ES2383310T3 - Enzimas lacasa novedosas y sus usos - Google Patents

Abstract

Una enzima lacasa, caracterizada por que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupoque consiste en la SEQ ID 41 (TaLcc2) o una secuencia que muestra una identidad de al menos el 75 % con laSEQ ID NO:41 y es la más eficaz en el blanqueado de tela vaquera a la temperatura de aproximadamente 40 a50 ºC.

Description

Enzimas lacasa novedosas y sus usos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una enzima lacasa novedosa útil en muchas aplicaciones. Esta invención se

5 refiere también a un ácido nucleico que codifica la enzima, un vector, una célula huésped y un procedimiento para producir la enzima, así como a la preparación de enzima que comprende la enzima. Además, esta invención se refiere a un procedimiento para tratar tela vaquera, un procedimiento para eliminar manchas, un procedimiento para tratar fibras naturales o sintéticas o fibras lignocelulósicas, un procedimiento para tratar la lana, un procedimiento para tratar el pelo y un procedimiento para blanquear pulpa y aguas residuales de tintorerías y un procedimiento

10 para decolorar tintes. Esta invención se refiere también a diversos usos y composiciones, que pueden usarse en las aplicaciones mencionadas.

Antecedentes de la invención

Las lacasas (EC. 1.10.3.2 p-bencenodiol:oxígeno oxidorreductasa) pertenecen a una familia de oxidasas multicobre. Las lacasas son enzimas distribuidas ampliamente en vegetales superiores, hongos, algunos insectos y bacterias. 15 Se caracterizan por una especificidad de sustrato baja, por oxidar diversos sustratos, incluidos difenoles, polifenoles, diferentes fenoles sustituidos, diaminas, aminas aromáticas e incluso compuestos inorgánicos como el yodo. Las lacasas oxidan sus sustratos mediante un mecanismo de oxidación de un electrón y usan oxígeno molecular como aceptor de electrones. Entre las lacasas, son variables la secuencia principal, la inducción del mecanismo y las características físico-químicas (p. ej., punto isoeléctrico y contenido en hidratos de carbono) y bioquímicas. No

20 obstante, los sitios de unión de cobre de las lacasas se conservan de forma rigurosa.

Varias proteínas lacasa y genes que codifican estas lacasas se han aislado anteriormente. Por ejemplo el documento WO 01/92498 describe una enzima lacasa fúngica aislada a partir de una cepa de Melanocarpus albomyces, la publicación de patente EP 0765394 B1 (que corresponde a la patente de EE. UU. N.º 5.981.243) describe la clonación de un gen de lacasa a partir de Myceliophthora thermophila y su expresión en Aspergillus y la

25 patente de EE. UU. N.º 5.750.388 describe la clonación de un gen de lacasa a partir de Scytalidium thermophilum y su expresión en Aspergillus.

Chefetz et al. (1998a) describen el aislamiento y la caracterización preliminar de una lacasa a partir de abono de residuos del suelo municipales. El microbio que produce esta lacasa se identificó posteriormente como Chaetomium thermophilum y la enzima se purificó y se caracterizó después (Chefetz et al., 1998b). La enzima referida tenía un pI 30 de 5,1. La lacasa era estable durante 1 hora a 70 ºC y tenía semividas de 24 y 12 h a 40 y 50 ºC, respectivamente. La enzima era estable a pH de 5 a 10 y el pH óptimo era de 6. Saito et al. (2003) describen la purificación y la caracterización de una lacasa extracelular de un hongo de la familia Chaetomiaceae. La masa molecular de la enzima era de aproximadamente 73 a 80 kDa y el pI de 3,5. El pH óptimo para la oxidación de la siringaldazina era de 7,0 y la temperatura óptima fue de 42 ºC. La lacasa era estable durante hasta 288 h a 4 ºC y se calculó que sus

35 semividas correspondientes a 25 y 40 ºC eran de 150 y 20 h.

El documento EP 1167528 divulga una lacasa de Botrytis cinerea.

Las lacasas tienen muchas aplicaciones industriales potenciales, tales como la deslignificación de pulpas de madera, procedimientos para tratar fibras que contienen lignina, procedimientos para tratar fibras de madera para funcionalizarlas o pegar las fibras, mejorar la producción de etanol combustible a partir de materias primas

40 renovables, aplicaciones en alimentos (por ejemplo en el horneado o en la clarificación de la cerveza o el vino), diversos procedimientos curativos biológicos y aplicaciones textiles, tales como el tratamiento de tela vaquera, la eliminación de manchas, el tratamiento de diversas fibras para la industria textil, procedimientos para decolorar tintes y procedimientos para tratar aguas residuales de tintorerías, o su uso en composiciones de tinte capilar, en la limpieza de superficies duras o en formulaciones detergentes.

45 En los últimos años, los fabricantes de tela vaquera se han interesado en un aspecto "lavado a la piedra" o un aspecto desgastado. El lavado a la piedra tradicional con piedras de pumita reduce la resistencia del tejido y sobrecarga los aparatos de lavado. La tendencia en los últimos años ha sido hacia procedimientos enzimáticos de acabado de la tela vaquera. El "aspecto blanqueado" de la tela vaquera se obtiene normalmente por medio de productos químicos blanqueantes, p. ej., el hipoclorito de sodio. Hasta ahora, el blanqueado con hipoclorito ha sido

50 el procedimiento de blanqueado más eficaz para la tela vaquera teñida con añil, ya que pueden obtenerse prácticamente todos los tonos. Sin embargo, el procedimiento con hipoclorito es muy perjudicial para el medio ambiente, es difícil de controlar y daña el tejido fácilmente. También es un procedimiento muy poco práctico o incluso perjudicial para el usuario, no puede usarse para productos que contienen licra y es necesario un tratamiento anticloro con varias etapas de aclarado/lavado. Por tanto, existe una necesidad de desarrollar una alternativa para el

55 hipoclorito de sodio menos perjudicial ecológicamente, en particular, se han estudiado las lacasas para ese fin.

El documento WO 97/25468 describe el uso de lacasas en un procedimiento para proporcionar a la tela vaquera teñida un aspecto desgastado. El procedimiento comprende un tratamiento con celulasa y un tratamiento simultáneo o subsiguiente con una enzima oxidante de fenol, tal como una lacasa, y un agente potenciador, tal como metilsiringato. La lacasa de Myceliophthora thermophila es el ejemplo de lacasas de la publicación de patente.

En la industria textil se han desarrollado nuevos materiales, acabados y tintes en los últimos años. Aunque los nuevos desarrollos tienen muchas propiedades ventajosas, tales como un secado fácil, resistencia a la manchas y al

5 agua o colores brillantes de los materiales textiles, frecuentemente, su desventaja es que tienen que lavarse a temperaturas bajas. Las temperaturas bajas se prefieren también por razones económicas, ya que el uso de temperaturas bajas ahorra energía. Por tanto, existe la necesidad de proporcionar lacasas que funcionen a temperaturas bajas.

A pesar de que se dispone de numerosas publicaciones que describen lacasas de diversos microorganismos, sigue

10 existiendo la necesidad de lacasas novedosas, que funcionen de forma más eficaz y sean más adecuadas para las diversas condiciones de diferentes aplicaciones.

Sumario de la invención

Es un objetivo de la presente invención eliminar al menos algunos de los problemas asociados con la técnica anterior. En particular, es un objetivo de esta invención proporcionar una enzima lacasa novedosa con propiedades

15 variables adecuadas para aplicaciones diferentes.

En el presente documento se divulga que pueden aislarse enzimas lacasa que tienen propiedades novedosas y diversas a partir del mismo género, especie e incluso a partir de la misma cepa. Algunas de las lacasas son particularmente adecuadas para su uso a temperaturas relativamente bajas.

Un objeto de esta invención es una enzima lacasa, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID 41 20 (TaLcc2) o una secuencia que muestra una identidad de al menos el 75 % con la secuencia SEQ ID NO:41.

Más específicamente, la enzima lacasa de esta invención se caracteriza por lo que se expone en la parte de caracterización de la reivindicación 1.

Preferentemente, la enzima puede obtenerse a partir de un microorganismo, más preferentemente a partir de un hongo filamentoso, en particular del género Thielavia, más específicamente a partir de la especie Thielavia arenaria.

25 Ventajosamente, la enzima puede obtenerse a partir de la cepa CBS 116071 depositada el 2 de septiembre de 2004 en el Centraalbureau voor Schimmelcultures, Upsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, Países Bajos.

La enzima funciona en un amplio intervalo de pH desde pH 3 a 9, preferentemente a pH de 4 a 8, más preferentemente a pH de 4,5 a 6,5. La enzima funciona también en un intervalo de temperatura amplio. Por ejemplo, en el tratamiento de tela vaquera la enzima es eficaz a de 30 a 80 ºC, preferentemente a temperaturas de 40 a

30 60 ºC. La enzima presenta una actividad máxima a temperaturas de 40 a 50 ºC y, por tanto, es muy útil en aplicaciones donde las temperaturas más bajas son más ventajosas.

En particular, en el tratamiento de tela vaquera, las lacasas que pueden usarse a bajas temperaturas tienen ventajas respecto a las lacasas que funcionan mejor a temperaturas convencionales, tales como a aproximadamente 60 ºC. Las temperaturas más bajas ahorran energía y son más económicas.

35 La enzima lacasa de la presente invención es adecuada también para otras aplicaciones, donde las temperaturas bajas son más ventajosas. Tales aplicaciones son, por ejemplo, otras aplicaciones textiles, tales como eliminación de manchas o, por ejemplo, tinte capilar.

Para su comparación, se divulga en el presente documento una enzima lacasa que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID 43 (TaLcc3) o una secuencia que muestra una identidad de al menos el 58 % con la secuencia

40 SEQ ID NO:43.

Preferentemente, la enzima puede obtenerse a partir de un microorganismo, más preferentemente a partir de un hongo filamentoso, en particular del género Thielavia, más específicamente a partir de la especie Thielavia arenaria. Ventajosamente, la enzima puede obtenerse a partir de la cepa CBS 116071 depositada el 2 de septiembre de 2004 en el Centraalbureau voor Schimmelcultures, Upsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, Países Bajos.

45 La enzima funciona a pH de 3,5 a 7,5, preferentemente a pH de 4 a 6,5.

Para su comparación, también se divulga en el presente documento una enzima lacasa que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:45 (TaLcc4) o una secuencia que muestra una identidad de al menos el 78 % con la secuencia SEQ ID NO:45.

Preferentemente, la enzima puede obtenerse a partir de un microorganismo, más preferentemente a partir de un

50 hongo filamentoso, en particular del género Thielavia, más específicamente a partir de la especie Thielavia arenaria. Ventajosamente, la enzima puede obtenerse a partir de la cepa CBS 116071 depositada el 2 de septiembre de 2004 en el Centraalbureau voor Schimmelcultures, Upsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, Países Bajos.

La enzima funciona a pH de 3,5 a 7,5, más preferentemente a pH de 4 a 7, más preferentemente a pH de 5 a 6,5.

Para su comparación, también se divulga en el presente documento una enzima lacasa que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:47 (CtLcc1) o una secuencia que muestran una identidad de al menos el 74 % con la secuencia SEQ ID NO:47.

5 Preferentemente, la enzima puede obtenerse a partir de un microorganismo, más preferentemente a partir de un hongo filamentoso, en particular del género Chaetomium, preferentemente de la especie Chaetomium thermophilum. Ventajosamente, la enzima puede obtenerse a partir de la cepa CBS 730.95 depositada el 8 de noviembre de 1995 en el Centraalbureau voor Schimmelcultures a Oosterstraat 1, 3742 SK BAARN, Países Bajos.

La enzima funciona a pH de 3,5 a 8, preferentemente a pH de 4 a 7, más preferentemente a pH de 4,5 a 6. Por

10 ejemplo, en el tratamiento de tela vaquera, la enzima es eficaz a temperaturas de 30 a 80 ºC, preferentemente de 40 a 70 ºC, lo más preferentemente de 50 a 60 ºC.

Para una comparación adicional, se divulga en el presente documento una enzima lacasa, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID 49 (CtLcc2) o una secuencia que muestra una identidad de al menos el 55 % con la secuencia SEQ ID NO:49.

15 Preferentemente, la enzima puede obtenerse a partir de un microorganismo, más preferentemente a partir de un hongo filamentoso, en particular del género Chaetomium, preferentemente de la especie Chaetomium thermophilum. Ventajosamente, la enzima puede obtenerse a partir de la cepa CBS 730.95 depositada el 8 de noviembre de 1995 en el Centraalbureau voor Schimmelcultures a Oosterstraat 1, 3742 SK BAARN, Países Bajos.

Para una comparación adicional, también una enzima lacasa, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID 20 51 (CtLcc3) o una secuencia que muestra una identidad de al menos el 53 % con la secuencia SEQ ID NO:51.

Preferentemente, la enzima puede obtenerse a partir de un microorganismo, más preferentemente a partir de un hongo filamentoso, en particular del género Chaetomium, preferentemente de la especie Chaetomium thermophilum. Ventajosamente, la enzima puede obtenerse a partir de la cepa CBS 730.95 depositada el 8 de noviembre de 1995 en el Centraalbureau Voor Schimmelcultures a Oosterstraat 1, 3742 SK BAARN, Países Bajos.

25 La presente invención se refiere en particular a una enzima lacasa que muestra una identidad de al menos el 75 % con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:41 (TaLcc2) y que tiene una actividad máxima a una temperatura de 40 a 50ºC.

Un objeto de esta invención es también una secuencia de ácidos nucleicos que codifica al menos la enzima de la invención.

30 La secuencia de ácidos nucleicos se caracteriza por lo que se expone en la parte de caracterización de la reivindicación 23.

Objetos adicionales de esta invención son un vector que comprende la secuencia de ácidos nucleicos y un huésped que comprende la secuencia de ácidos nucleicos o el vector, y un procedimiento para la producción de un polipéptido que tiene actividad lacasa.

35 Un objeto adicional de la invención es un procedimiento para obtener una preparación de enzima que comprende el polipéptido o la enzima, que comprende las etapas de cultivar una célula huésped que comprende la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la enzima o un vector que comprende la secuencia de ácidos nucleicos y o bien recuperar el polipéptido de las células o bien separar las células del medio de cultivo y obtener el sobrenadante. Además, un objeto de la invención es la preparación de enzima que comprende la enzima lacasa de la invención.

40 Un objeto de esta invención es un procedimiento para tratar tela vaquera, que comprende poner en contacto tela vaquera en un medio acuoso con la enzima lacasa o la preparación de enzima de la invención bajo condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima.

Un objeto de esta invención es un procedimiento para eliminar manchas, que comprende que el material que se va a tratar con el procedimiento se pone en contacto con una enzima lacasa de la presente invención bajo condiciones

45 adecuadas para el funcionamiento de la enzima.

Esta invención también proporciona un procedimiento para blanquear pulpa, para tratar fibras naturales o sintéticas, un procedimiento para tratar lana, un procedimiento para tratar el pelo, un procedimiento para tratar aguas residuales de tintorerías y un procedimiento para decolorar tintes usando la enzima lacasa de la presente invención.

Otros objetos más de esta invención son usos de la enzima lacasa de la presente invención en diversas aplicaciones 50 y composiciones.

Es posible obtener muchas ventajas usando la enzima lacasa de esta invención en el blanqueado de tela vaquera. Mediante el uso de la enzima lacasa de esta invención puede reducirse o incluso evitar los efectos perjudiciales para el medio ambiente del hipoclorito de sodio. Si no se usa hipoclorito de sodio, no es necesario un tratamiento anticloro. Mediante la lacasa de la presente invención también es posible obtener diferentes tonos, como con el blanqueado con hipoclorito de sodio. Una ventaja de la enzima lacasa de la invención es que el tratamiento no daña el tejido. La lacasa también puede usarse para tratar productos que contienen licra. Además, el tratamiento con

5 lacasas también es práctico para el usuario.

Además, la enzima puede funcionar en un intervalo de temperatura y pH amplio. La enzima Talcc2 es particularmente adecuada para su uso a temperaturas bajas, en particular a temperaturas de 40 a 50 ºC.

Otras características, aspectos y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones adjuntas.

10 Breve descripción de los dibujos

Figura 1A. Producción de la lacasa de Thielavia en un cultivo en matraz de agitación de 50 ml.

Figura 1B. Producción de la lacasa de Chaetomium en un cultivo en matraz de agitación de 50 ml.

Fig. 2A. SDS-PAGE (al 15 %) que muestra la purificación de la lacasa de Thielavia . 1 marcador de PM (175, 83, 62, 47, 32,5, 25, 16,5 y 6,5 kDa), 2 sobrenadante del cultivo, 3 después de DEAE Sefarosa, 4-7 fracciones después de

15 filtración en gel, aproximadamente 3-6 μg de proteína cargados en cada carril. Las proteínas se tiñen con azul brillante de Coomassie.

Fig. 2B. SDS-PAGE (al 12 %) de la purificación de la lacasa de Chaetomium. 1 sobrenadante del cultivo (60 μg), 2 después de intercambio iónico (14,5 μg), 3 patrones de PM (175, 83, 62, 47,5, 32,5, 25, 16,5, 6,5 kDa), 4-9 fracciones de CIH (3,5, 3,3, 3,1, 2,4, 2,0 y 1,5 μg), 10 sobrenadante del cultivo (30 μg).

20 Fig. 3A. pH óptimos de la lacasa de Thielavia purificada (LT P) y la enzima en bruto (EB) determinados en guayacol.

Fig. 3B. pH óptimos de la lacasa de Chaetomium purificada (LCt P) y la enzima en bruto (EB) determinados en guayacol.

Fig. 4A. Estabilidad térmica de la lacasa de Thielavia a 50 y 60 ºC.

Fig. 4B. Estabilidad térmica de la lacasa de Chaetomium a 50 y 60ºC.

25 Fig.5. Las secuencias peptídicas usadas en el diseño de los cebadores de PCR para clonar los genes de lacasa de Thielavia arenaria ALKO4197 y Chaetomium thermophilum ALKO4265. Se muestran todos los codones posibles que codifican las secuencias. A. Las secuencias peptídicas homólogas elegidas a partir de la alineación de varias secuencias de lacasa fúngicas. La primera metionina de los péptidos II y III (entre paréntesis) no estaba presente en todas las secuencias de lacasa. B. Las secuencias peptídicas tripsínicas obtenidas a partir de la TLcc1 de Thielavia

30 arenaria ALKO4197. C. La secuencia N-terminal y las secuencias peptídicas tripsínicas obtenidas a partir de la CtLcc1 de Chaetomium thermophilum ALKO4265.

Fig. 6 A-G. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducidas de los genes de lacasa de Thielavia arenaria ALKO4197 y de Chaetomium thermophilum ALKO4265. El codón de detención se muestra mediante un asterisco debajo de la secuencia. La ubicación de los posibles intrones y de las señales de ayuste de intrones consenso 35 (5'GTPuNGPy, 3'PyAG, NNCTPuAPy interna) están marcadas en la secuencia usando letras minúsculas y en negrita, respectivamente. Los posibles péptidos señal, analizados con el programa SignalP V2.0, y las secuencias de aminoácidos de C-terminal maduras, determinadas a partir de las proteínas TaLcc1 y TaLcc2 recombinantes purificadas, están subrayados. Se usa un subrayado doble para la otra secuencia señal potencial codificada por el gen Talcc2 más largo. La ubicación del péptido de N-terminal de CtLcc1 y las secuencias peptídicas tripsínicas

40 obtenidas a partir de TaLcc1 y CtLcc1 purificadas están marcadas con líneas de puntos por debajo de las secuencias. Los residuos conservados que intervienen en la unión de cobre están resaltados. Los posibles sitios de N-glucosilación (N-X-S/T) están en negrita. Los dos posibles sitios de inicio de la traducción de TaLcc2 y CtLcc3 están en recuadros. A. Talcc1, B. Talcc2, C. Talcc3, D. Talcc4, E. Ctlcc1, F. Ctlcc2, G. Ctlcc3.

Fig.7 A-C. Los casetes de expresión usados en la transformación de protoplastos de Trichoderma reesei para

45 producir lacasas fúngicas recombinantes. Los genes de lacasa estaban bajo el control del promotor cbh1 (cel7A) (p cbh1) y la terminación de la transcripción se garantizó mediante el uso de la secuencia de terminación cbh1 (t cbh1). El gen amdS se incluyó como un marcador de transformación y la región flanqueante en 3' de cbh1, junto con el promotor cbh1, se usó para permitir dirigir el casete de expresión al locus cbh1 por recombinación homóloga.

Fig.8. El rendimiento de las preparaciones de lacasa en el blanqueado de tela vaquera a diferentes valores de pH en 50 las condiciones descritas en el ejemplo 7.

Fig.9. El rendimiento de las preparaciones de lacasa en el blanqueado de tela vaquera a diferentes temperaturas en las condiciones descritas en el ejemplo 8.

