果。如果想要更为发白的效果，可以用更高的剂量，或者可以重复酶处理，或者与其它漂白方法相结合。本发明的漆酶处理也可以与能够增加斜纹布光亮度的任何其它的漂白处理、一种或多种化学漂白处理或者一种或多种其它酶处理相结合。
“介体”本文指添加剂，在提高漆酶的作用中经常是需要的。现有技术的许多漆酶在没有介体时不发挥作用或不能有效发挥作用。本文中源于梭孢壳菌的漆酶也是在有介体时更有效地起作用。适用的介体包括例如，丁香酸甲酯、acetosyringon、丁香酸乙酯、丁香酸丁酯和丁香酸月桂酯、丙酸-酚噻嗪(PPT)、2，2′连氮双-3-乙基苯噻唑-6-磺酸盐(ABTS)、2，2，6，6-四甲基-1-哌啶氧(Tempo)、1-羟基苯并三唑(HBT)、紫脲酸、N-羟基-乙酰苯胺(NHA)。根据应用和介体，介体可以在处理材料的0.1-100mg/g或0.1-100mg/l，优选1-10mg/g或1-10mg/l的范围内使用。
本发明的漆酶可以处理任何种类的粗斜纹布织物。粗斜纹布最好是靛青染色的粗斜纹布。粗斜纹布还能用靛青衍生物处理或者粗斜纹布用靛青连同一些其它染料染色，例如用硫磺打底(sulphur bottom)的靛青染色。粗斜纹布织物可以用纤维素酶处理或石洗或二者，或者粗斜纹布织物可以在完成脱浆后用本发明的漆酶处理。
根据本发明的优选实施方案，本发明的漆酶处理可以在30-80℃的温度下进行，优选50-70℃的温度，更优选60-70℃的温度。处理期间的pH可以在pH3.5-8的范围内，优选pH4-7.5，最优选pH5-7。处理可以进行15分钟至2小时，优选30分钟至90分钟，更优选30分钟至60分钟。处理中所用的剂量可以是2-500nkat，更优选20-200，最优选20-100nkat/g织物。
根据本发明的粗斜纹布处理通常包括下列步骤：
-脱浆的或任选脱浆和纤维素酶处理的粗斜纹布在水基质中与有效量的漆酶在适当条件下接触，使酶发挥功能，和
-用水进行一次或多次漂洗。
漆酶处理优选在纤维素酶处理的粗斜纹布上进行。漆酶处理继以任选用具有洗涤剂的热水或冷水漂洗一次或多次。漆酶处理后通常不需要酶失活，因为它不降低织物的强度，但是如果需要的话，可以用本领域技术人员公知的方法进行。在纺织工业中，处理通常在常规用作湿处理的设备中进行，如用于洗涤、纤维素酶处理、染色或整理的工业机器。
与本发明有关的“粗斜纹布”指粗斜纹布织物，通常是粗斜纹布牛仔布。
在粗斜纹布漂白中，本发明的漆酶制剂在不同pH值下的性能，以实施例7中所述的内容示例。检验木霉作宿主生产的重组漆酶制剂的漂白粗斜纹布的能力，并与Novozymes的商用漆酶制剂DeniLite IIBase作比较。
如表10和图8所见，与现有技术的漆酶相比较，本发明的漆酶在靛青染色的粗斜纹布的脱色作用上，在5-7的所有pH值中都要优越，pH6最佳。只有本发明的漆酶制剂能达到具有高光亮度值的强烈的漂白外观。另外，纤维素酶处理得到的磨损外观得以保持。光亮度的增加和粗斜纹布反面蓝色的减少也是用带有介体的本发明的漆酶制剂处理时最高。
本发明的漆酶在不同温度下漂白粗斜纹布的能力，按照实施例8所描述进行检验，并与现有技术的漆酶比较。
如表12和图9所见，在30-80℃下，与现有技术的漆酶相比，本发明的漆酶制剂在粗斜纹布的漂白中更优越(光亮度的增加更高)。60-70℃对于本发明的漆酶是最适的，粗斜纹布织物的外观褪色强烈。
酶剂量对粗斜纹布的漂白的影响如实施例9所述，用漆酶-介体体系来研究。纤维素酶处理的粗斜纹牛仔裤用不同漆酶剂量的木霉菌株产生的重组漆酶和现有技术漆酶处理。剂量从20增加到100nkat/g织物的能大幅改善用本发明的酶的漂白。从表14和图10可见，时间从30分钟增加至60分钟能进一步改善本发明漆酶的性能。
如实施例10所述，用漆酶-介体体系的粗斜纹布漂白与用次氯酸的漂白相比较。不同类型的粗斜纹布用本发明的漆酶和现有技术的漆酶处理，得到的结果与次氯酸漂白相比较。粗斜纹布样品在脱浆后用纤维素酶洗涤至不同的磨损程度，或者实验中只用脱浆样品。如表18-20和图11A-D所见，每一类型的所有纤维素酶处理的粗斜纹布样品中，本发明的漆酶比现有技术漆酶和氯漂白更优越。用只经过脱浆的织物，用梭孢壳菌漆酶制剂获得的漂白效果(在粗斜纹布正面增加的L*)等于或好于次氯酸钠，并且比现有技术的漆酶(Denilite II Base)至少好出100％。用本发明的漆酶，可能达到通常只有用高剂量次氯酸钠才能得到的很强烈的漂白效果
产生本发明漆酶的微生物能从自然界分离，或者它们可以用本领域技术人员公知的筛选方法，从已经分离和鉴别的培养物保藏的菌株中筛选。通过测定酶活性，在平板培养的固体培养物上或在液体培养基中研究酶的产生，进行筛选。测定活性的适用底物包括ABTS、二甲氧基苯酚(DMP)、愈创木酚和丁香醛连氮。可以通过例如实施例1所述的方法，用指示剂如Remazol Brilliant Blue R-478、鞣酸和愈创木酚筛选真菌产生漆酶的能力。从较高等生物如植物中，可以分离适用的漆酶，并且也能克隆编码它们的基因。
本发明涉及对各种底物具有高氧化能力的酶，因而适合不同的应用。本发明尤其涉及在pH4.5时，对ABTS具有至少800nkat/mg、更优选至少900nkat/mg比活性性的酶。当丁香醛连氮用作底物时，比活性在pH5.5时至少200，优选至少300nkat/mg。当愈创木酚用作底物时，酶的比活性在pH5.5时至少40nkat/mg，优选至少60nkat/mg。
作为筛选结果被发现的微生物菌株能栽培在适当的培养基上，并且能观察培养液或板上的漆酶形成。产生足量想要的漆酶后，可以提纯该酶并更彻底地定性其性质。
产生的漆酶可以用传统的酶化学方法提纯，如盐沉淀、超滤、离子交换层析和疏水相互作用色谱。提纯可以用蛋白质测定、酶活性分析和用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来监测。可以测定各种温度和pH值下提纯的酶的酶活性，同样，也能测定分子量和等电点。
提纯的酶指酶制剂，除了漆酶蛋白，没有其它蛋白或极少量的其它蛋白。所得的基本没有其它蛋白质的漆酶的纯度≥90％。
优选的本发明漆酶的提纯示例于实施例1。浓缩的培养物滤出液加样在Q Sepharose FF柱上，蛋白质以递增的盐梯度洗脱，漆酶活性级分加样在Sephacryl S100凝胶过滤树脂上。提纯继以活性分析和SDS-PAGE。为了得到高纯度样品，可以另外包括Resource Q阴离子交换步骤。当然，用其它已知的提纯方法代替或添加到本文描述的方法中，也可能分离本发明的酶。
如实施例2所述，漆酶的等电点能用等电聚焦测定，含有漆酶活性的条带通过例如ABTS染色凝胶可以显色。
各种温度下漆酶活性的测定可以如实施例1所述，依照Niku-Paavola等(1988)建立的方法，用ABTS法或文献中描述的其它方法进行。
漆酶的最适pH可以在适当的缓冲液内的适当底物中，在不同pH值下通过追踪其活性而测定。
热稳定性可以通过在pH确定的适当缓冲液中，在不同温度下孵育酶样本来测定。每个温度下酶的残留活性能用例如ABTS法表现。
提纯的漆酶的比活性可以对不同漆酶底物测定，如ABTS、二甲氧基苯酚(DMP)、丁香醛连氮和愈创木酚。
各种抑制剂对漆酶活性的作用，举例，可以通过存在抑制剂时，在带有氧电极的封闭和填充的容器中，测定ABTS进行酶反应期间的氧消耗来确定，或在用光谱法追踪酶活性。
蛋白质的N-端和内部肽能根据实施例2描述的Edman降解化学法[Edman P.和Begg G.(1967)]或文献中描述的其它方法测序。
从沙质梭孢壳菌RF5597分离的提纯漆酶的分子量约为80kDa。等电聚焦中，提纯漆酶在等电点(pIs)5.5、5.9、6.4、6.8和6.9显示出多个条带。
对愈创木酚测定的提纯漆酶的最适pH为5.5，该酶在pH7时仍显示出显著的高活性。该酶在3.5-8的pH范围内起作用，优选4-7.5，最优选5-7。测量精确度为±0.5。
第一个pH范围(pH3.5-8)意味着最大活性的20％或以上在该范围内，第二个pH范围(pH4-7)意味着最大活性的40％或以上在该范围内。第三个区域(pH5-7)意味着最大活性的80％或以上在该范围内。
分析条件下，漆酶的半衰期在50℃时为26小时，60℃时为5.5小时。
漆酶在粗斜纹布漂白应用中的最适温度为60℃。该酶在18-80℃的温度下起作用，虽然是在30-80℃的温度下有效，更优选50-70℃的温度，最优选60-70℃的温度。
酶的比活性对ABTS最高，pH4.5时为1020nkat/mg蛋白。pH5.5时，对DMS的比活性为260，对丁香醛连氮为490，对愈创木酚为63nkat/mg。
显示出优势性质的漆酶可以通过原始或重组的宿主产生，方法包括了在适当条件下培育宿主，所述宿主中导入编码所述漆酶的DNA序列和表达所述酶需要的序列，并任选分离该酶。生产宿主可以是能表达漆酶的任何生物体。优选该宿主是微生物细胞，更优选真菌。最优选的宿主是丝状真菌。优选重组宿主被修饰为将表达和分泌漆酶作为其主要活性或其主要活性之一。生产宿主用过的培养基可以就这样使用，或者可以去除宿主细胞，和/或可以浓缩、过滤或分级分。也可以把它干燥。
适用的表达和生产宿主体系是，举例，为真菌宿主木霉建立的生产体系(EP 244234)，或曲霉菌生产体系，如米曲霉(A.oryzae)或黑曲霉(A.niger)(WO 9708325和WO 9533386，US 5,843,745，US5,770,418)，或者为镰刀菌(Fusarium)如尖孢镰刀菌(F.oxysporum)(Malardier等，1989)或为黄孢原菌(Chrysosporium)(US 6,573,086)建立的生产体系。为细菌建立的适用的生产体系是为芽孢杆菌(Bacillus)例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、或为大肠杆菌(E.coli)、或为放线菌链霉菌(actinomycete Streptomyces)建立的生产体系。为酵母建立的适用的生产体系是为酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母(Shizosaccharomyces)或毕赤氏酵母(Pichia pastoris)建立的体系。在一些其它微生物中或哺乳动物细胞中的生产体系也是可能的。
优选本发明生产漆酶的宿主特别是来自木霉属或曲霉属的菌株。
编码所选漆酶的核酸序列被导入宿主时可以用的载体，以及促进漆酶编码序列的表达和分泌的序列如启动子和信号序列，也在保护范围内。
在漆酶的克隆中可用的标准分子生物方法，即用于DNA的分离和酶处理中、用于大肠杆菌转化中等。所用的基本方法记述在标准分子生物手册中，如Sambrook等(1989)以及Sambrook和Russell(2001)
制备于选择的宿主生物体的基因组文库用PCR制备的探针筛选。用于PCR反应的寡核苷酸引物的序列建立在天然宿主产生的提纯漆酶中得到的肽的氨基酸序列基础上，以及真菌漆酶的共有序列的基础上。得到的DNA产物通过测序以及通过与被数种限制性酶消化的梭孢壳菌基因组DNA进行Southern blot杂交，来确认性质。
全长梭孢壳菌漆酶基因包含在质粒pALK1607、pALK1341和pALK1342中。包含质粒pALK1342的大肠杆菌RF5473保藏在DSMZ保藏中(DSM 15484)。分析从DNA序列中的推导漆酶氨基酸序列。
梭孢壳菌漆酶Talccl序列(SEQ ID NO：11)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)显示在图6中。基因长度为2279 bp(包括终止密码子)。推导的蛋白序列由617个氨基酸组成，其中包括21个氨基酸的预测信号序列和13个氨基酸的“尾”序列(在序列DSGL后开始)。从野生型漆酶中提纯的肽均从推导的氨基酸序列发现，说明克隆的基因编码了从重组宿主中提纯的漆酶。成熟多肽的预测分子量为64456Da，预测的pI为6.31(氨基酸22-604，去除了信号序列和C-端加尾)。推导的氨基酸序列包括9个推定的N-糖基化位点。与已发表的漆酶序列的同源性用NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)BLAST程序2.2.9版研究(Altschul等，1990)。与漆酶的最高同源性是从Melanocarpus albomyces、鹅柄孢壳菌(Podosporaanserina)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(EMBL编号CAE00180.1，LAC2 PODAN，XP 323881.1)中发现的。TaLccl序列在BLAST研究中与序列对比的同一性超过50％，并与来自嗜热毁丝霉(EP 0765394 B1，相应的美国专利No.5,981,243)和嗜热色串孢(美国专利No.5,570,388)的漆酶序列对比。发现与Melanocarpus albomyces漆酶有最高的同一性，73,1％。
术语“同一性”这里指两个氨基酸序列从相应基因编码的第一个氨基酸至最后一个氨基酸进行彼此比较。全长序列的同一性使用EMBOSS(European Molecular Biology Open Software Suite；Rice等，2000)程序包2.9.0版的Needleman-Wunsch总体序列对比程序，参数如下：EMBLOSUM 62，空隙罚分(Gap penalty)10.0，延伸罚分(Extendpenalty)0.5。
包含具有漆酶活性并显示出与氨基酸序列SEQ ID NO：12至少有74％同一性的氨基酸序列的酶或多肽，在本发明范围内。优选的酶所包含的氨基酸序列显示至少76％，更优选至少78％，更甚优选至少80％的同一性。还更优选氨基酸序列显示出与氨基酸序列SEQ ID NO：12有至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性。
本发明范围内还有以上限定的但缺少信号序列或加尾或二者的酶和截短的多肽。信号序列或加尾或二者可以在例如生产的转译后的阶段期间、或在用过的培养基中、或在培养基或酶制剂保存期间被切除。另外，蛋白质的前肽可以被宿主断裂。截短也能通过例如在将基因转化到生产宿主之前，缩短编码多肽的基因来实现。
根据本发明的漆酶可以产生到其天然宿主和重组宿主的培养基中，并可通过已知的蛋白质化学方法从其中分离和提纯。如果培养基含有足够高量漆酶而没有其它有害蛋白，可以通过简单分离细胞就这样使用培养液。需要时，培养液可以浓缩、过滤、分级和/或提纯。它也能干燥。在各种应用中，优选用含有较高漆酶量的酶制剂。这样的酶制剂可以依靠基因技术或使培育条件最适化，通过在生产宿主的培养基中产生较高量的漆酶来制备。较高量指漆酶的量超过了天然宿主天然产生的漆酶的量。
根据本发明的优选实施方案，梭孢壳菌漆酶可以在丝状真菌宿主中产生，优选木霉宿主。实施例4更详细的记述了生产方法。提纯的重组漆酶根据最适pH、热稳定性和pI鉴别特性，清楚地表明重组漆酶与野生型梭孢壳菌漆酶具有相似的性质。
漆酶生产也能通过使野生或重组菌株的培养条件和培养基最优化而改进。碳/氮比率能优化为酶生产的最佳状态。生长条件、pH、温度、搅拌和空气供应能优化为可能是正在探讨的酶生产的最佳状态。在发酵中，也能用漆酶生产的诱导剂如藜芦醇、二甲代苯胺或木质素。加入诱导剂的方式和时间及其浓度可以被优化。
术语“酶制剂”这里表示任何酶产品，其含有至少一种漆酶。因而，所述的酶制剂可以是：含有一种或多种漆酶或者一种或多种漆酶和其它酶的用过的培养基或滤出液，分离的漆酶，或一种或多种漆酶混合物，或一种或多种漆酶和一种或多种其它酶的混合物。除了漆酶活性，所述制剂可含有添加剂，如介体、稳定剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂和/或培养基成分。优选的添加剂是计划要用的酶制剂，在酶制剂所要应用的用途中，通常所用的那些。酶制剂可以是液体、粉末或颗粒的形式。
“用过的培养基”这里指包含了产生的酶的宿主培养基。优选宿主细胞在生产后从所述培养基中分离。
