CN115028693A - 一种花生青枯菌效应蛋白RipW及其在花生抗青枯病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种花生青枯菌效应蛋白RipW及其在花生抗青枯病中的应用，属于植物病理和作物病害防治技术领域。花生青枯菌效应蛋白RipW的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，其编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。敲除RipW后，能够显著降低Rs‑P.362200对花生的致病性，表明RipW作为一个毒力因子，在花生致病过程中发挥着重要的作用。根据酵母双杂交方法，在花生受青枯菌诱导的cDNA文库中筛选到了RipW的靶蛋白AhPOA，其基因核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，蛋白序列如SEQ ID No.4所示。本发明在揭示花生青枯菌致病机理以及花生青枯病的防治方面具有重要的应用价值。

Description

一种花生青枯菌效应蛋白RipW及其在花生抗青枯病中的应用
技术领域
本发明属于植物病理和作物病害防治技术领域，具体公开了一种花生青枯菌效应蛋白RipW及其在花生抗青枯病中的应用。
背景技术
青枯菌（Ralstonia solanacearum）又称青枯雷尔氏菌，是一种革兰氏阴性棒状杆菌，其引起的青枯病是世界上最为广泛的细菌性病害之一。该病原体能够感染200多种植物，包括花生、马铃薯、番茄、烟草、拟南芥和许多观赏性植物。青枯菌的生命力非常顽强，在没有营养物质的超纯水中，可以数年不改变其致病力，这种现象是很罕见的，这可能是青枯病能够在世界范围内广泛传播的原因之一。青枯菌的毒力因子有很多，在众多毒力因子中，由三型分泌系统分泌的三型效应蛋白是主要的毒力决定因子。
花生是世界上四大油料作物之一，是我国多用途加工利用的油、食兼用的重要农作物。国家统计局数据表明，我国花生种植面积占世界总量的1/4，而产量占世界花生产量的43%，然而我国的油料作物产品长期处于短缺状态，年进口油料已达7140万吨，食用植物油对外依存度高达2/3以上。因此，我国花生产业的发展对保障我国食用油安全具有举足轻重的作用，国家高度重视花生等油料作物的生产。由青枯菌引起的花生青枯病是我国花生生产中的一种严重病害，可造成高达50% -100%的产量损失。青枯病除了造成花生的减产外，还能增加黄曲霉对花生的侵染。目前还无有效的措施防治花生青枯病，究其原因是对青枯菌的致病机制研究匮乏。因此深入研究青枯病的致病机理为花生抗病育种提供了重要依据，从而有效解决青枯菌对花生造成的病害损失这一重大问题。
植物在与病原菌协同进化的过程中获得了两层免疫力，使它们能够感知病原体并诱导植物产生防御反应。在第一层，定位于细胞膜上的模式识别受体（PRRs）直接识别保守的病原相关分子模式（PAMPs），从而激活PAMP触发的免疫（PTI）。反过来，病原体利用效应蛋白，扰乱寄主细胞内生理过程和抑制 PTI，以促进其在寄主体内大量繁殖。在第二层，植物进化出R基因，直接或间接感知效应蛋白，触发植物的免疫反应，称为效应子触发的免疫（ETI）。
本研究基于实验室前期花生青枯菌Rs-P.362200全基因组序列分析的结果，基于生物信息学分析，克隆了一个三型效应蛋白RipW。用同源重组的方法，敲除了RipW，能显著降低青枯菌的致病性，表明RipW作为一个毒力因子，在青枯菌致病过程中起着关键的作用。同时通过酵母双杂筛选到了RipW在寄主中的互作蛋白AhPOA。推测AhPOA可能参与寄主对青枯菌的防御反应，可为植物抗青枯病遗传改良提供基因资源。目前对青枯菌和寄主之间的互作研究较少，本申请从三型效应蛋白以及其寄主靶标基因出发，研究RipW和AhPOA之间的相互作用，对于揭示青枯菌的致病机理以及防治提供了新的思路，具有重要的科学意义。
发明内容
本发明的目的在于，针对上述问题，提供了一种花生青枯菌效应蛋白RipW及其在花生抗青枯病中的应用，为青枯菌致病机理及花生抗青枯病提供了理论基础，具有重要的应用前景。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种花生青枯菌三型效应蛋白RipW，所述花生青枯菌三型效应蛋白RipW的氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。
本发明基于前期实验室花生青枯菌Rs-P.362200全基因组的测序和分析，表明RipW属于三型效应蛋白,含有一个果胶裂解酶保守结构域。克隆该基因后表明，RipG7序列有1146个碱基对，编码381个氨基酸。
一种花生青枯菌三型效应蛋白RipW的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种包含花生青枯菌三型效应蛋白RipW编码基因的超量表达载体。所述超量表达载体的构建方法包括：基于gataway系统通过BP反应构建入门载体pDONR207-RipW, 再通过LR反应构建35S启动子驱动的植物表达载体pK7WG2.0-RipW。
一种包含花生青枯菌三型效应蛋白RipW编码基因的敲除载体。所述敲除载体的构建方法包括：根据花生青枯菌Rs-P.362200全基因序列, 克隆RipW上游524bp片段U，下游519bp片段D；通过酶切连接的方法构建敲除载体pK18mobSacB-U-D。
一种包含花生青枯菌三型效应蛋白RipW编码基因的回补载体。所述回补载体的构建方法包括：根据花生青枯菌Rs-P.362200全基因序列, 克隆上游524bp片段U、1146bp的RipW、下游519bp片段D；通过酶切连接的方法构建回补载体pK18mobSacB-U-RipW-D。
本发明基于酵母双杂交筛选RipW互作的方法，主要步骤为：构建诱饵载体PGBKT7-RipW，根据受青枯菌诱导根叶混合cDNA文库，筛选RipW的互作蛋白。
