CN1273509A - 用分泌杀菌剂的细菌抑制硫酸盐还原菌介导的降解作用的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过使用分泌杀菌化学物质的细菌来防止或预防降解或腐蚀的领域。具体地,本发明涉及可天然地或通过使用重组技术而分泌化学物质的细菌的用途,这些化学物质可抑制硫酸盐还原菌在金属、混凝土、灰浆或其他易腐蚀或降解的表面上的生长。

Description

用分泌杀菌剂的细菌抑制硫酸盐还原菌介导的降解作用的方法

相关申请的交叉引用

本申请是1998年5月6日申请的美国申请No.09/074,037的部分续展申请，该申请的内容在此引用作为参考。

非联邦的研究资助

在本文所描述的发明是在与电力研究院的合同RP8044-02之下和执行过程中完成的。

发明领域

本发明涉及通过使用分泌杀菌化学物质的细菌来防止或抑制易降解的表面发生降解的领域。具体地，本发明涉及可天然地或通过使用重组技术而分泌化学物质的细菌的用途，这些化学物质可抑制硫酸盐还原菌在金属、混凝土、灰浆或其他会发生腐蚀或降解的表面上的生长。

发明背景

降解和腐蚀破坏在全世界都造成巨大的损失。仅在美国，腐蚀破坏造成的年损失估计相当于国民生产总值的4.2％(Martinez，L.J.Metals.45：21(1993)(以下简称为Martinez，1993))。通过更好地和更广地使用防腐蚀技术，可以大大减少这些巨大的损失。

微生物对降解和腐蚀破坏起了很大作用。当表面(尤其是金属)暴露于自然环境时，它们会被散装液相中的需氧菌快速占据(Geesey，G.G.，What isbiocorrosion？Presented at the International workshop on industrial biofouling andbiocorrosion，Stuttgart，Germany，Springer-Verlag，New York(1990)(以下简称Geesey，1990))。该生物膜的上层是需氧的，而在靠近金属表面的区域因生物膜的耗氧作用而是缺氧的(Blenkinsopp，S.A.等人，Trends.Biotechnol.9：138-143(1991)；Bryers，J.D.等人，Biotech.Prog.3：57-67(1987))。硫酸盐还原菌(SRB)可在这些缺氧的生态小境中定居，并因此即使在有氧环境中也造成腐蚀(Hamilton，W.A.＂硫酸盐还原菌及其在生物腐蚀中的作用＂，Presented at theInternational workshop on industrial biofouling and biocorrosion，Stuttgart，Germany，Springer-Verlag，(1990)(以下简称Hamilton，1990))。

在大量不同环境中的金属劣化过程中都涉及SRB(Borenstein，S.W.Microbiologically influenced corrosion handbook，Woodhead Publishing Limited，Cambridge，England(1994)(以下简称Borenstein，1994)；Hamilton，W.A.Ann.Rev.Microbiol.39：195-217(1985)(以下简称Hamilton，1985)；Hamilton，W.A.Trends.Biotechnol.1：36-40(1983)；Hamilton 1990)。在石油和船运业的管线和海上石油钻机(Hamilton，W.A.Trends.Biotechnol.1：36-40(1983))，在工业系统中的冷却水再循环系统(Borenstein，1994；Miller，J.D.Metals.p.150-201，在Rose，A.H.编辑的Microbial Deterioration，Academic Press，New York(1981))(以下简称Miller，1981)，污水处理设备和管线(Hamilton，1985；Odom，J.M.ASM NEWS，56：473-476(1990))，在航空业中的喷气机燃料箱(Miller，1981)，以及发电业(Licina，G.J.Mater.Perform.28：55-60(1989))(以下简称Licina，1989)都因为SRB的生长和定居而受害。SRB可导致大量不同的金属腐蚀，例如低级碳素钢(如Borshchevskii，A.M.等人，Prot.Metals，30：313-316(1994)；Cheung，C.W.S.和Beech，I.B.，Biofouling，9：231-249(1996)(以下简称Cheung和Beech，1996)；Dubey，R.S.等人，Ind.J.Chem.Tech.2：327-329(1995)；Gaylarde，C.C.Int.Biodet.Biodeg.30：331-338(1992)(以下简称Gaylarde，1992)；Lee等人，Biofouling 7：197-216(1993)；)、不锈钢(Benbouzid-Rollet，N.等人，J.Appl.Bacteriol.71：244-251(1991)；Mollica，A.Int.Biodet.Biodeg.29：213-229(1992)；Newman，R.C.等人，ISIJ International.3：201-209(1991)；Oritz等人，Int.Biodet.26：315-326(1990))和铜合金(Licina，1989；Wagner，P.和Little，B.Mater.Perform.32：65-68(1993)(以下简称Wagner和Little，1993))，所有这些金属都是在加工、船舶运输和电力产业中经常使用的。SRB还对世界基础设施的非金属部分造成很大的破坏。SRB产生硫化氢，硫化氢会接着被硫氧化性生物如硫杆菌(Thiobacillus)代谢而生成硫酸。已发现，因细菌而导致的硫酸降解会显著缩短供水系统中混凝土管道的使用寿命。据估计，仅在金属方面由SRB造成的腐蚀损失在美国相当于每年约40-60亿美元(Beloglazov，S.M.等人，Prot.Met.USSR.27：810-813(1991))(以下简称Beloglazov，1991)。

传统的抑制腐蚀的策略包括对安装设备的土壤的pH、氧化还原电位和电阻加以改变(Iverson，W.P.Adv.Appl.Microbiol.32：1-36(1987)(以下简称Iverson，1987))，使用无机涂层、阴极保护和抗微生物剂(Jack，T.R.等人，Controlin Industrial Settings，p.265-292，Barton，L.L.(编)，Sulfate-reducing Bacteria，Plenum Press，New York(1995))(以下简称Jack等人，1995)(Barton的全部文献都在此引用作为参考)。无机保护涂层如涂料和环氧涂料在过去已经被广泛使用；但是它们不是永久性的，而且维持和替换它们的成本都是很高的(Jayaraman，A.等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.47：62-68(1997)(以下简称Jayaraman，1997a)；Martinez，1993)。对于阴极保护，是通过将金属表面偶连于镁或锌制成的牺牲阳极，或通过耐腐蚀的阳极从外部电源供应强制电流，从而在金属表面上激发阴极反应。化学电流或强制电流降低了金属表面上各处的电化学电位，使得金属阳离子不形成，因而不发生溶解((Iverson，1987)；Little，B.J.等人，材料性能(Mater.Perform.)32：16-20(1993))。然而，Wagner和Little(1993)报道，使用高达-1074mV之内的阴极电位还不能防止形成生物膜。