除了漆酶，酶制剂可以包括一种或多种其它酶，可以是例如淀粉酶、纤维素酶和/或过氧化物酶。或者，在本发明的漆酶处理之前、期间或之后，可以进行另一种酶的处理。酶处理可以包括，例如一种或多种淀粉酶处理，一种或多种纤维素酶处理，和/或一种或多种过氧化物酶处理。哪种酶包括在酶制剂中或者用于酶处理中由应用来决定。
酶制剂可以包括本发明的一种或多种漆酶，或者其它漆酶加上一种或多种本发明的漆酶。例如，性质不同的漆酶可以合用，使酶制剂对于不同的条件更为有用。
本发明的漆酶可以在与粗斜纹布漂白相似的条件下，用在污渍去除中。
根据本发明的优选实施方案，污渍去除可以在30-80℃的温度下进行，优选50-70℃的温度，更优选60-70℃的温度。处理期间的pH可以从pH3.5-8，优选pH4-7.5，最优选pH5-7。该处理可以进行15分钟至2小时，优选30分钟至90分钟，更优选30分钟至60分钟。用于处理的剂量基于织物重量可以是0.2-2000nkat/g，优选1-500nkat/g，更优选2-200nkat/g。
如实施例11所述，检验本发明的漆酶和DeniLite II Base漆酶制剂的去除污渍的能力。实验中，在带有或不带有介体的情况下，使用草渍和茶渍人工染污的介体实验布料。酶剂量为20和200nkat/g织物，实验在40、50或60℃以及pH6的条件下运行60分钟。
本发明的漆酶在60℃带有介体时，比现有技术的漆酶更有效去除草渍，如表21与图12A和B所见。如表22与图14A和B可见，本发明的漆酶在40℃下也是更好。介体是达到想要的作用所需的。
本发明的漆酶在60℃带有介体时，去除茶渍也更有效，甚至在40℃下也略好，特别是用较高的剂量时，如表21和22以及图13A和B还有图15A和B所见。介体是达到想要的作用所需的。
本发明的漆酶在60℃带有介体时，去除茶渍也更有效，甚至在40℃下也略好，特别是用较高的剂量时，如表22以及图14所见。介体是达到想要的作用所需的。
本发明的漆酶也可以用在染料脱色中。染坊废水，举例，不能不经过去除染料和/或对其脱色就排放到自然界的水中。脱色可以在与粗斜纹布漂白相似的条件下进行。酶的适用剂量和处理时间依赖于要脱色的染料量和处理条件。
根据本发明的优选实施方案，染料的脱色在30-80℃的温度下进行，优选50-70℃的温度，更优选60-70℃的温度。处理期间的pH可从3.5至8，优选pH4-7.5，最优选5-7。酶的剂量和处理时间可以检验并选择，使之最适合应用。作为指导，剂量可以用0.2-2000nkat/l处理液。处理时间优选15分钟至24小时，更优选30分钟至12小时。如果处理是在较低的温度下进行，例如18-30℃，处理时间可延长。
如实施例12所述，检验本发明的漆酶在有或没有介体时，对不同染料脱色的能力。在50℃下孵育摇瓶约30、90和150分钟。如表23所见，漆酶可以在很大程度上对Indigocarmine、Remazol Brilliant Blue和Cibacron Brilliant Red 3B-P脱色。
由于本发明的漆酶有各种底物的高氧化能力，它很适合许多工业应用。所述应用是，例如纤维产品的制造和森林工业的应用，在化妆品工业中和在制备个人护理的工业中的应用，以及其它应用。在这些应用中，温度和pH处于本发明的漆酶起作用的区域。剂量和处理时间可以依赖应用和要处理的材料来选择。
可能需要介体作为增强本发明漆酶效果的添加剂。另外，必须有充足的氧气带入反应。如果需要，氧气可以通过将空气或氧气或富氧的空气带入反应混合物中而添加。
本发明的漆酶适于用在纺织工业中，处理人造或天然纤维或其组合。该酶适于处理纤维素纤维以及蛋白质纤维如羊毛。
本发明的漆酶适于用在林木工业中。可以将含木质素的纤维与漆酶接触。由于漆酶的处理，纤维的强度性质改善了，能用在含木质素的机械碾摩制成的例如纤维板材的制造中、木复合材料中、纸或纸板产品和复合材料中。羊毛纤维也能用本发明的漆酶处理，以赋予它们功能或粘合所述纤维。
本发明的漆酶也能很好地适用于各种化合物的解聚作用。使用本发明的漆酶，牛皮纸浆中的木质素能解聚，从而产生木质素含量较低的纸浆。因而漆酶可以用于纸浆漂白，以降低漂白化学品的使用。漆酶处理后，纸浆漂白性更好的结果是，其后的漂白化学品的消耗减少，当使用含氯化学品时，这导致了不利环境的有机氯化合物的形成减少。
本发明的漆酶也能用于聚合化合物如木质素，以产生高分子量的化合物。
由于酶的高氧化能力，它可以在化妆品工业中或在个人护理产品的工业中，用于氧化染料或染料前体或发色化合物。染料的氧化导致化合物的脱色。该作用能用在例如染发中或美白牙齿时。进行染发通常需要染料前体或修饰剂。
根据本发明的漆酶也能用于改善造纸机的运行能力(runnability)。通过聚合来源于木质素的化合物和提取物，以及通过降低微生物在造纸机内的有害生长，漆酶能用于改善造纸机的运行能力。
本发明漆酶的进一步可能的应用是，在烘焙应用中改良面团的方法，澄清啤酒和葡萄酒的方法，在改进从回收的原材料中生产燃料乙醇的用途和在各种生物去污(bioremediative)方法中的用途，以及在硬表面清洁或清洁剂制剂中的用途。
通常，在上述应用中，处理温度优选30-80℃。更优选50-70℃，尽管反应也能在较低的温度下进行，如在18-30℃温度下。PH可以是3.5-8，优选5-7。处理时间可以是15分钟至24小时，优选30分钟至2小时。剂量可以是0.1-2000，优选1-1000，更优选2-200nkat/g或1待处理的材料。可以加入适量的适用介体。
用于上述应用的组合物包含有效量的本发明的酶或酶制剂，以及适合所探讨的应用的任选添加剂。用于纺织工业的组合物可以包括例如适量表面活性剂、缓冲剂、稳定剂和防腐剂，用于林木工业的组合物可包含例如适量缓冲剂、稳定剂和防腐剂。所有的组合物中应当避免使用对环境和人类(或动物)有害的物质。特别是用于化妆品工业和个人护理产品工业的组合物，不应含有对皮肤或摄食后有害的作用。
本发明提供了用于处理粗斜纹布的、含有根据本发明的漆酶或酶制剂的组合物。本发明还提供了包含根据本发明的漆酶或漆酶制剂的，用于去除污渍的组合物，用于漂白纸浆的组合物，用于纺织工业处理纤维的组合物，用于林木工业处理纤维的组合物，用于处理羊毛的组合物，用于处理毛发的组合物，用于处理染坊废水的组合物，以及用于染料脱色的组合物。
下列实施例意在举例说明本发明，不应理解为以任何方式限制本发明。
实施例1.梭孢壳菌漆酶的生产和提纯
梭孢壳菌漆酶的生产
如Kiiskinen等(2004)所述，用指示剂Remazol Brilliant Blue R-478、鞣酸和愈创木酚，对Roal Oy的培养物收集中的各种菌株筛选其产生漆酶的能力。沙质梭孢壳菌ALKO4197对愈创木酚和Remazol BrilliantBlue R-478显示出阳性反应。
梭孢壳菌真菌+4℃下培养在PD琼脂(Difco)上。接种和生产培养基含有：25g/l葡萄糖(AnalaR)，27.5g/l Bacto酵母提取物(Difco)，0.5mg/ml Indulin AT(Sigma)，0.04l/l矿物质溶液(1.0g/l CaCl22H2O(Riedel-de Haen)，1.0g/l FeSO4·7H2O(Riedel-de Haen)，0.1g/lZnSO4·7H2O(Merck)，0.16g/l CuSO4·5H2O(Merck)，1.0g/l Na2EDTA(Riedel-de Haen))。葡萄糖被分开灭菌并与培养基无菌混合。
微生物在37℃温度下，培养在50或200ml容积的摇瓶中(200rpm)。培养基以5或20ml的公知菌丝体接种。追踪漆酶活性8天，培养6天后达到最高漆酶活性(约20nkat/ml)。制备6个平行培养。细胞用离心法(+4℃，10000g为时10min)从发酵培养基中去除，并进一步提纯培养基滤出液。
梭孢壳菌漆酶的提纯
浓缩的培养基滤出液首先加样在用pH8.5的10mM Tris HCL预平衡的Q Sepharose FF柱上。蛋白质用递增的盐梯度(平衡缓冲液中0-500mM Na2SO4)洗脱。收集漆酶活性级分，加样在Sephacryl S100凝胶过滤树脂上，所述树脂以pH7.0的含有200mM NaCl的20mM Tris缓冲液平衡。提纯后继以考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE。收集漆酶阳性级分并浓缩。去除盐，缓冲液改为pH7.0的20mM Tris缓冲液。为了得到高纯度样品，另外还包括了Resource Q阴离子交换步骤。样品加样到用pH8.5的10mM Tris HCl平衡的Resource Q柱上。蛋白质用1-300mM Na2SO4盐线性梯度洗脱。图1显示了漆酶的提纯。
酶活性分析
用ABTS作底物，测定培养基上清液的漆酶活性。活性分析依照Niku-Paavola等(1988)建立的方法进行。样品用pH4.5的0.025M琥珀酸缓冲液稀释。第一个0.350ml ABTS溶液(11g/l)加至1.15ml稀释液中，反应在436nm波长下进行2分钟。活性表达为nkat。
蛋白含量的测定
蛋白含量用Bio-Rad的DC Protein Assay试剂盒，根据Lowry等(1951)建立的方法测定。分析根据厂商的说明书进行，反应中形成的颜色强度用Perkin Elmer Lambda 20分光光度计，在750nm波长下测定。标准曲线用浓度为0.25-1.25g/l的牛血清白蛋白(BSA，Bio-Rad)确定。
实施例2.提纯的沙质梭孢壳菌漆酶wt TaLccl的特性鉴定
分子量和pI
沙质梭孢壳菌漆酶(wt TaLccl)的分子量在根据Laemmli(1970)的SDS-PAGE上测定。用在SDS-PAGE分析中的凝胶是预制的12％TrisHCl凝胶(BioRad)。通过用考马斯亮蓝(R 350；Pharmacia)染色，蛋白条带可以显色，并与分子量标记(Prestained Protein Marker Broad Range#7708 S；New England BioLabs，Beverly，Mass.)相比较。沙质梭孢壳菌漆酶的分子量大约80kDa。漆酶的等电点在LKB 2117 Multiphor IIElectrophoresis System(LKB Pharmacia，Bromma，Sweden)上，根据制造商的说明书，以pH3-9范围内的等电聚焦(Pharmalyte IEF，Pharmacia)测定。含有漆酶活性的条带，通过以25mM琥珀酸缓冲液(pH4.5)中的2mM ABTS染色凝胶和以考马斯蓝染色蛋白，进行显色。提纯的梭孢壳菌漆酶在等电聚焦中，在等电点(pIs)5.5、5.9、6.4、6.8和6.9显示多条条带。
最适pH
沙质梭孢壳菌漆酶的最适pH用愈创木酚作底物，在pH2.0-8.0范围内的通用McIlvaine缓冲液中进行测定。测定的提纯和粗制孢壳菌漆酶的最适pH示于图2。如图2所示，孢壳菌漆酶的最适pH为5.5，酶在pH7时仍显示相当高的活性，超过该pH活性开始下降。
热稳定性
漆酶的热稳定性在60mM柠檬酸缓冲液(pH6)中，通过孵育酶溶液(0.3gl-1)测定。残留的酶活性在ABTS上测定。如结果所示，漆酶的半衰期在50和60℃下分别为26和5.5小时(图3)。
比活性
测定提纯的梭孢壳菌漆酶对不同的漆酶底物的比活性。测定对ABTS(Niku-Paavola等1988)、二甲氧基苯酚(DMP)(Schlosser等.，1997)、丁香醛连氮(Paszczynski等，1985)和愈创木酚(Leonowicz&Grzywnowicz，1981)的活性。对于ABTS，活性测定于25℃、pH4.5的25mM琥珀酸缓冲液中进行，对于其它底物，在pH5.5的25mM MES缓冲液中进行。结果示于表1。
表1.提纯的梭孢壳菌野生型漆酶(wt TaLccl)的比活性
    底物     Wt TaLccl nkat/mg
    ABTS     1020
    DMP     260
    丁香醛连氮     490
    愈创木酚     63
漆酶的抑制
各种抑制剂对漆酶活性的影响，在带有Orion Research 081010氧电极的密闭和充满的Erlenmeyer烧瓶中，在酶与ABTS反应期间通过测定耗氧来判定(软件：SensorLinkTM PCM800；Orion，Espoo，芬兰)。耗氧率是在30ml反应容积中的25 mM琥珀酸缓冲盐(pH4.5)内，从含有适量漆酶、2mM ABTS和各种不同浓度的抑制剂的溶液中测定。
表2 梭孢壳菌野生型漆酶的抑制
    化合物     浓度     抑制(％)wt TaLccl
    EDTA     10mM     0
    NaN3     0.5mM     99
    KCN     0.1mM     65
    NaCl     0.1mM     35
    NaCl     1mM     42
N-端和内部氨基酸测序
蛋白质的N-端以及内部肽根据Edman降解化学法(Edman和Begg，1967)，用PE Biosystems Procise测序仪测序。对于肽制剂，冻干的蛋白质在37 C下、pH8.3的0.1M碳酸氢铵中，以二硫苏糖醇还原，以碘乙酰胺羧甲基化，并用测序级胰蛋白酶(Promega)以酶/底物质量比1∶100裂解，为期12小时(Stone等，1988)。产生的蛋白以反相高效液相色谱法(RP-HPLC，Vydac C-18柱)用线性乙腈梯度(0.1％三氟乙酸中0-60％乙腈)分离。内部肽序列显示于表3。得不到蛋白质的N-端，因为它被推测是封闭的。
表3 从梭孢壳菌漆酶(ALKO4197)测定的内部肽序列。蛋白质的N-端被推测是封闭的。
肽  序列  SEQ ID NO 注解
肽1  YQGAPNTLPTNQGLPVPNH  SEQ ID NO：1 相等的Ile信号也能在第12个循环看到
肽2  ENWIGPD GVLK  SEQ ID NO：2
肽3  (S)LFLAVGQR  SEQ ID NO：3 (S)结果不明
实施例3.编码TaLccl的沙质梭孢壳菌ALKO4197基因的克隆
标准的分子生物方法用于DNA(质粒，DNA片段)的分离和酶处理、大肠杆菌的转化等。所用的基本方法记述在标准分子生物学手册中，如Sambrook等(1989)以及Sambrook和Russell(2001)。根据厂商的说明书，沙质梭孢壳菌ALKO4197的基因组文库被制成LambdaDASHII载体(Stratagene，USA)。用Raeder和Broda的方法(1985)分离的染色体DNA被Sau3A部分消化。消化的DNA在琼脂糖凝胶中按大小分级，之后所选大小的片段(9-23kb)被分离、脱磷酸并连接到BamHl消化的lambda载体臂上。用Gigapack III XL包装提取物，按照制造商的说明书(Stratagene，USA)包装连接混合物。基因组的滴度为1.2×106pfu/ml，扩增文库为1.1×1010pfu/ml。
用于基因文库筛选的探针，用梭孢壳菌ALKO4197基因组DNA作模板，通过PCR进行扩增。首先，数个引物(简并寡核苷酸)在PCR反应中被计划(表4，SEQ ID NO：4-9)和测试。引物的序列建立在从提纯的TaLccl中获得的肽的氨基酸序列基础上(图5)。在PCR反应中，根据在发表的漆酶序列中肽同源物的位置来选择引物的组合。PCR反应混合物含有：50mM Tris-HCl，pH9.0，15mM(NH4)2SO4，0.1％TritonX-100，5％DMSO，3mM MgCl2，0.2mM dNTPs，每种引物5μM和2单位的Dynazyme EXT DNA聚合酶(Finnzymes，芬兰)，以及大约5μg的基因组DNA。PCR反应的条件如下：95℃下5分钟初始变性，随后95℃下1分钟，50℃下退火1分钟，72℃下延伸2分钟30个循环和72℃下的终末延伸10分钟。从用引物组合物POX27/POX31和POX28/POX31进行的PCR反应中，得到了最特异的结果和具有预期大小的DNA产物(以发表的真菌漆酶序列计算)。从这两个反应中分离DNA片段，并将它们克隆到pCRBlunt-TOPO载体(Invitrogen，USA)上。DNA产物通过测序，并与数种限制性酶消化的基因组梭孢壳菌DNA进行Southern点杂交，鉴别其特性。在严格的清洗条件下，从两个片段得到的杂交模式一致。两个片段的推导的氨基酸序列，含有与数个发表的漆酶序列同源的序列(BLAST program，version 2.2.9 atNCBI，National Center for Biotechnology Information；Altschul et al.，1990)。