本发明提供了一种花生青枯菌三型效应蛋白RipW的互作蛋白AhPOA，所述互作蛋白AhPOA为多酚氧化酶AhPOA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4 所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
上述花生青枯菌三型效应蛋白RipW在青枯菌防治中的应用。
上述花生青枯菌三型效应蛋白RipW的互作蛋白AhPOA在青枯菌防治中的应用。
本发明的有益效果在于：
本申请通过花生青枯菌Rs-P.362200全基因组测序分析，预测到一个三型效应蛋白RipW。敲除RipW后会显著降低青枯菌对花生的致病性，这是首次关于RipW影响青枯菌对花生致病性的报道。并通过酵母双杂交首次筛选到了RipW的寄主靶标多酚氧化酶AhPOA，对于揭示青枯菌对花生的致病机理以及花生抗青枯病具有重要的科学意义。
附图说明
图1为基于Gateway系统的花生青枯菌三型效应蛋白RipW超量表达载体的构建示意图。
图2 为同源重组法构建RipW突变和回补菌株示意图。左：RipAU突变菌株构建示意图；右：RipAU回补菌株构建示意图。
图3 为PCR鉴定RipW突变和回补菌株。M：突变菌株，C：回补菌株，WT野生型菌株。
图4青枯菌野生型菌株（WT）、突变菌株（ ∆ripAU）、回补菌株( CripAU∆ripAU)接种花生后的表型图。
图5 酵母双杂交验证RipW与AhPOA存在互作。
具体实施方式
实施例1构建RipW超量表达载体
根据RipW全长基因CDS序列（核苷酸序列SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示），设计特异性引物（RipW-attb1-F:5’-GGGGACA AGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCATGTCCATCCAGATTGATCGCCCGAAC-3’,RipW-attb2-R:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGCCCGAGTAGGCCTTGTAGCTCACC-3’）以花生青枯菌Rs-P.362200基因组DNA（Chenet al.,2021；NCBI登陆号PRJNA668065）为模板进行PCR扩增，采用康为公司PCR预混液进行扩增，PCR反应体系：1 µL的基因组DNA为模板，5µL的PCR预混液，RipW-attb1-F/RipW-attb2-R正反引物各0.5 µL，水3 µL。反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ ,1 min，28个循环；72℃ 10min，25℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测无杂带后纯化回收RipW产物，将目的基因片段与pDONR207空载连接进行BP反应：纯化后的RipW产物1 μL（80ng），pDONR207空载体1 μL（80ng），BP酶0.25 μL，25℃连接14h。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，测序正确的克隆提取质粒，入门载体pDONR207-RipW构建好。将入门载体质粒和植物超量表达载体pK7WG2.0进行LR反应：pDONR207-RipW质粒1 μL（80ng），pK7WG2.0空载质粒1 μL，LR酶0.25 μL，25℃连接14h，转化大肠杆菌，PCR验证阳性克隆，植物超表达载体pK7WG2.0-RipW构建完成。RipG7超量表达载体的构建过程示意图如图1所示。
实施例2构建RipW敲除和回补载体
根据青枯菌Rs-P.362200找到RipW上游524bp序列U（U的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示），下游519bp序列D（D的核苷酸序列SEQ ID NO.6所示），设计特异性引物（RipW-U-XbaI-F1:5’-CTAGTCTAGACTAGACCATCACGCAGCA GCTGGCCAAGAAC-3’, RipW-U-SalI-R1:5’-GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCC GCGGTCTGGATGGACATGACTGTCTCGGC-3’, RipW-D-SalI-F2:5’-GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGGTCGGGCTGATGCTGCCGCTGGAGCG-3’，RipW- D-SphI-R2:5’-ACATGCATGCATGTTGCTGGCCGACGAAGTGACCGACCAGG-3’）以花生青枯菌Rs-P.362200基因组DNA为模板进行PCR扩增，采用康为公司PCR预混液进行扩增，PCR反应体系：1 µL的基因组DNA为模板，5µL的PCR预混液，正反引物各0.5 µL，水3 µL。反应条件：94℃ 5 min；94℃30 s，60℃ 30 s，72℃ ,1 min，28个循环；72℃ 10min，25℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测无杂带后纯化回收。用限制性内切酶XbaI、SalI酶切回收U和空载Pk18mobsacb，SalI、SphI酶切回收D和空载Pk18mobsacb,用T4连接酶分别将U和D连接到Pk18mobsacb载体上，连接条件为：T4 ligase 2ul，T4 buffer 1ul，Pk18mobsacb 1ul (100ng)，U/D 2ul(100ng), H2O 4ul，16度连接14h。连接产物转化大肠杆菌，PCR验证阳性克隆，RipW敲除载体Pk18mobsacb-U-D构建完成，载体构建过程示意图如图2（左）所示。