抗微生物剂(biocide)也已经被用于延缓密闭系统如冷却塔和储藏罐中的腐蚀反应(Iverson，1987)，并且可能是最常用的对抗生物腐蚀的方法(Boivin，J.材料性能(Mater.Perform.)34：65-68，1995)(以下简称Boivin，1995)；Brunt，K.D.Biocides for the oil industry，p.201-207，in Hill.，E.C.，Shennan，J.L.，Watkinson，R.J.(编)，Microbial Problems in the Offshore Oil Industry，John Wiley and Sons，Chichester，England(1986)；Cheung，C.W.S.等人，Biofouling，9：231-249(1996)(以下简称Cheung，1996)。Saleh等人(J.Appl.Bacteriol.27：281-293(1964)(以下简称，Saleh等人，1964)综述了使用近200种对SRB有杀菌或抑菌作用的化合物。氧化性抗微生物剂如氯气、氯胺和含氯化合物被用于自来水系统(Boivin，1995，同上)。含氯化合物是最实用的抗微生物剂；然而，它们的活性取决于水的pH以及光和温度条件(Keevil，C.W.等人，Int.Biodet.26：169-179(1990)(以下简称Keevil等人，1990))，而且它们对于生物膜细菌并不十分有效(Boivin，1995，同上)。非氧化性抗微生物剂如季铵盐(Beloglazov，1991)、胺类型的化合物、蒽醌类(Cooling III，F.B.等人，Appl.Environ.Microbiol.62：2999-3004(1996))(以下简称Cooling等人，1996)和醛类(Boivin，1995)是最稳定的并且能够在不同环境中使用。使用这些抗微生物剂有许多严重的缺点，不仅包括抗微生物剂本身的成本高，还包括将大量无机化合物释放入供水中而导致的环境处理成本高。

在材料表面上的生物膜结构还造成了另一问题。糖萼(glycocalyx)(Brown，M.L.等人，应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)61：187-193(1995)；Hoyle，B.D.等人，J.Antimicrob.Chemother.26：1-6(1990)；Suci，P.A.等人，Antimicrob.Agents.Chemother.38：2125-2133(1994))和在生物膜中发生的表型变化，例如P.aeruginosa中algC基因的表达(Costerton，W.J.等人，Ann.Rev.Microbiol.49(711-745)(1995))(以下简称Costerton，1995)，以及表面化学物质对生物膜代谢状态的影响(Keevil等人，1990)，这些都会导致生物膜中的生物体对于抗微生物剂的抗性的增加超过了对浮游菌所观察到的抗性(Brown，M.R.W.等人，J.Appl.Bacteriol.Symp.Suppl.74：87S-97S(1993))。将有机的膜腐蚀抑制剂(一种聚丙烯酸酯/磷酸酯)和两种抗微生物剂合用，已成功地控制了冷却水系统中的腐蚀(Iverson，同上)。然而，SRB天生对于大量不同的抗菌剂有抗性(Saleh等人，1964，同上)，并且，SRB茁壮生长的恶劣的厌氧环境(由腐蚀产物所造成)也降低了抗菌剂的效力(Cheung，1996；Iverson，同上)。一旦SRB牢固定居于它们的小生态环境中，那么不进行拆卸就难以将它们从系统中清除掉(Boivin，1995，同上)。

其他控制微生物诱导的腐蚀的策略是通过控制养分的利用度来抑制最有害微生物的生长，从而产生更良性的生物膜(Jack等人，1995)。最近，Jansen和Kohnen(J.Ind.Microb.，15，391-396(1995))报道了，通过将银离子与表面离子性地结合而修饰聚合物表面，可降低表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)KH6对表面的粘附，这提示可开发抗微生物的聚合物来防止细菌粘附。Wood，P.等人，(1996)(应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)62：2598-2602)报道了通过催化在表面生成单过硫酸钾和过氧化氢，可使这些抗微生物剂对P.aeruginosa生物膜的活性增加150倍。该方法依赖于用必要的化学物质渗透过塑料，并且需要在制造工艺进行广泛的、根本性和昂贵的改变才能实施。

最后，其他研究者的工作提示(Pedersen和Hermansson，Biofouling，1：313-322(1989)，和Biofouling 3：1-11(1991))，并且我们自己的工作最近证实(Jayaraman等人，1997a和Jayaraman等人，J.Ind.Microb.18(396-401)(1997)(以下简称Jayaraman等人，1997b)，生物膜中的需氧细菌可抑制金属的电化学腐蚀2-40倍，这部分可能是因为金属上生物膜中呼吸的细菌用掉了一部分原本会用来氧化金属的氧气。然而，如上所述，氧气浓度的下降也增加了厌氧性的SRB在金属上定居的机会。因此，事实上，作为抑制电化学腐蚀的手段，生物膜的效率因随后SRB相关腐蚀的增加而下降。

本领域需要的是一种有效而价廉的防止或抑制SRB所造成的腐蚀或降解的手段，并且可减少毒性物质向环境的排放。本发明提供了这些以及其他好处。

发明概述

本发明涉及通过使用分泌杀菌化学物质的细菌来防止或抑制腐蚀的领域。具体地，本发明涉及可天然地或通过使用重组技术而分泌化学物质的细菌的用途，这些化学物质可抑制硫酸盐还原菌在金属、混凝土、灰浆或其他会发生腐蚀或降解的表面上的生长。

本发明提供了一种抑制SRB在易腐蚀或降解的材料上生长的方法。该方法包括向易腐蚀或降解的材料上施用细菌，该细菌分泌数量足以抑制SRB在材料上生长的化学物质。易腐蚀的材料可以是金属如铁、铝、镍、铜或其他合金。例如，金属可以是软钢或各种不锈钢中的一种。易降解材料可以是诸如混凝土、钢筋混凝土或水泥之类的材料。细菌可以是需氧的，而且可以来自例如假单胞菌属或芽孢杆菌属。细菌分泌的化学物质可以是野生型的该细菌物种通常不分泌的物质，而且可以是抗生素如短杆菌肽S、indolicidin、多粘菌素(polymixin)或杀细菌素(bactenecin)，可以是聚氨基酸如聚天冬氨酸或聚谷氨酸，或者可以是铁载体(siderophore)。