从使用引物POX27和POX31的PCR反应中所得的1kb片段，被选作筛选基因文库的探针。该片段的序列包括使用引物POX28和POX31扩增的基因区。同样，推导的氨基酸序列包括内部TaLccl Peptide3序列(实施例2，图5)。含有PCR片段的pCRBlunt-TOPO载体被命名为pALK.1550。
表4合成作为PCR引物的寡核苷酸(SEQ ID NOs：4-9)，用于扩增从基因组文库筛选Talccl的探针。Oligo，寡核苷酸；Oligo定位，用于寡核苷酸序列设计中的肽的氨基酸。
Oligo    长度(nts)     简并度(a  序列(b   肽(c     Oligo定位
POX26     26     8  GAGAACTGGATCGGYCCCGAYGGYGT(s)   TaLccl 2     1-9
POX27     17     48 GARAAYTGGATHGGXCC(s)   TaLccl 2     1-6
POX28     20     16 CTCTTCCTCGCYGTSGGYCA(s)   TaLccl 3     2-8
POX29     20     16 TGRCCSACRGCGAGGAAGAG(as)   TaLccl 3     2-8
POX30     20     8 TACCAGGGYGCYCCSAACAC(s)   TaLccl 1     1-7
POX31     20     8 GTGTTSGGRGCRCCCTGGTA(as)(d   TaLccl 1     1-7
(a为了降低简并度，根据真菌的偏好来选择一些密码子。
(bD＝A或G或T，H＝A或C或T，R＝A或G，S＝C或G，W＝A或T，X＝I(肌醇)或C，Y＝T或C；括号中的″s″＝有义链，括号中的″as″＝反义链。
(c肽序列包括在图5中。
(d密码子的用法根据从C.thermophilum ALKO4265(EMBLAJ508931-508933)中分离的木聚糖酶基因xynllA、xynllB和xynllC中的偏好来选择。
来自质粒pALK1550的插入片段根据厂商说明书用洋地黄毒甙配基(Roche，德国)标记。来自扩增的基因组文库的大约1.8×105菌斑菌班被筛选。滤出物的杂交温度为68℃，滤出物用2xSSC-0.1％SDS在RT清洗2×5min，随后用0.1xSSC-0.1％SDS在68℃下清洗2×15min。得到数个阳性菌班。一些阳性菌班出现强杂交，但另外，也有很多菌班与探针的杂交较弱。提纯5个强杂交菌班(F1-F5)，并分离噬菌体DNA。噬菌体DNA的Southern点杂交揭示，克隆F1、F2和F3均包括与探针杂交的大约3kb XhoI和大约7kb BαmHI片段。这些片段和另外的6.1kb SαcII和3.8kb SpeI片段，从克隆F1中分离。所述片段与pBluescript II KS+或SK+载体(Stratagene，USA)连接，得到的质粒命名为pALK1606(XhoI片段)、pALK1607(BαmHI片段)、pALK1341(SαcII片段)和pALK1342(SpeI片段)。编码TaLccl的基因从这些克隆和从pALK1607分离的较短的亚克隆中测序。全长Talccl基因包括在质粒pALK1607、pALK1341和pALK1342中。包含质粒pALK1342的大肠杆菌菌株RF5473保藏在DSM收藏中(DSM 15484)。
Talccl序列(SEQ ID NO：11)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)示于图6。基因长度为2279bp(包括终止密码子)。发现6个内含子的长度为51、62、91、83、79和59bps。推导的蛋白质序列由617个氨基酸组成，所述氨基酸包括21个氨基酸的预测信号序列(SignalP V2.0；Nielsen等，1997以及Nielsen和Krogh，1998)和13个氨基酸的“尾”序列(从序列DSGL后开始)。从wt TaLccl提纯的肽均发现来自推导的氨基酸序列，表明克隆的基因编码从ALKO4197提纯的漆酶。成熟多肽的预测分子量为64456Da，预测的pI为6.31(氨基酸22-604、信号序列和C-端尾被去除)。这些预测是在ExPASy服务器上用ComputepI/MW工具完成的(Gasteiger等，2003)。推导的氨基酸序列包括9个推定的N-糖基化位点。用NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)的BLAST程序2.2.9版，研究同已发表的漆酶序列的同源性(Altschul等，1990)。与漆酶的最高同源性是从Melanocarpusalbomyces、鹅柄孢壳菌(Podospora anserina)和粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)(EMBL编号CAE00180.1，LAC2_PODAN，XP_323881.1)中发现的。TaLccl序列与所述三个漆酶序列对比，与BLAST研究中与TaLccl的同一性超过50％的NCBI数据库中的其它序列对比，并与从专利数据库发现的嗜热毁丝霉和嗜热色串孢的漆酶序列对比(分别为EP0765394B1/US 5,981,243和US 5,750,388)。用Needleman-Wunsch总体比对(EMBLOSUM62，空隙罚分10.0，延伸罚分0.5；EMBOSS程序包2.9.0版)所得的同一性数值示于表5。
表5得自推导的漆酶氨基酸序列的Needleman-Wunsch总体比对的同一性数值(％)。包括信号肽的全长氨基酸序列被比对。矩阵：EMBLOSUM62，空隙罚分10.0，延伸罚分0.5。MaL：Melanocarpusalbomyces CAK001810；Mth：EP 0765394 B1的嗜热毁丝霉；Pan：鹅柄孢壳菌LAC2_PODAN；Sth：US 5,750,388的嗜热色串孢；Ncr LAC1：粗糙脉孢菌LAC1_NEUCR；Ncr XP：粗糙脉孢菌XP_323881；NcrKSNCLO：粗糙脉孢菌KSNCLO；Ncr LAC2.：粗糙脉孢菌LAC2_NEUCR；Cpa：寄生隐丛赤壳菌(Cryphonectria parasitica)LAC1_CRYPA；Ggr：禾顶囊壳小麦变种菌(Gaeumannomyces graminisvar tritici)CAD100749。
 TaLccl     Mai     Mth   Pan   Sth   NcrLAC1   NcrXP   NcrKSNCLO   NcrLAC2   Cpa   Ggr
  TaLcclMaLMthPanSthNcrLAC1NcrXPNcrKSNCLONcrLAC2CpaGgr  100.0     73.1100.0     68.373.1100.0   66.768.067.1100.0   62.666.064.059.8100.0   60.762.159.861.457.6100.0   60.762.160.061.457.899.5100.0   60.661.959.861.457.699.799.8100.0   60.461.659.461.257.597.798.298.1100.0   57.556.656.755.354.754.254.254.154.7100.0   51.048.949.749.349.846.546.646.446.646.3100.0
实施例4里氏木霉(Trichoderma reesei)中重组TaLccl的生产
为在里氏木霉中生产重组TaLccl，构建表达质粒pALK1667。Talccl基因与其自身的信号序列，通过PCR与里氏木霉cbhl(cel7A)启动子精确融合。所包括的cbhl启动子、cbhl终止子、amdS标记和cbhl 3′侧翼区同Paloheimo等(2003)的描述。Talccl基因片段以Nco I从3’端切除。该裂解在构建中留下了80bp的Talccl终止子，在cbhl终止子序列之前。EcoRI消化后，10.1kb线性表达盒(图7)从载体骨干(backbone)中分离，并转化到里氏木霉A47原生质体中。转化按照Penttila等(1987)进行，伴有Karhunen等(1993)描述的修饰。转化子在通过形成孢子接种到PD上之前，通过单一的分生孢子在选择平板上提纯。
转化子的漆酶产物从摇瓶培养(50ml)的培养基上清液中分析。转化子在以5％KH2PO4缓冲和添加0.1mM CuSO4的复合的基于乳糖的纤维素酶诱导培养基(Joutsjoki等，1993)上，pH6.0，培养7天。漆酶活性如实施例1所述，用ABTS作底物分析。通过斑点杂交(MinifoldI-SRC 96；Schleicher&Schuell，Dassel，德国)或Western杂交，筛选表达盒对cbhl基因座的可能寻靶作用，作为CBHI-阴性表型。CBHI蛋白的检测用单克隆抗体CI-258或CI-261(Aho等，1991)以及ProtoBlotWestern blot AP体系(Promega)进行。选择的转化子的基因型用包括数个基因组消化的Southern点杂交证实，各自的表达盒用作探针。
选中的CBHI-阴性转化子RF5597和RF5598进行发酵，得到原料用于提纯重组TaLccl(实施例5)和用于应用实验(实施例7-12)
实施例5.里氏木霉中表达的羧孢壳菌(ALKO4197)的TaLccl提纯
TaLccl是多等电点的同工漆酶，即酶在pH范围5.5-6.9内等电聚焦和随后的活性染色中，显示6-7条清晰的条带。培养基上清的缓冲液首先改为用Sephadex G25树脂的5mM Tris-HCl缓冲液，pH8.5。样品加样在预先平衡的DEAE Sephadex FF柱上。蛋白质用线性Na2SO4盐梯度(0-350mM)洗脱。收集DEAE Sepharose的漆酶阳性级分，缓冲液改为用Pharmacia PD 10柱的5mM Tris-HCl缓冲液，pH8.5。样品加样在预先平衡的Resource Q柱上。蛋白质用渐增的线性Na2SO4(0-200mM)洗脱。漆酶阳性级分用5-40mM Na2SO4盐浓度洗脱。最后的提纯步骤以凝胶过滤进行。收集Resource Q的漆酶阳性级分，以ContraSepMWCO 10kDa浓缩。样品上样在预平衡的Sephacryl S-100凝胶过滤柱上。用于凝胶过滤的缓冲液是含有150mM NaCl的100mM Tris-HCl，pH7.3。显示重组TaLccl漆酶提纯的SDS-PAGE示于图4。
实施例6.重组TaLccl漆酶的性质
提纯的重组沙质梭孢壳菌TaLccl根据实施例2所叙述的最适pH、热稳定性和等电点，鉴别特性。通过MALDI-TOF质谱法，在UltraflexTM飞行时间仪上(BrukerDaltonics，德国)按照以前的描述(Palonen等，2003)测定分子量。TaLccl的氧化还原潜力，也用组合的Pt-AgCl/KCl微电极在pH5.0下根据Sigoillot等(2004)进行测定。
特性鉴定结果汇集于表6。
表6.重组沙质梭孢壳菌TaLccl(rTaLccl)和野生型TaLccl(wtTaLcc)漆酶的特性总结。Nd＝检测不到
  漆酶   对愈创木酚的最适pH     T1/2(60℃)(hrs)   PI   PI同工型数目  MW(MALDI-TOF)     E0mV
  rTaLccl   6.0     5   5.5-6.9   6-7  71890     560
  wtTaLcc   6.0     5.5   5.5-6.9   6-7  Nd     nd
不同化合物对重组TaLccl漆酶活性的抑制作用按照实施例2的叙述测定。结果示于表7。
表7.各种化合物对重组沙质梭孢壳菌TaLccl漆酶(rTaLccl)的抑制作用。抑制作用在标准条件下以ABTS作为底物，通过氧耗测定检验(实施例2)。野生型沙质梭孢壳菌漆酶(wtTaLcc)的抑制结果作为对照也展示出来，Nd＝检测不到
  化合物   浓度(mM)   漆酶的抑制(％)
  wtTaLcc   rTaLccl
  EDTA   10   0   5
  NaN3   0.5   99   95
  KCN   0.1   65   60
  KCN   1   Nd   90
  NaCl   0.1   35   0
  NaCl   1   42   0
提纯的TaLccl的比活性按照实施例2所描述，相对于ABTS、二甲氧苯酚(DMP)、丁香醛连氮和愈创木酚测定。ABTS活性测定在25℃下pH4.5的25mM琥珀酸缓冲液中进行，其它活性在pH5.5的25mMMES缓冲液中进行。结果示于表8。
表8.重组TaLccl(rTaLccl)比活性与野生型酶(wtTaLcc)比活性的比较。
    底物   比活性wt TaLcc(nkat/mg)     比活性rTaLccl(nkat/mg)
    ABTS   1020     910
    DMP   260     285
    丁香醛连氮   490     340
    愈创木酚   63     61
本文所展示的生化数据清楚地表明，重组TaLccl与从培养基上清提纯的野生型梭孢壳菌漆酶是同样的蛋白质。
梭孢壳菌和Melanocarpus漆酶的动力学参数
测定对ABTS、2，6-二甲氧苯酚(DMP)和丁香醛连氮的动力学参数、米-曼氏常数Km、转化数(turn-over number)kcat和专一性常数(specificity constant)(kcat/Km)。对ABTS进行的测定在pH4.5的25mM琥珀酸缓冲液中完成。对丁香醛连氮和DMP用pH6的40mM MES缓冲液和25mM琥珀酸缓冲液。所有的活性分析在25℃下进行。动力学参数通过非线性回归曲线拟合来计算。结果示于表9。数值与Melanocarpus albomyces MaL漆酶的数值相比较。
表9.对ABTS、丁香醛连氮和DMP测定的重组TaLccl的动力学参数。一种公知的来自Melanocarpus albomyces MaL的漆酶的数值也展示作为对照。
    TaLccl     MaL
                                ABT
    Km(μM)     75     270
    kcat(min-1)     4130     4690
    kcat/Km(M-1min-1)     5.51*107     1.8*107
                                DMP
    Km(μM)     17     5
    kcat(min-1)     4030     4160
    kcat/Km(M-1min-1)     2.37*108     8.1*108
                                丁香醛连氮
    Km((μM)     4.3     1.3
    kcat(min-1)     1940     4710
    kcat/Km(M-1min-1)     4.51*108     3.6*109
实施例7不同pH值下，TaLccl漆酶制剂在粗斜纹布漂白中的性能
在实施例7-12，用木霉(Thrichoderma)作宿主产生的重组TaLccl漆酶制剂用于所有的应用试验中。检验TaLccl制剂(来自菌株RF5598)漂白粗斜纹布的能力，并与Novozymes的商用漆酶制剂DeniLite II Base比较。