回补载体的构建方法：根据花生青枯菌Rs-P.362200全基因组序列, 设计特异性引物以青枯菌基因组DNA为模板进行PCR扩增（PCR反应体系同敲除载体的构建），同时克隆包含上游524bp(U)、RipW(1146bp)、下游519bp(D)片段（所用特异性引物为CRipW-XbaI-F1:5’-CTAGTCTAGACTAGACCATCACGCAGCAGCTGGCCAAGAAC-3’，CRipW-SphI-R2:5’-ACATGCATGCATGTTGCTGGCCGACGAAGTGACCGACCAGG-3’）。用限制性内切酶XbaI、SphI分别酶切回收目的片段和空载Pk18mobsacb，用T4连接酶将U-RipW-D连接到Pk18mobsacb载体上（连接条件同上）。连接产物转化大肠杆菌，PCR验证阳性克隆，RipW回补载体pK18mobSacB -U-RipW-D构建完成，载体构建过程示意图如图2（右）所示。
实施例3 RipW突变和回补菌株的构建
突变和回补菌株的构建方法主要为：挑取花生青枯菌Rs-P.362200的单克隆放置入50mL BG+PB（硫酸多粘菌素B）液体培养基中（BG培养基配方：蛋白胨10g/L，酵母提取粉1g/L，酪氨酸1g/L，琼脂粉15g/L，葡萄糖5g/L,硫酸多粘菌素B 50mg/L），在28℃恒温摇床中培养，测得菌体浓度 OD600=0.6 时，离心收集全部菌体；帮助菌为大肠杆菌 MT616 ，挑取单克隆于50mL LB+Cm(氯霉素）培养基(LB培养基配方：酵母提取粉 3g/L，胰蛋白胨 10 g/L，氯化钠 10 g/L，琼脂糖 15 g/L；氯霉素30mg/L)，在37℃恒温摇床中培养，待测得菌体浓度OD600=1.0 时，离心收集全部菌体；供体菌（含有质粒pK18mobSacB-U-D、pK18mobSacB -U-RipW-D的大肠杆菌）挑取单克隆于50mL的LB (Kan+) 培养基，在 37℃恒温摇床中培养，待测得菌体浓度OD600=2.0 时，离心收集全部菌体；将三种菌体离心弃上清，用无菌水清洗两次后将菌体重悬浮；以分光光度计将菌体浓度OD600调整为1.0；然后将花生青枯菌，供体菌，帮助菌Escherichia coli MT616，分别吸取 800ul：400ul：400ul，均匀混合；离心收集菌体，以50 µL 无菌水将菌体重悬浮，并用移液枪将菌体均匀的点到BG 平板上，待平板菌液干燥后，将平板在 28℃恒温培养箱中培养2-3 d。刮取平板上的混合菌，再用100 µL 无菌水悬浮起来，均匀涂布BG（PB+Kan）平板上，在28℃恒温培养箱中倒置培养2 d；挑取平板上长势良好的青枯菌，以pK18mobSacB载体通用引物M13F/M13R（M13F:GTTGTAAAACGACGGCCAG,M13R:CAGGAAACAGCTATGAC）进行扩增，若扩增条带与设计片段大小一致，这说明载体成功转入青枯菌菌体中。
挑取青枯菌于BG+PB（50mg/L）+Kan（50mg/L）平板划线培养 1-2 天后，挑选长势良好的青枯菌分别在BGS和BG平板上划线培养，（BGS培养基为在BG培养基中加入100g/L的蔗糖，在蔗糖培养基上观察到含有sac载体的菌落生长缓慢或不生长），1 d 后，挑取BG板上生长良好的青枯菌28℃恒温摇菌5-6 h，然后取100 µL涂在BGS平板上培养 1-2 d。2d后，挑取长势良好的青枯菌分别在BG和BG+PB（50mg/L）+Kan（50mg/L）平板上划线过夜培养。挑取在BG板生长的，在BG+PB（50mg/L）+Kan（50mg/L）平板上不生长的青枯菌，以特异性引物CRipW-XbaI-F1和CRipW-SphI-R2进行扩增，以野生型青枯菌作阳性对照。阳性对照的片段大小和回补菌株的大小一致，并且比敲除菌株的片段要大。
通过上述方法获得RipW的敲除和回补菌株敲除和回补菌株的构建流程图如图2所示。
【实施例4】RipW对青枯菌致病力的影响
将野生型菌株（WT）、突变菌株（∆ripW）、回补菌株（CripW∆ripW）在28℃恒温摇床中250 rpm用 8 mL BG（PB+）培养。待测得OD600=0.4时，通过伤根灌根法，取5mL菌液接种，观察记录花生植株生长情况。青枯菌接种花生后的表型如图4所示，突变菌株几乎丧失了致病力。
【实施例5】RipW寄主靶标蛋白的筛选及验证
将RipW连接到PGBKT7载体上，并送测序公司验证，获得诱饵载体PGBKT7-RipW。将诱饵载体PGBKT7-RipW和PGBKT7空载分别转化酵母AH109，涂SD/-Trp板挑克隆做PCR验证是否转化成功。按照100/10-1/ 10-2/10-3/10-4/10-5梯度稀释转化成功的空载和诱饵载体菌液，吸取5ul到SD/-Trp平板上，2d后观察菌落（转化空载和诱饵载体菌株）形态大小是否一致，如果一致，说明RipW对酵母细胞无毒性。共转PGBKT7-RipW+PGBKT7、PGBKT7-Lam+PGADT7-T(阴性对照)、PGBKT7-53+PGADT7-T(阳性对照)，涂SD/-Leu/-Trp平板，挑克隆摇菌后按按照100/10-1/10-2/10-3/10-4梯度稀释菌液，取5ul到SD/-Ade/ -His/-Leu/-Trp+x-α-gal平板。如果含有PGBKT7-RipW+PGBKT7在SD/-Ade/-His/ -Leu/-Trp+x-α-gal平板不长，阴性在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp+x-α-gal平板不生长，阳性在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp+x-α-gal平板生长，则无自激活现象，可以进行后续筛库试验。