本发明还提供了一种抑制腐蚀的系统，它包括在表面上有生物膜的易腐蚀或降解的材料，其中该生物膜包含细菌，该细菌分泌数量足以抑制SRB在材料上的生长的化学物质。易腐蚀的材料可以是金属，例如在上一段落中提及的那些种类。易降解材料可以是诸如水泥、混凝土或钢筋混凝土之类的材料。细菌可以是需氧的，尤其是假单胞菌属或芽孢杆菌属。细菌分泌的化学物质可以是野生型的该细菌物种通常不分泌的物质，而且可以是抗生素如短杆菌肽S、indolicidin、多粘菌素(polymixin)或杀细菌素(bactenecin)，可以是聚氨基酸如聚天冬氨酸或聚谷氨酸，或者可以是铁载体。

附图简述

图1：indolicidin和杀细菌素的克隆和表达。S＝丝氨酸，A＝丙氨酸。仅

    示出了相关的限制性位点。

图1a：用于克隆和分泌indolicidin和杀细菌素的表达系统的示意图。

图1b：用于克隆indolicidin的互补寡核苷酸。

图1c：用于克隆杀细菌素的互补寡核苷酸。

图2：克隆和表达具有保护性pro-芽孢杆菌RNA酶(pro)区域的杀细菌

    素。

图2a：用于克隆和分泌pro-杀细菌素的表达系统的示意图。单字符

的氨基酸缩写表示了pro-区域和杀细菌素基因。SP表示碱性蛋白酶

信号肽。

图2b：克隆pro-杀细菌素的有关核苷酸。S＝丝氨酸，A＝丙氨酸。

仅示出了相关的限制性位点。图3：304不锈钢在含下列双培养物(除了对照)的改良型Baar氏培养基

中的阻抗谱：枯草杆菌BE1500[携带质粒pBE92(不存在SRB(空心方

块)和存在SRB(实心方块))，携带pBE92-Ind(indolicidin)(实心菱形)、

携带pBE92-Bac(杀细菌素)(空心三角)和携带pBE92-ProBac(带pro区

域的杀细菌素)(空心圆圈)]和对照的细菌P.fragi K(实心六角形)，与

代表性的SRB D.Vulgaris构成的双培养物。数据来自代表性的试验。

图3a：Y轴：阻抗的对数，X轴：频率(赫兹)

图3b：Y轴：相角(度)，X轴：频率(赫兹)

对图3-9中阻抗谱的解释说明：

电化学阻抗频谱术是材料科学中一种研究腐蚀的技术。在图3-9中每

图的上图(“a”图)是所述金属在一定频率范围内的的阻抗的对数

图，如图所示进行处理。在低频处的阻抗平台被称为极化阻抗，它与

腐蚀速率成反比；因此，如果在低频处的阻抗上升，就反映腐蚀速率

下降。当仪器扫过图中所示的频率范围时，图中被认为与腐蚀研究有

关的部分是在最低频率处的数据。因此，在试验中对腐蚀速率改变的

影响是通过图中最左侧所示的数据加以确定的。因为“a”图的Y轴

是log函数的数值，因此Y轴上各数值间的差异反映了10倍差异。

所以，在代表性曲线上数据点的相对位置上的小差别就反映了腐蚀速

率的大差别。关于极化阻抗、阻抗谱和测量腐蚀情况的其他技术的更

多信息，可见Baboian，R.编，腐蚀测试和标准：应用和解释(Corrosion

Test and Standards：Application and Interpretation)，American Society

for Testing and Materials，Philadelphia(1995)。

各图中的下图(“b”图)是阻抗响应的相移位图。这些图证实了每个

试验中在“a”图中的阻抗反映了单一的时间常数并且在低频处的阻

抗平台是极化阻抗。

在所有的图3-9(“a”和“b”图)中，X轴是频率(Hz)。图4：上图和下图：304不锈钢在含下列双培养物的改良型Baar氏培养

基中的阻抗谱：枯草杆菌WB600[携带质粒pBE92(不存在SRB(空心

方块)和存在SRB(实心方块))，携带pBE92-Ind(indolicidin)(实心菱

形)、携带pBE92-Bac(杀细菌素)(空心三角)和携带pBE92-ProBac(带

pro区域的杀细菌素)(空心圆圈)]和细菌P.fragi K(实心六角形)，

“SRB”表示代表性的SRB D.Vulgaris。数据来自一次试验。

图4a：Y轴：阻抗的对数，X轴：频率(赫兹)

图4b：Y轴：相角(度)，X轴：频率(赫兹)图5：上图和下图：304不锈钢在含下列双培养物的改良型Baar氏培养

基中的阻抗谱：多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)[携带质粒pBE92(不存在

SRB(空心三角)和存在SRB(实心三角))，携带pBE92-Bac(杀细菌

素)(空心方块)和对照细菌P.fragi K(实心六角形)，与代表性的SRB

D.Vulgaris构成的双培养物。数据来自代表性的试验(两次独立的试

验)。

图5a：Y轴：阻抗的对数，X轴：频率(赫兹)

图5b：Y轴：相角(度)，X轴：频率(赫兹)图6：上图和下图：SAE 1018软钢在改良型Baar氏培养基中的阻抗谱，

并且在加入SRB之前和之后将抗微生物的纯氨苄青霉素加至P.fragi

K。对照的P.fragi K培养物：空心圆圈。P.fragi和SRB(D.vulgaris)：

实心菱形。P.fragi和SRB，并且在SRB后加入氨苄青霉素：实心

三角。P.fragi，并且在SRB前加入氨苄青霉素：空心方块。数据来

自代表性的试验(来自最少两次独立试验)。

图6a：Y轴：阻抗的对数，X轴：频率(赫兹)

图6b：Y轴：相角(度)，X轴：频率(赫兹)图7：上图和下图：304不锈钢在改良型Baar氏培养基中的阻抗谱，并

且在加入SRB之前和之后加入抗微生物的纯氨苄青霉素。对照的

P.fragi K培养物：空心圆圈。P.fragi和SRB(D.vulgaris)：实心菱形。

P.fragi和SRB，并且在SRB后加入氨苄青霉素：实心三角。P.fragi，

并且在SRB前加入氨苄青霉素：实心菱形。数据来自代表性的试验(来

自最少两次独立试验)。

图7a：Y轴：阻抗的对数，X轴：频率(赫兹)