Lee Cooper牛仔布(Hamilton，111-1060-55522-65，MASI CompanyOy，芬兰，曾用名M.A.S.I.jeans Oy)，用环锭纱(ring spun yarn)为经线、转杯纱(open-end yarn)为纬线制成，预先用过中性ECOSTONE纤维素酶脱浆和处理，用作实验材料。漆酶处理在LP-2 Launder Ometer按如下进行。大约10g粗斜纹布小块布样(15×14cm)被加入到pH5、6或7的含有200ml Mc Ilvaine′s柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液的1.2升容器中，适度温热容器。加入带有或不带有介体(丁香酸甲酯，DeniLite IIAssist，Novozymes)的酶。根据织物重量，酶剂量为200nkat/g，介体为10mg/g。酶活性同实施例1用ABTS底物测定，但是全部的实施例7-12用柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液。Launder Ometer机在50℃下运行30分钟，其后Launder的温度升高到80℃，为期10分钟。小块布样用热水仔细漂洗，在转筒中干燥至半干，之后晾干。
漂白效果在Minolta分光光度计CM 1000(Minolta Co.)上，用L*a*b*色彩空间坐标(光源D65/2°)，通过测定色彩作为反射率值来评价。测定漆酶处理前后布样双面的颜色。每次测量都是数次、至少10次测量的平均。
表10和图8清楚地表明，在粗斜纹布靛青染色的脱色方面，TaLccl漆酶在pH5-7的全部pH值下，较商用DeniLite II Base优越，pH6最佳。只有TaLccl制剂能够达到具有高光亮度值的强烈的漂白外观。粗斜纹布反面的光亮度增加和蓝度减少，也是用TaLccl漆酶制剂和介体处理最高。没有介体，漆酶对粗斜纹布就没有可观察到的效果(表11)。后来用漆酶进行的漂白实验显示，酶在很宽的pH范围(4-8)下工作良好。
表10.用漆酶制剂和介体在pH5-7在Launder中处理的粗斜纹布正面的色彩测量。L*指示光亮度，-b*是蓝色方向，+b*黄色方向。
  制剂   酶nkat/g     介体mg/g   条件       漆酶处理前       漆酶处理后     L*的增加
  L*   b*   L*   B*
  TaLccl   200     10   30min，50℃，PH5   28.52   -18.46   42.04   -14.78     13.52
  DeniLite   200     10   30min，50℃，PH5   28.41   -18.70   35.70   -17.59     7.29
  TaLccl   200     10   30min，50℃，PH6   27.78   -18.49   48.97   -12.36     21.19
  DeniLite   200     10   30min，50℃，PH6   26.98   -18.67   34.16   -17.82     7.18
  TaLccl   200     10   30min，50℃，PH7   27.79   -19.00   44.71   -14.43     16.92
  DeniLite   200     10   30min，50℃，pH7   28.67   -18.99   34.51   -17.75     5.84
表11.在pH5-7在Launder中，用没有介体的漆酶制剂处理或仅用介体处理的粗斜纹布正面的色彩测量。L*指示光亮度，-b*是蓝色方向，+b*黄色方向。
  制剂 酶nkat/g     介体mg/g  条件     漆酶处理前       漆酶处理后   L*的增加
 L* b*   L*   B*
  TaLccl 200     0  30min，50℃，pH5  28.08 -18.41   28.22   -18.35   0.14
  DeniLite 200     0  30min，50℃，pH5  29.18 -18.55   29.30   -18.34   0.12
  Mediator 0     10  30min，50℃，PH5  29.85 -18.58   29.90   -18.15   0.05
  TaLccl 200     0  30min，50℃，pH6  28.77 -18.77   29.58   -18.38   0.82
  DeniLite 200     0  30min，50℃，PH6  28.55 -18.48   28.77   -18.52   0.22
  Mediator 0     10  30min，50℃，pH6  28.68 -18.40   28.90   -18.37   0.22
  TaLccl 200     0  30min，50℃，pH7  27.43 -18.93   27.80   -18.50   0.37
  DeniLite 200     0  30min，50℃，pH7  27.82 -18.93   29.78   -18.31   1.96
  Mediator 0     10  30min，50℃，PH7  29.00 -18.94   30.06   -18.46   1.06
实施例8.不同温度下TaLccl漆酶制剂在粗斜纹布漂白中的性能
检验来自RF5598菌株的TaLccl酶制剂(实施例7)在不同温度下漂白粗斜纹布的能力，并与Novozymes的商用漆酶制剂DeniLite IIBase比较。
实验体系和粗斜纹布与实施例7相同，除了在Launder中漆酶和介体处理期间的条件是30分钟、pH6和温度30-80℃。还有，酶失活是通过如下在Launder中碱处理而不是升高温度。从容器中取出布样后，将其浸在含有NaOH(pH11.5)的温水中10分钟，用温水仔细清洗。布样在滚筒中半干，然后晾干。漂白效果按照实施例7，通过测定色彩作为反射率值来评价。
表12和图9显示，TaLccl漆酶在30-80℃下漂白粗斜纹布，较DeniLite II Base优越(光亮度更高)。60-70℃温度对TaLccl最佳，粗斜纹布织物的外观强烈褪色。DeniLite II Base只能中度脱色靛青。
表12不同温度下的Launder中，漆酶和介体处理的粗斜纹布正面的色彩测定。L*指示光亮度，-b*是蓝色方向，+b*黄色方向。
  制剂     酶nkat/g     介体mg/g   条件       漆酶处理前       漆酶处理后   L*的增加
  L*   b*   L*   B*
  TaLccl     200     10   30min，30℃，pH6   29.58   -18.82   33.68   -19.17   4.10
  DeniLite     200     10   30min，30℃，pH6   29.56   -18.60   32.73   -18.77   3.17
  TaLccl     200     10   30min，40℃，pH6   28.81   -19.03   37.49   -18.64   8.68
  DeniLite     200     10   30min，40℃，pH6   28.87   -18.90   32.94   -19.14   4.07
  TaLccl     200     10   30min，50℃，pH6   28.40   -18.88   42.99   -17.06   14.59
  DeniLite     200     10   30min，50℃，pH6   28.41   -19.10   34.67   -19.07   6.26
  TaLccl     200     10   30min，60℃，pH6   29.14   -19.03   47.56   -14.55   18.42
  DeniLite     200     10   30min，60℃，pH6   29.06   -18.99   35.92   -1 8.33   6.86
  TaLccl     200     10   30min，70℃，pH6   29.09   -19.03   46.94   -13.82   17.85
  DeniLite     200     10   30min，70℃，pH6   29.05   -19.15   36.72   -17.35   7.67
  TaLccl     200     10   30min，80℃，pH6   29.39   -19.01   39.24   -15.74   9.85
  TaLccl     200     0   30min，80℃，pH6   29.63   -19.16   30.27   -18.62   0.64
  DeniLite     200     10   30min，80℃，pH6   29.28   -18.97   35.33   -17.02   6.05
  DeniLite     200     0   30min，80℃，pH6   29.81   -18.74   31.69   -18.19   1.88
实施例9.漆酶-介体体系中酶剂量对粗斜纹布漂白的作用
预先用ECOSTONE纤维素酶洗涤的Lee Cooper牛仔布(实施例7)，用不同漆酶剂量的木霉菌株RF5598的TaLccl漆酶产品和Novozymes的DeniLite Base处理。漆酶处理用Electrolux′s WascatorFOM 71 CLS洗涤脱水机，在每种酶的最适条件下进行，示于表13。丁香酸甲酯(实施例7)用作介体。脱水后用NaOH(10分钟，60℃)升高pH超过11，灭活漆酶。织物在滚筒中干燥。
表13不同剂量的TaLccl和DeniLite II Base漆酶用在漂白试验中的方法参数。
    方法参数     TaLccl漆酶     DeniLite II Base漆酶
    粗斜纹布加样量     1.5kg     1.5kg
    水     15l     15l
    缓冲液/pH控制     37.5g Na2HPO4*2H2O14.7g柠檬酸     醋酸
    pH     6     5-5.5
    时间     30min或60min     30min
    温度     60℃     60℃
    酶剂量     20或100nkat/g织物     20或100nkat/g织物
    介体剂量     1或5mg/g织物     1或5mg/g织物
漂白效果通过测定漆酶处理后的色彩作为反射率值(同实施例7)来评价，并将该值与先前测定的纤维素酶处理后的值相比较。结果在表14和图10中，显示剂量的增加能大大改善TaLccl漆酶的漂白性能。
DeniLite II Base的剂量作用低。将时间从30分钟增至60分钟进一步改善了TaLccl漆酶的性能。如Mueller和Shi(2000)所探讨，对于DeniLite，增加的处理时间长于30分钟不再出现附加的漂白性能。用TaLccl漆酶，可能实现通常只有用高量次氯酸钠才能得到的很强的漂白效果。磨损的外观也得以保持。迄今尚没有用漆酶-介体体系得到粗斜纹布光亮度高增长的报导。
表14在Launder中用不同剂量的漆酶制剂和介体处理粗斜纹布正面的颜色测定。L*指示光亮度，-b*是蓝色方向，+b*黄色方向。
  制剂   酶nkat/g     介体mg/g  条件       漆酶处理前       漆酶处理后   L*的增加
 L*   b*   L* B*
  TaLccl   20     1  30min，60℃，pH6  28.37   -18.56   40.61 -16.16   12.24
  TaLccl   100     5  30min，60℃，pH6  27.96   -18.88   49.84 -13.75   21.88
  TaLccl   20     1  60min，60℃，pH6  27.63   -18.54   42.72 -15.61   15.09
  TaLccl   100     5  60min，60℃，pH6  27.78   -18.91   53.46 -11.64   25.68
  DeniLite   20     1  30min，60℃，pH5.3   28.78   -18.46   36.13 -17.12   7.35
  DeniLite   100     5   30min，60℃，pH5-5.5   28.88   -18.74   37.19 -17.37   8.32
实施例10用漆酶-介体体系漂白粗斜纹布与次氯酸钠漂白的比较
不同类型的粗斜纹布以木霉菌株RF5597的TaLccl漆酶产物和Novozymes的DeniLite II Base处理，所得的结果与次氯酸漂白进行比较。收集总共27样不同种类的粗斜纹布(整条牛仔裤)用于检验(表15)，均预先在脱浆后用纤维素酶洗涤至不同的磨损程度或者仅以ECOSTONEA200(60℃，10min)脱浆。这些仔裤以靛青染色的粗斜纹布制成，除了含有用硫磺打底的靛青染色粗斜纹布的English仔裤。牛仔裤剪切的方式是能够使用同一条牛仔裤的所有布片都可以用于所有的试验。
牛仔裤用靛青染色的粗斜纹布(右斜纹)制成，除了含有用硫磺打底的靛青染色粗斜纹布的English仔裤。最初的(即未经脱浆)粗斜纹布织物的重量通常高于475g/m2(14oz/yd2)。在室温下(大约22℃，相对湿度大约64％)孵育24小时后，测定三片10cm×10cm布片的重量。
表15.用在漂白测试中的粗斜纹布样品
  样品   粗斜纹布类型   粗斜纹布来源 用在纤维素酶处理中的酶
  T1   Tincan牛仔裤   MASI Company Oy，芬兰 只脱浆，未用纤维素酶处理
  T2   Tincan牛仔裤   MASI Company Oy，芬兰 Ecostone N400，AB Enzymes
  T3   Tincan牛仔裤   MASI Company Oy，芬兰 Ecostone L300，AB Enzymes
  T4   Tincan牛仔裤   MASI Company Oy，芬兰 Denimax 99IS，Novozymes
  LI   Lee Cooper牛仔裤   MASI Company Oy，芬兰 只脱浆，未用纤维素酶处理
  L2   Lee Cooper牛仔裤   MASI Company Oy，芬兰 Ecostone L，AB Enzymes
  L3   Lee Cooper牛仔裤   MASI Company Oy，芬兰 Biotouch C29，AB Enzymes
  L4   Lee Cooper牛仔裤   MASI Company Oy，芬兰 Ecostone L，AB Enzymes
  L5   Lee Cooper牛仔裤   MASI Company Oy，芬兰 Indiage Max L，Genencor International
  L6   Lee Cooper牛仔裤   MASI Company Oy，芬兰 Indiage Super L，GenencorInternational
  L7   Lee Cooper牛仔裤   MASI Company Oy，芬兰 Ecostone CXP500 Exper.，ABEnzymes
  L8   Lee Cooper牛仔裤   MASI Company Oy，芬兰 Ecostone CXP experimental，ABEnzymes
  L9   Lee Cooper牛仔裤   MASI Company Oy，芬兰 Ecostone N400，AB Enzymes
  W1   Warric牛仔裤   Iki-Asu Oy，芬兰 只脱浆，未用纤维素酶处理
  W2   Warric牛仔裤   Iki-Asu Oy，芬兰 Ecostone P4500，AB Enzymes
  W3   Warric牛仔裤   Iki-Asu Oy，芬兰 Indiage Max G，GenencorInternational