转化受青枯菌诱导根叶混合cDNA文库质粒到AH109 (PGBKT7-RipW)，涂SD/-His/-Leu/-Trp平板，挑取在SD/-His/-Leu/-Trp板上生长正常的克隆点SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp+x-α-gal平板，2-3d后在四缺平板上变蓝色的克隆为候选阳性克隆。提取候选阳性克隆的质粒，PCR验证，并将PCR产物送公司测序，通过花生网站PGR（http://59.79.248.25/Blast_Search_result.php）找到靶基因AhPOA的全长序列（ID:AH03G36510.1）。将AhPOA全长基因CDS序列（核苷酸序列SEQ ID NO.3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示）克隆到PGADT7载体上，共转PGADT7-AhPOA+ PGBKT7-RipW，涂SD/-Leu/-Trp板，挑克隆摇菌后按按照100/10-1/10-2/10-3/10-4梯度稀释菌液，取5ul到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp+x-α-gal平板，3天后菌落变蓝，说明RipW和AhPOA存在互作（图5）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修改，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种花生青枯菌效应蛋白RipW及其在花生抗青枯病中的应用
<130> 16
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1146
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.1
<400> 1
atgtccatcc agattgatcg cccgaacaac catttccaga cgccctcgac gtggaatcac 60
gacgcgggtt ccaatatcga taccagccag ctccagcgcg cagtacaact gctcgaccag 120
gtcttgcagc agctcgaagc gcgcaagctg ttcgggaaca tgctgaacca gccgggcgcc 180
gacaacgccg gccagaacca cgctggcggc cacggcggcg gcggtcatca tggcggctcg 240
aacgggttcg gtgaaaacgg ccgcttcggt tcgccgcacg ccaattcgcc tgcgcagccg 300
gacctcgagc tgccggccaa caagcccaac aacggcaagc acaacacttc ggcttccacg 360
ccggacacgc agacggcgcc gtcttccact tcgcccacga ccggcacgtc cccgacgccc 420
acgtccacct ccgcgaccga gggcaaggtg gcctacggcg tcaagccgcc cgagccgacc 480
ggcgtggtcg acgtcagcaa gccgatcgtc gtcaaggctg gcgagacgtt cgacggcggc 540
ggcaagtact accgcccgac caaggagatg ggcgacggtt cgcagaacga gcaccagaag 600
ccgctgttca ttctggagcc cggcgcgacg ctcaagaacg tgcagtattc cggcggcgac 660
ggcatccaca tgctgggcag cggcaagctg gaccgcgtcg tcaaccgcca ggtgggcgag 720
gatgccatca ccatcgacgg cgccaagaac cgcgcgcatg atgccaagat cgccgggatc 780
gatccggcgt cgatccccgg aggaacgccc aaagtggaga tcaccaacag cgccttctat 840
ggcgccaagg acaagctcgc tcagatcaac ggcgacgttg acctgcaggt gaaaggcatg 900
tatgtcaacg gcgccggcaa ggtcttccgt accaacggtg gtgatacgca gatcaaggcg 960
acggtcaacg tccaggattc gaatttccag aacgtgtcgg aggcggtttt ccggaccgat 1020
tccaagttct cgactgcgtc gttctcggac gatgtgaaat cggatgcgcc cttcgatgga 1080
ctggctcccg acaagagcca agtcacaggc accaacaagg tgagctacaa ggcctactcg 1140
ggctga 1146
<210> 2
<211> 381
<212> PRT
<213> SEQ ID NO.2
<400> 2
Met Ser Ile Gly Ile Ala Ala Pro Ala Ala His Pro Gly Thr Pro Ser
1 5 10 15
Thr Thr Ala His Ala Ala Gly Ser Ala Ile Ala Thr Ser Gly Leu Gly
20 25 30
Ala Ala Val Gly Leu Leu Ala Gly Val Leu Gly Gly Leu Gly Ala Ala
35 40 45
Leu Leu Pro Gly Ala Met Leu Ala Gly Pro Gly Ala Ala Ala Ala Gly
50 55 60
Gly Ala His Ala Gly Gly His Gly Gly Gly Gly His His Gly Gly Ser
65 70 75 80
Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly Ala Pro Gly Ser Pro His Ala Ala Ser