Fig. 10 A y B. Efecto de la lacasa CtLcc1 sobre manchas de hierba a 60 ºC y de las lacasas TaLcc2 y TaLcc4 a 50 ºC en las condiciones descritas en el ejemplo 9. Control del mediador sin la enzima para ambas temperaturas. A. Valores de la claridad, B. valores de a* (-a es la dirección verde, +a es la dirección roja)

Fig. 11 A y B. Efecto de la lacasa CtLcc1 sobre manchas de té a 80 ºC y de las lacasas TaLcc2 y TaLcc4 a 50 ºC en 5 las condiciones descritas en el ejemplo 9. Control del mediador sin la enzima para ambas temperaturas. A. Valores de la claridad, B. valores de a* (-a es la dirección verde, +a es la dirección roja)

Fig. 12 A y B. Efecto de las preparaciones de lacasa sobre manchas de hierba a 40 ºC con dosificaciones diferentes en las condiciones descritas en el ejemplo 10. A. Valores de la claridad, B. valores de a* (-a es la dirección verde,+a es la dirección roja)

10 Fig. 13 A y B. Efecto de las preparaciones de lacasa sobre manchas de té a 40 ºC con dosificaciones diferentes en las condiciones descritas en el ejemplo 10. A. Valores de la claridad, B. valores de a* (-a es la dirección verde,+a es la dirección roja)

Secuencias

SEQ ID NO:1 Secuencia del péptido 1, un péptido tripsínico de la proteína TaLcc1 de Thielavia arenaria ALKO4197.

15 SEQ ID NO:2 Secuencia del péptido 2, un péptido tripsínico de la proteína TaLcc1 de Thielavia arenaria ALKO4197. SEQ ID NO:3 Secuencia del péptido 3, un péptido tripsínico de la proteína TaLcc1 de Thielavia arenaria ALKO4197. SEQ ID NO:4 Secuencia N-terminal de la proteína CtLcc1 de Chaetomium thermophilum ALKO4265. SEQ ID NO:5 Secuencia del péptido 18.9, un péptido tripsínico de la proteína CtLcc1 de Chaetomium thermophilum

ALKO4265.

20 SEQ ID NO:6 Secuencia del péptido 22.4, un péptido tripsínico de la proteína CtLcc1 de Chaetomium thermophilum ALKO4265. SEQ ID NO:7 Secuencia del péptido 22.7, un péptido tripsínico de la proteína CtLcc1 de Chaetomium thermophilum

ALKO4265.

SEQ ID NO:8 Secuencia del cebador de oligonucleótido POX1

25 SEQ ID NO 9: Secuencia del cebador de oligonucleótido POX2 SEQ ID NO 10: Secuencia del cebador de oligonucleótido POX22 SEQ ID NO 11: Secuencia del cebador de oligonucleótido POX3 SEQ ID NO 12: Secuencia del cebador de oligonucleótido POX16 SEQ ID NOº 13: Secuencia del cebador de oligonucleótido POX23

30 SEQ ID NO:14 Secuencia del cebador de oligonucleótido POX26. SEQ ID NO:15 Secuencia del cebador de oligonucleótido POX27. SEQ ID NO:16 Secuencia del cebador de oligonucleótido POX28. SEQ ID NO:17 Secuencia del cebador de oligonucleótido POX29. SEQ ID NO:18 Secuencia del cebador de oligonucleótido POX30.

35 SEQ ID NO:19 Secuencia del cebador de oligonucleótido POX31. SEQ ID NO:20 Secuencia del cebador de oligonucleótido POX4 SEQ ID NO:21 Secuencia del cebador de oligonucleótido POX5 SEQ ID NO:22 Secuencia del cebador de oligonucleótido POX6 SEQ ID NO:23 Secuencia del cebador de oligonucleótido POX7

40 SEQ ID NO:24 Secuencia del cebador de oligonucleótido POX8 SEQ ID NO:25 Secuencia del cebador de oligonucleótido POX9

SEQ ID NO:26 Secuencia del cebador de oligonucleótido POX10 SEQ ID NO:27 Secuencia del cebador de oligonucleótido POX11 SEQ ID NO:28 Secuencia del cebador de oligonucleótido POX12 SEQ ID NO:29 Secuencia del cebador de oligonucleótido POX13

5 SEQ ID NO:30 Secuencia del cebador de oligonucleótido POX14 SEQ ID NO:31 Secuencia del cebador de oligonucleótido POX15 SEQ ID NO:32 Secuencia del fragmento de PCR obtenido a partir de la Thielavia arenaria ALKO4197 usando los

cebadores POX27 y POX31. SEQ ID NO:33

10 Secuencia del fragmento de PCR obtenido a partir de Thielavia arenaria ALKO4197 usando los cebadores POX4 y POX11. SEQ ID NO:34 Secuencia del fragmento de PCR obtenido a partir de Thielavia arenaria ALKO4197 usando los cebadores POX27 y

POX9. 15 SEQ ID NO:35

Secuencia de un fragmento de PCR obtenido a partir de Chaetomium thermophilum ALKO4265 usando los cebadores POX8 y POX11. SEQ ID NO:36 Secuencia del fragmento de PCR obtenido a partir de Chaetomium thermophilum ALKO4265 usando los cebadores

20 POX4 y POX9. SEQ ID NO:37 Secuencia de un fragmento de PCR obtenido a partir de Chaetomium thermophilum ALKO4265 usando los

cebadores POX8 y POX11. SEQ ID NO:38

25 La secuencia de nucleótidos del gen Talcc1 de Thielavia arenaria ALKO4197. SEQ ID NO:39 La secuencia de aminoácidos deducida de TaLcc1 de Thielavia arenaria ALKO4197. SEQ ID NO:40 La secuencia de nucleótidos del gen Talcc2 de Thielavia arenaria ALKO4197.

30 SEQ ID NO:41 La secuencia de aminoácidos deducida de TaLcc2 de Thielavia arenaria ALKO4197. SEQ ID NO:42 La secuencia de nucleótidos del gen Talcc3 de Thielavia arenaria ALKO4197. SEQ ID NO:43

35 La secuencia de aminoácidos deducida de TaLcc3 de Thielavia arenaria ALKO4197. SEQ ID NO:44 La secuencia de nucleótidos del gen Talcc4 de Thielavia arenaria ALKO4197. SEQ ID NO:45 La secuencia de aminoácidos deducida de TaLcc4 de Thielavia arenaria ALKO4197.

SEQ ID NO:46 La secuencia de nucleótidos del gen Ctlcc1 de Chaetomium thermophilus ALKO4265. SEQ ID NO:47 La secuencia de aminoácidos deducida de CtLcc1 de Chaetomium thermophilum ALKO4265.

5 SEQ ID NO:48 La secuencia de nucleótidos del gen Ctlcc2 de Chaetomium thermophilum ALKO4265. SEQ ID NO:49 La secuencia de aminoácidos deducida de CtLcc2 de Chaetomium thermophilum ALKO4265. SEQ ID NO:50

10 La secuencia de nucleótidos del gen Ctlcc3 de Chaetomium thermophilum ALKO4265. SEQ ID NO:51 La secuencia de aminoácidos deducida de CtLcc3 de Chaetomium thermophilum ALKO4265.

Depósitos

La Thielavia arenaria ALKO4197 se depositó en el Centraalbureau Voor Schimmelcultures en Upsalalaan 8, 3584 15 CT, Utrecht, Países Bajos el 2 de septiembre de 2004 y se le asignó el número de acceso CBS 116071.

La Chaetomium thermophilum ALKO04265 se depositó en el Centraalbureau Voor Schimmelcultures en Oosterstraat 1, 3742 SK BAARN, Países Bajos, el 8 de noviembre de 1995 y se le asignó el número de acceso CBS 730.95. Después de la finalización del periodo de depósito actual, las muestras se almacenarán en virtud de acuerdos que permitan que la cepa esté disponible más allá del tiempo de validez de la patente.

20 La cepa de E. Coli que incluye el plásmido pALK1342 se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 7 de marzo de 2003 y se le asignó el número de acceso DSM 15484.

La cepa de E. Coli que incluye el plásmido pALK1347 se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 7 de marzo de 2003 y 25 se le asignó el número de acceso DSM 15486.

La cepa de E. Coli que incluye el plásmido pALK1345 se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 7 de marzo de 2003 y se le asignó el número de acceso DSM 15485.

La cepa de E. Coli que incluye el plásmido pALK1664 se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen 30 und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 7 de marzo de 2003 y se le asignó el número de acceso DSM 15487.

La cepa de E. Coli que incluye el plásmido pALK1304 se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 27 de junio de 2002 y se le asignó el número de acceso DSM 15075.

35 La cepa de E. Coli que incluye el plásmido pALK1305 se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 27 de junio de 2002 y se le asignó el número de acceso DSM 15076.

La cepa de E. Coli que incluye el plásmido pALK1685 se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 20 de noviembre de 40 2003 y se le asignó el número de acceso DSM 16040.

Descripción detallada

La presente invención proporciona una enzima lacasa, que tiene propiedades sorprendentes y que es adecuada para diferentes aplicaciones.

En el presente documento, "la enzima lacasa de la presente invención" significa la lacasa como se define en las 45 reivindicaciones y se describe en el presente documento.

Por "enzima lacasa" en relación con esta invención se quiere decir una enzima clasificada como EC 1.10.3.2 mediante la nomenclatura de enzimas. La enzima lacasa puede provenir de cualquier organismo, incluidos los vegetales, preferentemente, puede derivar de microorganismos. Puede derivar de bacterias, por ejemplo, de un género seleccionado del grupo que comprende Bacillus, Azospirillum y Streptomyces. Preferentemente, la enzima

5 deriva de hongos (incluidos hongos filamentosos y levaduras), por ejemplo, de un género seleccionado del grupo que comprende Thielavia, Chaetomium, Achaetomium, Aspergillus, Botrytis, Collybia, Fomes, Humicola, Hypocrea, Lentinus, Melanocarpus, Myceliophthora, Neurospora, Phlebia, Pleurotus, Podospora, Polyporus, Rhizoctonia, Scytalidium, Pycnoporus, Trametes y Trichoderma.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, las lacasas de la presente invención pueden obtenerse a

10 partir del género Thielavia, más preferentemente a partir de Thielavia arenaria. De acuerdo con una de las realizaciones más preferidas de la invención, la enzima puede obtenerse a partir de una cepa depositada en el Centraalbureau von Schimmelcultures con el número CBS 116071. Otras enzimas lacasa que pueden obtenerse a partir de dichas especies se describen en el presente documento para su comparación.

Para su comparación, también se describen en el presente documento lacasas que pueden obtenerse a partir de

15 género Chaetomium, más preferentemente a partir de Chaetomium thermophilum. De acuerdo con una de las realizaciones más preferidas de la invención, la enzima puede obtenerse a partir de una cepa depositada en el Centraalbureau voor Schimmelcultures con el número CBS 730.95.

El origen de las lacasas de la presente invención no se limita al género Thielavia o a la especie T. arenaria. Mediante el uso de la descripción proporcionada en el presente documento, un experto en la técnica puede encontrar y aislar

20 la lacasa de la presente invención a partir de otros géneros de hongos, de otros microorganismos y también de organismos superiores, tales como vegetales.

La lacasa de la presente invención puede aislarse a partir de cualquier organismo productor de lacasa. Preferentemente, la enzima lacasa de la presente invención se aísla a partir de una fuente microbiana. Pueden seleccionarse organismos que pueden producir lacasa, puede determinarse la actividad sobre distintos sustratos y 25 puede caracterizarse la enzima. Por ejemplo, pueden determinarse los intervalos de pH y temperatura donde funciona la enzima, el pH y la temperatura óptimos y la estabilidad de la enzima a diversas temperaturas. De forma alternativa, pueden aislarse genes que codifican lacasas en diversos organismos y pueden compararse las secuencias de aminoácidos codificadas por los genes con la secuencia de aminoácidos de las lacasas aisladas y caracterizadas en los ejemplos del presente documento. Esto incluye la clonación directa a partir de muestras

30 ambientales.

Pueden aislarse microorganismos que producen la lacasa de la presente invención a partir de la naturaleza o pueden seleccionarse a partir de cepas ya aisladas e identificadas de colecciones de cultivos usando procedimientos que son bien conocidos por un experto en la técnica. La selección puede llevarse a cabo estudiando la producción de la enzima, bien en un cultivo sólido en cultivos en placas o bien en un medio de cultivo líquido, midiendo la

35 actividad enzimática. Los sustratos adecuados para medir la actividad incluyen ABTS, di-metoxifenol (DMF), guayacol y siringaldazina. Pueden seleccionarse hongos por su capacidad para producir lacasas, por ejemplo, mediante los procedimientos a los que se hace referencia en el ejemplo 1 con indicadores, tales como azul brillante de remazol R-478 y guayacol o ABTS. También pueden aislarse las lacasas adecuadas y clonarse los genes que las codifican a partir de organismos superiores, tales como vegetales.

40 Las cepas de microorganismos, que se encuentran como consecuencia de la selección, pueden cultivarse en un medio adecuado, y puede observarse la formación de lacasa en la disolución de cultivo o la placa. Una vez se ha producido una cantidad suficiente de lacasa de interés, la enzima puede purificarse y sus propiedades pueden caracterizarse más a fondo.

Las enzimas lacasa producidas pueden aislarse y purificarse usando procedimientos convencionales de química de

45 proteínas, tales como precipitación por sal, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de interacción hidrófoba. La purificación puede monitorizarse por determinación de proteína, ensayos de actividad enzimática y por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. Puede determinarse la actividad enzimática de la enzima purificada a diversas temperaturas y valores de pH; de forma similar, pueden determinarse el peso molecular y el punto isoeléctrico.

50 La enzima purificada se refiere a una preparación de enzima, que no tiene otras proteínas o tiene una cantidad muy baja de otras proteínas además de la proteína lacasa. La pureza de la lacasa obtenida que, esencialmente, no tiene otras proteínas, es de ≥90 %.

La purificación de las lacasas preferidas de la presente invención se ha ejemplificado en el ejemplo 1. Se cargó filtrado concentrado de cultivo de Thielavia en una columna de Sefarosa Q FF, las proteínas se eluyeron con un 55 gradiente creciente de sal y se cargaron las fracciones de lacasa activas en resina de filtración en gel Sefacril S100. Después de la purificación se realizaron ensayos de actividad y SDS-PAGE y tinción con azul brillante de Coomassie subsiguiente. Con el fin de obtener muestras de gran pureza se incluyó una etapa adicional de intercambio aniónico con Resource Q. El sobrenadante del cultivo de lacasa de Chaetomium se concentró y se cambió de tampón

mediante ultrafiltración a un tampón de unión. Las proteínas se unieron a DEAE sefarosa FF, se eluyeron con un gradiente de sulfato de sodio y las fracciones positivas para lacasa se agruparon y se purificaron adicionalmente con cromatografía de interacción hidrófoba. Finalmente, la pureza de las fracciones activas, se analizó mediante SDS-PAGE y tinción de Coomassie subsiguiente. Naturalmente, es posible separar las enzimas de la presente invención

5 usando otros procedimientos de purificación conocidos, en lugar de o además de los procedimientos descritos en el presente documento.

El peso molecular de la lacasa puede determinarse en SDS-PAGE de acuerdo con Laemmli (1970) y el punto isoeléctrico de la lacasa puede determinarse con enfoque isoeléctrico y las bandas que contienen lacasa pueden visualizarse mediante tinción del gel con ABTS, por ejemplo, como se describe en el ejemplo 2.

10 La determinación de la actividad lacasa a diversas temperaturas puede llevarse a cabo usando ABTS como sustrato, como se describe en el ejemplo 1, de acuerdo con el procedimiento desarrollado por Niku-Paavola et al. (1988) o mediante otros procedimientos descritos en la bibliografía.

El pH óptimo de la lacasa puede determinarse sobre un sustrato adecuado en un tampón adecuado a diferentes valores de pH midiendo la actividad.

15 La estabilidad térmica puede determinarse incubando una muestra de enzima durante diferentes periodos de tiempo a diversas temperaturas en un tampón adecuado a un pH determinado. La actividad residual de la enzima a cada temperatura puede definirse a valores de pH midiendo la actividad.

Pueden determinarse las actividades específicas de las lacasas purificadas frente a diferentes sustratos de lacasa, tales como ABTS, dimetoxifenol (DMF), siringaldazina y guayacol.

20 El efecto de diversos inhibidores de la actividad lacasa puede determinarse midiendo el consumo de oxígeno durante la reacción enzimática con ABTS, por ejemplo, en recipientes cerrados y totalmente llenos con electrodo de oxígeno o siguiendo la actividad enzimática por medios espectroscópicos en presencia de un inhibidor.

El extremo N-terminal de la proteína, así como los péptidos internos, pueden secuenciarse de acuerdo con la química de degradación de Edman [Edman y Begg (1967)] como se describe en el ejemplo 2 o por otros

25 procedimientos descritos en la bibliografía.

Los pesos moleculares de las enzimas lacasa principales purificadas aisladas a partir de sobrenadantes de cultivo de Thielavia arenaria y Chaetomium thermophilum fueron ambos de aproximadamente 80 KDa. La lacasa de Thielavia purificada mostró varias bandas en el enfoque isoeléctrico a pI de 5,5, 5,9, 6,4, 6,8 y 6,9. La lacasa de Chaetomium purificada mostró 3-4 bandas en el enfoque isoeléctrico a pI de 4,1 a 4,3.

30 El pH óptimo para la lacasa de Thielavia purificada fue de 5,5 determinado en guayacol y la enzima mostró una actividad sustancialmente elevada aun a pH 7. El pH óptimo para la lacasa de Chaetomium purificada fue a pH 5,0. La precisión de la medida es de ± 0,5.

La actividad específica de la enzima lacasa de Thielavia más alta fue sobre ABTS, 1020 nkat/mg de proteína a pH 4,5. La actividad específica sobre DMS fue de 260, sobre siringaldazina de 490 y sobre guayacol de 63 nkat/mg a pH

35 5,5. La actividad específica de la enzima lacasa de Thielavia más alta fue sobre ABTS, 750 nkat/mg de proteína a pH 4,5. La actividad específica sobre DMS fue de 290, sobre siringaldazina de 400 y sobre guayacol de 85 nkat/mg a pH 5,5.

La lacasa que muestra propiedades ventajosas puede producirse bien por el huésped original o recombinante mediante un procedimiento que comprende cultivar bajo condiciones adecuadas un huésped en el que se han 40 introducido una secuencia de ADN que codifica dicha lacasa y secuencias necesarias para expresar dicha enzima o bien, opcionalmente, aislando la enzima. El huésped productor puede ser cualquier organismo capaz de expresar la lacasa. Preferentemente, el huésped es una célula microbiana, más preferentemente un hongo. Lo más preferentemente, el huésped es un hongo filamentoso. Preferentemente, el huésped recombinante se modifica para que exprese y secrete lacasa como su actividad principal o una de sus actividades principales. El medio de cultivo

45 gastado del huésped productor puede usarse como tal o puede concentrarse, filtrarse o fraccionarse. También puede secarse.

Los sistemas huéspedes de producción y expresión adecuados son, por ejemplo, el sistema de producción desarrollado para el huésped de hongo Trichoderma (documento EP 244 234) o sistemas productores de Aspergillus, tales como A. oryzae o A. niger (documentos WO 9708325 y WO 9533386, US 5.843.745, US 50 5.770.418) o el sistema de producción desarrollado para especies fúngicas de Fitsarium, tales como F. oxysporum (Malardier et al., 1989). Los sistemas de producción adecuados desarrollados para bacterias son un sistema de producción desarrollado para Bacillus, por ejemplo B. subtilis o para E. coli o para actinomicetos Streptomyces. Los sistemas de producción adecuados desarrollados para levaduras son sistemas desarrollados para Saccharomyces, Shizosaccharomyces o Pichia pastoris. También pueden usarse sistemas de producción en algunos otros microbios

55 o en células de mamíferos.

Los huéspedes preferidos para producir la enzima lacasa de la presente invención son cepas concretas de los géneros Trichoderma o Aspergillus.

Dentro del alcance de protección de la presente invención también se encuentran vectores que pueden usarse cuando la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la lacasa elegida se introduce en un huésped. Dentro del 5 alcance de protección de la presente invención también se encuentran secuencias que facilitan la expresión y la secreción de la secuencia codificante de la lacasa, tales como promotores y secuencias señal.

Pueden usarse procedimientos de biología molecular estándar en la clonación de la enzima lacasa, es decir, en el aislamiento y los tratamientos enzimáticos del ADN, en las transformaciones de E. coli, etc. Los procedimientos básicos usados se describen en los manuales de biología molecular estándar, p. ej., en Sambrook et al. (1989) y en

10 Sambrook y Russell (2001).

La colección genómica preparada a partir del organismo huésped elegido se rastreó con sondas preparadas por PCR. Las secuencias de los cebadores de oligonucleótido usados en las reacciones de PCR se basan en las secuencias de aminoácidos de los péptidos obtenidos a partir de la enzima lacasa purificada producida por el huésped natural y en las secuencias consenso de lacasas fúngicas. Los productos de ADN obtenidos se

15 caracterizaron por secuenciación y realizando hibridaciones de bandas de Southern con el ADN genómico de Thielavia y Chaetomium digerido con varias enzimas de restricción.