  W4   Warric牛仔裤   Iki-Asu Oy，芬兰 Ecostone NP2000，AB Enzymes
  W5   Warric牛仔裤   Iki-Asu Oy，芬兰 Ecostone L900，AB Enzymes
  we   Warric牛仔裤   Iki-Asu Oy，芬兰 Denabraide MBL 65 E，Iogen
  E1   English牛仔裤   English公司 只脱浆，未用纤维素酶处理
  E2     English牛仔裤     English公司   Ecostone NP2000，AB Enzymes
  E3     English牛仔裤     English公司   Rocksoft NCE-EA，Dyadic
  E4     English牛仔裤     English公司   Rocksoft NCE-2X，Dyadic
  E5     English牛仔裤     English公司   Ecostone L900，AB Enzymes
  E6     English牛仔裤     English公司   Ecostone L900，AB Enzymes
  E7     English牛仔裤     English公司   Ecostone L900，AB Enzymes
  B1     Basic牛仔裤     MASI Company Oy，芬兰   Ecostone P1250，AB Enzymes
在每种酶的最佳条件下，用Electrolux′S Wascator FOM 71 CLS洗涤脱水机执行漆酶处理，描述在表16中。丁香酸甲酯(实施例7)用作介体。脱水后漆酶通过用NaOH将pH提高至超过11(10min，60℃)灭活并漂洗3次。织物在滚筒中干燥。
表16用于TaLccl和DeniLite II Base漆酶制剂漂白测试中的方法参数
    方法参数     TaLccl漆酶     DeniLite II Base漆酶
    加样的粗斜纹布     1.5kg     1.5kg
    水     15l     15l
    缓冲液     37.5g Na2HPO4*2H2O14.7g柠檬酸     37.5g Na2HPO4*2H2O25.5g柠檬酸
    pH     6     5
    时间     30min     30min
    温度     60℃     60℃
    酶剂量     100nkat/g织物     100nkat/g织物
    介体剂量     5mg/g织物     5mg/g织物
次氯酸钠漂白以Electrolux′s Wascator FOM 71 CLS洗涤脱水机进行，所用的粗斜纹布来自表17描述的条件下进行漆酶处理的同一条牛仔裤。氢氧化钠在加入25ml/l的10％次氯酸钠溶液(Klorite Forte，Farmos Oy)之前加入，保持处理期间的pH超过10.5。在排去漂白液体后，在用硫代硫酸钠脱氯之前，有一个液体比例1∶20的2分钟漂洗步骤。脱氯后，粗斜纹布样品用1∶20的液体比例清洗3次，每次2分钟。织物在滚筒中干燥。
表17用在次氯酸钠漂白和脱氯中的方法参数
    方法参数     NaOCl漂白     脱氯
    加样的粗斜纹布     1.5kg     1.5kg
    水     22l     15l
    NaOH     6.6g     -
    次氯酸钠     550ml 10％NaOCl     -
    硫代硫酸钠     ～     30g(2 g/l)
    pH     11.5-11.9
    处理时间     15min     5min
    温度     40℃     30℃
漂白效果通过如实施例7测定色彩反射率值来评价。得到的结果示于表18-20和图11。在上述的每种纤维素酶处理的粗斜纹布样品的条件下，TaLccl漆酶较DeniLite II Base漆酶更优(大约好于55-200％)，较次氯酸钠漂白也更优(甚至好于60-115％)。用只经过脱浆的织物，以TaLccl制剂得到的漂白效果(L*在粗斜纹布正面的增加)等于或好于次氯酸钠，并且优于DeniLite II Base100％。得到的不同外观取决于粗斜纹布类型和所用的纤维素酶处理。“硫磺-打底型”粗斜纹布最难于漂白。
表18.用TaLccl漆酶制剂(RF5597)处理粗斜纹布正面的色彩测定。L*指示光亮度，-b*是蓝色方向，+b*黄色方向。
    样品号         漆酶处理前         漆酶处理后     L*的增加
    L*     b*     L*     b*
    T1     25.02     -12.75     34.82     -16.36     9.80
    T2     28.20     -16.20     42.70     -14.60     14.50
    T3     29.08     -17.04     47.09     -14.04     18.01
    T4     27.16     -16.26     43.53     -15.18     16.37
    L1     20.21     -16.14     33.13     -19.41     12.92
    L2     31.81     -19.08     50.89     -13.17     19.08
    L3     28.45     -19.38     47.66     -14.82     19.21
    L4     29.42     -19.31     48.39     -13.83     18.97
    L5     28.49     -18.82     47.73     -14.28     19.24
    L6     29.54     -18.64     46.71     -14.68     17.17
    L7     27.20     -19.02     42.95     -16.23     15.75
    L8     29.46     -19.04     46.73     -14.86     17.27
    L9     28.80     -18.73     45.02     -14.91     16.22
    W1     18.03     -13.04     28.54     -17.55     10.51
    W2     26.12     -17.08     42.16     -14.48     16.04
    W3     28.55     -16.63     44.08     -13.66     15.53
    W4     26.22     -16.13     39.54     -14.72     13.32
    W5     23.97     -17.54     40.49     -15.38     16.52
    W6     24.01     -17.01     39.58     -15.62     15.57
    -E1     17.47     -10.05     22.71     -13.97     5.24
    E2     25.48     -14.75     35.99     -14.08     10.51
    E3     25.26     -15.91     36.52     -14.46     11.26
    E4     27.04     -15.91     38.79     -13.94     11.75
    E5     25.19     -15.32     37.53     -14.03     12.34
    E6     22.54     -14.90     34.17     -14.79     11.63
    E7     22.84     -15.72     36.00     -14.95     13.16
    B1     29.48     -14.67     47.19     -12.75     17.71
表19.用DeniLite II Base漆酶处理粗斜纹布正面的色彩测定。L*指示光亮度，-b*是蓝色方向，+b*黄色方向。
    样品号         漆酶处理前         漆酶处理后     L*增加
    L*     b*     L*     b*
    T1     24.66     -12.76     28.84     -15.02     4.18
    T2     28.54     -15.97     33.34     -16.19     4.80
    T3     29.78     -16.94     37.86     -16.80     8.08
    T4     27.68     -15.70     35.00     -16.79     7.32
    LI     19.99     -16.35     25.75     -18.94     5.76
    L2     32.70     -18.39     43.80     -15.74     11.10
    L3     28.67     -18.94     39.27     -17.47     10.60
    L4     29.40     -19.40     40.28     -17.19     10.88
    L5     28.29     -19.10     39.14     -17.26     10.85
    16     29.74     -18.84     40.48     -16.45     10.74
    L7     27.70     -18.73     35.54     -18.26     7.84
    L8     29.86     -18.71     40.39     -16.80     10.53
    L9     28.95     -18.71     38.85     -16.89     9.90
    W1     18.67     -12.81     23.04     -16.09     4.37
    W2   26.62     -16.80     35.70   -15.85     9.08
    W3   28.06     -16.83     36.90   -15.48     8.84
    W4   26.42     -16.27     33.25   -15.53     6.83
    W5   24.28     -17.43     33.47   -16.62     9.19
    W6   24.32     -17.14     33.00   -16.66     8.68
    E1   16.94     -9.80     19.11   -12.36     2.17
    E2   25.49     -14.17     31.54   -14.34     6.05
    E3   24.97     -15.82     32.23   -14.90     7.26
    E4   27.47     -15.23     34.26   -14.76     6.79
    E5   24.42     -15.68     32.37   -15.02     7.95
    E6   22.58     -14.91     29.30   -15.11     6.72
    E7   22.76     -15.56     30.73   -15.26     7.97
    B1   28.65     -14.84     36.29   -14.95     7.64
表20用次氯酸钠处理粗斜纹布正面的色彩测定。L*指示光亮度，-b*是蓝色方向，+b*黄色方向。
    样品号         漆酶处理前         漆酶处理后     L*增加
  L*   b*   L*   b*
    T1   25.02   -12.87   33.97   -17.95     8.95
    T2   27.65   -16.05   34.38   -18.22     6.73
    T3   29.09   -16.80   40.33   -18.30     11.24
    T4   27.56   -16.00   37.66   -18.58     10.10
    LI   20.54   -16.12   31.23   -20.83     10.69
    L2   31.14   -19.03   44.11   -18.60     12.97
    L3   28.45   -18.64   39.71   -19.67     11.26
    L4   29.15     -19.26   40.63   -19.25     11.48
    L5   28.00     -19.01   39.47   -19.48     11.47
    L6   29.08     -18.61   41.50   -18.68     12.42
    L7   26.76     -19.03   37.91   -19.85     11.15
    L8   28.76     -18.67   40.74   -19.12     11.98
    L9   28.91     -18.40   40.82   -18.82     11.91
    W1   17.58     -13.07   27.75   -18.76     10.17
    W2   25.59     -17.16   39.35   -17.39     13.76
    W3   28.12     -16.57   41.11   -16.79     12.99
    W4   25.78     -16.11   38.07   -17.33     12.29
    W5   23.72     -17.39   37.12   -18.03     13.40
    W6   23.75     -16.81   36.65   -17.95     12.90
    E1   16.76     -10.10   21.91   -15.03     5.15
    E2   25.49     -14.17   33.30   -16.43     7.36
    E3   24.73     -15.52   34.13   -16.73     9.40
    E4   26.55     -15.56   35.83   -16.86     9.28
    E5   24.57     -15.48   33.85   -16.48     9.28
    E6   22.20     -14.48   30.61   -16.65     8.41
    E7   22.74     -15.52   32.36   -16.75     9.62
    B1   28.35     -15.21   40.62   -17.37     12.27
实施例11用漆酶去污