85 90 95
Pro Ala Gly Pro Ala Leu Gly Leu Pro Ala Ala Leu Pro Ala Ala Gly
100 105 110
Leu His Ala Thr Ser Ala Ser Thr Pro Ala Thr Gly Thr Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Thr Ser Pro Thr Thr Gly Thr Ser Pro Thr Pro Thr Ser Thr Ser
130 135 140
Ala Thr Gly Gly Leu Val Ala Thr Gly Val Leu Pro Pro Gly Pro Thr
145 150 155 160
Gly Val Val Ala Val Ser Leu Pro Ile Val Val Leu Ala Gly Gly Thr
165 170 175
Pro Ala Gly Gly Gly Leu Thr Thr Ala Pro Thr Leu Gly Met Gly Ala
180 185 190
Gly Ser Gly Ala Gly His Gly Leu Pro Leu Pro Ile Leu Gly Pro Gly
195 200 205
Ala Thr Leu Leu Ala Val Gly Thr Ser Gly Gly Ala Gly Ile His Met
210 215 220
Leu Gly Ser Gly Leu Leu Ala Ala Val Val Ala Ala Gly Val Gly Gly
225 230 235 240
Ala Ala Ile Thr Ile Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ala His Ala Ala Leu
245 250 255
Ile Ala Gly Ile Ala Pro Ala Ser Ile Pro Gly Gly Thr Pro Leu Val
260 265 270
Gly Ile Thr Ala Ser Ala Pro Thr Gly Ala Leu Ala Leu Leu Ala Gly
275 280 285
Ile Ala Gly Ala Val Ala Leu Gly Val Leu Gly Met Thr Val Ala Gly
290 295 300
Ala Gly Leu Val Pro Ala Thr Ala Gly Gly Ala Thr Gly Ile Leu Ala
305 310 315 320
Thr Val Ala Val Gly Ala Ser Ala Pro Gly Ala Val Ser Gly Ala Val
325 330 335
Pro Ala Thr Ala Ser Leu Pro Ser Thr Ala Ser Pro Ser Ala Ala Val
340 345 350
Leu Ser Ala Ala Pro Pro Ala Gly Leu Ala Pro Ala Leu Ser Gly Val
355 360 365
Thr Gly Thr Ala Leu Val Ser Thr Leu Ala Thr Ser Gly
370 375 380
<210> 3
<211> 1716
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.3
<400> 3
atggcttcaa tatctcctct ctcttttgtg tccagtgtga acgcctcagc caccaagacc 60
tcctcctctt ctttgttccc taaaggccgg cagagccacg tggcagccac gaaggtgtct 120
tgcaatgcct cgaacgaaga ggcatcaaac ggcattgccc atgggaacag gagagatgtt 180
cttattggtc ttggagggct ggccggtgcc gcaggctttg cctacaaccc ttttgccttt 240
gcggcaccgg ttgcaccgga tctccaagcc tgtgggctac caaccctgcc ggcgggcgcc 300
aaacccgtca agtgttgccc tcctgcttcc acaaagatca tagattttga gttcccaaaa 360
aaccaaccct taagggttcg gaaaccggct cataaggtta ccggtgacga tctggtcaag 420
tacaaggaag ccataaaggc catgagagag cttccagacg atgaccctcg cagcttcacc 480
caacaagccg ccattcattg cgcttactgc cacaactcgt atcaccaagt tggcttccct 540
gacaaggatc tccaggtcca ttactcgtgg attttccttc cttttcaccg ttggtacctt 600
tacttctacg agaggatctt aggaagcttg atcaacgatc caacctttgc attgcccttc 660
tggaactggg atcaccctga cggcatggaa attccttcca ttttcactga cagaagatca 720
tcgctctatg acccactcag aaacgcaaac catcaaccgc cggttctcgt cgatctcagt 780
tggaacagga acggtcctga caccagcggt gacgtcgacg ctaacctcag tttgatgtac 840
acaaacttcg tcgaagtgaa ggcgccgttg aacttcttcg gcaatgcttt ccgtgccggc 900