Se aislaron cuatro genes de lacasa a partir de Thielavia y tres a partir de Chaetomium. Todos estos genes se incluyeron en vectores plasmídicos y se depositaron en una cepa de E. Coli en la colección de la DSMZ. El gen de lacasa Talcc1 de longitud completa de Thielavia se incluyó en el plásmido pALK1342 y se depositó con el número 20 DSM 15484. En consecuencia, el gen de lacasa Talcc2 de Thielavia se incluyó en el plásmido pALK1347 y se depositó con el número DSM 15486, el gen Talcc3 se incluyó en el plásmido pALK1345 y se depositó con el número DSM 15485 y el gen Talcc4 se incluyó en el plásmido pALK1664 con el número DSM 15487. El gen de lacasa Ctlcc1 de Chaetomium se incluyó en el plásmido pALK1304 y se depositó con el número DSM 15075. El Ctlcc2 se incluyó en el plásmido pALK1305 y se depositó con el número DSM 15076. El Ctlcc3 se incluyó en el plásmido pALK1685 y

25 se depositó con el número DSM 16040. Las secuencias de aminoácidos deducidas de las lacasas se analizaron a partir de la secuencia de ADN.

Las secuencias de los genes de lacasa y de las proteínas lacasa deducidas se muestran en la figura 6. La información pertinente sobre los genes y las secuencias de aminoácidos deducidas se resumen en las tablas 8 y 9, respectivamente.

30 Por ejemplo, la longitud del gen Talcc2 era de 1957 pb (o 1737 pb, dependiendo del sitio de inicio de la traducción), incluido el codón de detención, y el gen tenía dos intrones. La secuencia de la proteína deducida constaba de 589 aminoácidos (para la secuencia de aminoácidos deducida más corta, 579 aminoácidos) incluida una secuencia señal predicha de 29/24 aminoácidos sin "cola" después de la secuencia consenso DSGL. La masa molecular predicha era de 61811/62274 Da para el polipéptido maduro y el pI predicho era de 4,65/4,65 (secuencia señal eliminada). La

35 secuencia de aminoácidos deducida incluía 12 sitios de N-glucosilación posibles.

La longitud del gen Ctlcc1 gen era de 2127 pb (incluido el codón de detención) y el gen tenía cinco intrones. La secuencia de la proteína deducida constaba de 607 aminoácidos, incluida una secuencia señal predicha de 20 aminoácidos y una "cola" de 13 aminoácidos después de la secuencia consenso DSGL. La masa molecular predicha era de 63905 Da para el polipéptido maduro (secuencia señal y cola no incluidas) y el pI predicho era de 6,09

40 (secuencia señal eliminada). La secuencia de aminoácidos deducida incluía 9 sitios de N-glucosilación posibles.

Se descubrió que las secuencias de aminoácidos deducidas de TaLcc1 y CtLcc1 eran las más homólogas entre sí, como también lo eran las de TaLcc3 y CtLcc2 (también en el nivel génico, p. ej., en la organización de los intrones de los genes respectivos). El valor de identidad obtenido para TaLcc1 y CtLcc1 usando la alineación global de Needleman-Wunsch (EMBLOSUM62, penalización por hueco 10,0, penalización por extensión 0,5; paquete

45 informático European Molecular Biology Open Software Suite, versión 2.9.0; Rice et al., 2000) fue del 159,5 % y para TaLcc3 y CtLcc2 fue del 67,3 % (tabla 10). Los valores de identidad de las otras proteínas lacasa fueron menores, cuando se alinearon entre sí y con TaLcc1, CtLcc1, TaLcc3 y CtLcc2, como puede verse en la tabla 10.

El término "identidad" significa en el presente documento la identidad entre dos secuencias de aminoácidos comparadas entre sí desde el primer aminoácido codificado por el gen correspondiente hasta el último aminoácido.

50 La identidad de las secuencias de longitud completa se mide usando el programa de alineación global de Needleman-Wunsch del paquete informático EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite), versión 2.9.0, con los parámetros siguientes: EMBLOSUM62, penalización por hueco 10,0, penalización por extensión 0,5.

Dentro del alcance de la presente invención se encuentran enzimas o polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos que tienen actividad lacasa y que muestran una identidad de al menos el 75 % con la secuencia de

55 aminoácidos SEQ ID NO:41 (TaLcc2). La enzima preferida comprende una secuencia de aminoácidos que muestra una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente de al menos el 85 %, más y más preferentemente de al menos el 90 %, lo más preferentemente de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:41.

Para su comparación también se divulgan en el presente documento enzimas o polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos que tienen actividad lacasa y que muestran una identidad de al menos el 58 % con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:43 (TaLcc3). Dichas enzimas comprenden secuencias de aminoácidos que muestran una identidad de al menos el 65 %, más preferentemente de al menos el 68 %, incluso más

5 preferentemente de al menos el 75 %. Aún más preferentemente, las secuencias de aminoácidos muestran una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente de al menos el 85 %, más y más preferentemente de al menos el 90 %, lo más preferentemente de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:43.

Para su comparación también se divulgan en el presente documento enzimas o polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos que tienen actividad lacasa, que muestran una identidad de al menos el 78 % con la

10 secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:45 (TaLcc4). Dichas enzimas comprenden secuencias de aminoácidos que muestran una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente de al menos el 85 %, incluso más preferentemente de al menos el 90 %. Lo más preferentemente, el amino muestra una identidad de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:45.

Para su comparación se divulgan en el presente documento enzimas o polipéptidos que comprenden secuencias de

15 aminoácidos que tienen actividad lacasa y que muestran una identidad de al menos el 74 % con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:47 (CtLcc1). Dichas enzimas comprenden secuencias de aminoácidos que muestran una identidad de al menos el 76 %, más preferentemente de al menos el 80 %, incluso más preferentemente de al menos el 85 %. Aún más preferentemente, las secuencias de aminoácidos muestran una identidad de al menos el 90 %, lo más preferentemente de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:47.

20 Para su comparación también se divulgan en el presente documento enzimas o polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos que tienen actividad lacasa y que muestran una identidad de al menos el 55 % con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:49 (CtLcc2). Dichas enzimas comprenden secuencias de aminoácidos que muestran una identidad de al menos el 60 %, más preferentemente de al menos el 68 %. Aún más preferentemente, las secuencias de aminoácidos muestran una identidad de al menos el 75 %, más preferentemente de al menos el

25 80 %, aún más preferentemente de al menos el 85 %, más y más preferentemente de al menos el 90 %, lo más preferentemente de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:49.

Para su comparación también se divulgan en el presente documento enzimas o polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos que tienen actividad lacasa y que muestran una identidad de al menos el 53 % con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:51 (CtLcc3). Dichas enzimas comprenden secuencias de aminoácidos que

30 muestran una identidad de al menos el 60 %, más preferentemente de al menos el 65 %, incluso más preferentemente de al menos el 70 %. Aún más preferentemente, las secuencias de aminoácidos muestran una identidad de al menos el 75 %, más preferentemente de al menos el 80 %, aún más preferentemente de al menos el 85 %, más y más preferentemente de al menos el 90 %, lo más preferentemente de al menos el 95 % con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:51.

35 Dentro del alcance de la presente invención se encuentran también la enzima y el polipéptido truncado como se definen anteriormente, pero que carecen de secuencia señal. La secuencia señal puede eliminarse, por ejemplo, durante las fases postraduccionales de la producción o en el medio de cultivo gastado o durante el almacenamiento del medio de cultivo o la preparación de enzima. Además, el huésped puede escindir un propéptido de la proteína. La truncación también puede lograrse, p.ej., acortando el gen que codifica el polipéptido antes de transformarlo en el

40 huésped productor.

La lacasa de acuerdo con la invención puede producirse en el medio de cultivo de su huésped natural o de un huésped recombinante, desde donde puede aislarse y purificarse usando procedimientos conocidos de la química de proteínas. Si el medio de cultivo contiene una cantidad lo suficientemente alta de lacasa, pero no otras proteínas perjudiciales, puede usarse el medio de cultivo como tal simplemente separando las células. Cuando así se desee, 45 la disolución de cultivo puede concentrarse, filtrarse, fraccionarse y/o purificarse. También puede secarse. En diversas aplicaciones, es preferible usar un preparación de enzima que contenga una cantidad de lacasa incrementada. Una preparación de enzima de este tipo puede prepararse produciendo la cantidad de enzima lacasa incrementada en el medio de cultivo del huésped productor por medio de tecnología genética o mediante la optimización de las condiciones de cultivo. La cantidad incrementada se refiere a una cantidad de enzima lacasa que

50 excede de la cantidad de enzima lacasa producida de manera natural por el huésped natural. En el presente documento, "medio de cultivo gastado" significa el medio de cultivo del huésped que comprende las enzimas producidas.

De acuerdo con una realización preferida de la invención la lacasa de Thielavia puede producirse en un huésped hongo filamentoso, preferentemente en un huésped de Trichoderma. La producción se describe con más detalle en

55 el ejemplo 4. La purificación y la caracterización de lacasas recombinantes en términos de pH óptimo, estabilidad térmica y pI se describe en el ejemplo 5. La lacasa de Thielavia TaLcc2 tenía un pH óptimo en guayacol a pH 5,5, la TaLcc3 a pH 5,0 en guayacol, la TaLcc4 a pH 6,0 en DMF. La CtLcc1 tenía un pH óptimo en guayacol a pH 5,0.

La enzima TaLcc2 funciona en un amplio intervalo de pH desde pH 3 a 9, preferentemente a pH de 4 a 8, lo más preferentemente a pH de 4,5 a 6,5 determinado en guayacol. La enzima TaLcc3 funciona a pH de 3,5 a 7,5, preferentemente a pH de 4 a 6,5 determinado en guayacol. La enzima TaLcc4 funciona a pH de 3,5 a 7,5, más preferentemente a pH de 4 a 7, lo más preferentemente a pH de 5 a 6,5 determinado en DMF.

La enzima CtLcc1 funciona a pH de 3,5 a 8, preferentemente a pH de 4 a 7, lo más preferentemente a pH de 4,5 a 6 determinado en guayacol.

5 De los intervalos de pH mencionados, el primer intervalo de pH significa que el 20 % o más de la actividad máxima se da en esta región, el segundo intervalo de pH significa que el 40 % o más de la actividad se da en esta región. La tercera región significa que el 80 % o más de la actividad se da en esta región.

Las actividades específicas se determinaron frente a ABTS, DMF, siringaldazina y guayacol como se describe en el ejemplo 6. La actividad específica más alta de TaLcc2 fue en ABTS, 360 nkat/mg a pH 4,5, la de TaLcc3 8,3 nkat/mg

10 a pH 4,5, la de TaLcc4 1000 nkat/mg a pH 4,5, respectivamente. La actividad específica de CtLcc1 fue de 705 nkat/mg a pH 4,5.

Dentro del alcance la presente invención también se encuentran enzimas lacasa que muestran una identidad de al menos el 75 % con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:41 (TaLcc2) y tienen una actividad específica de al menos 300, preferentemente de al menos 350 nkat/mg frente a ABTS a pH 4,5. Se divulgan para su comparación en

15 el presente documento enzimas lacasa que muestran una identidad de al menos el 58 % con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:43 (TaLcc3) y tienen una actividad específica de al menos 7, preferentemente de al menos 8 nkat/mg frente a ABTS a pH 4,5 y enzimas lacasa que muestran una identidad de al menos el 78 % con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:45 (TaLcc4) y tienen una actividad específica de al menos 900, preferentemente de al menos 1000 nkat/mg frente a ABTS a pH 4,5.

20 También se divulgan en el presente documento para su comparación enzimas lacasa que muestran una identidad de al menos el 74 % con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:47 (CtLcc1) y tienen una actividad específica de al menos 600, preferentemente de al menos 700 nkat/mg frente a ABTS a pH 4,5.

La producción de lacasa también puede mejorarse optimizando las condiciones de cultivo y el medio de cultivo de una cepa natural o recombinante. Puede optimizarse la proporción de carbono/nitrógeno para que sea la mejor para

25 la producción de enzima. Las condiciones de crecimiento, pH, temperatura, mezcla y suministro de aire pueden optimizarse para que sean las mejores posibles para la producción de enzima en cuestión. En la fermentación, también pueden usarse inductores de la producción de lacasa, tales como alcohol veratrílico, xilidino o lignina u otros compuestos aromáticos. Pueden optimizarse la forma y el momento de la adición de los inductores, así como su concentración.

30 El término "preparación de enzima" designa en el presente documento cualquier producto enzimático que contenga al menos una enzima lacasa. Por tanto, una preparación de enzima de este tipo puede ser un medio de cultivo gastado o un filtrado que contenga una o más lacasas o una o más lacasas y otras enzimas, una enzima lacasa aislada o una mezcla de una o más enzimas lacasa o una mezcla de una o más enzimas lacasa y una o más enzimas diferentes. Además de la actividad lacasa, dicha preparación puede contener aditivos, tales como

35 mediadores, estabilizantes, tampones, conservantes, tensioactivos y/o componentes del medio de cultivo. Los aditivos preferidos son aquellos que se usan comúnmente en preparaciones de enzimas destinadas para la aplicación, donde se usa la preparación de enzima. La preparación de enzima pueden estar en forma de líquido, polvo o granulado.

La preparación de enzima puede comprender, además de lacasa, una o más enzimas diferentes, que pueden ser,

40 por ejemplo, amilasas, celulasas y/o peroxidasas. De forma alternativa, antes, durante o después del tratamiento con lacasa de la presente invención, puede llevarse a cabo otro tratamiento enzimático. El tratamiento enzimático pueden comprender, por ejemplo, uno o más tratamientos con amilasa, uno o más tratamientos con celulasa y/o uno

o más tratamientos con peroxidasa. Qué otras enzimas se incluyen en la preparación de enzima o se usan en el tratamiento enzimático, depende de la aplicación.

45 La preparación de enzima puede comprender una o más enzimas lacasa de la presente invención u otras enzimas lacasa junto con una o más enzimas lacasa de la presente invención. Por ejemplo, pueden combinarse enzimas lacasa que tienen propiedades diferentes para hacer que la preparación de enzima sea más útil para diferentes condiciones.

En el presente documento, "mediadores" significa aditivos que son necesarios a menudo para potenciar el efecto de

50 las lacasas. Muchas de las lacasas de la técnica anterior no funcionan o no funcionan de forma eficaz en ausencia de mediadores. Asimismo, las lacasas que pueden obtenerse a partir de Thielavia o Chaetomium, funcionan con más eficacia en presencia de mediadores. Los mediadores adecuados incluyen, por ejemplo, metilsiringato, acetosiringona, etilsiringato, butilsiringato y laurilsiringato, ácido propiónico-fenotiazina (PPT) 2,2'azinobis-3etilbenzotiazol-6-sulfonato (ABTS), 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi (Tempo), 1-hidroxibenzotriazol (HBT), ácido

55 violúrico, N-hidroxi-acetanilida (NHA). El mediador puede usarse en el intervalo de 0,1 a 100 mg/g o de 0,1 a 100 mg/l, preferentemente de 1 a 10 mg/g o de 1 a 10 mg/l del material tratado dependiendo de la aplicación.

Blanqueado de tela vaquera

La enzima de la presente invención es particularmente adecuada para el blanqueado de tela vaquera. En el presente documento, "incrementar la claridad" de la tela vaquera significa un incremento visible y medible de la claridad en el tejido de tela vaquera. "Incrementar la claridad" de la tela vaquera quiere decir, en particular, incrementar la claridad

5 de la tela vaquera en la cara visible de la tela vaquera. El incremento puede medirse, por ejemplo, midiendo el color como valores de reflectancia con un cromámetro usando coordenadas de espacio de color L*a*b* como se describe en los ejemplos 7-10.

"Aspecto blanqueado" quiere decir los efectos que se obtienen sobre el tejido de tela vaquera en la técnica anterior por medio de productos químicos blanqueantes, p. ej., hipoclorito de sodio. Hasta ahora, el "blanqueado con cloro"

10 ha sido el procedimiento de blanqueado más eficaz para la tela vaquera teñida con añil, ya que pueden obtenerse prácticamente todos los tonos. Si ha sido deseable un efecto de "blanqueado blanco", el blanqueado se ha llevado a cabo de 2 a 3 veces, una después de otra en diferentes baños de tratamiento, o usando altas concentraciones de hipoclorito. El blanqueado con glucosa, derivados del ácido sulfínico o lacasas se ha propuesto para el tratamiento de tela vaquera para reemplazar al hipoclorito de sodio.

15 Para "incrementar la claridad" del tejido de tela vaquera, de acuerdo con la técnica anterior, se lleva a cabo el tratamiento con diversos productos químicos blanqueantes o enzimas. A menudo, se realiza el blanqueado después del tratamiento con celulasas o piedras de pumita o ambas.

Cuando se usa la lacasa de la presente invención, si se desea un efecto más blanquecino, pueden usarse dosis más altas o puede repetirse el tratamiento enzimático o combinarlo con otros procedimientos de blanqueado. El

20 tratamiento con lacasa de la presente invención puede combinarse también con cualquier otro tratamiento blanqueante, con uno o más tratamientos blanqueantes químicos o con uno o más tratamientos enzimáticos diferentes capaces de incrementar la claridad de la tela vaquera.

El tratamiento de la tela vaquera de acuerdo con la invención comprende generalmente las etapas siguientes:

-

la tela vaquera desaprestada u opcionalmente desaprestada y la tela vaquera tratada con celulasa se pone en 25 contacto en medio acuoso con una cantidad eficaz de enzima lacasa bajo condiciones adecuadas para la función de la enzima; y

-

se llevan a cabo uno o más aclarados con agua.

Preferentemente, el tratamiento con lacasa se lleva a cabo en tela vaquera tratada con celulasa. Después del tratamiento con lacasa se realizan uno o más aclarados con agua caliente o fría, opcionalmente con detergentes. La 30 inactivación de la enzima no suele ser necesaria después del tratamiento con lacasa, ya que no reduce la resistencia del tejido, pero, si es necesario, se lleva a cabo mediante procedimientos bien conocidos por un experto en la técnica. Normalmente, el tratamiento se lleva a cabo en un equipo que normalmente se usa para procedimientos en mojado en la en la industria textil, tales como maquinaria industrial usada para lavado, tratamiento con celulasa, tinte

o acabado.

35 "Tela vaquera", en relación con esta invención, quiere decir tejido de tela vaquera, normalmente pantalones de tela vaquera.

El rendimiento de las preparaciones de lacasa de la presente invención en el blanqueado de tela vaquera se ejemplificó a diferentes valores de pH como se describe en el ejemplo 7. Se probaron preparaciones de lacasa recombinante producidas usando Thrichoderma como huésped para determinar su capacidad para blanquear tela

40 vaquera y se compararon con una preparación de lacasa convencional DeniLite II Base de Novozymes.

Ambas lacasas, CtLcc1 y TaLcc2, fueron más eficaces en la decoloración del tinte añil de la tela vaquera en comparación con la lacasa de la técnica anterior a valores de pH 6 y 7, como puede verse en la tabla 18 y el figura 8. El aspecto del tejido de tela vaquera, en particular a pH 6, fue mucho más claro.

Se probó la capacidad de las lacasas divulgadas en el presente documento para blanquear tela vaquera a diferentes 45 temperaturas y se comparó con la lacasa de la técnica anterior como se describe en el ejemplo 8.

CtLcc1 y, en particular, TaLcc2 fueron más eficaces en la decoloración de la tela vaquera (mayor incremento de la claridad) en comparación con la lacasa de la técnica anterior de 40 a 50 ºC. Por tanto, las dos enzimas son muy adecuadas para su uso en aplicaciones donde se prefieren temperaturas bajas. Sin embargo, CtLcc1 fue más eficaz también a 60 ºC y, por tanto, funciona en un intervalo de temperatura amplio.

50 De acuerdo con una realización preferida de esta invención, el tratamiento de tela vaquera por las lacasas de la presente invención se lleva a cabo a la temperatura de 30 a 80 ºC, preferentemente a la temperatura de 40 a 70 ºC, más preferentemente a la temperatura de 40 a 60 ºC. El pH durante el tratamiento puede estar en el intervalo desde pH 3 a 9, preferentemente desde pH 4 a 8, lo más preferentemente desde pH 5 a 7. El tratamiento puede llevarse a cabo en de 15 minutos a 2 horas, preferentemente en de 30 minutos a 90 minutos, más preferentemente en de 30 minutos a 60 minutos.

La dosificación usada en el tratamiento puede ser de 2 a 500 nkat, más preferentemente de 20 a 200, lo más preferentemente de 20 a 100 nkat/g de tejido.

Con la enzima lacasa de la presente invención puede tratarse cualquier tipo de tejido de tela vaquera. De forma

5 ventajosa, la tela vaquera es tela vaquera teñida con añil. En el presente documento, "teñido con añil" significa que la tela vaquera que se quiere tratar está teñida con añil, con derivados de añil o tela vaquera teñida con añil junto con algún otro tinte, por ejemplo, tela vaquera teñida con añil con fondo de azufre.

El tejido de tela vaquera puede tratarse con celulasa o lavarse a la piedra, o ambas, o el tejido de tela vaquera puede tratarse con lacasa de la presente invención justo después de desaprestarlo. Puede obtenerse un mayor

10 incremento de la claridad de la tela vaquera cuando el tratamiento con lacasa se lleva a cabo en tejido tratado con celulasa.