检验TaLccl(RF5598)和Denilite II Base漆酶制剂的去污能力。使用的人工染污测试布料如下：草渍(Art.164，EMPA Testmaterialen，德国)，茶渍(Art.167，EMPA Testmaterialen，德国)。织物切成5.8×5.8cm的小块布样。漆酶处理在LP-2 Launder Ometer机中如下进行：大约5g染污的织物放进1.2升含有150ml Mc Ilvaine′s柠檬酸盐缓冲液、pH6的容器中，容器是温热的。带有或不带有介体(丁香酸甲酯，DeniLiteII Assist，Novozymes)的酶以漆酶的活性单位给量(实施例7)。酶剂量为200nkat/g，介体剂量为10mg/g织物重量，除了在40℃时也用20nkat/g和2mg/g剂量。Launder Ometer机在40、50或60℃和pH6下运行60分钟。之后布样在流动水中和在含温水的摇瓶中仔细清洗，并空气干燥。
去污效果通过使用L*a*b*色彩空间坐标(实施例7)，以反射率值测定色彩来评价。在漆酶处理前后测定布样的色彩。
去污检验的结果列于表21、表22和图12-15。在去除草渍上，带有介体的TaLccl制剂在60℃时(最高a*-值＝最小绿色，最高光亮度L*)比DeniLite II更有效(图12，表21)。通过目测该结果也是最佳的。TaLccl在40℃时也略好于DenLite(图14，表22)。没有介体，去草渍的效率低。
在去除茶渍上，带有介体的TaLccl漆酶在60℃时也比DeniLite II更有效，这可以从图13和表21的最高光亮度和最低红度值以及目测法看出。TaLccl在40℃时也略好，尤其是在较高剂量下(图15，表22)。没有介体的漆酶对茶渍没有显著的效果。清除草渍和茶渍在40℃下比更高的温度下要困难。
表21漆酶在50和60℃下去除污渍测试的色彩测定。L*指示光亮度，-b*是蓝色方向，+b*黄色方向，+a*是红色方向，-a*是绿色方向)。未处理的人工染污测试布料和介体以及缓冲液对照用作对比。
  样品     酶剂量nkat/g     介体mg/g   条件                 草                   茶
  L*   a*   b*   L*     a*   b*
  人工染污的布料(未处理)     -     -   -   78.32   -10.18   25.31   69.27     8.56   25.80
  TaLccl     200     10   60min，60℃，pH6   80.6   0.02   18.71   81.69     2.91   22.29
  TaLccl     200     0   60min，60℃，pH6   79.38   -4.19   17.77   76.98     4.98   21.20
  DeniLite     200     10   60min，60℃，pH6   80.26   -0.91   18.46   80.42     3.29   21.92
  DeniLite     200     0   60min，60℃，pH6   79.53   -4.69   18.33   75.91     5.39   22.09
  只有介体     0     10   60min，60℃，pH6   77.98   -6.80   19.26   75.54     5.00   20.50
  只有缓冲液     0     0   60min，60℃，pH6   77.93   -6.70   19.31   75.55     4.94   20.58
  TaLccl     200     10   60min，50℃，pH6   80.60   -0.18   17.65   79.52     3.45   23.74
  只有介体     0     10   60min，50℃，pH6   77.95   -6.45   18.56   75.97     4.84   20.47
表22漆酶在40℃下去除污渍测试的色彩测定。L*指示光亮度，-b*是蓝色方向，+b*黄色方向，+a*是红色方向，-a*是绿色方向)。未处理的人工染污测试布料和介体以及缓冲液对照用作对比。
  样品     酶剂量nkat/gnkat/g    介体mg/gmg/g  条件                   草                   茶
    L*     a*     b*     L*     a*     b*
  人工染污的布料(未处理)     _     _     _     78.18     -8.88     25.29     69.36     8.65     25.80
  TaLccl     200     10  60min，40℃，pH6     80.34     0.47     16.51     78.77     3.93     24.97
  DeniLite     200     10  60min，40℃，pH6     80.07     -0.22     16.40     77.37     4.36     24.67
  只有介体     0     10  60min，40℃，pH6     78.88     -6.19     18.28     74.72     5.63     22.16
  TaLccl     200     0  60min，40℃，pH6     80.25     -4.22     17.41     75.99     5.59     23.54
  DeniLite     200     0  60min，40℃，pH6     80.25     -4.60     17.55     76.07     5.45     22.94
  只有介体     0     10  60min，40℃，pH6     80.1     -5.67     17.68     76.25     5.11     22.15
  只有缓冲液     0     0  60min，40℃，pHS     79.66     -5.79     18.45     76.00     5.22     22.74
  TaLccl     20     2  60min，40℃，pH6     80.16     -0.73     16.20     77.17     4.65     24.40
  DeniLite     20     2  60min，40℃，pH6     79.65     -1.18     16.32     77.01     4.81     24.49
  只有介体     0     2  60min，40℃，pH6     79.32     -6.43     18.64     74.71     5.94     22.99
实施例12.用TaLccl漆酶制剂脱色染料
在丁香酸甲酯介体存在或不存在的条件下(实施例7)，检验来自菌株RF5597的TaLccl漆酶制剂对不同染料脱色的能力。实验在含有100ml溶解于柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液、pH6的染料的250ml摇瓶中进行。所用的染料浓度为12mg/100ml。酶给定剂量为每100ml200nkat(或20nkat)，介体为每100ml 10(或1)mg。摇瓶在50℃下孵育30、90和150分钟。3.5ml样本放入试管用于目测。
表23的结果显示，TaLccl在存在介体时，能很大程度上脱色靛青胭脂、Remazol亮蓝(活性蓝19)和Cibacron亮红3B-P，和一定程度上脱色Pontamine Bast橙。靛青胭脂的脱色很快，在不到30分钟内蓝色就转为浅黄色。对所有染料的反应看来在90分钟内完成，因为在延长孵育后，检测到样品的颜色没有改变。
表23.TaLccl(RF5597)漆酶制剂的染料脱色作用。处理时间30和60分钟。-目测没有改变，+目测褪色，++明显褪色，+++完全/几乎完全脱色。
  染料12mg/100ml     酶剂量nkat/100ml     介体mg/100ml    时间30min     时间90min
  Remazol亮蓝(Sigma)     200     0    -     -
  Remazol亮蓝(Sigma)     200     10    ++     ++
  Remazol亮蓝(Sigma)     20     0    -     -
  Remazol亮蓝(Sigma)     20     1    -     -
  Cibacron亮红3B-P(Ciba-Geigy)     200     0    -     -
  Cibacron亮红3B-P(Ciba-Geigy)     200     10    +++     +++
  靛青胭脂(Merck)     200     0    -     -
  靛青胭脂(Merck)     200     10    +++     +++
  靛青胭脂(Merck)     20     1    +     +++
  Pontamine Bast橙GRN     200     0    -     -
  Pontamine Bast橙GRN     200     10    +     +
参考文献
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序列表
<110>生化酶股份有限公司(AB Enzymes OY)
<120>新型漆酶及其应用(Novel laccase enzyme and uses thereof)
<130>SCT070910-47
<160>12
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>19
<212>PRT
<213>Thielavia arenaria ALKO4197
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(19)
<223>Sequence of Peptide 1，a tryptic peptide from Thielavia arenariaALKO4197 Ta Lccl protein
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>Xaa may be Gln or Ile
<400>1
Tyr Gln Gly Ala Pro Asn Thr Leu Pro Thr Asn Xaa Gly Leu Pro Val
1               5                   10                  15
Pro Asn His
<210>2
<211>11
<212>PRT
<213>Thielavia arenaria ALKO4197
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(11)
<223>Sequence of Peptide 2，a tryptic peptide from Thielavia arenariaALKO4197 Ta Lccl protein
<400>2
Glu Asn Trp Ile Gly Pro Asp Gly Val Leu Lys
1               5                   10
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>Thielavia arenaria ALKO4197
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(9)
<223>Sequence of Peptide 3，a tryplic peptide from Thielavia arenariaALKO4197 Ta Lccl prolein
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>S is unsure
<400>3
Ser Leu Phe Leu Ala Val Gly Gln Arg
1               5
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>Sequence of oligonucleoti de primer POX26
<400>4
gagaactgga tcggycccga yggygt                                            26
<210>5
<211>17
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>Sequence of oligonucleotide primer POX27
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>n can be c or i
<400>5
garaaytgga thggncc                                                          17
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>Sequence of oligonucleotide primer 28
<400>6
ctcttcctcg cygtsggyca                                                       20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>Sequence of oligon ucleoti de primer POX29
<400>7
tgrccsacrg cgaggaagag                                                       20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>Sequence of oligonucleotidc sequence POX30
<400>8
taccagggyg cyccsaacac                                                        20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>Sequence of oligonucleotidc primer POX 31
<400>9
gtgttsggrg crccctggta                                                        20
<210>10
<211>1057
<212>DNA
<213>Thielavia arenaria ALK04197
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1057)
<223>Sequence of the PCR fragment obtained from Thielavia arenariaALK04197 using the primers POX27 and POX31
<400>10
gagaactgga tcgggcccga tggcgttctc aagaatgtgg tgatgttggt caatggtacg      60
ttgatgtcca attctgtata aagagaagaa acgtgctgat acgctccctt cgtctagaca     120
agattatagg tatgttgtca aacccgctgt aaccccaacc gccaagacct ggaggctcct     180