图7b：Y轴：相角(度)，X轴：频率(赫兹)图8：上图和下图：304不锈钢在改良型Baar氏培养基中的阻抗谱，其

中在加入SRB之前加入抗微生物的纯化的短杆菌肽S，以及由重组

的生物膜在原位产生短杆菌肽S。

实心圆圈：对照细菌P.fragi和SRB；实心菱形：P.fragi和短杆菌肽

S和SRB D.vulgaris(在SRB之前加入短杆菌肽S)；空心方块：短杆

菌肽S高产性的短芽孢杆菌(B.Brevis)18；实心方块：短芽孢杆菌18

和SRB。数据来自代表性的试验(来自最少两次独立试验)。

图8a：Y轴：阻抗的对数，X轴：频率(赫兹)

图8b：Y轴：相角(度)，X轴：频率(赫兹)图9：上图和下图：SAE 1018软钢在改良型Baar氏培养基中的阻抗谱，

其中在加入SRB之前加入抗微生物的纯化的短杆菌肽S，以及由重

组的生物膜在原位产生短杆菌肽S。图标如图8。数据来自代表性

的试验(来自最少两次独立试验)。

图8a：Y轴：阻抗的对数，X轴：频率(赫兹)

图8b：Y轴：相角(度)，X轴：频率(赫兹)

详细描述

1.序言

本发明提供了抑制材料降解的方法，以及用于抑制降解的系统。我们最近表明，在金属上存在需氧生物膜可降低腐蚀2-40倍(Jayaraman等人，1997a和Jayaraman等人，1997b)。这种抑制部分可能是因为细菌的呼吸作用而降低了金属表面上的氧气浓度。然而，在天然环境下，这种氧气浓度的下降也增加了硫酸盐还原菌(SRB)在金属上定居的机会。尽管SRB的影响在Jayaraman等人，1997a或1997b中没有作过研究，但是预计在所报道的那些研究中SRB会大大增加腐蚀速率。因此，尽管Jayaraman等人，1997a或1997b的研究表明需氧生物膜可以作为抑制腐蚀的手段，但是他们并没有提供如何减少SRB介导的腐蚀的有关指导。

本发明解决了这一问题，因此显著地增加了需氧生物膜作为抑制降解手段的实用性。简而言之，本发明涉及使用分泌抗微生物剂的细菌。现在，我们已表明，可以形成需氧细菌的生物膜，该细菌分泌抑制SRB生长的物质。这些物质可以是在生物膜中通常不存在的野生型细菌(该细菌被引入生物膜)所天然分泌的物质(包括因为突变而使物质的分泌量高于正常水平)。该细菌还可以被重组改造，从而高表达其天然分泌的物质，或者分泌野生型的该细菌品种不表达的抗微生物剂，或者兼而有之。

腐蚀是一种影响金属的问题。但是其他材料也受到与SRB定居于材料的相关性降解的影响。SRB产生硫化氢作为它们的一种代谢产物。硫化物侵袭铁、其合金(包括不锈钢)，并且使铜及其合金氧化。硫化氢可以被众多的硫氧化微生物氧化成硫酸盐，例如产生硫酸的硫杆菌。以这种方式形成的硫酸造成了例如洛杉机的混凝土自来水管降解，并且显著减少了混凝土的水控制系统的预期使用寿命。

尽管本发明特别适用于对抗于SRB有关的腐蚀或降解，但是本发明的方法和系统还可用于其他加剧材料腐蚀或降解的生物体。例如，诸如Hormoconisresinae之类的真菌会污染喷气燃料并产生会加剧燃料系统中铝合金腐蚀的有机酸。参见例如H.A.Videla，生物腐蚀手册(Manual of Biocorrosion)(CRCLewis Pub.，New York)(1996a)，at 129.(以下简称“手册”；该手册的全部内容在此引用作为参考)。使用分泌和/或改造后分泌抗真菌物质的细菌，可以减少这种起源的腐蚀。类似地，假单胞菌在航空燃料中的生长会加剧腐蚀，而灵杆菌(Serratia marcescens)被发现是保护性的(同上，129-132)。本发明包括对灵杆菌进行遗传工程改造，以分泌一种或多种抑制假单胞菌、SRB或其他造成腐蚀的微生物生长的抗微生物的物质。

用本方法抑制SRB介导的腐蚀或降解、以及抑制其他细菌(如假单胞菌)或真菌引起的腐蚀，是十分有利的。因为细菌可自我繁殖，因此分泌抗微生物剂的菌群会长时间自我补充。这样，一次施用就可长期有效这与施用有机或无机化学物质相反(它们通常必须经常重复施用)。此外，生物膜自身分泌的物质会使该物质在作用点的浓度最高，这与外部施用的化学物质不同。化学物质通常必须大量施用以保证有足够的剂量作用于SRB或其他所针对的目标生物体。此外，SRB获得能量的机制是稍高能才有利，因此该微生物的生长可能受到不会严重影响其他微生物的物质所抑制。所以，周围微生物分泌抗微生物剂能够完全抑制或减少SRB对其他物质的抗性，使之可以通过外部施用比原本所需水平低得多的抗微生物剂和其他毒性剂来抑制SRB相关的腐蚀或降解。

本发明的一个额外优点是，即使因为液体流动或磨损而使某些地方的生物膜受损或被移去，相邻区域不断地供应的抑制剂会有利于暴露的金属或其他表面被产生抑制剂的细菌重新占据。因为生物膜可快速地在暴露表面上形成(Costerton，1995)，因此细菌的明智选择会导致将其他细菌品种排除在生物膜之外。

最后，生物膜对降解或腐蚀的抑制效应还可进一步提高，即通过单独地引入分泌降解/腐蚀抑制性物质的细菌，或者与抗微生物剂一起引入。这类降解或腐蚀抑制性物质可包括诸如聚天冬氨酸或聚谷氨酸等多肽，以及铁载体如parabactin和肠杆菌素(enterobactin)。