Normalmente, el procedimiento de "desaprestado" es el primer tratamiento en mojado de los vaqueros y significa la eliminación del almidón u otros agentes de apresto aplicados habitualmente a los hilos de urdimbre para evitar el daño durante el procedimiento de tejido. Para un procesamiento en mojado mejorado y uniforme, se usan alfa

15 amilasas para eliminar el apresto a base de almidón. Después de desaprestarlos, los vaqueros suelen aclararse con agua.

El término "desgastado" significa en el presente documento la apariencia del tejido de tela vaquera cuando se ha tratado con enzimas celulasas o se ha lavado a la piedra, o ambas. Como consecuencia de la eliminación desigual del tinte, existen contrastes entre zonas teñidas y zonas de las que se ha eliminado el tinte. "Aspecto lavado a la

20 piedra" o "aspecto usado" son expresiones sinónimas. El tratamiento con celulasa puede realizarse usando celulasas neutras o ácidas o ambas. Si un tejido no se trata con celulasa o no se lava a la piedra, se dice que el aspecto del tejido es "apagado", ya que no estarían presentes los contrastes de moda.

Eliminación de manchas

La enzima lacasa de la presente invención puede usarse también para eliminar manchas bajo condiciones similares 25 a las del blanqueado de tela vaquera.

De acuerdo con una realización preferida de esta invención, el tratamiento de tela vaquera por las lacasas de la presente invención se lleva a cabo a la temperatura de 30 a 80 ºC, preferentemente a la temperatura de 40 a 70 ºC, más preferentemente a la temperatura de 40 a 60 ºC. El pH durante el tratamiento puede estar en el intervalo desde pH 3 a 9, preferentemente desde pH 4 a 8, lo más preferentemente desde pH 5 a 7. El tratamiento puede llevarse a

30 cabo en de 15 minutos a 2 horas, preferentemente en de 30 minutos a 90 minutos, más preferentemente en de 30 minutos a 60 minutos.

La dosificación usada en el tratamiento puede ser de 0,2 a 2000 nkat/g de tejido, preferentemente de 1 a 500, más preferentemente de 2 a 200 nkat/g de tejido.

La lacasas de la presente invención y las preparaciones de lacasa Denilite II Base se probaron para determinar su

35 capacidad para eliminar manchas como se describe en el ejemplo 9. En las pruebas, se usaron telas de prueba manchadas artificialmente para manchas de hierba y manchas de té con o sin el mediador (siringato de metilo). Las dosificaciones de las enzimas fueron de 20 y 200 nkat/g de tejido y la prueba se realizó 40, 50 o 60 ºC y a pH 6 durante 60 minutos.

Como puede verse en las tablas 21 y 22 y en las figuras 10 a 13, la lacasa CtLcc1 fue eficaz en la eliminación de las 40 manchas de hierba y té con mediador a 60 ºC y la lacasa TaLcc2 a 50 ºC. El efecto también se observó a 40 ºC.

Decoloración de tintes

La enzima lacasa de la presente invención puede usarse también en la decoloración de tintes. Las aguas residuales de las tintorerías, por ejemplo, no pueden verterse a aguas naturales sin degradar los tintes y/o decolorarlos. La decoloración puede llevarse a cabo bajo condiciones similares a las usadas en el blanqueado de tela vaquera. La

45 dosificación de la enzima y el tiempo de tratamiento adecuados dependen de la cantidad de tinte que se quiere decolorar y de las condiciones de tratamiento.

De acuerdo con una realización preferida de esta invención, la decoloración de tintes se lleva a cabo a la temperatura de 30 a 80 ºC, preferentemente a la temperatura de 40 a 70 ºC, más preferentemente a la temperatura de 40 a 60 ºC. El pH durante el tratamiento puede estar en el intervalo desde pH 3 a 9, preferentemente desde pH 4

50 a 8, lo más preferentemente desde pH 5 a 7.

Las dosificaciones de enzima y los tiempos de tratamiento pueden probarse y elegirse para que sean los más adecuados para la aplicación. Como guía, pueden usarse dosificaciones de 0,2 a 2000 nkat/l de la disolución de tratamiento. Preferentemente, el tiempo de tratamiento es de 15 min a 24 horas, más preferentemente de 30 min a 12 horas. Si el tratamiento se lleva a cabo a temperaturas más bajas, por ejemplo, de 18 a 30 ºC, el tiempo de tratamiento puede ser mayor.

Como se describe en ejemplo 10, las lacasas divulgadas en el presente documento se probaron para determinar su capacidad para decolorar diferentes tintes en presencia o ausencia de un mediador. Las lacasas CtLcc1 y TaLcc2 fueron capaces de decolorar el indigotíndisulfonato sódico y el azul brillante de remazol de forma muy eficaz. El rojo

5 brillante de cibacrón 3B-P también se decoloró parcialmente.

Otras aplicaciones

Dado que la lacasa de la presente invención tiene una alta capacidad oxidante de distintos sustratos, es muy adecuada para muchas aplicaciones industriales. Tales aplicaciones son, por ejemplo, la fabricación de productos de fibra y aplicaciones de la industria forestal, aplicaciones en la industria cosmética y en la industria de preparación del

10 cuidado personal y otras aplicaciones. En estas aplicaciones, la temperatura y el pH están en la zona en la que la lacasa de la presente invención funciona. La dosificación y el tiempo de tratamiento pueden elegirse dependiendo de la aplicación y el material que se quiere tratar.

Pueden necesitarse mediadores como aditivos para potenciar el efecto de la lacasa de la presente invención. Además, es esencial que llegue oxígeno suficiente a la reacción. En caso necesario, puede añadirse oxígeno, bien

15 haciendo llegar aire u oxígeno o aire enriquecido en oxígeno a la mezcla de reacción.

La lacasa de la presente invención es adecuada para su uso en la industria textil, para tratar fibras sintéticas o naturales o sus combinaciones. La enzima es adecuada para tratar fibras celulósicas, así como fibras proteináceas, tales como la lana o la seda.

La lacasa de la presente invención es adecuada para su uso en la industria forestal. Pueden ponerse en contacto

20 con la lacasa fibras que contienen lignina. Debido al tratamiento con lacasa, las propiedades de resistencia de las fibras mejora, pudiendo utilizarse, por ejemplo, en la fabricación de paneles de fibra, en productos y compuestos de papel o cartón, que se fabrican con fibras que contienen lignina molidas mecánicamente. Las fibras de madera también pueden tratarse con lacasas de la presente invención para funcionalizarlas o para pegar las fibras.

La lacasa de la presente invención también es muy adecuada para la despolimerización de diversos compuestos.

25 Usando la lacasa de la presente invención, puede despolimerizarse la lignina de la pulpa kraft, produciendo de este modo una pulpa con un contenido en lignina menor. Por tanto, la lacasa puede usarse para blanquear la pulpa para reducir el uso de productos químicos blanqueantes. Como consecuencia de la mejor capacidad para blanquearse de la pulpa después del tratamiento con lacasa, se produce una reducción del consumo subsiguiente de productos químicos blanqueantes, que, cuando se usan productos químicos que contienen cloro, da lugar a la formación de

30 compuestos organoclorados no deseables para el medio ambiente.

La lacasa de la presente invención puede usarse también para polimerizar compuestos, tales como lignina, para producir compuestos de alto peso molecular.

Debido a la alta capacidad oxidante de la enzima, puede usarse para oxidar tintes o precursores de tintes o compuestos cromóforos en la industria cosmética o en la industria de preparación productos de cuidado personal. La

35 oxidación de los tintes da lugar a la decoloración de los compuestos. Este efecto puede usarse, por ejemplo, para teñir el pelo o al blanquear los dientes. Para llevar a cabo el tinte del pelo, suelen ser necesarios modificadores o precursores de tintes.

La lacasa de acuerdo con la invención también puede usarse para mejorar el funcionamiento de las máquinas de papel. La lacasa puede usarse para mejorar el funcionamiento de máquinas de papel mediante la polimerización de

40 compuestos procedentes de la lignina y extractos y mediante la disminución del crecimiento perjudicial de microbios en la máquina de papel.

Otras aplicaciones posibles en las que puede usarse la enzima lacasa de la presente invención son procedimientos para mejorar las masas en aplicaciones de horneado, procedimientos para clarificar la cerveza y el vino, su uso en la mejora de la producción de etanol combustible a partir de materias primas renovables y su uso en diversos

45 procedimientos curativos biológicos, así como su uso en la limpieza de superficies duras o en formulaciones detergentes.

En general, en las aplicaciones mencionadas, la temperatura de tratamiento es, preferentemente, de 30 a 80 ºC, más preferentemente de 40 a 70 ºC, aunque también pueden llevarse a cabo reacciones a temperaturas más bajas. El pH puede ser de 3 a 9, preferentemente de 4 a 7. El tiempo de tratamiento puede ser de 15 min a 24 horas,

50 preferentemente de 30 min a 2 horas. La dosificación puede ser de 0,1 a 2000, preferentemente de 1 a 1000, más preferentemente de 2 a 200 nkat/g o l del material que se quiere tratar. Puede añadirse una cantidad adecuada de mediador.

Las composiciones para las aplicaciones mencionadas comprenden la enzima o la preparación de enzima de la presente invención en una cantidad eficaz y, opcionalmente, aditivos adecuados para la aplicación en cuestión. Las 55 composiciones para la industria textil pueden comprender, por ejemplo, una cantidad adecuada de agentes activos

de superficie, tampones, estabilizantes y conservantes, las composiciones para la industria forestal puede comprender, por ejemplo, una cantidad adecuada de tampones, estabilizantes y conservantes. En todas las composiciones deberían evitarse sustancias nocivas para el medio ambiente y para uso humano (o animal). En particular, las composiciones para la industria cosmética y para la industria de productos de cuidado personal, no

5 deberían contener efectos nocivos sobre la piel o al ingerirlos.

La presente invención proporciona una composición para el tratamiento de tela vaquera que comprende una enzima lacasa o una preparación de enzima de acuerdo con la invención. La presente invención también proporciona una composición para eliminar manchas, una composición para blanquear pulpa, una composición para tratar fibra para la industria textil, una composición para tratar fibra para la industria forestal, una composición para tratar lana, una

10 composición para tratar pelo, una composición para tratar aguas residuales de tintorerías y una composición para decolorar tintes que comprende una enzima lacasa o una preparación de enzima de acuerdo con la invención.

Los siguientes ejemplos están destinados a ilustrar la presente invención y no deberían interpretarse como limitantes de la presente invención en modo alguno.

Ejemplo 1. Producción y purificación de las lacasas de Thielavia arenaria y Chaetomium thermophilum

15 Producción de las lacasas de Thielavia arenaria y Chaetomium thermophilum

Se seleccionaron diversas cepas de la colección de cultivos de Roal Oy para determinar su capacidad para producir lacasas con los indicadores azul brillante de remazol R-478, ácido tánico y guayacol como se describe en Kiiskinen et al. (2004). La Thielavia arenaria ALKO4197 mostró reacciones positivas en guayacol y azul brillante de remazol R478 y la Chaetomium thermophilum ALKO4265 mostró una fuerte reacción positiva cuando se añadió disolución de

20 ABTS 5mM en tampón succinato 25 mM (pH 4,5) o en tampón de Mcllvaine 25 mM (pH 6,0) sobre micelio fresco en placas de agar. Se produjeron lacasas de Chaetomium y se analizaron para su comparación.

Ambos hongos se mantuvieron en PD agar (Difco) a +4 ºC. El medio de inoculación y producción contenía: 25 g/l de glucosa (AnalaR), 27,5 g/l de extracto de levadura Bacto (Difco), 0,5 mg/ml de Indulin AT (Sigma), 0,04 l/l de disolución mineral (1,0 g/l CaCl2·2H2O (Riedel-de Haën), 1,0 g/l FeSO4·7H2O (Riedel-de Haën), 0,1 g/l ZnSO4·7H2O

25 (Merck), 0,16 g/l CuSO4·5H2O (Merck), 1,0 g/l Na2EDTA (Riedel-de Haën)). La glucosa se esterilizó por separado y se combinó de manera aséptica con el medio.

La cepa ALKO4197 de Thielavia arenaria se cultivó en un volumen de 50 o 200 ml en un agitador rotatorio (200 rpm) a temperatura de 37 ºC. El medio se inoculó con 5 o 20 ml de micelios que se hicieron crecer en pocillos. Se realizó el seguimiento de la actividad lacasa hasta ocho días y la mayor actividad lacasa (aproximadamente 20 nkat/ml) se

30 alcanzó después de seis días de cultivo (figura 1A). Se realizaron seis cultivos paralelos. Las células se retiraron del caldo de fermentación por centrifugación (10.000 g durante 10 minutos, a +4 ºC) y el filtrado del cultivo se purificó adicionalmente.

La cepa ALKO4265 de C. Thermophilum se cultivó en un volumen de 50 o 200 ml en un agitador rotatorio (200 rpm) a temperatura de 42 ºC. El medio se inoculó con 5 o 20 ml de micelios que se hicieron crecer en pocillos. Se realizó

35 el seguimiento de la actividad lacasa hasta cuatro días y la mayor actividad lacasa (aproximadamente 170 nkat/ml) se alcanzó después de tres días de cultivo (figura 1B). Se realizaron seis cultivos paralelos. Las células se retiraron del caldo de fermentación por centrifugación (10.000 g durante 10 minutos, a +4 ºC) y el filtrado del cultivo se purificó adicionalmente.

Purificación de las lacasas de Thielavia y Chaetomium

40 En primer lugar, el filtrado del cultivo concentrado de la lacasa de Thielavia en bruto, se cargó en una columna de Sefarosa Q FF (Pharmacia, V=26 ml), preequilibrada con Tris HCl 10 mM, pH 8,5. Las proteínas se eluyeron con un gradiente de sal creciente (Na2SO4 0-500 mM en el tampón de equilibrado, en 5 volúmenes de columna). Las fracciones activas de lacasa se eluyeron a una concentración de sal de 70-150 mM y se agruparon y se cargaron en resina de filtración en gel Sefacril S100 (Pharmacia, V=160 ml), equilibrada con tampón Tris 20 mM, pH 7,0, que

45 contenía NaCl 200 mM. Después de la purificación se realizó una SDS-PAGE teñida con azul brillante de Coomassie (figura 2A). Las fracciones positivas para lacasa se agruparon y se concentraron. Se eliminaron las sales y se cambió el tampón a tampón Tris 20 mM, pH 7,0. Con el fin de obtener muestras de gran pureza se incluyó una etapa adicional de intercambio aniónico con Resource Q. La muestra se cargó en una columna Resource Q (Pharmacia, V=1 ml), que se equilibró con Tris HCl 10 mM, pH 8,5. Las proteínas se eluyeron con un gradiente lineal de sal de

50 Na2SO4 1-300 mM en 12 volúmenes de columna.

Se concentró el sobrenadante del cultivo de C. thermophilum y se cambió el tampón mediante ultrafiltración por el tampón de unión (MWCO 10 000). Las proteínas se unieron a DEAE sefarosa FF (Pharmacia, volumen de columna de 25 ml) en tampón Tris 20 mM pH 8,0. Las proteínas se eluyeron con un gradiente de sulfato de sodio (0-500 mM). Las fracciones positivas para lacasa se eluyeron a una concentración de sal de 150-200 mM y se agruparon y se 55 purificaron adicionalmente con cromatografía de interacción hidrófoba (fenil sefarosa FF, Pharmacia, volumen de columna de 22 ml). Las proteínas se unieron a una concentración de sulfato de sodio de 500 mM, en tampón Tris 20 mM pH 7,0, y se eluyeron con un gradiente de sal decreciente (500-0 mM). Las fracciones positivas para lacasa se

eluyeron con tampón Tris 20 mM. La pureza de las fracciones se analizó por SDS-PAGE y tinción de Coomassie subsiguiente (figura 2B.).

Ensayo de actividad enzimática

La actividad lacasa del sobrenadante del cultivo se midió usando ABTS como sustrato. El ensayo de actividad se

5 llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento desarrollado por Niku-Paavola et al. (1988). La muestra se diluyó con tampón succinato 0,025 M, pH 4,5. Se añadieron 0,350 ml de disolución de ABTS (11 g/l) a 1,15 ml de la dilución y se realizó el seguimiento de la reacción durante 2 minutos por medio del espectrómetro Perkin Elmer Lambda 20 a una longitud de onda de 436 nm. La actividad se expresa como nanokatales.

Determinación de los contenidos en proteínas

10 Los contenidos en proteínas se determinaron mediante el kit DC Protein Assay de Bio-Rad, basado en un procedimiento desarrollado por Lowry et al. (1951). Los ensayos se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del proveedor y la intensidad del color formado en la reacción se midió a una longitud de onda de 750 nm usando el espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 20. Se definió una curva estándar usando albúmina de suero bovino a concentraciones de 0,25-1,25 g/l (BSA, Bio-Rad).

15 Ejemplo 2. Caracterización de la lacasa de C. thermophilum purificada

Peso molecular y pI

Los pesos moleculares de las lacasas de T. arenaria y C. thermophilum se determinaron en SDS-PAGE de acuerdo con Laemmli (1970). Los geles usados en el análisis en SDS-PAGE eran geles prefabricados en Tris HCl al 12 % (BioRad). Las bandas de proteínas se visualizaron mediante tinción con azul brillante de Coomassie (R 350; 20 Pharmacia) y se compararon con marcadores de peso molecular (Prestained Protein Marker Broad Range N.º 7708S; New England BioLabs, Beverly, Mass.). El peso molecular de ambas lacasas fue de aproximadamente 80 kDa. El punto isoeléctrico de las lacasas se determinó con enfoque isoeléctrico en el intervalo de pH de 3-9 (Pharmalyte IEF, Pharmacia) en un sistema de electroforesis LKB 2117 Multiphor II (Pharmacia LKB, Bromma, Suecia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las bandas que contenían actividad lacasa se visualizaron

25 mediante tinción del gel con ABTS 2 mM en tampón succinato 25 mM (pH 4,5) y las proteínas por tinción con azul de Coomassie. La lacasa de Thielavia purificada mostró varias bandas en el enfoque isoeléctrico a pI de 5,5, 5,9, 6,4, 6,8 y 6,9. La lacasa de C. thermophilum purificada mostró 3-4 en el enfoque isoeléctrico a pI de 4,1-4,3.

pH óptimo

Los pH óptimos de las lacasas de T. arenaria y C. thermophilum se determinaron en el tampón universal de

30 McIlvaine en un intervalo de pH 2,2-8,0 usando guayacol como sustrato. Los pH óptimos determinados para la lacasa de Thielavia purificada y en bruto se muestran en la fig. 3A. Como se muestra en la fig. 3A, el pH óptimo para la lacasa de Thielavia es a 5,5, la enzima muestra una actividad sustancialmente elevada aun a pH 7, por encima del cual la actividad empieza a disminuir. El pH óptimo de la lacasa de C. thermophilum purificada y en bruto es a 5,0 (fig. 3B).

35 Estabilidad térmica

Las estabilidades térmicas de las lacasas se determinaron incubando la disolución de enzima (0,3 g l-1) en tampón citrato 60 mM (pH 6). Las actividades enzimáticas residuales se midieron en ABTS. Como se muestra en los resultados, las semividas de la lacasa de Thielavia fueron de 26 y 5,5 horas a 50 y 60 ºC, respectivamente (fig. 4A) y para la de C. thermophilum de 30 y 6 horas a 50 y 60 ºC, respectivamente (fig. 4B).

40 Actividad específica

Las actividades específicas de las lacasas de T. arenaria y C. thermophilum se determinaron frente a diferentes sustratos de lacasa. Las actividades se determinaron frente a ABTS (Niku-Paavola et al., 1988), di-metoxi-fenol (DMF) (Schlosser et al., 1997), siringaldazina (Paszczynski et al., 1985) y guayacol (Leonowicz y Grzywnowicz, 1981). Para el ABTS, las medidas de actividad se llevaron a cabo en tampón succinato 25 mM, pH 4,5 a 25 ºC y

45 para los demás sustratos en tampón MES 25 mM, pH 5,5. Los resultados se muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Actividades específicas de las lacasas naturales de Thielavia (TaLcc) y Chaetomium (CtL) purificadas.

Sustrato

Act. espec. de TaLcc nkat/mg Act. espec. de CtLcc nkat/mg

ABTS

1020 705

DMF

260 290

siringaldazina

490 400

guayacol

63 85

Inhibición de la lacasa

5 Se determinó el efecto de diversos inhibidores sobre la actividad lacasa midiendo el consumo de oxígeno durante la reacción de la enzima con ABTS en matraces Erlenmeyer totalmente llenos y cerrados con un electrodo de oxígeno Orion Research 081010 (programa informático: SensorLink™ PCM800; Orion, Espoo, Finlandia). Las tasas de consumo de oxígeno se midieron a partir de disoluciones que contenían una cantidad adecuada de la lacasa, ABTS 2 mM y diversos inhibidores a diferentes concentraciones, en tampón citrato 50 mM (pH 5) en un volumen de

10 reacción de 30 ml.

Tabla 2. Inhibición de las lacasas naturales de Thielavia (TaLcc) y Chaetomium (CtL) purificadas.