gacacgcctt acaccgtgaa aaccggtgcc ggaacttgcg agagcgtgca caacacgctc 960
cacacttgga gtggggatag aacccagcca aacggggagg acatggggtc cctctactct 1020
gctggtaggg atcctctctt ctactgtcac cattccaatg tcgatagaat gtggaatctg 1080
tggaaatcct tcggtaacaa agacatcacc gaccctgact ttctggaatc aaattttctg 1140
ttctatgatg agaataagaa cttggtgcgc gtgaagacca aagattgcct cgactccgtg 1200
aagcttgggt atgatttcga gaaggttccc attccgtggg cgaaaacgaa gccgaaagcg 1260
cgtaggacga aagctgagag ggcgcagaag ccgttgacga cgaagagcgt tgacttgccg 1320
ttgactctgg aggagaataa gcttgtgagc acggtggtga agaggccaag gagatccagg 1380
agcaggaagg agaaggatga gagagaggag actctggttt tggagattga gtttgatcgg 1440
aggaagccta taaagttcga tgtgttgctg aacgaagaag aggatgcgca gtttgcgacg 1500
ccaaagaaca gagagtttgc tggaagcttc gtgaatgtgt cgcacactca gaaatcgagt 1560
gccctgaaaa ctgaactggc attcaagatc gggatcacgg agaagctgat cgatttggaa 1620
gctgatgatg atgacagcgt tgtcgtcact ttggttcccc aatatggtga cggtgtcatt 1680
gttaagggca tcaagatcga ctatgaagat tgctga 1716
<210> 4
<211> 571
<212> PRT
<213> SEQ ID NO.4
<400> 4
Met Ala Ser Ile Ser Pro Leu Ser Pro Val Ser Ser Val Ala Ala Ser
1 5 10 15
Ala Thr Leu Thr Ser Ser Ser Ser Leu Pro Pro Leu Gly Ala Gly Ser
20 25 30
His Val Ala Ala Thr Leu Val Ser Cys Ala Ala Ser Ala Gly Gly Ala
35 40 45
Ser Ala Gly Ile Ala His Gly Ala Ala Ala Ala Val Leu Ile Gly Leu
50 55 60
Gly Gly Leu Ala Gly Ala Ala Gly Pro Ala Thr Ala Pro Pro Ala Pro
65 70 75 80
Ala Ala Pro Val Ala Pro Ala Leu Gly Ala Cys Gly Leu Pro Thr Leu
85 90 95
Pro Ala Gly Ala Leu Pro Val Leu Cys Cys Pro Pro Ala Ser Thr Leu
100 105 110
Ile Ile Ala Pro Gly Pro Pro Leu Ala Gly Pro Leu Ala Val Ala Leu
115 120 125
Pro Ala His Leu Val Thr Gly Ala Ala Leu Val Leu Thr Leu Gly Ala
130 135 140
Ile Leu Ala Met Ala Gly Leu Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ser Pro Thr
145 150 155 160
Gly Gly Ala Ala Ile His Cys Ala Thr Cys His Ala Ser Thr His Gly
165 170 175
Val Gly Pro Pro Ala Leu Ala Leu Gly Val His Thr Ser Thr Ile Pro
180 185 190
Leu Pro Pro His Ala Thr Thr Leu Thr Pro Thr Gly Ala Ile Leu Gly
195 200 205
Ser Leu Ile Ala Ala Pro Thr Pro Ala Leu Pro Pro Thr Ala Thr Ala
210 215 220
His Pro Ala Gly Met Gly Ile Pro Ser Ile Pro Thr Ala Ala Ala Ser
225 230 235 240
Ser Leu Thr Ala Pro Leu Ala Ala Ala Ala His Gly Pro Pro Val Leu
245 250 255
Val Ala Leu Ser Thr Ala Ala Ala Gly Pro Ala Thr Ser Gly Ala Val
260 265 270
Ala Ala Ala Leu Ser Leu Met Thr Thr Ala Pro Val Gly Val Leu Ala
275 280 285
Pro Leu Ala Pro Pro Gly Ala Ala Pro Ala Ala Gly Ala Thr Pro Thr
290 295 300
Thr Val Leu Thr Gly Ala Gly Thr Cys Gly Ser Val His Ala Thr Leu