下面叙述了本发明众多用途中的一部分，以及实施的方法。在术语定义之后，下文讨论了通过使用分泌抗-SRB或抗真菌物质的微生物(包括天然分泌这些物质以及经遗传工程改造后分泌这些物质的两类微生物)，从而提高需氧生物膜的抗腐蚀效应的方法。此外，描述了使用抗腐蚀或抗降解物质(如多肽或铁载体)来进一步提高抗腐蚀效应。本文还进一步描述了如何选择用于本发明方法或系统的合适生物体以及如何确定生物体是否产生(在改变之前或之后)抑制SRB、真菌或其他目标生物体生长的物质。然后，讨论了在待保护的材料被投入使用之前或之后施用生物体的方法，并且描述了该方法和系统的用途。最后，给出了实施例。

II.定义

如本文所用，“软钢”指通常用于管道等的价廉的低级钢。“SAE 1018钢”是一种具体牌号的软钢，它符合Society of Automotive Engineers设定的产业标准。

如本文所用，“不锈钢304”或“304不锈钢”指一种具体牌号的符合设计产业标准的不锈钢。

术语“金属试样”指小而薄的长方形或圆形的金属。这样的“试样”在本领域中常规用于比较不同金属、物质和抑制剂的腐蚀方面的特性。

如本文所用，“易腐蚀材料”包括所有会腐蚀的金属，具体地包括铁、铝、钛、铜、镍和它们中任一种金属的合金，包括软钢和不锈钢。

“腐蚀”具体指对金属的破坏，而“降解”指其他材料(如混凝土、水泥、灰浆等材料)的遭破坏。因此，如本文所用，“易降解材料”是因细菌相关因素而易遭破坏的非金属材料。然而，出于描述方便，如本文所用，所有“腐蚀”也包括对非金属材料的破坏，除非上下文另外需要。牙科植入物也可以是一种“易降解材料”。

如本文所用，“化学物质”指对造成金属腐蚀或非金属材料降解的微生物有生长抑制作用的化学品。该术语在本文中通常与术语“抗微生物剂”通常是同义的，但并不一定是同义的。

术语“施用”包括由人的活动所介导或协助的任何手段，通过该手段细菌与表面接触，包括文中将细菌或含细菌的混合物接触、喷洒、刷、浇、滴于易腐蚀或降解的材料上的合适手段。还包括，当管道、水管、冷却塔或水系统第一次投入使用时，将分泌抗微生物物质(如抗-SRB物质)的细菌置于水流通过的例如管道、水管、冷却塔或水系统的最初陶土(bolus)中。还包括将细菌直接置于表面，可以刮表面以便在已有的生物膜中形成一处空白处或不刮。

短语“数量足以抑制硫酸盐还原菌生长”指数量足以减少细菌生长，并且与对照菌群相比时在统计学上是显著的。其减少的范围可以低至能检测出统计学显著差异的限度，可高至完全抑制。较佳地，抑制程度最少约10％，意味着细菌的生长比对照菌群的生长低至少约10％。更佳地，抑制程度约为30-50％。更好地，抑制程度约为50-90％。最佳地，抑制程度为90％或更高。

III.提高生物膜的抗腐蚀效应

A.通过分泌抗微生物剂的细菌提高生物膜的抗腐蚀效应

1.概述

暴露于自然环境的表面会很快被需氧细菌所占据。金属和其他表面会产生包裹在多糖外被(被称为“糖萼”)中的粘结性菌群(Costerton，1995)。如“发明背景”中所述，本发明人的最近研究已证实，当生长成单培养物或“无共生”培养物时生物膜对表面有保护效应。然而，在自然界中生物体极少长成单培养物，并且因为生物膜中需氧细菌消耗氧气而在金属或其他材料的表面附近出现缺氧区域，这增加了硫酸盐还原菌(SRB)定居于这些材料的机会。因此，这些细菌甚至能在有氧环境中造成腐蚀(Hamilton，1990)。

通过将一种或多种分泌抑制SRB生长的抗微生物剂的细菌引入现有的生物膜，可提高生物膜的保护作用。在一个实施例中，细菌可以是一种天然地或因突变而能天然地产生和分泌抑制SRB生长的物质的细菌。或者，该细菌可通过重组技术改造而分泌原来该物种不分泌的抗微生物剂，或者高水平地或连续地分泌通常低水平地或仅在特定时间分泌的抗微生物剂。

2.天然的细菌分泌者

某些细菌天然产生的物质可有效地抑制导致腐蚀的微生物(如SRB)的生长。细菌的生物学已经被研究了数十年并已获得了相当的知识，包括与已知分泌抗微生物剂的许多细菌有关的知识。下面进一步描述并在实施例中测试了一种这样的细菌对SRB介导的腐蚀的抑制能力，该细菌因诱导突变而超量表达抗微生物物质-短杆菌肽S(出于本发明目的，因化学诱导突变而超量分泌某物质的细菌被认为是该物质的天然分泌者)。根据下面实施例中所述的测试方法或本领域已知的方法，可以方便地测试已知分泌抗微生物剂的其他细菌的分泌物对引起腐蚀的微生物(如SRB或真菌Hormoconis resinae)的有效性。

3.重组改变的分泌者

(a)被用作分泌者的细菌并不天然产生的化学物质

并不总是这样，即能够找到天然分泌某特定抗微生物剂的细菌，或者天然分泌用于特定用途的所需抗微生物剂的细菌，在特定暴露的特定环境中能够旺盛生长。在这些和其他情况下，并不天然分泌有关抗微生物剂的细菌就可以用重组生物技术加以改变以分泌所需的抗微生物剂。

(b)细菌天然产生的化学物质，但是更大量或组成型地产生

重组技术还可用于提高那些通常的确分泌抗微生物剂的细菌的抗-SRB腐蚀的特性，即通过用构建物转染它们，该构建物含有可操作地连于强组成型启动子的抗微生物剂基因，从而提高了分泌物质的数量、或者使通常不连续产生或在仅在特定环境或代谢条件下产生的抗菌物质连续地产生。该构建物还可将编码抗微生物剂的基因置于诱导型启动子的控制之下，从而使该物质的分泌可受控制。

(c)将DNA构建物引入细菌细胞

应理解，在本领域已知道用于将DNA(包括异源DNA)引入细菌细胞的许多技术。一种代表性的方法将在下面实施例中给出。选择将DNA引入细菌并获得表达的具体方法，对于本发明实施并不是关键的。