Compuesto

Concentración Inhibición de TaLcc (%) Inhibición de CtL (%)

EDTA

10 mM 0 0

NaN3

0,5 mM 99 100

KCN

0,1 mM 65 70

KCN

1 mM ND 100

NaCl

0,1 mM 35 0

NaCl

1 mM 42 10

NaF

0,5 mM ND 40

NaF

10 mM ND 70

Secuenciación de aminoácidos internos y en N-terminal

El extremo N-terminal de la proteína, así como los péptidos internos se secuenciaron de acuerdo con la química de

15 degradación de Edman (Edman y Begg, 1967) usando el PE Biosystems Precise Sequencer. Para la preparación de los péptidos, la proteína liofilizada se redujo con ditiotreitol, se carboximetiló con yodoacetamida y se escindió con tripsina de calidad de secuenciación (Promega) a proporciones de masa de enzima/sustrato de 1:100 durante 12 horas a 37 ºC en bicarbonato de amonio 0,1 M, pH 8,3 (Stone et al., 1988). Los péptidos generados se separaron por cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC, columna C-18 Vydac) con un gradiente

20 lineal de acetonitrilo (acetonitrilo al 0-60 % en ácido trifluoroacético al 0,1 %). Las secuencias peptídicas internas para la lacasa de Thielavia se muestran en la tabla 3 (SEQ ID NO:1-3). El extremo N-terminal de la proteína no pudo obtenerse, porque probablemente estaba bloqueado. Las secuencias de aminoácidos obtenidas a partir de la lacasa de Chaetomium se muestran en la tabla 4 (SEQ ID NO:4-7). Las secuencias de los péptidos 22.4 y 22.7 de Chaetomium se obtuvieron después de haber clonado el gen de lacasa correspondiente.

25 Tabla 3. Secuencias peptídicas internas determinadas a partir de la lacasa de Thielavia (ALKO4197). El extremo N-terminal de la proteína probablemente estaba bloqueado.

Péptido

Secuencia Comentarios

Péptido 1

YQGAPNTLPTNQGLPVPNH Una señal de Ile equivalente puede verse también en el 12º ciclo.

Péptido 2

ENWIGPDGVLK

Péptido 3

(S) LFLAVGQR (S), resultado incierto.

Tabla 4. Secuencias peptídicas internas y en N-terminal a la lacasa de C. thermophilum (ALKO4265).

Péptido

Secuencia Comentarios

Extremo N-terminal

E (AD) GPGPCHTPANYACWAPGFD Además del Glu, pueden verse señales de Ala y Asp en el primer ciclo

Péptido 18.9

LTENDNWTGPDGWK

Péptido 22.4

DHNCLDLLDLVPWPR

Péptido 22.7

T (S) LGGTPT (L) FVXK El aminoácido del primero ciclo puede ser Thr o Ser y en el séptimo ciclo Thr o Leu. X, resultado incierto.

Ejemplo 3. Clonación de los genes de lacasa de Thielavia arenaria ALKO4197 y Chaetomium thermophilum ALKO4265

5 Se usaron procedimientos de biología molecular estándar en el aislamiento y los tratamientos enzimáticos del ADN (plásmidos, fragmentos de ADN), en las transformaciones de E. coli, etc. Los procedimientos básicos usados se describen en los manuales de biología molecular estándar, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989) y en Sambrook y Russell (2001).

Las colecciones genómicas de Thielavia arenaria ALKO4197 y Chaetomium thermophilum ALKO4265 se prepararon

10 con el vector lambda DASH®II (Stratagene, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los ADN cromosómicos, aislados mediante el procedimiento de Raeder y Broda (1985), se digirieron parcialmente con Sau3A. Los ADN digeridos se repartieron por tamaño y los fragmentos del tamaño elegido (9-23 kb) se desfosforilaron y se ligaron a los brazos del vector lambda digerido con BamhI. Las mezclas de ligación se empaquetaron usando extractos de empaquetamiento Gigapack III XL (Thielavia) o Gigapack III (Chaetomium) de acuerdo con las

15 instrucciones del fabricante (Stratagene, EE. UU.). Las valoraciones de las colecciones genómicas de Thielavia y Chaetomium fueron de 1,2 x 106 y 3,6 x 106 ufp/ml y las de las colecciones amplificadas fueron de 1,1 x 1010 y 6,5 x 1010 ufp/ml, respectivamente.

Las sondas para rastrear los bancos de genes se amplificaron por PCR usando los ADN genómicos de Thielavia ALKO4197 y Chaetomium ALKO4265 como moldes en las reacciones. En primer lugar, se diseñaron varios 20 cebadores (oligos degenerados) y se probaron en reacciones de PCR (tabla 5, SEQ ID NO:8-31). Las secuencias de los cebadores homólogos basadas en las secuencias de aminoácidos de los péptidos de la TaLcc1 y la CtLcc1 purificadas y los cebadores heterólogos se diseñaron de acuerdo con las secuencias de lacasa conservadas (fig. 5). Las secuencias conservadas se identificaron alineando las secuencias de aminoácidos publicadas anteriormente de lacasas de Neurospora, Podospora, Cryphonectria, Myceliophthora, Scytalidium y Coprinus (con números de acceso 25 de EMBL P10574, P78722, Q03966, AAB58088, AAE68087, AAE63570, AAE63572 y AAE63571). Además, se amplificó una sonda heteróloga a partir del gen de lacasa de N. crassa (se usó ADN genómico de la cepa ATCC9277 de N. crassa como molde), usando los cebadores POX12 y POX13 diseñados de acuerdo con la secuencia de nucleótidos publicada (tabla 5). Las combinaciones de los cebadores para las reacciones de PCR se seleccionaron de acuerdo con la situación del péptido o del homólogo del péptido en las secuencias de lacasa publicadas. Las 30 mezclas de reacción de PCR contenían Tris-HCl 50 mM, pH 9,0, (NH4)2SO4 15 mM, Tritón X-100 al 0,1 %, DMSO al 5 %, MgCI2 1,5-3 mM, dNTP 0,2 mM, 5 μM de cada cebador y 1-2 unidades de la polimerasa de ADN Dynazyme EXT (Finnzymes, Finlandia) y 1-5 μg del ADN genómico. Las condiciones para las reacciones de PCR fueron las siguientes: 5 min de desnaturalización inicial a 95 ºC, seguido por 25-30 ciclos de 1 min a 95 ºC, 1 min de apareamiento a 50 ºC (ADN de Thielavia como molde) o a 50 o 42 ºC (ADN de Chaetomium como molde), 2 min de

35 extensión a 72 ºC y una extensión final a 72 ºC durante 7-10 min.

Tabla 5. Los oligonucleótidos probados como cebadores de PCR para amplificar sondas para rastrear los genes de lacasa. Oligo, oligonucleótido; Situación del oligo, los aminoácidos del péptido usados en el diseño de la secuencia de oligonucleótido.

Oligo

Longitud (nts) Degeneración(a Secuencia (b Péptido(d Sit. oligo.

POX1

17 16 AAYTAYGCXTGYTGGGC (s) Ct Lcc1 N-term 11-16

POX2

17 16 GCCCARCAXGCRTARTT (as) Ct Lcc1 N-term 11-16

POX22

32 16 TGCCAYACSCCCGCYAACTACGCYTGCTGGGC (s) (e Ct Lcc1 N-term 6-16

POX3

17 16 GTCCARTTRTCRTTYTC (as) Ct Lcc1 18.9 3-8

POX16

17 16 GARAAYGAYAAYTGGAC (s) Ct Lcc1 18.9 3-8

POX23

32 8 GAGAACGAYAACTGGACSGGCCCCGAYGGCGT (s) (e Ct Lcc1 18.9 3-13

POX26

26 8 GAGAACTGGATCGGYCCCGAYGGYGT (S) Ta Lcc1 2 1-9

POX27

17 48 GARAAYTGGATHGGXCC (S) Ta Lcc1 2 1-6

(continuación)

Oligo

Longitud (nts) Degeneración(a Secuencia (b Péptido(d Sit. oligo.

POX28

20 16 CTCTTCCTCGCYGTSGGYCA (s) Ta Lcc1 3 2-8

POX29

20 16 TGRCCSACRGCGAGGAAGAG (as) Ta Lcc1 3 2-8

POX30

20 8 TACCAGGGYGCYCCSAACAC (s) Ta Lcc1 1 1-7

POX31

20 8 GTGTTSGGRGCRCCCTGGTA (as) (e Ta Lcc1 1 1-7

POX4

17 64 TGGTAYCAYWSXCAYTT (S) Homol. I 1-6

POX5

17 64 AARTGXSWRTGRTACCA (as) Homol. I 1-6

POX6

20 64 ATGCAYYTXCAYGGXCAYGA (s) Homol. II 1-7

POX7

20 64 TCRTGXCCRTGXARRTGCAT (as) Homol. II 1-7

POX8

17 64 CAYYTXCAYGGXCAYGA (s) Homol. II 2-7

POX9

17 64 TCRTGXCCRTGXARRTG (as) Homol. II 2-7

POX10

23 48 TGCCAXGCDATRTGRCARTGCAT (as) Homol. Ill 1-8

POX11

20 48 TGCCAXGCDATRTGRCARTG (as) Homol. Ill 2-8

POX12

17 Codones de Ncr TGGTACCACTCGCATTT (S) (d Homol. I 1-6

POX13

17 Codones de Ncr TCGTGGCCGTGCAGGTG (as) (d Homol. II 2-7

POX14

23 Codones de Ncr TGCCAGGCAATGTGGCAGTGCAT (as) (d Homol. Ill 1-8

POX15

20 Codones de Ncr TGCCAGGCAATGTGGCAGTG (as) (d Homol. Ill 2-8

(a Para reducir la degeneración, algunos codones se eligieron de acuerdo con la preferencia por hongos.

(b D = A o G o T, H = A o C o T, R = A o G, S = C o G, W = A o T, X = I (inositol) o C, Y = T o C; "s" entre paréntesis = hebra sentido, "as" entre paréntesis = hebra antisentido. (c Las secuencias peptídicas están incluidas en la fig. A. (d Se usaron codones de Neurospora crassa (de la secuencia: EMBL M18334) (e El uso de codones se escogió de acuerdo con los genes de xilanasa xyn11A, xyn11B y xyn11C aislados a partir de C.

thermophilum ALKO4265 (EMBL AJ508931-508933).

Los productos de ADN con los tamaños esperados (calculados a partir de las secuencias de lacasas fúngicas publicadas) se obtuvieron a partir de varias reacciones. En algunas de las reacciones de PCR, se detectaron varias bandas que tenían tamaños muy similares; p. ej., se obtuvieron tres bandas de aproximadamente 0,2 kb con los

5 cebadores POX8 y POX11 a partir de las reacciones con ADN de Chaetomium. Esto sugirió que podían encontrarse varios genes de lacasa. Los fragmentos de ADN con los tamaños esperados se aislaron a partir de las reacciones de PCR más específicas y se clonaron en el vector pCR® Blunt-TOPO® (Invitrogen, EE. UU.). Los insertos se caracterizaron por secuenciación y realizando hibridaciones de bandas de Southern con los ADN genómicos digeridos con varias enzimas de restricción.

10 Se descubrió que los productos de PCR obtenidos a partir de las reacciones tanto de Thielavia como de Chaetomium contenían secuencias de tres genes diferentes, de acuerdo con los patrones de hibridación y secuenciación. Tres fragmentos de PCR, representando cada uno un posible gen de lacasa (tabla 6, SEQ ID NO:3237), se eligieron a partir de las reacciones tanto de Thielavia como de Chaetomium para usarlos como sondas para rastrear los bancos génicos. Las secuencias de aminoácidos deducidas de todas estas sondas tenían homología con

15 varias secuencias de lacasas publicadas (programa BLAST, versión 2.2.9 del NCBI, National Center for Biotechnology Information; Altschul et al., 1990). Además de las sondas homólogas, se usó el fragmento de N. crassa heterólogo para rastrear ambos bancos de genes.

Tabla 6. Los cebadores usados en las reacciones de PCR y las sondas elegidas para rastrear los genes de lacasa. Se muestran el ADN genómico molde y el nombre del plásmido que contiene el fragmento de sonda.

Gen

Cebador sentido Cebador inverso ADN molde usado en la reacción de PCR Fragmento obtenido (kb) Inserto en plásmido

Talcc1

POX27 POX31 T. arenaria ALKO4197 1,0 kb pALK1550

Talcc2

POX4 POX 11 T. arenaria ALKO4197 1,3 kb pALK1601

Talcc3

POX27 POX9 T. arenaria ALKO4197 1,3 kb pALK1624

Talcc4

POX12 POX15 N. crassa ATCC9277 1,1 kb -

Ctlcc1

POX8 POX11 C. thermophilum ALKO4265 0,2 kb pALK1299

Ctlcc2

POX4 POX9 C. thermophilum ALKO4265 0,9 kb pALK1295

Ctlcc3

POX8 POX11 C. thermophilum ALKO4265 0,25 kb pALK1296

El fragmento de lacasa de N. crassa y los insertos de los plásmidos recogidos en la tabla 6 se marcaron usando digoxigenina de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Roche, Alemania). Las colecciones genómicas amplificadas (8x104 -1x106 placas) se rastrearon con fragmentos de la sonda homóloga y con el fragmento de lacasa de N. crassa. La temperatura de hibridación para los filtros fue de 68 ºC y los filtros se lavaron 2x5 min a TA usando 2xSSC-SDS al 0,1 %, seguido por 2x15 min a 68 ºC usando 0,1xSSC-SDS al 0,1 % cuando se usaron las sondas homólogas. Los filtros sondados con el fragmento de lacasa de N. crassa se lavaron 2x5 min a TA usando 2xSSC-SDS al 0,1 %, seguido por 2x15 min a 68 ºC usando 2xSSC-SDS al 0,1 %. Se obtuvieron varias placas positivas a partir de cada una de las hibridaciones. Algunas de las placas positivas hibridaron fuertemente con la sonda en cuestión pero, además, existía una serie de placas que hibridaban más débilmente con las sondas. De nuevo, esto sugirió que existirían otros genes de lacas en los genomas, con reacción cruzada con las sondas usadas. Se purificaron de dos a ocho placas de hibridación fuerte a partir de cada rastreo. Los ADN de fago se aislaron y se caracterizaron por hibridaciones de bandas de Southern. Los fragmentos de restricción elegidos que hibridaban con la sonda se subclonaron en vectores pBluescript II KS+ o SK+ y se secuenciaron las regiones pertinentes de los clones.

Se clonaron un total de cuatro genes de lacasa a partir de Thielavia arenaria ALKO4197 y tres a partir de Chaetomium thermophilum ALKO4265. La tabla 7 resume la información sobre las sondas usadas para rastrear los genes, los clones de fagos a partir de los cuales se aislaron los genes, los fragmentos de restricción elegidos que contenían los genes de longitud completa con sus regiones promotoras y de terminación, los nombres de los plásmidos y los números de depósito de DSM para las cepas de E. coli portadoras de estos plásmidos.

Tabla 7. Las sondas usadas para clonar el gen de lacasa, el clon de fago y los subclones elegidos, el número de plásmido y el número de depósito de la cepa de E. coli correspondiente.

Gen

Sonda usada en el rastreo Clon de fago El fragmento subclonado en pBluescript II N.º de plásmido N.º de depósito de E.coli.

Talcc1

pALK1550 F1 3,8 kb Spel pALK1342 DSM 15484

Talcc2

pALK1601 F9 4,2 kb XbaI -SpeI PALK1347 DSM 15486

Talcc3

pALK1624 F1 4,3 kb Smal PALK1345 DSM 15485

Talcc4

Sonda de PCR de N. crassa F14 5,0 kb Bglll pALK1664 DSM 15487

Ctlcc1

pALK1299 F6/4 3,7 kb Xhol PALK1304 DSM 15075

Ctlcc2

pALK1295 F2/5 4,2 kb Xbal PALK1305 DSM 15076

Ctlcc3

pALK1296 F3/7 3,5 kb SacII -SalI PALK1685 DSM 16040

Las secuencias de los genes de lacasa se muestran en la fig. 6. La información pertinente sobre los genes y las secuencias proteicas deducidas se resumen en la tabla 8 y la tabla 9, respectivamente.

Las secuencias peptídicas de la TaLcc1 y la CtLcc1 purificadas (tablas 3 y 4) se descubrieron a partir de las secuencias de aminoácidos deducidas de los clones que contenían los genes Talcc1 y Ctlcc1 (se descubrieron algunas imprecisiones a partir de las secuencias peptídicas una vez estuvieron disponibles las secuencias de aminoácidos deducidas). Por tanto, podría concluirse que se clonaron los genes que codifican las proteínas lacasa TaLcc1 y CtLcc1 purificadas. La síntesis de fragmentos de PCR a partir del gen Talcc1 fue satisfactoria cuando los cebadores de PCR se diseñaron de acuerdo con las secuencias peptídicas de TaLcc1 (POX28+POX31 y POX27+POX31). Sin embargo, debido a las imprecisiones en la secuenciación de los péptidos, la clonación de Ctlcc1 sólo fue satisfactoria cuando se usaron los cebadores derivados de las secuencias de lacasas fúngicas homólogas. El gen de lacasa Talcc4 de Thielavia se obtuvo mediante el uso de la sonda de N. crassa en el rastreo de la colección genómica. No se descubrieron genes de lacasa adicionales a partir de las placas elegidas y purificadas a partir de la colección de Chaetomium sondada con el fragmento de lacasa de N. crassa.

Tabla 8. Resumen de los genes de lacasa aislados a partir de Thielavia arenaria ALKO4197 y Chaetomium thermophilum ALKO4265.

Gen de lacasa

Longitud con los intrones (pb)(a Región codificante (pb)(b N.º de intrones Longitudes de los de intrones (pb)

Talcc1

2279 1851 6 51, 62, 91, 83, 79, 59

Talcc2

1957 (d 1767 2 80, 107

Talcc3

2015 1833 3 65, 54, 60

Talcc4

1793 1719 1 71

Ctlcc1

2127 1821 5 50, 53, 50, 55, 95

Ctlcc2

1986 1797 3 49, 61, 79

Ctlcc3

2064 (c 1869 3 58, 65, 69

(a Se incluye el codón de detención.

(b No se incluye el codón de detención.

(c El otro sitio de inicio de la traducción en Ctlcc3, suprimiendo el primer intrón, daría como resultado una longitud del gen de 1958 pb y una región codificante de 1821 pb (fig. 6). (d El otro sitio de inicio de la traducción en Talcc2 daría como resultado una longitud del gen de 1927 pb y una

región codificante de 1737 pb (fig. 6).

Tabla 9. Resumen de las secuencias de lacasa deducidas de Thielavia arenaria ALKO4197 y Chaetomium thermophilum ALKO4265. ss, secuencia señal.

Proteína lacasa

N.º de aa Longitud de la ss NN/HMM (a Cola en C-term. (b PM predicho (Da, ss no incl.) (c pI predicho (ss no incl) Sitios de Nglucosilación posibles(d

Talcc1

617 21/21 DSGL + 13 aa 64 456 6,31 9

Talcc2 (e

589 29/24 DSGI 61 811/62 274 4,65/4,65 12

Talcc3

611 25/23 DSGL + 18 aa 62 703 /62 893 6,27/6,27 8

Talcc4

573 18/18 DSGV 61 072 4,31 9

Ctlcc1

607 20/20 DSGL + 13 aa 63 905 6,09 8

Ctlcc2

598 22/22 DSGL 64 162 6,15 9

Ctlcc3 (f

623 No se encontró ss DSGT 69 536 5,28 8

(a La predicción sobre la secuencia señal se realizó usando el programa SignalP V2.0 (Nielsen et al., 1997; Nielsen y Krogh, 1998); el valor de NN se obtuvo usando redes neuronales y el valor de HMM usando modelos de Markov encubiertos.

(b La secuencia de aminoácidos "consenso" (DSGX) en el extremo C-terminal y el número de aminoácidos después

de la secuencia consenso. (c La secuencia señal predicha y la cola C-terminal no se incluyeron. La predicción se realizó usando la herramienta Compute pI/MW del servidor ExPASy (Gasteiger et al., 2003). Los dos valores marcados para TaLcc2 y TaLcc3 se calculan después de suprimir las dos secuencias posibles.

(d El número de secuencias N-X-S/T (e Existen dos sitios de inicio de la traducción posibles para el gen Talcc2. Los péptidos señal predichos y otros

valores se obtuvieron usando la secuencia más larga. La secuencia señal predicha sería de 17 aminoácidos para el polipéptido codificado por el gen más corto (la secuencia de deducida, 579 aminoácidos). (f Existen dos sitios de inicio de la traducción posibles para el gen Ctlcc3. La secuencia de aminoácidos deducida para

polipéptido más corto es de 607 aminoácidos, PM 62.029 Da y pI 4,65. No se detectó ninguna secuencia señal predicha de ninguna de las secuencias de aminoácidos deducidas.

Se descubrió que las secuencias de aminoácidos deducidas de TaLcc1 y CtLcc1 eran las más homólogas entre sí,

10 como también lo eran las de TaLcc3 y CtLcc2 (también en el nivel génico, p. ej., en la organización de los intrones de los genes respectivos). El valor de identidad obtenido para TaLcc1 y CtLcc1 usando la alineación global de Needleman-Wunsch (EMBLOSUM62, penalización por hueco 10,0, penalización por extensión 0,5; paquete informático European Molecular Biology Open Software Suite, versión 2.9.0) fue del 69,5 % y para TaLcc3 y CtLcc2 fue del 67,3 % (tabla 10). Los valores de identidad de las otras proteínas lacasa fueron menores, cuando se alinearon entre sí y con TaLcc1, CtLcc1, TaLcc3 y CtLcc2 (tabla 10).