305 310 315 320
His Thr Thr Ser Gly Ala Ala Thr Gly Pro Ala Gly Gly Ala Met Gly
325 330 335
Ser Leu Thr Ser Ala Gly Ala Ala Pro Leu Pro Thr Cys His His Ser
340 345 350
Ala Val Ala Ala Met Thr Ala Leu Thr Leu Ser Pro Gly Ala Leu Ala
355 360 365
Ile Thr Ala Pro Ala Pro Leu Gly Ser Ala Pro Leu Pro Thr Ala Gly
370 375 380
Ala Leu Ala Leu Val Ala Val Leu Thr Leu Ala Cys Leu Ala Ser Val
385 390 395 400
Leu Leu Gly Thr Ala Pro Gly Leu Val Pro Ile Pro Thr Ala Leu Thr
405 410 415
Leu Pro Leu Ala Ala Ala Thr Leu Ala Gly Ala Ala Gly Leu Pro Leu
420 425 430
Thr Thr Leu Ser Val Ala Leu Pro Leu Thr Leu Gly Gly Ala Leu Leu
435 440 445
Val Ser Thr Val Val Leu Ala Pro Ala Ala Ser Ala Ser Ala Leu Gly
450 455 460
Leu Ala Gly Ala Gly Gly Thr Leu Val Leu Gly Ile Gly Pro Ala Ala
465 470 475 480
Ala Leu Pro Ile Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Gly Gly Gly Ala Ala
485 490 495
Gly Pro Ala Thr Pro Leu Ala Ala Gly Pro Ala Gly Ser Pro Val Ala
500 505 510
Val Ser His Thr Gly Leu Ser Ser Ala Leu Leu Thr Gly Leu Ala Pro
515 520 525
Leu Ile Gly Ile Thr Gly Leu Leu Ile Ala Leu Gly Ala Ala Ala Ala
530 535 540
Ala Ser Val Val Val Thr Leu Val Pro Gly Thr Gly Ala Gly Val Ile
545 550 555 560
Val Leu Gly Ile Leu Ile Ala Thr Gly Ala Cys
565 570
<210> 5
<211> 524
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.5
<400> 5
accatcacgc agcagctggc caagaacctg ttcctctccg gcgagcgcca ttacctgcgc 60
aagggcgagg agctcgtcat cacgtggatg ctggagttct ggctcgacaa ggagcgcatc 120
ctggagatct acctgaattc ggtggagtgg ggcgagggcg tcttcggcgc cgaggcggcg 180
gcgcagcatt acttcaaacg gccggcatcg caattgacgg tgggccaggc cgcgcgactg 240
gccgcggcgc tgccggcgcc caagtgcttc gacaagaagc gctactgcgc caatgtccac 300
atcagtttca cgcgcaaggc gacggtcatc gccaaccgga tgggctcggc gaccctgccg 360
gactgacccg gctcaggcgc gcgggggctt cgtaaacctg cactcagttg cggtttcgga 420
gcgaggttga aggggacctg aaaggtacaa ctgtccaacg cgcctcacgc gaggggcgcg 480
ggctccccca acctttcttg ccgagacagt catgtccatc caga 524
<210> 6
<211> 519
<212> DNA
<213> SEQ ID NO.6
<400> 6
tcgggctgat gctgccgctg gagcgggccg cgccgccggg tgcggcctat ttcagccagc 60
ccttgcgccg gaaatacacc agcgggatcg ccgccgacac gatcatcagc acgatcgcat 120
aggggtagcc ctccgcccag tccagctccg gcatcacctt gaagttcatg ccgtagatcg 180
aggcgatcag ggtcggcggc atcagcgcca ccgagaccac cgagaacagc ttgatgatct 240
tgttctggtt gatgttgatg aagccgaccg tggcgtccat caggaagttg accttgtcgg 300
acaggaaggc ggtgtggttc tcgatggagt cgatgtcgcg cagcacctgg cgcgcctcgt 360
cctgctggtc gggcgacagc atctggctgc gcagcaggaa ggacaccgcg cggcgcgtgt 420
ccatcacgtt gcggcggatg cggccgttga ggtcttccac gcgggcgatg atttcgagca 480