B.选择抗微生物物质

1.抗微生物剂

可由细菌产生的许多抗微生物剂是本领域中已知的。例如，乳链菌肽，一种由Lactococcus lactis菌分泌的34氨基酸的肽，可用作食物防腐剂。海洋细菌分泌的1700氨基酸的多肽(称为“D2”)已表明有普遍的抗微生物活性。对目标微生物如SRB有抑制性的任何一种这些抗微生物剂，都可用于本发明。

在一优选例中，抗微生物剂是一种抗生素肽。肽抗微生物剂可以是短小的(通常10-35个氨基酸)，而且小的抗微生物剂可以比许多常规抗生素(可能需要大的操纵子或数个途径以实现单个抗生素的表达)更容易克隆入细菌。除了上述提及的之外，大量的肽抗生素，如短杆菌肽S和D(在下面实施例中论述)是本领域中已知的。然而，如果对于有关的特定应用合适，可以使用更多的抗生素物质，只要它们可在细菌中足量地表达。

还可以使用通常不被认为是抗生素但具有抗微生物效果的其他小肽。例如，indolicidin和杀细菌素是牛嗜中性白细胞产生的阳离子型抗微生物肽，已知它对大范围的微生物有效(关于这些化合物的详细信息(包括相关文献)在下面实施例中给出)。indolicidin是已知最小的抗微生物线性肽。

对具体抗微生物化合物的选择可由技术人员作出明智的判断，它取决于目标微生物、所选择的分泌抗微生物剂的生物体以及使用分泌生物体的应用场合。所选定的抗微生物剂应能抑制目标生物体(例如，它必须抑制真菌生长如果目标是真菌，必须抑制假单胞菌生长如果目标生物体是假单胞菌，依此类推。在下面的实施例中，给出了确定抗微生物剂对一组生物体中各成员的抑制效应的代表性测试方法)。为了使抗微生物剂可以长时间地持续产生，选定的抗微生物剂通常应对目标生物体的抑制性高于对分泌抗微生物剂的生物体(有时被称为“宿主生物体”，如果该生物体表达引入的基因)的抑制性。在下面实施例中给出了确定宿主生物体对抗微生物剂的敏感性的代表性测试方法。然而，  在某些情况下，可能不必连续产生抗微生物剂，可能没有其他生物体能够分泌某特定抗微生物剂，或者可能需要在消除或抑制目标物种的几乎同时消除产生抗微生物剂的物种。在这些情况下，可以选择对宿主生物体以及对目标生物体有抑制性的抗微生物剂。

最后，抗微生物剂的选择部分取决于所需的应用。例如，indolicidin和杀细菌素是衍生自牛嗜中性白细胞的抗微生物剂。将它们释放到环境中可能会因此导致产生至少对牛免疫系统的这些天然抗微生物剂有抗性的细菌菌株，并且可能导致产生出对人免疫系统中类似抗微生物剂有更强抗性的菌株。出于该原因，indolicidin和杀细菌素是不宜用于开放系统(即分泌性生物体或被分泌的抗微生物剂通常被释放入环境的系统，例如水管、排水管等)的优选抗微生物剂。另一方面，这些化合物可用于封闭系统，即生物体和分泌的抗微生物剂通常不会被释放入环境的系统。

2.抗腐蚀剂

(a)多肽

已知氨基酸，尤其是甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酸可作为腐蚀抑制剂。参见例如Kalota和Silverman，Corosion 50：2：138-145(1994)(以下简称Kalota和Silverman)及其引用的文献。然而，取决于它们所处的环境，许多氨基酸倾向于具有一个以上的酸-碱常数，具有多个pK值，并且有不同的电荷。Kalota和Silverman发现低分子量的氨基酸能够抑制依赖于pH的腐蚀，而且仅在高pH(pH≥10)时才使腐蚀速率显著下降。

根据Kalota和Silverman，可能需要对细菌进行工程改造以分泌聚天冬氨酸、聚谷氨酸或聚甘氨酸或者由这3种氨基酸构成的多肽，以作为仅在pH约为10或更高的环境中使用的腐蚀抑制剂。尽管这可以用于某些产业用途，但是涉及如此高pH的场合数目可能有限。

我们自己的研究与Kalota和Silverman相反。我们发现，例如聚天冬氨酸和聚谷氨酸可在低至7的pH下保护金属免受腐蚀。因此，根据我们的数据，如果细菌分泌多肽例如聚天冬氨酸和聚谷氨酸(或它们对应的酸或盐)、聚甘氨酸或这些氨基酸的混合物，通过预计或检测的金属环境pH约为7或更高，那么可抑制腐蚀。因此，它提高了需氧生物膜的对腐蚀的抑制作用，如果生物膜中的生物体在pH约为7或更高时分泌这些多肽。

(b)铁载体

铁载体如parabactin(分离自Paracoccus Denitrificans)和肠杆菌素(分离自大肠杆菌)是较低分子量的螯合剂，它们是由细菌产生和分泌，用于溶解铁离子以便运入其细胞(McCafferty和McArdle，J.Electrochem.Soc.，142：1447-1453(1995))。这些物质已经被测试过并发现能抑制铁的腐蚀(同上)。为了提高生物膜的抗腐蚀效果，可将这些物质的基因置于强组成型启动子的控制之下并且以高于正常的水平进行表达，或者被插入通常不表达它们的细菌中。

3.抗微生物剂、抗腐蚀剂或两者的组合

构思之中的是用于本发明的细菌可被设计成分泌一种以上的抗微生物剂。例如，在实施例中报道的一个研究涉及使用一种芽孢杆菌，它因突变而超表达短杆菌肽S并且它还经遗传改造以产生另一种抗微生物剂。使用分泌两种或多种抗微生物剂的细菌可能是有利的，因为它使造成腐蚀的目标菌(SRB或真菌)更难以产生抗性。

因此，分泌抗微生物剂的细菌可以经工程改造使其也产生抗腐蚀剂(例如聚天冬氨酸，聚谷氨酸、由这两种肽构成的多肽、或parabactin、肠杆菌素或其他铁载体)，从而提高其抑制腐蚀的能力。事实上，对细菌进行工程改造以产生抗微生物剂和抗腐蚀剂数目的限制，可能是抗微生物剂对宿主细胞的毒性作用以及代谢排放对产生分泌物的宿主细胞的毒性作用。因为不同生物体有不同的代谢效率，而且因为环境中的可利用养分可能发挥作用，因此对选定细菌能够分泌多少种物质的确定通常是通过实验确定。这种确定可方便地进行，即在含所需使用场合中预计会有的养分的培养基中，通过用所需的抗微生物剂和抗腐蚀剂系列地转化细菌，直至达到目标细菌被完全抑制的时候，然后选择(1)宿主细胞相对生物膜的天然菌群的竞争能力和(2)宿主细胞分泌所需数目抑菌物质的能力之间的最佳组合。