Tabla 10. Los valores de identidad (%) obtenidos a partir de la alineación de las secuencias de aminoácidos deducidas de las lacasas de Thielavia ALKO4197 y Chaetomium ALKO4265 (alineación global de Needleman-Wunsch, EMBLOSUM62, penalización por hueco 10,0, penalización por extensión 0,5).

Lacasa

Ta Lcc1 Ct Lcc1 Ta Lcc3 Ct Lcc2 Ta Lcc4 Ta Lcc2 (a Ct Lcc3 (a

Ta Lcc1

100,0 69,5 47,8 47,1 34,7 34,4 28,8

Ct Lcc1

100,0 47,8 47,0 36,1 33,8 31,2

Ta Lcc3

100,0 67,3 35,6 37,5 28,4

Ct Lcc2

100,0 36,5 35,0 29,6

Ta Lcc4

100,0 42,4 31,2

Ta Lcc2

100,0 32,9

Ct Lcc3

100,0

(a En las alineaciones se usaron las secuencias de aminoácidos deducidas de TaLcc2 y CtLcc3 comenzando desde la primera Met de las secuencias posibles (fig. 6). 5

Las mayores homologías de las secuencias de TaLcc1 y CtLcc1 deducidas (programa BLAST, versión 2.2.9 en el NCBI, National Center for Biotechnology Information; Altschul et al., 1990) fueron con las lacasas de Melanocarpus albomyces, Podospora anserina y Neurospora crassa (números de acceso de EMBL CAE00180, LAC2_PODAN, LAC1_NEUCR/XP_323881/KSNCLO). Las identidades más altas de TaLcc1 y CtLcc1 con las lacasas de la base de 10 datos de patentes fueron con lacasas de Myceliophthora thermophila (documento EP 0765394 B1) y Scytalidium thermophilum (documento US 5.750.388). Las otras secuencias de lacasa deducidas no presentaban identidades tan altas con las secuencias publicadas anteriormente. Las identidades más altas de TaLcc3 y CtLcc2 fueron con la proteína hipotética de Magnaporthe grisea (EAA57158.1) y con la lacasa de Collecotrichum lagenarium (BAB32575). Las mayores homologías de las demás lacasas con las secuencias publicadas anteriormente fueron las siguientes: 15 TaLcc2 con la proteína hipotética de N. crassa (XP_330977), TaLcc4 con la proteína hipotética de Gibberella zeae (EAA68613), CtLcc3 con las proteínas hipotéticas de N. crassa y Magnaporthe grisea (XP_324706 y EAA47633). Por tanto, también otras especies fúngicas presentan secuencias similares, aunque estas secuencias aún no se han identificado como lacasas. Las secuencias encontradas en las bases de datos, con una identidad de al menos el 50 % con las secuencias de aminoácidos deducidas de las lacasas a partir de Thielavia ALKO4197 y Chaetomium

20 ALKO4265, se muestran en la tabla 11.

Tabla 11. Las secuencias con una identidad de al menos el 50 % (%) con las secuencias de aminoácidos deducidas de las lacasas de Thielavia ALKO4197 y Chaetomium ALKO4265. La alineación se realizó usando la alineación global de Needleman-Wunsch (EMBLOSUM62, penalización por hueco 10,0, penalización por extensión 0,5).

La secuencia de aminoácidos

Identidad (%)

TaLcc1 (un polipéptido comparativo)

100,0

Melanocarpus albomyces CAE001810

73,1

Myceliophthora thermophila

68,3

Podospora anserina LAC2_PODAN

66,7

Scytalidium thermophilum

62,6

Neurospora crassa LAC1_NEUCR

60,7

Neurospora crassa XP_323881

60,7

Neurospora crassa KSNCLO

60,6

Neurospora crassa LAC2_NEUCR

60,4

Cryphonectria parasítica LAC1_CRYPA

57,5

Gaeumannomyces graminis var tritici Lac3 CAD10749

51,0

TaLcc2

100,0

Neurospora crassa XP_330977

59,3

Botryotinia fuckeliana lacasa 2 AAK77953

56,4

Gaeumannomyces graminis var tritici Lac1 CAD10747

53,0

(continuación)

La secuencia de aminoácidos

Identidad (%)

Gaeumannomyces graminis var graminis CA024841 Botryotinia fuckeliana lacasa 1 AAK77952

52,6 50,2

TaLcc3 (un polipéptido comparativo) Magnaporthe grisea EAA57158 Colletotrichum lagenarium BAB3257 5

100,0 57,4 53,4

TaLcc4 (un polipéptido comparativo)

100,0

Gibberella zeae EAA68613

77,4

Gibberella zeae XP_390780

77,4

Magnaporthe grisea EAA52662

60,1

Gaeumannomyces graminis var tritici Lac2 CAD10748

54,8

Magnaporthe grisea EAA48009

53,6

Gibberella zeae XP_389822

50,2

CtLcc1 (un polipéptido comparativo)

100,0

Melanocarpus albomyces CAE001810

73,2

Podospora anserina LAC2_PODAN

68,4

Myceliophthora thermophila

67,6

Scytalidium thermophilum

66,5

Neurospora crassa XP_323881

62,7

Neurospora crassa KSNCLO

62,6

Neurospora crassa LAC2_NEUCR

62,4

Neurospora crassa LAC1_NEUCR

62,1

Cryphonectria parasitica LAC1_CRYPA

58,1

CtLcc2 (un polipéptido comparativo) Magnaporthe grisea EAA57158 Colletotrichum lagenarium BAB32575

100,0 54,5 53,4

CtLcc3 (un polipéptido comparativo) Neurospora crassa XP_330977 Magnaporthe grisea EAA47633

100,0 52,7 52,3

Ejemplo 4. Producción de lacasas recombinantes Trichoderma reesei

Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de las proteínas recombinantes TaLcc1, TaLcc2, TaLcc3, TaLcc4, CtLcc1 y CtLcc2. No se construyó el casete de expresión para la producción de CtLcc3 debido a la 5 falta de una secuencia señal predicha en la secuencia de aminoácidos deducida. Los plásmidos de expresión construidos se recogen en la tabla 12. Los genes de lacasa, incluidas sus propias secuencias señal, se fusionaron exactamente con el promotor cbhI (cel7A) de T. reesei por PCR. El promotor cbhl , el terminador cbhI, el marcador amdS y la región flanqueante en 3' cbhl incluidos eran como se describe en Paloheimo et al. (2003). Los casetes de expresión lineales (fig. 7) se aislaron a partir de los esqueletos de los vectores y se transformaron en protoplastos de

10 T. reesei A47. Las transformaciones se realizaron como en Penttila et al. (1987) con las modificaciones descritas en Karhunen et al. (1993). Los transformantes se purificaron en placas de selección a través de conidios sencillos antes de esporularlos sobre PD.

Tabla 12. Los casetes de expresión construidos para producir las lacasas de Chaetomium thermophilum ALKO4265 y Thielavia arenaria ALKO4197 en Trichoderma reesei. La estructura general de los casetes de expresión era como se describe en la fig. 7. Los genes de lacasa se fusionaron exactamente con el promotor cbhl excepto en pALK1326 y pALK1327, donde el gen Ctlcc1 se fusiona con un polipéptido transportador (Cel 6A CDB A+B o A+B+B') y un enlazador sintético Kex2 (incluidos los aminoácidos RDKR). Se describen construcciones análogas a estos dos plásmidos, pALK1285 y pALK1286, en Paloheimo et al. (2003).

Gen de lacasa

Plásmido de expresión Tamaño del casete de expr. (a Terminador de lacasa (b Transportador

Ct lcc1

pALK1321 10,1 kb 205 pb (EcoRV) Sin transportador

Ct lcc1

pALK1326 10,3 kb 205 pb EcoRV) Cel6A CBD (A+B)

Ct lcc1

PALK1327 10,4 kb 205 pb (EcoRV) Cel6A CBD (A+B+B')

Ct lcc2

pALK1340 9,8 kb 92 pb (BamHI) Sin transportador

Ct lcc3

No realizado

Ta lcc1

pALK1667 10,1 kb 80 pb (Ncol) Sin transportador

Ta lcc2

pALK1655 (c 9,9 kb 168 pb (Xhol) Sin transportador

Ta lcc2

pALK1656 (d 9,9 kb 168 pb (Xhol) Sin transportador

Ta lcc3

pALK1671 10,0 kb 232 pb (MscI) Sin transportador

Ta lcc4

pALK1684 10,0 kb 481 pb (EcoRV) Sin transportador

(a El casete de expresión para la transformación de T. reesei se aisló a partir del esqueleto del vector

usando digestión con EcoRI, excepto en el caso de pALK1671, donde se usó NcoI.

(b El número de los nucleótidos de la región de terminación de la lacasa genómica después del codón de

detención. El sitio de restricción usado en la escisión del fragmento de gen genómico desde el extremo 3'

se incluye entre paréntesis.

(c Se usó el gen Ta lcc2 desde el primer sitio de inicio de la traducción posible (incluyendo la longitud de

1957 pb del gen los intrones y el codón de detención; fig. 6 tabla 8).

(d Se usó el gen Ta lcc2 desde el segundo sitio de inicio de la traducción posible (incluyendo la longitud de

1927 pb del gen los intrones y el codón de detención; fig. 6 tabla 8).

La producción de lacasa de los transformantes se analizó a partir de los sobrenadantes de cultivo de los cultivos de los matraces de agitación (50 ml). Los transformantes se hicieron crecer durante 7 días en un medio complejo a base de lactosa, inductor de celulasa, (Joutsjoki et al. 1993) tamponado con KH2PO4 al 5 % y suplementado con CuSO4 0,1 mM a pH 6,0. La actividad lacasa se ensayó usando ABTS como sustrato como se describe en el ejemplo 1. Se obtuvo la actividad lacasa de todas las construcciones. La posible dirección del casete de expresión al locus cbhl (cel7A) se analizó como un fenotipo negativo para CBHI por transferencia de mancha (sistema de transferencia de mancha Minifold I-SRC 96, Schleicher y Schuell, Dassel, Alemania) o por transferencia western. La detección de la proteína CBHI se realizó usando el sistema de anticuerpos monoclonales CI-258 o CI-261 (Aho et al., 1991) y el sistema de transferencia western ProtoBlot AP (Promega). Los genotipos de los transformantes elegidos se confirmaron mediante el uso de transferencias de Southern en las que se incluyeron varios digeridos genómicos y se usó el casete de expresión correspondiente como sonda.

Los transformantes negativos para CBHI elegidos se cultivaron en fermentadores para obtener material para la purificación de las proteínas recombinantes (ejemplo 5) y para las pruebas de aplicación (ejemplos 7-10).

Ejemplo 5. Purificación de las lacasas recombinantes de Thielavia y Chaetomium

Las lacasas de Thielavia arenaria y Chaetomium thermophilum producidas de forma heteróloga se purificaron a partir de los filtrados de cultivo con medios cromatográficos comunes. El tampón del filtrado de cultivo se cambió por el tampón de equilibrado adecuado antes de la etapa cromatográfica con filtración en gel usando resina Sephadex G25 (Pharmacia). Los procedimientos de purificación para cada lacasa se resumen en la tabla 13.

Tabla 13. Purificación de las lacasa de Thielavia arenaria y Chaetomium thermophilum producidas de forma heteróloga. CIH cromatografía de interacción hidrófoba, TE tampón de equilibrado.

Lacasa Procedimiento cromatográfico / Resina Tampón de equilibrado Protocolo de elución

con un gradiente lineal deCtLcc1 Intercambio aniónico / DEAE sefarosa FF Tris HCl 20 mM, pH 8,0

Na2SO4 0-250 mM en TE Tris HCl 20 mM pH 7,0, que con un gradiente lineal deCIH / Fenil sefarosa FF

contiene Na2SO4 500 mM Na2SO4 200-0 mM en TE con un gradiente lineal deIntercambio aniónico / Resource Q Imidazol 10 mM, pH 7,3 Na2SO4 0-150 mM en TE

con un gradiente lineal de TaLcc1 Intercambio aniónico / DEAE sefarosa FF Tris HCl 5 mM, pH 8,5

Na2SO4 0-350 mM en TE con un gradiente lineal deIntercambio aniónico / Resource Q Tris HCl 5 mM, pH 8,5 Na2SO4 0-200 mM en TE

Tris HCl 100 mM, pH 7,3, NaCl

Filtración en gel / Sefacril S-100 HR

150 mM

con un gradiente lineal deTaLcc2 Intercambio aniónico / DEAE sefarosa FF Tris HCl 10 mM, pH 8,5

Na2SO4 0-300 mM en TE Citrato 20 mM pH 7,0, que con un gradiente lineal deCIH / Fenil sefarosa FF

contiene Na2SO4 500 mM Na2SO4 500-0 mM en TE con un gradiente lineal deIntercambio aniónico / Resource Q Imidazol 10 mM, pH 7,3

Na2SO4 0-150 mM en TE Tris HCl 100 mM, pH 7,0, NaCl

Filtración en gel / Sefacril S-100 HR

150 mM

con un gradiente lineal de TaLcc3 Intercambio catiónico / CM sefarosa FF Acetato 20 mM, pH 5,0

Na2SO4 0-100 mM en TE Citrato 20 mM, pH 6,0, que con un gradiente lineal deCIH / Fenil sefarosa FF

contiene Na2SO4 700 mM Na2SO4 700-0 mM en TE con un gradiente lineal deIntercambio catiónico / Resource S Acetato 10 mM pH 5,0 Na2SO4 0-200 mM en TE

con un gradiente lineal deTaLcc4 Intercambio aniónico / DEAE sefarosa FF Acetato 20 mM pH 5,5

120-400 mM en TE Citrato 20 mM, pH 6,0, que con un gradiente lineal deCIH / Fenil sefarosa FF

contiene 1500 mM, 1500-900 mM

Ejemplo 6. Caracterización de las lacasas de Thielavia y Chaetomium

5 Las lacasas recombinantes de Thielavia y Chaetomium purificadas se caracterizaron en términos de pH óptimo, estabilidad térmica y pI como se describe en el ejemplo 2. El peso molecular se determinó por espectrometría de masas MALDI-TOF en un instrumento de tiempo de vuelo Ultraflex ™ (BrukerDaltonics, Alemania) como se describe anteriormente (Palonen et al, 2003). Los potenciales redox de los cobres T1 para las lacasas CtLcc y TaLcc2 se determinaron por valoración de cobre fotométrica en KH2PO4 0,1 M (pH 6,0) como se describe por Xu et al. (1996)

10 usando el par redox de valoración K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6. El potencial redox de TaLcc1 se determinó con un microelectrodo combinado de Pt-AgCl/KCl a pH 5,0 de acuerdo con Sigoillot et al. (2004). Los resultados de la caracterización se recogen en la tabla 14.

Tabla 14. Resumen de las características de las lacasas recombinantes de Thielavia y Chaetomium. nd = no determinado.

Lacasa

pH óptimo en guayacol o DMF T½ (60 ºC) (h) pI Número de isoformas de pI PM (MALDI-TOF) E0 mV

CtLcc1

5,0 guayacol 7 4,0-4,3 3-4 71 670 480

TaLcc1

6,0 guayacol 5 5,5-6,9 6-7 71 890 560

TaLcc2

5,5 guayacol 0,5 3,5 1 75 618 450

TaLcc3

5,0 guayacol 3,5 7,0-8,0 2 70 050 nd

TaLcc4

6,0 DMF < 5min 3,0 1 nd nd

El efecto de inhibición de diferentes compuestos sobre la actividad las lacasas se determinó como se describe en el ejemplo 2, excepto con Talcc4, con la que la inhibición se analizó usando un análisis de la actividad espectroscópico. En lugar de realizar un seguimiento del consumo de oxígeno en la reacción con ABTS, la actividad enzimática se determinó de forma espectrofotométrica. Debido a que la actividad de TaLcc3 era muy baja con todos los sustratos probados, no se llevaron a cabo los experimentos de inhibición con esta enzima. Los resultados se muestran en la tabla 15.

Tabla 15. Inhibición de las lacasas recombinantes de Thielavia y Chaetomium por diversos compuestos. La inhibición se probó por ensayo espectrofotométrico de ABTS con TaLcc4, la inhibición de las otras lacasas se determinó por medidas de consumo de oxígeno.

Concentr.

Inhibición (%)

Compuesto

(mM) CtLcc1 TaLcc1 TaLcc2 TaLcc4

EDTA

10 0 5 0 2

NaN3

0,5 100 95 95 95

KCN

0,1 70 60 30 44

1

100 90 70 90

NaCl

0,1 0 0 20 5

1

10 0 30 20

Las actividades específicas de las lacasas de Thielavia y Chaetomium purificadas se determinaron frente a ABTS, dimetoxi fenol (DMF), siringaldazina y guayacol como se describe en el ejemplo 2. Las medidas de la actividad de ABTS se llevaron a cabo en tampón succinato 25 mM, pH 4,5 a 25 ºC y las demás actividades en tampón MES 25 mM, pH 5,5. Los resultados se muestran en Tabla 16.

15 Tabla 16. Actividades específicas de las lacasas de Thielavia y Chaetomium comparadas con las actividades específicas de una lacasa fúngica bien conocida de Melanocarpus albomyces. MaL lacasa de Melanocarpus albomyces.

Sustrato

MaL nkat/mg CtLcc1 nkat/mg TaLcc1 nkat/mg TaLcc2 nkat/mg TaLcc3 nkat/mg TaLcc4 nkat/mg

ABTS

840 705 910 360 8.3 1000

DMF

290 290 285 75 2.1 110

Siringald

380 400 340 120 3.6 52

Guayacol

90 85 61 40 0 5

Parámetros cinéticos de las lacasas de Thielavia y Chaetomium

20 Los parámetros cinéticos, la constante de Michaelis-Menten Km, el número de recambio kcat y la constante de especificidad (Kcat/Km)) se determinaron en ABTS, 2,6-dimetoxi fenol (DMF) y siringaldazina. Las mediciones en ABTS se realizaron en tampón succinato 25 mM, pH 4,5. En siringaldazina y DMF, se usó tampón MES 40 mM, pH

6. Todos los ensayos de actividad se llevaron a cabo a 25 ºC. Los parámetros cinéticos se calcularon mediante un

ajuste de regresión no lineal de la curva. Los resultados se muestran en la tabla 4. Los valores se compararon con 25 los de la lacasa de Melanocarpus albomyces, MaL.

Tabla 17. Parámetros cinéticos de las lacasas de Thielavia y Chaetomium determinados en ABTS, siringaldazina y DMF y comparación con los valores de MaL.

CtLcc1

TaLcc1 TaLcc2 TaLcc3 TaLcc4 MaL

ABTS

Km (μM)

330 75 30 1040 2470 270

kcat (min-1)

4480 4130 640 37 8610 4690

kcat/Km (M-1min-1)

1,36*108 5,51*107 3,52*107 3,48*104 3,48*106 1,8*107

DMF

Km (μM)

4,6 17 30 14 1900 5

kcat (min-1)

2500 4030 520 5 1590 4160

kcat/Km (M-1min-1)

5,42*108 2,37*107 1,72*107 3,57*105 8,37*106 8,1*108

Siringaldazina

Km (μM)

2,4 4,3 6,3 4,3 115 1,3

(continuación)

CtLcc1

TaLcc1 TaLcc2 TaLcc3 TaLcc4 MaL

kcat (min-1)

2490 1940 450 12 930 4710

kcat/Km (M-1min-1)

1,04*109 4,51*107 7,12*107 2,79*106 7,96*106 3,6*109

Los datos bioquímicos presentados en el presente documento indican claramente que la CtLcc1 recombinante es la misma proteína que la lacasa natural de Chaetomium purificada a partir del sobrenadante del cultivo y que la TaLcc1 recombinante es la misma proteína que la lacasa natural de Thielavia purificada a partir del sobrenadante del cultivo.

Ejemplo 7. Rendimiento de las preparaciones de lacasa en el blanqueado de tela vaquera a diferentes valores de pH

Las preparaciones de lacasa recombinante producidas usando Trichoderma como huésped se usaron en todas las pruebas de aplicación, en los ejemplos 7-10. Se probaron las lacasas recombinantes CtLcc1, TaLcc2 y TaLcc4, derivadas de las cepas RP5469, RF5573 y RF5687, respectivamente, para determinar su capacidad para blanquear tela vaquera. La preparación de lacasa comercial DeniLite II Base de Novozymes se usó como comparación.

Como material de prueba se usaron pantalones de tela vaquera Lee Cooper (MASI Company Oy, Finlandia) que se desaprestaron y se trataron con celulasa neutra ECOSTONE®. Se realizaron tratamientos con lacasa en un Launder Ometer LP-2 como sigue. Se cargaron aproximadamente 10 g de muestras de tela vaquera (15 x 14 cm) en recipientes de 1,2 litros que contenían 200 ml de tampón citrato-fosfato de McIlvaine a pH 5, 6 o 7 y se calentaron los recipientes. Como unidades de actividad lacasa, se añadió la enzima con o sin el mediador (metil siringato, DeniLite II Assist, Novozymes). La enzima se administró a 200 nkat/g y el mediador a 10 mg/g de peso de tejido. La actividad enzimática se midió con sustrato ABTS (ejemplo 1) pero usando tampón citrato-fosfato en todos los ejemplos 7 -10. El Launder Ometer se hizo funcionar a 50 ºC durante 30 min y después de eso, la temperatura en el Launder se elevó hasta 80 ºC durante 10 minutos. Las muestras de tela se aclararon cuidadosamente con agua templada, se secaron parcialmente en una secadora y después de eso, se secaron al aire.