cgtcggcggc ggcctggtcg gtcacttcgt cggccagca 519
<210> 7
<211> 57
<212> DNA
<213> RipW-attb1-F
<400> 7
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc atgtccatcc agattgatcg cccgaac 57
<210> 8
<211> 58
<212> DNA
<213> RipW-attb2-R
<400> 8
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcagcccgag taggccttgt agctcacc 58
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> RipW-U-XbaI-F1
<400> 9
ctagtctaga ctagaccatc acgcagcagc tggccaagaa c 41
<210> 10
<211> 55
<212> DNA
<213> RipW-U-SalI-R1
<400> 10
gcgtcgacgt cttggccata gcggccgcgg tctggatgga catgactgtc tcggc 55
<210> 11
<211> 55
<212> DNA
<213> RipW-D-SalI-F2
<400> 11
gcgtcgacgt cttggccata gcggccgcgg tcgggctgat gctgccgctg gagcg 55
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> RipW- D-SphI-R2
<400> 12
acatgcatgc atgttgctgg ccgacgaagt gaccgaccag g 41
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> CRipW-XbaI-F1
<400> 13
ctagtctaga ctagaccatc acgcagcagc tggccaagaa c 41
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> CRipW-SphI-R2
<400> 14
acatgcatgc atgttgctgg ccgacgaagt gaccgaccag g 41
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> M13F
<400> 15
gttgtaaaac gacggccag 19
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> M13R
<400> 16
caggaaacag ctatgac 17

Claims (10)

1.一种花生青枯菌三型效应蛋白RipW，其特征在于：所述花生青枯菌三型效应蛋白RipW的氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。
2.一种花生青枯菌三型效应蛋白RipW的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种包含权利要求2所述花生青枯菌三型效应蛋白RipW编码基因的超量表达载体。
4.一种包含权利要求2所述花生青枯菌三型效应蛋白RipW编码基因的敲除载体。
5.根据权利要求4所述敲除载体，其特征在于：所述敲除载体的构建方法包括：根据花生青枯菌Rs-P.362200全基因序列, 克隆RipW上游524bp片段U，下游519bp片段D；通过酶切连接的方法构建敲除载体pK18mobSacB-U-D。
6.一种包含权利要求2所述花生青枯菌三型效应蛋白RipW编码基因的回补载体。
7.根据权利要求6所述的回补载体，其特征在于：所述回补载体的构建方法包括：根据花生青枯菌Rs-P.362200全基因序列, 克隆上游524bp片段U、1146bp的RipW、下游519bp片段D；通过酶切连接的方法构建回补载体pK18mobSacB-U-RipW-D。
8.一种权利要求1所述花生青枯菌三型效应蛋白RipW的互作蛋白AhPOA，其特征在于：所述互作蛋白AhPOA为多酚氧化酶AhPOA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4 所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
9.权利要求1所述花生青枯菌三型效应蛋白RipW在青枯菌防治中的应用。
10.权利要求8所述上述花生青枯菌三型效应蛋白RipW的互作蛋白AhPOA在青枯菌防治中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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GENBANK: "PREDICTED: Arachis hypogaea polyphenol oxidase A1, chloroplastic (LOC112791435), mRNA", 《GENBANK》, pages 025834274 *
GENBANK: "PREDICTED: polyphenol oxidase A1, chloroplastic-like [Arachis duranensis]", 《GENBANK》, pages 015956318 *
GENBANK: "Ralstonia solanacearum strain B2 chromosome, complete genome", 《GENBANK》, pages 049787 *

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