C.确定适用于所需应用场合的生物体

1.选择所需应用环境之外的细菌

通常，应根据所需应用的环境选择分泌抗SRB、真菌、或其他目标微生物的抗微生物剂的生物体。我们的发现表明，需氧细菌可保护表面免受腐蚀和降解，因此，选定的生物体应是需氧的。此外，生物体必须能够在所需应用环境中生存。例如，如果目的是保护锚定在海水中或海上的桥梁的钢材和混凝土，那么应选择能够在海水或盐喷洒下生长的生物体。相反，如果本发明是用于保护输送含工业废物的淡水的管道，那么生物体就应能在淡水中并且在存在有预期的排放物下生长。此外，生物体应能够在所需环境的预计温度和pH条件下生长。因为细菌已经被集中研究了近百年，因此大多数菌种的温度、pH和其他环境要求以及耐受性是已知的并且见于文献。

较佳地，生物体应能够在预计的环境条件下产生防腐蚀的保护作用。我们已发表了一研究结果，其中我们比较了7个属的15种不同细菌在两种不同介质(一种是模拟海水，一种是富含养分的淡水介质)中保护金属的效果。(Jayaraman等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，48：11-17(1997c))(以下简称Jayaraman等人，1997c；该文献全部在此引用作为参考)。对于某些细菌而言，在两种不同介质中对腐蚀的抑制程度明显不同，而10种测试的生物体在两种介质中都很良好地保护金属(同上，在397)。按照该研究测试，本领域技术人员能轻易地确定，任何用于本发明方法或作为本发明系统一部分的细菌品种是否能够在所需环境中存在的介质中生长，以及该生物体是否能够在这些条件下保护金属免受腐蚀。

此外，如果生物体能够在生物膜中生长，则是优选的。通常，存在有能够“粘附(sliming)”的生物体。代表性的菌属是芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷菌属、埃希氏杆菌属(尽管假单胞菌属的不应选用于例如航空燃料箱之类的那些环境，已发现在这些场合这些细菌会造成腐蚀。参见例如“手册”，同上，at 129)。一种确定选定的生物体是否形成生物膜的代表性方法，在Jayaraman等人，1997c(同上)中有所讲授。

2.选择所需应用环境之内的细菌

一种选择适用于早已使用的设备的细菌的优选方法，是让自然界来选择。因为生物膜在自然界普遍存在，因此管、道、水冷却塔、电厂水库和类似设备和设施会早已存在生物膜，这些生物膜由经自然选择能够在这种环境中生长的生物体构成。可取出一份这些生物体的样品(例如，通过刮下生物膜)，用标准技术进行培养，然后鉴别。如果所鉴别的物种原本是合适的(例如，它们可方便地被遗传修饰，并且不知道其对腐蚀是增加而不是抑制)，那么它们自身可以被修饰以分泌所需的抗微生物剂。然而，如果需要，在原位发现的生物体纯培养物也可通过购买或用母菌液生长得到，而不是使用从原位发现的细菌生长出的培养物。

一旦生物体已被修饰以分泌选定的抗微生物剂，那么它们可以被引入管、道、塔或其他设施中。引入设施可以用任何常规手段，例如按一定间隔刮擦表面以提供生物膜中的空隙，然后将一份培养物用吸管滴在刮过的部位。在一种优选方法中，可以简单地让含有高浓度细菌的一份水(即一部分水)通过待保护的材料，从而引入细菌。在水通过的过程中，细菌会粘附于生物膜并成为生物膜整体的一部分，或者在原本没有生物膜时形成生物膜。

D.施用方法

1.在首次将装置投入使用前施用生物体

我们的研究已表明，当预防SRB对表面的定居而不是尝试将早已定居的SRB去除时，可更成功地减少SRB相关的表面降解。因此，一种优选的实施本发明的方法，是在将装备、系统、或设备投入使用之前，用分泌合适抗微生物剂的细菌(例如适合抑制SRB生长的细菌)处理易腐蚀或降解的材料。

如果选定的细菌是形成孢子的，那么可以在导致孢子形成的条件下培养该生物体，在设备被使用之前将孢子施用于干的表面，然后正好在设备投入使用之前使表面润湿以激活孢子。如果细菌不形成孢子，或者如果不方便让可形成孢子的细菌先形成孢子(例如由于时间限制)，那么可以用任何方便的方法将含细菌的介质施用于表面，如将培养物刷、喷、喷雾、点滴、浇、滴于表面。

如果表面是不规则的，或者具有凹角或裂缝，那么喷洒或喷雾表面是优选的方法，因为它们能够更佳地对凹角和裂缝进行接种。某些装置，例如室外的喷泉、水冷却塔、加热和冷却系统等，被设计成让水、油或其他液体在系统中循环。先将一大桶水进行接种，然后用该水装满或冲刷该系统，可以方便地使这些装置接种。其他开放的或者本来系统中的液体并不循环的系统(例如管道)，也可用这种方式进行接种。

2.在装置投入使用之后施用生物体

一旦SRB已定居在生物膜中，将SRB去除是困难的。在某些情况下，可能需要将全部或部分设备、装置或设施拆开，然后用例如浓抗微生物剂或“新”蒸汽使全部或部分表面灭菌。在其他情况下，不能被拆开的设备可以用强抗微生物剂或新蒸汽进行冲刷以杀灭生物膜。这样处理过的设备可以用前面的“在使用前处理”章节中所述的相同方式进行接种。

对于不能这样处理，或者生物膜不能被有效除去的装置，可通过如上所述修饰早已存在的生物体以使其分泌所需抗微生物剂，将现有的生物膜有利地加以利用。可将分泌所需物质的细菌重新引入该生物膜。如果需要，可将该生物体简单地引入液体或其他介质，或者刷或喷在表面上。通过在引入新细菌之前刮去或破坏生物膜，从而产生细菌能够定居的空档，可以更成功地引入细菌。