cgcctggacg tgttgtacaa tatgctgacc tcgccgccag ggccaaccat ccgcgcgaac     240
tggggtgaca atatcgaagt cactgtcatc aacaatctca aaaccaatgg gtacgaccac     300
ttgaatcatc ccgggcctac ccctaacaca aaatctcaac gtgcatccga tctgacgtat     360
tatatccatc tagtacctcg atgcactggc atggccttcg tcagctgggt aacgttttca     420
acgacggtgc caacggcgtg actgagtgcc caatcccgcc caaaggaggg cgcaagacgt     480
acaagttccg tgcgacacag tatggcacca gctggtatca ctcccacttc tcggcccagt     540
acggcaacgg cgtggtcggc accatccaga tcgacggccc tgcctctctg ccatatgaca     600
ttgatctggg cgtgttccct ctcatggact actactacag gtcggccgat gagctggtgc     660
acttcaccca gagcaacggc gccccgccaa gcgacaacgt cctcttcaat ggcaccgccc     720
gtcaccctga gacgggggca ggccagtggt acaacgtcac gctgactcca ggcaagcgac     780
accgcctgcg catcatcaac acgtcgaccg acaaccactt tcaggtgtcg cttgtcggcc     840
acaacatgac cgtcattgcc accgacalgg tccccgtcaa cgcctttact gtcagcagcc     900
tattcctcgc cgtaggccag cgatacgalg tcaccatcga cgccaatagc ccggtgggca     960
actactggtt caacgtgact ttcggcgatg ggttgtgcgg ctccagtaac aacaaattcc    1020
cagccgccat cttccgctac cagggcgccc cgaacac                             1057
<210>11
<211>2680
<212>DNA
<213>Thielavia arenaria ALKO4197
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(2680)
<223>Nucleotide sequence of of Thielavia arenaria ALKO4197 laccase 1gene(Ta lccl).
<220>
<221>misc_feature
<222>(178)..(2456)
<223>Talccl
<220>
<221>Intron
<222>(406)..(456)
<220>
<221>Intron
<222>(536)..(597)
<220>
<221>Intron
<222>(610)..(700)
<220>
<221>Intron
<222>(771)..(853)
<220>
<221>Intron
<222>(1824)..(1902)
<220>
<221>Intron
<222>(1975)..(2033)
<400>11
ggatccccgg gtcagtctat ataaggggct gagtgtccag ctcttccatg cctttgattc     60
tcttgaatca ccaggacact cgggcggctt cagtcttgca taactcgggt cttcccttcc    120
tctcactgct tttcttcgct cagatatatt tcaggcgacc tcaaacagct cgccatcatg    180
aagtcttggg ccgccgccgt ggcgctcatg gtgggcattc tcagccctca tgctgccgcc    240
gcacctcctg caaacccggt ccagagagac atgctccagg tccttgaggc gagacagtct    300
ggcccgactt gcaacacccc gtccaatcgt gcgtgctgga ccaatggttt cgacatcaac    360
accgactatg aagtcagcac tcctaatacc ggacgtactg tggccgtaag cttcccctcc    420
ctttaaggag gcagagctag gactaacaag caccagtacc aacttaccct cactgagaaa    480
gagaactgga tcggtcccga tggcgttctc aagaatgtgg tgatgttggt caatggtacg    540
ttgatgtcca attctgtata aagagaagaa acgtgctgat acgctccctt cgtctagaca    600
agattatagg tatgttgtca aacccgctgt aaccccaacc gccaagacct ggaggctcct    660
cgcctggacg tgttgtacaa tatgctgacc tcgccgccag ggccaaccat ccgcgcgaac    720
tggggtgaca atatcgaagt cactgtcatc aacaatctca aaaccaatgg gtacgaccac    780
ttgaatcatc ccgggcctac ccctaacaca aaatctcaac gtgcatccga tctgacgtat     840
tatatccatc tagtacctcg atgcactggc atggccttcg tcagctgggt aacgttttca     900
acgacggtgc caacggcgtg actgagtgcc caatcccgcc caaaggaggg cgcaagacgt     960
acaagttccg tgcgacacag tatggcacca gctggtatca ctcccacttc tcggcccagt    1020
acggcaacgg cgtggtcggc accatccaga tcgacggccc tgcctctctg ccatatgaca    1080
ttgatctggg cgtgttccct ctcatggact actactacag gtcggccgat gagctggtgc    1140
acttcaccca gagcaacggc gccccgccaa gcgacaacgt cctcttcaat ggcaccgccc    1200
gtcaccctga gacgggggca ggccagtggt acaacgtcac gctgactcca ggcaagcgac    1260
accgcctgcg catcatcaac acgtcgaccg acaaccactt tcaggtgtcg cttgtcggcc    1320
acaacatgac cgtcattgcc accgacatgg tccccgtcaa cgcctttact gtcagcagcc    1380
tattcctcgc cgtaggccag cgatacgatg tcaccatcga cgccaatagc ccggtgggca    1440
actactggtt caacgtgact ttcggcgatg ggttgtgcgg ctccagtaac aacaaattcc    1500
cagccgccat cttccgctac cagggcgccc ccgctacgct cccgacggat cagggtctac    1560
ccgtgcccaa tcacatgtgt ttggacaacc tgaacctaac tcctgtggtg acacggagcg    1620
cgcccgtcaa caactttgtc aagcgtccgt ccaacacgct gggcgtcact ctcgatatcg    1680
gcggcacgcc gctctttgtg tggaaggtca acggcagcgc catcaacgtc gactggggca    1740
agccgatcct tgactatgtc atgagcggca acacgagcta cccggtcagc gataacattg    1800
tgcaggtgga cgctgttgac caggtacgcc cctcttgaag cccctagcag ttcacgctag    1860
tatacaatac aagtacatgc taacacttcc ctccctattc agtggactta ctggctgatc    1920
gagaacgacc cgaccaatcc cattgtcagc ttgccgcacc cgatgcatct gcacgtacgt    1980
tcaaacctcc ccccaccccc cacttcatac aaaatatact gacaaatcga cagggccacg    2040
acttcctcgt cctgggccga tcacccgacg agctccccag cgcgggggtc cgtcacatct    2100
ttgacccggc caaggacctg ccccggctta agggcaacaa ccccgtgcgg cgggacgtga    2160
cgatgcttcc ggcgggcggc tggctgctgc tggcgttcaa gacggacaac ccgggcgcat    2220
ggctgttcca ctgccacatt gcgtggcacg tgtcgggcgg cctgtcggtc gacttcctcg    2280
agcggcccaa cgaccttcgc acgcagctca acagcaacgc caagcgcgcc gaccgcgacg    2340
acttcaaccg cgtctgccgc gagtggaacg cctactggcc taccaacccg ttccccaaga    2400
tcgactcggg cttgaggcac cggtttgttg aggagagcga gtggatggtt cgctaaactg    2460
cctggctgtg ccaattgatt tgatgggtac atgtacctgt tggtgttact gttgacgagg    2520
ctgtgtaagt accatggcaa aggggtgttt tcaggggtgc tctggggtaa ttggcacagt    2580
acatggaggg gtctggggtt gggtatacaa ggcttgctgc tccgttttta tcttttggct    2640
tgattaagac tttcttgtct gatgtacgag tcaggccgcc                          2680
<210>12
<211>617
<212>PRT
<213>Thielavia arenaria ALK04197
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(617)
<223>Deduced amino acid sequence of Thielavia arenaria ALKO4197laccase 1(Ta Lccl)
<400>12
Met Lys Ser Trp Ala Ala Ala Val Ala Leu Met Val Gly Ile Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro His Ala Ala Ala Ala Pro Pro Ala Asn Pro Val Gln Arg Asp Met
            20                  25                  30
Leu Gln Val Leu Glu Ala Arg Gln Ser Gly Pro Thr Cys Asn Thr Pro
        35                  40                  45
Ser Asn Arg Ala Cys Trp Thr Asn Gly Phe Asp Ile Asn Thr Asp Tyr
    50                  55                  60
Glu Val Ser Thr Pro Asn Thr Gly Arg Thr Val Ala Tyr Gln Leu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Thr Glu Lys Glu Asn Trp Ile Gly Pro Asp Gly Val Leu Lys Asn
                85                  90                  95
Val Val Met Leu Val Asn Asp Lys Ile Ile Gly Pro Thr Ile Arg Ala
            100                 105                 110
Asn Trp Gly Asp Asn Ile Glu Val Thr Val Ile Asn Asn Leu Lys Thr
        115                 120                 125
Asn Gly Thr Ser Met His Trp His Gly Leu Arg Gln Leu Gly Asn Val
    130                 135                 140
Phe Asn Asp Gly Ala Asn Gly Val Thr Glu Cys Pro Ile Pro Pro Lys
145                 150                 155                 160
Gly Gly Arg Lys Thr Tyr Lys Phe Arg Ala Thr Gln Tyr Gly Thr Ser
                165                 170                 175
Trp Tyr His Ser His Phe Ser Ala Gln Tyr Gly Asn Gly Val Val Gly
            180                 185                 190
Thr Tle Gln Ile Asp Gly Pro Ala Ser Leu Pro Tyr Asp Ile Asp Leu
        195                 200                 205
Gly Val Phe Pro Leu Met Asp Tyr Tyr Tyr Arg Ser Ala Asp Glu Leu
    210                 215                 220
Val His Phe Thr Gln Ser Asn Gly Ala Pro Pro Ser Asp Asn Val Leu
225                 230                 235                 240