El efecto blanqueante se evaluó midiendo el color como valores de reflectancia con el cromámetro Minolta CM 1000 (Minolta Co.) usando coordenadas de espacio de color L*a*b* (iluminante D65). El color de ambas caras de las muestras de tela se midió antes y después del tratamiento con lacasa. Cada medida fue el promedio de varias medidas.

La tabla 18 y la fig. 8 muestran que tanto la lacasa CtLcc1 como la TaLcc2 fueron más eficaces en la decoloración del tinte añil de la tela vaquera en comparación con DeniLite II Base a valores de pH de 6 y 7. A pH 6 el aspecto del tejido de tela vaquera fue apreciablemente mucho más claro con estas dos lacasas que con DeniLite, también por evaluación visual. Sin el mediador, las lacasas no tuvieron un efecto apreciable sobre la tela vaquera (tabla 19). Todas las lacasas se sometieron a un análisis adicional.

Tabla 18. Medidas de color de la cara visible de la tela vaquera tratada con preparaciones de lacasa y el mediador en el Launder a pH 5-7. L* indica claridad, -b* es la dirección azul, +b* es la dirección amarilla.

Prep.

Enzima nkat/g Mediador mg/g Condiciones Antes del tratamiento con lacasa Después del tratamiento con lacasa Incremento de L*

L*

b* b* b*

CtLcc1

200 10 30 min, 50 ºC, pH 5 29,16 -18,45 35,07 -18,38 5,91

TaLcc2

200 10 30 min, 50 ºC, pH 5 28,29 -18,47 33,68 -17,91 5,39

TaLcc4

200 10 30 min, 50 ºC, pH 5 28,16 -18,70 29,17 -18,47 1,01

DeniLite

200 10 30 min, 50 ºC, pH 5 28,41 -18,70 35,70 -17,59 7,29

CtLcc1

200 10 30 min, 50 ºC, pH 6 28,89 -18,66 40,08 -17,18 11,19

TaLcc2

200 10 30 min, 50 ºC, pH 6 28,44 -18,52 39,01 -17,46 10,57

TaLcc4

200 10 30 min, 50 ºC, pH 6 28,20 -18,47 29,55 -18,11 1,35

DeniLite

200 10 30 min, 50 ºC, pH 6 26,98 -18,67 34,16 -17,82 7,18

CtLcc1

200 10 30 min, 50 ºC, pH 7 28,38 -18,94 36,69 -17,88 8,31

TaLcc2

200 10 30 min, 50 ºC, pH 7 28,59 -18,91 35,85 -18,27 7,26

TaLcc4

200 10 30 min, 50 ºC, pH 7 27,84 -18,63 28,31 -18,33 0,47

DeniLite

200 10 30 min, 50 ºC, pH 7 28,67 -18,99 34,51 -17,75 5,84

Tabla 19. Medidas de color de la cara visible de la tela vaquera tratada con preparaciones de lacasa sin el mediador o el mediador solo en el Launder a pH 5-7. L* indica claridad, -b* es la dirección azul, +b* es la dirección amarilla.

Prep.

Enzima nkat/g Mediador mg/g Condiciones Antes del tratamiento con lacasa Después del tratamiento con lacasa Incremento de L*

L*

b* L* b*

CtLcc1

200 0 30 min, 50 ºC, pH 5 28,42 -18,44 28,88 -18,65 0,46

TaLcc2

200 0 30 min, 50 ºC, pH 5 30,13 -18,62 30,11 -18,63 -0,02

TaLcc4

200 0 30 min, 50 ºC, pH 5 29,44 -18,69 29,40 -18,70 -0,04

DeniLite

200 0 30 min, 50 ºC, pH 5 29,18 -18,55 29,30 -18,34 0,12

Mediador

0 10 30 min, 50 ºC, pH 5 29,85 -18,58 29,90 -18,15 0,05

CtLcc1

200 0 30 min, 50 ºC, pH 5 28,96 -18,60 28,83 -18,53 -0,13

TaLcc2

200 0 30 min, 50 ºC, pH 5 28,87 -18,71 29,17 -18,51 0,30

TaLcc4

200 0 30 min, 50 ºC, pH 5 27,44 -18,55 27,68 -18,76 0,-24

DeniLite

200 0 30 min, 50 ºC, pH 5 28,55 -18,48 28,77 -18,52 0,22

Mediador

0 10 30 min, 50 ºC, pH 5 28,68 -18,40 28,9 -18,37 0,22

CtLcc1

200 0 30 min, 50 ºC, pH 5 28,59 -18,89 29,32 -18,52 0,73

TaLcc2

200 0 30 min, 50 ºC, pH 5 27,47 -18,82 28,24 -18,30 0,77

TaLcc4

200 0 30 min, 50 ºC, pH 5 28,79 -18,71 29,29 -18,89 0,50

DeniLite

200 0 30 min, 50 ºC, pH 5 27,82 -18,93 29,78 -18,31 1,96

Mediador

0 10 30 min, 50 ºC, pH 5 29,00 -18,94 30,06 -18,46 1,06

5 Ejemplo 8. Rendimiento de las preparaciones de lacasa en el blanqueado de tela vaquera a diferentes temperaturas

Se probaron las lacasas CtLcc1, TaLcc1 (ejemplo 7) y TaLcc2 (cepa RF5573) para determinar su capacidad para blanquear tela vaquera a diferentes temperaturas en comparación con la preparación de lacasa comercial DeniLite II Base de Novozymes.

10 El sistema de prueba y la tela vaquera fueron como en el ejemplo 7, excepto porque las condiciones durante el tratamiento con lacasa y con mediador en el Launder fueron 30 min, pH 6 y 30-70 ºC (DeniLite II Base también a 80 ºC) y la enzima se inactivó por tratamiento alcalino en lugar de elevar la temperatura en el Launder como sigue. Después de retirar las muestras de tela de los recipientes, se empaparon en agua templada que contenía NaOH (pH 11,5) durante 10 min y se aclararon cuidadosamente con agua templada. Las muestras de tela se secaron

15 parcialmente en una secadora y después de eso se secaron al aire. El efecto blanqueante se evaluó midiendo el color como valores de reflectancia como en el ejemplo 7.

La tabla 20 y la fig. 9 muestran que las lacasas CtLcc1 y, especialmente, la TaLcc2 fueron más eficaces en la decoloración de tela vaquera (el mayor incremento de la claridad) en comparación con la lacasa comercial Denilite II Base a 40-50 ºC y pH 6. La lacasa TaLcc2 es la enzima más adecuada para aplicaciones realizadas a temperaturas

20 bajas. CtLcc1 y TaLcc2 también presentaron un efecto blanqueante mejor a sus temperaturas óptimas que el DeniLite II Base a la suya. Todas las lacasas se sometieron a un análisis adicional.

Tabla 20. Medidas de color de la cara visible de la tela vaquera tratada con preparaciones de lacasa y el mediador en el Launder a diferentes temperaturas. L* indica claridad, -b* es la dirección azul, +b* es la dirección amarilla.

Prep.

Enzima nkat/g Mediador mg/g Condiciones Antes del tratamiento con lacasa Después del tratamiento con lacasa Incremento de L*

L*

b* L* b*

CtLcc1

200 10 30 min, 30 ºC, pH 6 29,34 -18,99 31,78 -19,15 2,44

TaLcc2

200 10 30 min, 30 ºC, pH 6 29,54 -18,77 33,99 -19,33 4,45

DeniLite

200 10 30 min, 30 ºC, pH 6 29,56 -18,60 32,73 -18,77 3,17

CtLcc1

200 10 30 min, 40 ºC, pH 6 28,71 -18,61 34,43 -18,77 5,72

(continuación)

Prep.

Enzima nkat/g Mediador mg/g Condiciones Antes del tratamiento con lacasa Después del tratamiento con lacasa Incremento de L*

TaLcc2

200 10 30 min, 40 ºC, pH 6 28,93 -18,48 37,08 -18,53 8,15

TaLcc4

200 10 30 min, 40 ºC, pH 6 29,11 -18,92 29,23 -18,44 0,12

DeniLite

200 10 30 min, 40 ºC, pH 6 28,87 -18,90 32,94 -19,14 4,07

CtLcc1

200 10 30 min, 50 ºC, pH 6 28,52 -18,97 36,78 -18,96 8,26

TaLcc2

200 10 30 min, 50 ºC, pH 6 28,47 -19,05 37,47 -18,48 9,00

DeniLite

200 10 30 min, 50 ºC, pH 6 28,41 -19,10 34,67 -19,07 6,26

CtLcc1

200 10 30 min, 60 ºC, pH 6 28,88 -19,01 37,40 -18,29 8,52

TaLcc2

200 10 30 min, 60 ºC, pH 6 29,25 -18,76 36,07 -18,26 6,82

DeniLite

200 10 30 min, 60 ºC, pH 6 29,06 -18,99 35,92 -18,33 6,86

CtLcc1

200 10 30 min, 70 ºC, pH 6 28,93 -18,95 34,16 -17,91 5,23

TaLcc2

200 10 30 min, 70 ºC, pH 6 28,3 -19,27 32,84 -17,94 4,54

DeniLite

200 10 30 min, 70 ºC, pH 6 29,05 -19,15 36,72 -17,35 7,67

DeniLite

200 10 30 min, 80 ºC, pH 6 29,28 -18,97 35,33 -17,02 6,05

Ejemplo 9. Eliminación de manchas con lacasas

Se probaron las lacasas CtLcc1, TaLcc2, TaLcc4 y Denilite II BASE (ejemplo 7) para determinar su capacidad para eliminar manchas. Se usaron las siguientes telas de prueba manchadas artificialmente: manchas de hierba (Art. 164, 5 EMPA Testmaterialen, Alemania), manchas de té (Art. 167, EMPA Testmaterialen, Alemania). El tejido se cortó en muestras de tela de 5,8 x 5,8 cm. Se realizaron tratamientos con lacasa en un Launder Ometer LP-2 como sigue. Se cargaron aproximadamente 5 g de tejidos manchados en recipientes de 1,2 l que contenían 150 ml de tampón citrato-fosfato de McIlvaine a pH 6 y se calentaron los recipientes. Como unidades de actividad lacasa (ejemplo 7), se añadió enzima con o sin el mediador (metil siringato, DeniLite II Assist, Novozymes). La enzima se administró a

10 200 nkat/g y el mediador a 10 mg/g de peso de tejido, excepto a 40 ºC que también se usaron dosificaciones de 20 nkat/g y 2 mg/g. El Launder Ometer se hizo funcionar a 40, 50 o 60 ºC y pH 6 durante 60 min. Después de eso, las muestras de tela se aclararon cuidadosamente bajo agua corriente y en matraces de agitación que contenían agua templada y se secaron al aire.

El efecto de eliminación de manchas se evaluó midiendo el color como valores de reflectancia usando coordenadas

15 de espacio de color L*a*b* (ejemplo 7). El color de las muestras de tela se midió antes y después del tratamiento con lacasa.

Los resultados de las pruebas de eliminación de manchas se muestran en las tablas 21-22 y en las figuras 10-13. La lacasa CtLcc1 fue eficaz en la eliminación de manchas de hierba con el mediador a 60 ºC y la lacasa TaLcc2 a 50 ºC, lo que puede observarse en una claridad incrementada y, especialmente, en la reducción de los valores de

20 verdor en la fig. 10 y también claramente por estimación visual. Puede observarse una tendencia similar a 40 ºC (fig. 12). La lacasa CtLcc1 también presentó algo de efecto sin el mediador, especialmente a 60 ºC. La lacasa TaLcc4 presentó un ligero efecto sobre la hierba (verdor reducido en aprox. 2 unidades) a 50 ºC. Sin el mediador, la eficacia en la eliminación de manchas con lacasas fue baja, especialmente a 40 ºC.

La lacasa CtLcc1 fue eficaz en la eliminación de manchas de té con el mediador a 60 ºC y la lacasa TaLcc2 a 50 ºC,

25 lo que puede observarse en la reducción de los valores de rojez y, especialmente, en el incremento de los valores de claridad en la fig. 11, y también claramente por estimación visual. Puede observarse la misma tendencia a 40 ºC (fig. 13). Sin el mediador las lacasas no presentaron un efecto apreciable sobre las manchas de té, especialmente a 40 ºC.

32 33

Tabla 21. Medidas de color de las pruebas de eliminación de manchas con lacasas a 50 y 60 ºC. L* indica claridad, -b* es la dirección azul, +b* es la dirección amarilla, +a* es la dirección roja, -a* es la dirección verde). Se usaron tela de prueba manchada artificialmente y controles de mediador y tampón para su comparación.

Muestra

Administración de enz.nkat/g Mediadormg/g Condiciones Hierba Té

L*

a* b* L* a* b*

Tela manchadaartificialmente (no tratada)

_ _ _ 78,32 10,18 25,31 69,27 8,56 25,80

CtLcc1, RF5469

200 10 60 min, 60 ºC, pH 6 79,92 -1,15 18,55 79,76 3,52 22,16

CtLcc1, RFS469

200 0 60 min, 60 ºC, pH 6 79,04 -3,69 18,12 77,10 4,84 21,10

Mediador, solo

0 10 60 min, 60 ºC, pH 6 77-98 -6,80 19,26 75,54 5,00 20,5

Tampón, solo

0 0 60 min, 60 ºC, pH 6 77,93 -6,70 ,1,9 -3,1 75,55 4,94 ,20,58

TaLcc2 RF5573

2.00 10 60 min, 50 ºC, pH 6 79,50 -1,15 17,94 77,73 3,99 ,22,89

TaLcc4, RF5687

200 10 60 min, 50 ºC, pH 6 78,62 -4,00 ,17,16 75,13 5,19 22,44

Mediador solo

0 10 60 min, 50 ºC, pH 6 77,95 -6,45 18,56 75,97 4,84 20,47

Tabla 22. Medidas de color de la prueba de eliminación de manchas con lacasas a 40 ºC. L* indica claridad, -b* es la dirección azul, +b* es la dirección amarilla, +a* es la dirección roja, -a* es la dirección verde). Se usaron tela de prueba manchada artificialmente y controles de mediador y tampón para su comparación.

Muestra

Administración de enz.nkat/g Mediadormg/g Condiciones Hierba Té

L*

a* b* L* a* b*

Tela manchadaartificialmente (no tratada)

_ _ _ 78,18 -8,88 25,29 69,36 8,65 25,8

CtLcc1, RF5469

200 10 60 min, 40 ºC, pH 6 79,74 0,17 16,48 77,70 4,26 24,50

TaLcc2, RF5573

200 10 60 min, 40 ºC, pH 6 79,19 -0,26 16,99 77,04 4,41 24,36

TaLcc2, RF5571

200 10 60 min, 40 ºC, pH 6 79,24 -0,31 16,72 77,28 4,36 24,32

TaLcc4, RF5687

200 10 60 min, 40 ºC, pH 6 78,94 -3,77 16,77 74,56 5,58 23,55

Mediador solo

0 10 60 min, 40 ºC, pH 6 78,88 -6,19 18,28 74,72 5,63 22,16

CtLcc1, RF5469

200 0 60 min, 40 ºC, pH 6 80,17 -4,14 17,45 76,22 5,37 22,68

TaLcc2, RF5573

200 0 60 min, 40 ºC, pH 6 80,01 -4,90 17,63 76,09 5,37 22,59

TaLcc4, RF5687

200 0 60 min, 40 ºC, pH 6 79,84 -4,98 17,62 76,74 5,05 21,67

Mediador solo

0 10 60 min, 40 ºC, pH 6 80,1 -5,67 17,68 76,25 5,11 22,15

Tampón solo

0 0 60 min, 40 ºC, pH 6 79,66 -5,79 18,45 76,00 5,22 22,74

CtLcc1, RF5469

20 20 60 min, 40 ºC, pH 6 79,94 -1,20 16,17 76,34 5,10 23,89

TaLcc1, RF5598

20 2 60 min, 40 ºC, pH 6 80,16 -0,73 16,20 77,17 4,65 24,40

TaLcc2, RF5573

20 2 60 min, 40 ºC, pH 6 79,25 -2,14 16,41 75,61 5,24 23,66

TaLcc4, RF5687

20 2 60 min, 40 ºC, pH 6 78,53 -6,07 19,33 75,09 5,73 22,08

Mediador solo

0 2 60 min, 40 ºC, pH 6 79,32 -6,43 18,64 74,71 5,94 22,99

Ejemplo 10. Decoloración de tintes usando preparaciones de lacasa

Se probaron las lacasas recombinantes CtLcc1, TaLcc2 y TaLcc4, derivadas de cepas de Trichoderma (ejemplo 7) para determinar su capacidad para decolorar diferentes tintes en presencia del mediador siringato de metilo (ejemplo 7) o sin él. Los experimentos se llevaron a cabo en matraces de agitación de 100 ml que contenían 50 ml de tinte

5 disuelto en tampón citrato fosfato a pH 6. Se usó una concentración de tinte de 5 mg/50 ml. La enzima se administró a 100 nkat por 50 ml y el mediador a 5 mg/50 ml. Las muestras de control contenían sólo disolución de tinte. Los matraces de agitación se incubaron a 50 ºC durante 30, 60 y 120 minutos. Se tomaron muestras de 3,5 ml en tubos de ensayo para su evaluación visual.

Los resultados se muestran en la tabla 23 y 24. Las lacasas CtLcc1 y TaLcc2 pudieron decolorar el

10 indigotíndisulfonato sódico y el azul brillante de remazol (azul reactivo 19) en gran medida o completamente y el rojo brillante de cibacrón 3B-P parcialmente en presencia del mediador. La degradación del indogotíndisulfonato sódico fue rápida y el color azul ya se había convertido en amarillo claro en 30 min o antes. La reacción pareció completarse después de 60 minutos con todos los tintes, ya que no se observó ningún cambio más detectable visualmente en los colores de las muestras.

15 Tabla 23. Decoloración de tintes con lacasa CtLcc1. Tiempo de tratamiento 30 y 60 min. -ningún cambio detectable visualmente, + desvanecimiento del color detectable, ++ desvanecimiento considerable del color, +++ decoloración completa/casi completa.

Tinte 5 mg/50 ml

Dosificación de enz. nkat/50 ml Mediador mg/50 ml Tiempo 30 min Tiempo 60 min

Rojo brillante de cibacrón 3B-P (Ciba-Geigy)

100 0 -

Rojo brillante de cibacrón 3B-P (Ciba-Geigy)

100 5 + +

Azul brillante de remazol (Sigma)

100 0

Azul brillante de remazol (Sigma)

100 5 ++ +++

Indigotíndisulfonato sódico (Merck)

100 0 - -

Indigotíndisulfonato sódico (Merck)

100 5 +++ +++

Tabla 24. Decoloración de tintes con lacasa TaLcc2. Tiempo de tratamiento 30 y 60 min. -ningún cambio 20 detectable visualmente, + desvanecimiento del color detectable, ++ desvanecimiento considerable del color, +++ decoloración completa/casi completa.