Phe Asn Gly Thr Ala Arg His Pro Glu Thr Gly Ala Gly Gln Trp Tyr
                245                 250                 255
Asn Val Thr Leu Thr Pro Gly Lys Arg His Arg Leu Arg Ile Ile Asn
            260                 265                 270
Thr Ser Thr Asp Asn His Phe Gln Val Ser Leu Val Gly His Asn Met
        275                 280                 285
Thr Val Ile Ala Thr Asp Met Val Pro Val Asn Ala Phe Thr Val Ser
    290                 295                 300
Ser Leu Phe Leu Ala Val Gly Gln Arg Tyr Asp Val Thr Ile Asp Ala
305                 310                 315                 320
Asn Ser Pro Val Gly Asn Tyr Trp Phe Asn Val Thr Phe Gly Asp Gly
                325                 330                 335
Leu Cys Gly Ser Ser Asn Asn Lys Phe Pro Ala Ala Ile Phe Arg Tyr
            340                 345                 350
Gln Gly Ala Pro Ala Thr Leu Pro Thr Asp Gln Gly Leu Pro Val Pro
        355                 360                 365
Asn His Met Cys Leu Asp Asn Leu Asn Leu Thr Pro Val Val Thr Arg
    370                 375                 380
Ser Ala Pro Val Asn Asn Phe Val Lys Arg Pro Ser Asn Thr Leu Gly
385                 390                 395                 400
Val Thr Leu Asp Ile Gly Gly Thr Pro Leu Phe Val Trp Lys Val Asn
                405                 410                 415
Gly Ser Ala Ile Asn Val Asp Trp Gly Lys Pro Ile Leu Asp Tyr Val
            420                 425                 430
Met Ser Gly Asn Thr Ser Tyr Pro Val Ser Asp Asn Ile Val Gln Val
        435                 440                 445
Asp Ala Val Asp Gln Trp Thr Tyr Trp Leu Ile Glu Asn Asp Pro Thr
    450                 455                 460
Asn Pro Ile Val Ser Leu Pro His Pro Met His Leu His Gly His Asp
465                 470                 475                 480
Phe Leu Val Leu Gly Arg Ser Pro Asp Glu Leu Pro Ser Ala Gly Val
                485                 490                 495
Arg His Ile Phe Asp Pro Ala Lys Asp Leu Pro Arg Leu Lys Gly Asn
            500                 505                 510
Asn Pro Val Arg Arg Asp Val Thr Met Leu Pro Ala Gly Gly Trp Leu
        515                 520                 525
Leu Leu Ala Phe Lys Thr Asp Asn Pro Gly Ala Trp Leu Phe His Cys
    530                 535                 540
His Ile Ala Trp His Val Ser Gly Gly Leu Ser Val Asp Phe Leu Glu
545                 550                 555                 560
Arg Pro Asn Asp Leu Arg Thr Gln Leu Asn Ser Asn Ala Lys Arg Ala
                565                 570                 575
Asp Arg Asp Asp Phe Asn Arg Val Cys Arg Glu Trp Asn Ala Tyr Trp
            580                 585                 590
Pro Thr Asn Pro Phe Pro Lys Ile Asp Ser Gly Leu Arg His Arg Phe
        595                 600                 605
Val Glu Glu Ser Glu Trp Met Val Arg
    610                 615

Claims (73)

1.一种漆酶，特征在于其能在适当条件下通过单次处理，增加脱浆的粗斜纹布光亮度的单位与次氯酸钠至少一样多或超过。
2.根据权利要求1所述的漆酶，其中次氯酸钠处理是通过使用在纺织工业湿处理中通常应用的设备如洗衣机，在40℃温度、pH超过10.5、液体比例大约1∶15的条件下，在存在25ml/110％次氯酸钠(NaOCl)的溶液中进行15分钟。
3.根据权利要求1或2所述的漆酶，其中漆酶处理在存在一种或多种介体下进行。
4.根据权利要求1至3任一项所述的漆酶，其中该酶可从微生物来源获得。
5.根据权利要求1至4任一项所述的漆酶，其中该酶可从丝状真菌获得。
6.根据权利要求1至5任一项所述的漆酶，其中该酶可从梭孢壳菌属(Thielavia)获得。
7.根据权利要求1至6任一项所述的漆酶，其中该酶可从保藏的菌株CBS 116071获得。
8.根据权利要求1至7任一项所述的漆酶，其中该酶包括氨基酸序列SEQ ID NO：12或者与SEQ ID NO：12至少有74％同一性的序列。
9.根据权利要求1至8任一项所述的漆酶，其中该酶缺少信号序列。
10.根据权利要求8或9所述的漆酶，其中该酶缺少尾部。
11.根据上述任何一项权利要求所述的漆酶，其中该酶由保藏编号为DSM 15484的大肠杆菌(E.coli)RF5473中的pALK1342序列编码。
12.根据上述任何一项权利要求所述的酶，其中该酶在pH 3.5-8下发挥功能，优选pH 4-7.5，最优选pH 5-7。
13.根据上述任何一项权利要求所述的酶，其中织物被脱浆和纤维素酶处理。
14.根据上述任何一项权利要求所述的酶，其中该酶在30-80℃的温度下有效处理粗斜纹布，优选50-70℃。
15.根据上述任何一项权利要求所述的酶，其中该酶在60-70℃的温度下最有效处理粗斜纹布。
16.根据上述任何一项权利要求所述的漆酶，其中织物的漆酶处理不会导致任何本质上的强度损失。
17.根据上述任何一项权利要求所述的漆酶，其中织物的漆酶处理不会导致磨损外观的损失。
18.根据上述任何一项权利要求所述的漆酶，其中漆酶是在异源生产宿主中产生。
19.根据上述任何一项权利要求所述的漆酶，其中漆酶是在微生物宿主中产生。
20.根据上述任何一项权利要求所述的漆酶，其中漆酶是在丝状真菌宿主中产生的。
21.根据上述任何一项权利要求所述的漆酶，其中漆酶是在木霉属(Trichoderma)或曲霉属(Aspergillus)宿主中产生的。
22.一种漆酶，特征在于其包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列或者显示与SEQ ID NO：12序列至少有74％同一性的序列。
23.根据权利要求22所述的漆酶，其中该酶缺少信号序列。
24.根据权利要求22或23所述的漆酶，其中该酶缺少尾部。
25.根据权利要求22至24任一项所述的漆酶，其中该酶可从微生物来源获得。
26.根据权利要求22至25任一项所述的漆酶，其中该酶可从丝状真菌获得。
27.根据权利要求22至26任一项所述的漆酶，其中该酶可从梭孢壳菌属(Thielavia)获得。
28.根据权利要求22至27任一项所述的漆酶，其中该酶可从保藏菌株CBS 116071获得。
29.据权利要求22-28任一项所述的漆酶，其中该酶由保藏编号为DSM 15484的大肠杆菌(E.coli)RF5473中的pALK1342序列编码。
30.根据权利要求22-29任一项所述的酶，其中该酶在pH 3.5-8下发挥功能，优选pH 4-7.5，最优选pH 5-7。
31.根据权利要求22-30任一项所述的酶，其中该酶的最适pH约pH 5.5。
32.根据权利要求22-31任一项所述的漆酶，其中该酶是在异源生产宿主中产生。
33.据权利要求22-32任一项所述的漆酶，其中该漆酶是在微生物宿主中产生。
34.根据权利要求22-33任一项所述的漆酶，其中该漆酶是在丝状真菌宿主中产生。
35.根据权利要求22-34任一项所述的漆酶，其中该酶是在木霉属或曲霉属宿主中产生。
36.根据权利要求22-35任一项所述的漆酶，其中该酶能在适当条件下通过单次处理，增加脱浆的粗斜纹布光亮度的单位与次氯酸钠处理的粗斜纹布至少一样多或超过。
37.根据权利要求36所述的漆酶，其中次氯酸钠处理是通过使用在纺织工业湿处理中通常应用的设备如洗衣机，在40℃温度、pH超过10.5、液体比例大约1∶15的条件下，在存在25ml/l的10％次氯酸钠(NaOCl)溶液中进行15分钟。
38.根据权利要求36或37的漆酶，其中酶处理在30-80℃温度下进行，优选温度50-70℃，更优选温度60-70℃。
39.根据权利要求36-38任一项所述的漆酶，其中漆酶处理在存在一种或多种介体时进行。
40.根据权利要求36-39任一项所述的漆酶，其中粗斜纹布的酶处理不会导致任何本质上的强度损失。
41.根据权利要求36-40任一项所述的漆酶，其中粗斜纹布的酶处理不会导致磨损外观的损失
42.根据权利要求22-41任一项所述的漆酶，其中该酶有效去污。
43.根据权利要求22-41任一项所述的漆酶，其中该酶能对染料脱色。
44.一种核酸序列，特征在于其编码权利要求1-43任一项所限定的酶。
45.一种载体，特征在于其包含根据权利要求44所述的核酸序列。
46.根据权利要求45所述的载体，其中核酸序列可操作地与表达控制序列连接，以产生在原核或真核宿主细胞中的表达。
47.一种宿主细胞，特征在于根据权利要求44所述的核酸序列或根据权利要求45或46所述的载体被导入宿主细胞。
48.根据权利要求47的宿主细胞，其中所述宿主细胞是微生物宿主细胞。
49.根据权利要求47或48的宿主细胞，其中所述宿主细胞属于木霉菌属或曲霉菌属。
50.一种具有漆酶活性的多肽的生产方法，包括培养根据权利要求47-49的任一项宿主细胞和回收多肽的步骤。
51.一种具有漆酶活性的多肽，由根据权利要求44的核酸序列或根据权利要求45或46所述的载体编码，并且所述多肽可以从根据权利要求50所述的方法获得。
52.一种获得包含根据权利要求51所述的多肽的酶制剂的方法，包括的步骤是：培养根据权利要求47-49的任一项所述的宿主细胞，以及或从细胞或从培养基分离细胞得到上清而回收多肽。
53.一种根据权利要求52所述的方法得到的酶制剂。
54.一种酶制剂，包括根据权利要求1-43任一项所述的漆酶。
55.根据权利要求53或54所述的酶制剂，其中酶制剂包括选自稳定剂、缓冲剂、介体和防腐剂的一种或多种适当添加剂。
56.根据权利要求53-55任一项所述的酶制剂，其中酶制剂是生产宿主用过的培养基。
57.根据权利要求53-56任一项所述的酶制剂，其中酶制剂是液体、粉末或颗粒的形式。
58.一种处理粗斜纹布的方法，包括将在液体基质中的粗斜纹布与根据权利要求1-43任一项所述的漆酶或与根据权利要求53-57任一项所述的酶制剂在适当条件下接触，以便酶发挥功能。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述的处理在存在介体时进行。
60.根据权利要求58或59所述的方法，其中所述处理在30-80℃温度下，优选50-70℃下，更优选60-70℃温度下进行。
61.根据权利要求58-60任一项所述的方法，其中所述处理在pH3.5-8，优选pH 4-7.5，最优选pH 5-7的pH范围内进行。
62.根据权利要求58-61任一项所述的方法，其中所述处理在15分钟至2小时，优选30分钟至90分钟，更优选30分钟至60分钟内进行。
63.根据权利要求58-62任一项所述的方法，其中用于处理的剂量为2-500，优选20-200nkat，最优选20-100nkat/g织物。
64.根据权利要求58-63任一项所述的方法，其中所述处理重复一次或多次。
65.一种去除污渍的方法，包括将待处理材料与根据权利要求1-43任一项所述的漆酶或与根据权利要求53-57任一项所述的酶制剂在适当条件下接触，以便酶发挥功能。
66.一种漂白纸浆的方法，包括将所述纸浆与根据权利要求1-43任一项所述的漆酶或与根据权利要求53-57任一项所述的酶制剂在适当条件下接触，以便酶发挥功能的步骤。
67.一种处理天然或人造纤维的方法，包括将纤维与根据权利要求1-43任一项所述的漆酶或与根据权利要求53-57任一项所述的酶制剂在适当条件下接触，以便酶发挥功能。
68.一种处理木质纤维素降解纤维的方法，包括将纤维与根据权利要求1-43任一项所述的漆酶或与根据权利要求53-57任一项所述的酶制剂在适当条件下接触，以便酶发挥功能。
69.一种处理木头的方法，包括将木头与根据权利要求1-43任一项所述的漆酶或与根据权利要求53-57任一项所述的酶制剂在适当条件下接触，以便酶发挥功能。
70.一种处理毛发的方法，包括将毛发与根据权利要求1-43任一项所述的漆酶或与根据权利要求53-57任一项所述的酶制剂在适当条件下接触，以便酶发挥功能。
71.一种处理染坊废水的方法，包括将染坊废水与根据权利要求1-43任一项所述的漆酶或与根据权利要求53-57任一项所述的酶制剂在适当条件下接触，以便酶发挥功能。
72.一种染料脱色的方法，包括将染料或含染料的材料与根据权利要求1-43任一项所述的漆酶或与根据权利要求53-57任一项所述的酶制剂在适当条件下接触，以便酶发挥功能。
73.根据权利要求1-43任一项所述的漆酶或根据权利要求53-57任一项所述的酶制剂在粗斜纹布处理、去除污渍、漂白纸浆、处理纤维、处理羊毛、处理毛发、处理染坊废水、或者脱色染料或含染料的材料中的应用。
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