Tinte 5 mg/50 ml

Dosificación de enz. nkat/50 ml Mediador mg/50 ml Tiempo 30 min Tiempo 60 min

Rojo brillante de cibacrón 3B-P (Ciba-Geigy)

100 0 - -

Rojo brillante de cibacrón 3B-P (Ciba-Geigy)

100 5 + +

Azul brillante de remazol (Sigma)

100 0

Azul brillante de remazol (Sigma)

100 5 ++ +++

Indigotíndisulfonato sódico (Merck)

100 0 - -

Indigotíndisulfonato sódico (Merck)

100 5 +++ +++

Referencias

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Listado de secuencias

<110> AB Enzymes OY

5 <120> Enzimas lacasa y sus usos

<130> ROAL2

<160> 51

<170> Patentin versión 3.2

<210> 1

<211> 19 15 <212> PRT

<213> Thielavia arenaria ALKO4197

<220>

<221>

CARACTERÍSTICA_MISC 20 <222> (1)..(19)

<223> Secuencia del péptido, un péptido tripsínico de la proteína Ta Lcc1 de Thielavia arenaria ALKO 4197

<220>

<221>

CARACTERÍSTICA_MISC 25 <222> (12)..(12)

<223> xaa puede ser Gln o Ile

<400> 1

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> Thielavia arenaria ALKO4197

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(11)

<223> secuencia del péptido 2, a un péptido tripsínico de la proteína Ta Lcc1 de 40 Thielavia arenaria ALKO 4197

<400> 2

45

<210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Thielavia arenaria ALKO4179

50

<220> <221> INCIERTO <222> (1)..(1)

37

<223> El primer aminoácido es incierto

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(9)

<223> secuencia del péptido 3, un péptido tripsínico de la proteína TaLcc1 de Thielavia arenaria ALKO 4197

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> PRT 15 <213> Chaetomium thermophilum ALKO4265

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(20)

20 <223> Secuencia del extremo N-terminal de la proteína CtLcc1 de Chaetomium thermophilum ALKO4265

<220>

<221> CARACTERÍSTICA-MISC 25 <222> (1)..(20)

<223> Secuencia del extremo N-terminal de la proteína CtLcc1 Chaetomium thermophilum ALKO4265

<220> 30 <221> CARACTERÍSTICA-MISC

<222> (1)..(20)

<223> xaa puede ser Glu, Ala o Asp

<400> 4

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> Chaetomium thermophilum ALKO4265

<220>

<221> CARACTERÍSTICA-MISC

<222> (1)..(15)

<223> Secuencia del péptido 18.9, un péptido tripsínico de la proteína Ct Lcc1 de 45 Chaetomium thermophilum ALKO 4265

<400> 5

50 <210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> Chaetomium thermophilum ALKO4265

<220> 5 <221> CARACTERÍSTICA-MISC

<222> (1)..(16)

<223> secuencia del péptido 22.4, un péptido tripsínico de la proteína Ct Lcc1 de Chaetomium thermophilum ALKO4265

10 <400> 6

<210> 7

<211> 11 15 <212> PRT

<213> Chaetomium thermophilum ALKO4265

<220>

<221>

CARACTERÍSTICA-MISC 20 <222> (1)..(1)

<223> xaa puede ser Thr o ser

<220>

<221>

CARACTERÍSTICA_MISC 25 <222> (7)..(7)

<223> xaa puede ser Thr o Leu

<220>

<221>

CARACTERÍSTICA_MISC 30 <222> (10)..(10)

<223> xaa puede ser cualquier aminoácido natural

<220>

<221>

CARACTERÍSTICA_MISC 35 <222> (10)..(10)

<223> xaa incierto; puede ser cualquier aminoácido natural

<400> 7

<210> 8

<211> 17

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia del cebador de oligonucleótido POX1

<220> 50 <221> característica_ misc

<222> (9)..(9)

<223> n puede ser c o i

<400> 8 <210> 9

<211> 17 5 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia del cebador de oligonucleótido POX2

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (9)..(9)

<223> n puede ser c o i

<400> 9

<210> 10 20 <211> 32

<212> ADN

<213> artificial

<220> 25 <223> secuencia del cebador de oligonucleótido POX22

<400> 10

30 <210> 11

<211> 17

<212> ADN

<213> artificial

35 <220>

<223> secuencia del cebador de oligonucleótido POX3

<400> 11

<210> 12

<211> 17

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia del cebador de oligonucleótido POX16

<400> 12

<210> 13

<211> 32

<212> ADN 55 <213> artificial <220>

<223> Secuencia del cebador de oligonucleótido POX23

<400> 13

<210> 14

<211> 26 10 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia del cebador de oligonucleótido POX26

<400> 14

<210> 15 20 <211> 17

<212> ADN

<213> artificial

<220> 25 <223> Secuencia del cebador de oligonucleótido POX27

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (15)..(15)30 <223> n puede ser c o i

<400> 15

35 <210> 16 <2U> 20

<212> ADN

<213> artificial

40 <220>

<223> Secuencia del cebador de oligonucleótido POX28

<400> 16

<210> 17

<211> 20

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia del cebador de oligonucleótido POX29

<400> 17

<210> 18

<211> 20

<212> ADN 5 <213> artificial

<220>

<223> secuencia del cebador de oligonucleótido POX30

10 <400> 18

<210> 19

<211> 20 15 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia del cebador de oligonucleótido POX31

<400> 19

<210> 20 25 <211> 17

<212> ADN

<213> artificial

<220> 30 <223> Secuencia del cebador de oligonucleótido POX4

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (12)..(12)35 <223> n puede ser c o i

<400> 20

40 <210> 21

<211> 17

<212> ADN

<213> artificial

45 <220>

<223> Secuencia del cebador de oligonucleótido POX5

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 50 <222> (6)..(6)

<223> n puede ser c o i

<400> 21

<210> 22

<211> 20

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> secuencia del cebador de oligonucleótido POX6

<220>

10 <221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (9)..(9)

<223> n puede ser c o i

<220>

15 <221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (15)..(15)

<223> n puede ser c o i

<400> 22

<210> 23

<211> 20

<212> ADN 25 <213> artificial

<220>

<223> Secuencia del cebador de oligonucleótido POX7

30 <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (6)..(6)

<223> n puede ser c o i

35 <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (12)..(12)

<223> n puede ser c o i

40 <400> 23

<210> 24

<211>

17 45 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia del cebador de oligonucleótido POX8

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (6)..(6)

<223> n puede ser c o i

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (12)..(12)

<223> n puede ser c o i

<400> 24

<210> 25

<211>

17 10 <212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia del cebador de oligonucleótido POX9

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (6)..(6)

<223> n puede ser c o i

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (12)..(12)

<223> n puede ser c o i

<400> 25

<210> 26 30 <211> 23

<212> ADN

<213> artificial

<220> 35 <223> Secuencia del cebador de oligonucleótido POX10

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (6)..(6)40 <223> n puede ser c o i

<400> 26

45 <210> 27

<211> 20

<212> ADN

<213> artificial

50 <220>

<223> secuencia del cebador de oligonucleótido POXll

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 55 <222> (6)..(6)

<223> n puede ser i o c

<400> 27

5 <210> 28

<211> 17

<212> ADN

<213> artificial

10 <220>

<223> secuencia del cebador de oligonucleótido POX12

<400> 28

15 210> 29

<211> 17

<212> ADN

<213> artificial

20 <220>

<223> secuencia del cebador de oligonucleótido POX13

<400> 29

<210> 30

<211> 23

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> Secuencia del cebador de oligonucleótido POX14

<400> 30

<210> 31

<211> 20

<212> ADN 40 <213> artificial

<220>

<223> secuencia del cebador de oligonucleótido POXl5

45 <400> 31

<210> 32

<211> 1056 50 <212> ADN

<213> Thielavia arenaria ALKO4197

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 55 <222> (1)..(1056)

<223> secuencia del fragmento de PCR obtenido a partir de Thielavia arenaria ALKO4197 usando los cebadores POX27 y POX31

<400> 32

<210> 33

<211> 1296 10 <212> ADN

<213> Thielavia arenaria ALKO4197

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 15 <222> (1)..(1296)

<223> Secuencia del fragmento de PCR obtenido a partir de Thielavia arenaria ALKO4197 usando los cebadores P0X4 y POXll

<400> 33

<210> 34

<211> 1295 5 <212> ADN

<213> Thielavia arenaria ALKO4197

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 10 <222> (1)..(1295)

<223> Secuencia del fragmento de PCR obtenido a partir de Thielavia arenaria ALKO4197 usando los cebadores POX27 y POX9

<400> 34

<210> 35

<211> 224 5 <212> ADN

<213> Chaetomium thermophilum AKLO 4265

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 10 <222> (1)..(224)

<223> secuencia del fragmento de PCR obtenido a partir de Chaetomiumthermophilum ALKO4265 usando los cebadores POX8 y POX11

<400> 35

<210> 36

<211> 929

<212> ADN 20 <213> Chaetomium thermophilum ALKO4265

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(929)

25 <223> Secuencia del fragmento de PCR obtenido a partir de Chaetomium thermophilum ALKO4265 usando los cebadores POX4 y POX9

<400> 36

<210> 37 5 <211> 251

<212> ADN

<213> Chaetomium thermophilum ALKO4265

<220> 10 <221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(251)

<223> Secuencia del fragmento de PCR obtenido a partir de Chaetomium thermophilum ALKO465 usando los cebadores POX8 y POXll

15 <400> 37

<210> 38

<211> 2680 20 <212> ADN

<213> Thielavia arenaria ALKO4197

<220>

<221>

CARACTERÍSTICA_MISC 25 <222> (178)..(2456)

<223> Talcc1

<220>

<221>

intrón 30 <222> (406)..(456)

<220>

<221> intrón

<222> (536)..(597)

<220>

<221>

Intrón 5 <222> 610)..(700)

<220>

<221> Intrón

<222> (771)..(853)

<220>

<221> Intrón

<222> (1824)..(1902)

15 <220>

<221> Intrón

<222> (1975)..(2033)

<400> 38

<210> 39

<211> 17

<212> PRT

<213> Thielavia arenaria ALKO4197

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(617)

<223> Secuencia de aminoácidos deducida de la TaLcc1 de Thielavia arenaria ALKO4197

<400> 39 <210> 40

<211> 3084

<212> ADN

<213> Thielavia arenaria ALKO4197

<220>

<221> característica_misc

<222> (1)..(2600)

<223> secuencia de nucleótidos del gen Ta lcc2 de Thielavia arenaria ALKO4197.

<220>

5 <221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (644)..(2600)

<223> Ta lcc2

<220>

10 <221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (644)..(646)

<223> inicio posible, ATG

<220>

15 <221> característica_misc

<222> (674)..(676)

<223> inicio posible, ATG

<220>

20 <221> Intrón

<222> (2003)..(2082)

<220>

<221> intrón 25 <222> (2142)..(2248)

<400> 40

<210> 41

<211> 589 5 <212> PRT

<213> Thielavia arenaria ALKO4197

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 10 <222> (1)..(589)

<223> Secuencia de aminoácidos deducida de la Ta Lcc2 de Thielavia arenaria ALKO4197

<400> 41

<210> 42

<211> 2971 5 <212> ADN

<213> Thielavia arenaria ALKO4197

<220>

<221>

CARACTERÍSTICA_MISC 10 <222> (1)..(2971)

<223> Secuencia de nucleótidos del gen Talcc3 de Thielavia arenaria AK04197

<220>

<221>

CARACTERÍSTICA_MISC 15 <222> (275)..(2289)

<223> Talcc3

<220>

<221>

Intrón 20 <222> (521)..(585)

<220>

<221> Intrón

<222> (662)..(715)

<220>

<221> Intrón

<222> (798)..(857)

30 <400> 42

<210> 43

<211> 611

<212> PRT

<213> Thielavia arenaria ALKO4197

<220> <221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(611)

<223> Secuencia de aminoácidos deducida de la TaLcc3 de Thielavia arenaria LAKO4197

5 <220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(611)

<223> Secuencia de aminoácidos deducida de la TaLcc3 de Thielavia arenaria ALKO4197

10 <400> 43

<210> 44

<211> 2731

<212> ADN

<213> Thielavia arenaria ALKO4197

<220>

<221> característica_misc

<222> (1)..(2731)

<223> Secuencia de nucleótidos del gen Talcc4 de Thielavia arenaria ALKO4197

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (455)..(2247)

10 <220>

<221> Intrón

<222> (1371)..(1442)

<400> 44

<210> 45

<211> 573 5 <212> PRT

<213> Thielavia arenaria ALKO4197

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 10 <222> (1)..C573)

<223> Secuencia de aminoácidos deducida de la TaLcc4 de Thielavia arenaria ALKO4197

<400> 45

<210> 46

<211> 2954

<212> ADN

<213> Chaetomium thermophilum ALKO4265

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(2954)

<223> Secuencia de nucleótidos del gen Ctlcc1 de Chaetomium thermophilum ALKKO4265

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(2954)

<223> Secuencia de nucleótidos del gen Ctlcc1 de Chaetomium thermophilum ALKO4265

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (371)..(2497)

<223> Ctlcc1

<220>

<221> Intrón

<222> (581)..(630)

<220>

<221> Intrón

<222> (710)..(762)

<220>

<221> Intrón

<222> (775)..(824)

<220>

<221> intrón

<222> (895)..(949)

<220>

<221> Intrón

<222> (1992)..(2086)

<400> 46

<210> 47

<211> 607 5 <212> PRT

<213> Chaetomium thermophilum ALKO4265

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 10 <222> (1)..(607)

<223> Secuencia de aminoácidos deducida de la CtLcc1 de Chaetomium thermophilum ALKO4265

<400> 47

<210> 48

<211> 2516 5 <212> ADN

<213> Chaetomium thermophilum ALKO4265

<220>

<221>

CARACTERÍSTICA_MISC 10 <222> (1)..(2516)

<223> Secuencia de nucleótidos del gen Ctlcc1 de Chaetomium thermophilum ALKO4265

<220>

<221>

CARACTERÍSTICA_MISC 15 <222> (246)..(2231)

<223> Ctlcc2

<220>

<221>

Intrón 20 <222> (483)..(531)

<220>

<221> Intrón

<222> (608)..(668)

<220>

<221> Intrón

<222> (751)..(829)

10 <400> 48 <210> 49

<211> 598 <212> PRT

<213> Chaetomium thermophilum ALKO4265

<220> 5 <221> CARACTERÍSTICA_MISC

<222> (1)..(598)

<223> Secuencia de aminoácidos deducida de la CtLcc2 de Chaetomium thermophilum ALKO4265

10 <400> 49 <210> 50

<211> 3025

<212> ADN <213> Chaetomium thermophilum ALKO4265

<220>

<221>

CARACTERÍSTICA_MISC 5 <222> (1)..(3025)

<223> Secuencia de nucleótidos de Chaetomium thermophilum ALKO4265

<220>

<221>

Intrón 10 <222> (711)..(768)

<223> Intrón 1

<220>

<221>

Intrón 15 <222> (1326)..(1390)

<223> Intrón 2

<220>

<221>

Intrón 20 <222> (2187)..(2255)

<223> Intrón 3

<400> 50

<210> 51

<211> 623 5 <212> PRT

<213> Chaetomium thermophilum ALKO4265

<220>

<221> CARACTERÍSTICA_MISC 10 <222> (1)..(623)

<223> Secuencia de aminoácidos deducida de la CtLcc3 de Chaetomium thermophilum ALKO4265

<400> 51

Claims (61)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una enzima lacasa, caracterizada por que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID 41 (TaLcc2) o una secuencia que muestra una identidad de al menos el 75 % con la SEQ ID NO:41 y es la más eficaz en el blanqueado de tela vaquera a la temperatura de aproximadamente 40 a 50 ºC.

2. 2.

   La enzima lacasa de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la enzima puede obtenerse a partir de una fuente microbiana.

3. 3.

   La enzima lacasa de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que la enzima puede obtenerse a partir de un hongo filamentoso.

4. 4.

   La enzima lacasa de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, en la que la enzima puede obtenerse a partir del género Thielavia.

5. 5.

   La enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la enzima puede obtenerse a partir de la cepa depositada CBS 116071.

6. 6.

   La enzima lacasa de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, en el que la enzima está codificada por pALK1347 depositado en E. coli bajo el número DSM 15486.

7. 7.

   La enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enzima funciona a pH de 3 a 9

8. 8.

   La enzima de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la enzima funciona a pH de 4 a 8.

9. 9.

   La enzima de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la enzima funciona a pH de 4,5 a 6,5.

10. 10.

    La enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el pH óptimo de la enzima es aproximadamente a pH 5,5.

11. 11.

    La enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enzima es eficaz a temperaturas de 30 a 80 ºC.

12. 12.

    La enzima de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la enzima es eficaz a temperaturas de 40 a 60 ºC.

13. 13.

    La enzima de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la enzima es eficaz a temperaturas de 40 a 50 ºC.

14. 14.

    La enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enzima tiene una eficacia máxima en el blanqueado de tela vaquera aproximadamente a pH 6.

15. 15.

    La enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enzima es eficaz en la eliminación de manchas.

16. 16.

    La enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enzima puede decolorar tintes.

17. 17.

    La enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la enzima tiene una eficacia máxima en presencia de uno o más mediadores.

18. 18.

    La enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enzima carece de la secuencia señal.

19. 19.

    La enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enzima se produce en un huésped productor heterólogo.

20. 20.

    La enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la lacasa se produce en un huésped microbiano.

21. 21.

    La enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la lacasa se produce en un huésped hongo filamentoso.

22. 22.

    La enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enzima se produce en un huésped del género Trichoderma o Aspergillus.

23. 23.

    Una secuencia de ácidos nucleicos, caracterizada por que codifica la enzima como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.

24. 24.

    Un vector, caracterizado por que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación

25. 23.

26. 25.

    El vector de acuerdo con la reivindicación 24, en el que la secuencia de ácidos nucleicos se ha enlazado de forma funcional a secuencias de control de la expresión, permitiendo la expresión en células huésped procariotas

    o eucariotas.

27. 26.

    Una célula huésped, caracterizada por que la célula comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 24 o 25 introducido en ella; o caracterizada por que la célula comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 23 introducido en ella y por que la célula es una célula huésped heteróloga.

28. 27.

    La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 26, en la que la célula huésped es una célula huésped microbiana.

29. 28.

    La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 26 o 27, en la que la célula huésped pertenece al género

    Trichoderma o Aspergillus.

30. 29.

    Un procedimiento para la producción de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 que tiene actividad lacasa, que comprende las etapas de cultivar la célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28 y recuperar el polipéptido.

31. 30.

    Un polipéptido que tiene actividad lacasa codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 23 o por el vector de acuerdo con la reivindicación 24 o 25 y que puede obtenerse mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 29.

32. 31.

    Un procedimiento para obtener una preparación de enzima que comprende un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 30, que comprende las etapas de cultivar una célula huésped de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28 y o bien recuperar el polipéptido de las células o bien separar las células del medio de cultivo del huésped y obtener el sobrenadante.

33. 32.

    Una preparación de enzima que puede obtenerse mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 31.

34. 33.

    Una preparación de enzima, que comprende la enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.

35. 34.

    La preparación de enzima de acuerdo con la reivindicación 32 o 33, en la que la preparación de enzima comprende además un/unos aditivo(s) adecuado(s) seleccionado(s) del grupo que comprende estabilizantes, tampones, mediadores y conservantes.

36. 35.

    La preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 34, en la que la preparación de enzima es el medio de cultivo gastado del huésped productor.

37. 36.

    La preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, en la que la preparación de enzima está en forma de líquido, polvo o granulado.

38. 37.

    Un procedimiento para tratar tela vaquera, que comprende poner en contacto tela vaquera en un medio acuoso con una enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o con una preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36 bajo condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima.

39. 38.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 37, en el que el tratamiento se lleva a cabo en presencia de un mediador adecuado.

40. 39.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 37 o 38 en el que el tratamiento se lleva a cabo a la temperatura de 30 a 80 ºC.

41. 40.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 39 en el que el tratamiento se lleva a cabo a la temperatura de 40 a 70ºC.

42. 41.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 39 en el que el tratamiento se lleva a cabo a la temperatura de 40 a 60ºC.

43. 42.

    El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 41, en el que el tratamiento se lleva a cabo a un intervalo de pH de 3 a 8, preferentemente a pH de 4 a 7, lo más preferentemente a pH de 4,5 a 6,5.

44. 43.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 42, en el que el tratamiento se lleva a cabo a un intervalo de pH de 4 a 7.

45. 44.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 42, en el que el tratamiento se lleva a cabo a un intervalo de pH de 4,5 a 6,5.

46. 45.

    El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 44, en el que el tratamiento se lleva a cabo en de 15 minutos a 2 horas, preferentemente en de 30 minutos a 90 minutos, lo más preferentemente en de 30 minutos a 60 minutos.

47. 46.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 45 en el que el tratamiento se lleva a cabo en de 30 minutos a 90 minutos.

48. 47.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 45 en el que el tratamiento se lleva a cabo en de 30 minutos a 60 minutos.

49. 48.

    El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 48, en el que la dosificación de la enzima usada en el tratamiento es de 2 a 500 nkat/g de tejido.

50. 49.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 48, en el que la dosificación de la enzima usada en el tratamiento es de 20 a 200 nkat/g de tejido.

51. 50.

    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 48, en el que la dosificación de la enzima usada en el tratamiento es de 20 a 100 nkat/g de tejido.

52. 51.

    El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 50, en el que el tratamiento se repite una o más veces.

53. 52.

    Un procedimiento para la eliminación de manchas, que comprende poner en contacto el material que se quiere tratar con una enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o con una preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36 bajo condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima.

54. 53.

    Un procedimiento para blanquear pulpa, que comprende la etapa de poner en contacto dicha pulpa con una enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o con una preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36 bajo condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima.

55. 54.

    Un procedimiento para tratar fibras naturales o sintéticas, que comprende poner en contacto fibras con una enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o con una preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones bajo condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima.

56. 55.

    Un procedimiento para tratar fibras lignocelulósicas, que comprende poner en contacto fibras con una enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o con una preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones bajo condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima.

57. 56.

    Un procedimiento para tratar lana, que comprende poner en contacto lana con una enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o con una preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones bajo condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima.

58. 57.

    Un procedimiento para tratar pelo, que comprende poner en contacto pelo con una enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o con una preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones bajo condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima.

59. 58.

    Un procedimiento para tratar aguas residuales de tintorerías, que comprende poner en contacto aguas residuales de tintorerías con una enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o con una preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36 bajo condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima.

60. 59.

    Un procedimiento para decolorar tintes, que comprende poner en contacto tintes o un material que contiene tinte con una enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 o con una preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36 bajo condiciones adecuadas para el funcionamiento de la enzima.

61. 60.

    Uso de una enzima lacasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 o una preparación de enzima de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36 para tratar tela vaquera, para eliminar manchas, para blanquear pulpa, para tratar fibras, para tratar lana, para tratar pelo, para tratar aguas residuales de tintorerías o para decolorar tintes o un material que contiene tinte.