E.本发明的应用

1.封闭系统

在工业、商业和公共设施中，有大量的封闭系统在使用(即通常不将内含物排入环境的系统)。例子包括钢制储罐(通常就地经过压力检测，然后用于长时间储存液体)、水冷却塔(用于发电站以及工厂、办公楼和其他商业大楼的加热和冷却装置)、热交换器(已知会因SRB相关的腐蚀而失效)、以及防火系统。这些系统通常采用金属管道和储存容器。在这些设施中可以使用分泌合适抗微生物剂、或抗腐蚀剂、或两者的需氧细菌，以形成能更好地抑制SRB相关腐蚀的生物膜。然而，用于储存为人类消费品而设计的液体如牛奶和啤酒的容器，以及定期灭菌(如通过与新蒸汽接触)的容器，通常不用本发明进行防腐蚀保护。

航空和其他燃料箱也构成了封闭系统。如前所述，在这些系统中腐蚀可由细菌(假单胞菌)或真菌污染引起。在这种情况下，对诸如沙雷氏菌之类的已修饰过而能分泌抗真菌或抗微生物剂(可抑制目标生物体(如假单胞菌))的细菌，可以被引入以减少这些原因引起的腐蚀。为了持续地保护系统，通常需要使所选定分泌的抗微生物剂，对分泌它的生物体的毒性低于它对真菌、假单胞菌或其他目标生物体的毒性。

2.开放系统

常规地或有规则地将其内含物(经过或不经过处理)排放入环境的系统，被认为是开放系统。这样的系统包括城市污水系统、暴雨排水沟和排放系统，它们通常包括较长时间地或反复地浸没于或暴露于水或其他液体混凝土管道。这些管道会因硫酸氧化菌用硫化氢(由SRB生成)来形成硫酸，而受到SRB相关的腐蚀。因此，在这些以及类似的混凝土管道中用本发明方法抑制SRB，可以减少这些构件的腐蚀。

3.暴露于环境的建筑物

有大量的金属和混凝土建筑物，如桥梁、铁道、公路立交等，它们经常暴露于环境，并且接触或始终与水接触，这使得在表面上形成生物膜。这些建筑物上的SRB相关的腐蚀可用本发明进行抑制。

实施例

用下列实施例阐述本发明。提供这些实施例用于阐述，而不用于限制本发明。

实施例1：生物膜结构和与腐蚀抑制的相关性

该研究的主要目的，是分析保护性生物膜的结构特性并将生物膜构成与腐蚀抑制相关起来。对生物膜的活细胞、死细胞和外多糖进行染色，用共焦扫描激光显微术(CSLM)观察，然后定量以获得深度曲线。研究温度上升和生长培养基盐含量上升两者对生物膜构成以及腐蚀抑制的影响。

材料和方法

菌株、生长培养基和培养条件

一种腐肉细菌的抗卡那霉素的转位子突变株P.fragi ATCC 4973(P.fragiK)(Jayaraman，A.等人，1997a)以及一种抗四环素的肠杆菌-大肠杆菌DH5α(pKMY319)(Jayaraman，A.等人，1997a)，因其能够形成生物膜而被使用(Parolis，L.A.S.等人，Carbohydrate Reserach 216：495-504(1991)；Huang，C.-T等人，Biotechnology and Bioengineering 41：211-220(1993))。两种菌株在23℃或30℃和不摇动条件下，在250毫升锥形烧瓶中与多块SAE1018金属试样一起，在35毫升Luria-Bertani培养基(以下简称“LB”)(Maniatis，T.等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1982))(以下简称Maniatis等人，1982)和Vaatanen九盐溶液(“VNSS”)(Hernandez，G.等人，Corrosion 50：603-608(1994))(以下简称Hernandez等人，1994)中培养，其中培养基中补充有50微克/毫升卡那霉素(Jayaraman，A.等人，1997a)或25微克/毫升四环素(Yen，K.M.Journal of Bacteriology 173：5328-5335(1991))。所有菌株取自-85℃甘油母菌液，并在含合适抗生素的LB琼脂平板上划线。然后挑选单克隆，并用于接种10毫升含合适抗生素的生长培养液中，在30℃和250rpm(Series 25摇床，New Brunswick Scientific，Edison，NJ)下生长过夜。用0.1％接种物(350微升)形成腐蚀实验所需的生物膜。通过缓慢地取出旧培养液并轻轻地沿着锥形烧瓶的壁加入新鲜培养液，补充培养液。

金属试样的制备和质量损失测定

从片材上切下重5.1克，直径25.5毫米且厚1.2毫米的SAE 1018钢试样，用240粒度的抛光纸(Buehler，Lake Bluff，IL)抛光，并按以前报道的方法(Jayaraman等人，1997a)进行制备。通过除以试样的总表面积(11.18平方厘米)而确定观察到的比质量损失(mg/cm²)，将其用作腐蚀程度的指标(Jayaraman等人，1997a)。所有的腐蚀试验重复3次。

共焦扫描激光显微术(CSLM)和测定生物膜厚度

将附着有表面生物膜的金属试样从锥形烧瓶中取出，在0.85％氯化钠中浸润一次以去除松散的上层细胞。在4毫升染色溶液中用“活的/死的”Baclit细菌活力测试试剂盒方案(1.125μl/ml各染色组份，Molecular Probes(Eugene，OR))和Calcofluor(300μg/ml，Sigma(St.Louis，MO)，Stewart等人，1995)同时对细胞和多糖染色30分钟。“活的/死的”活力试剂盒可根据膜完整性来区分活细胞和死细胞；具有完整膜的活细胞被染成绿色，而具有不完整膜的死细胞被染成红色。将染色后的试样转移至配有氪/氩激光器和60×，1.4NA油镜的共焦扫描激光显微镜(MRC 600，Bio-Rad，Hercules，CA)的工作台上。当生物膜被置于倒置式显微镜的工作台时，为了减少对生物膜的损坏，将1.8厘米直径的盖玻片(圆No.1，1.3-1.7厘米厚，Fisher Scientific Co.，Pittsburgh，PA)轻轻地置于试样上(通过毛细管作用固定)，通过位于盖玻片外侧区域中的显微镜圆孔(直径2.0厘米)固定试样(直径2.55厘米)。生物膜的中央区域不受试样重量的压迫，而且仅该区域被观察。

样本在488纳米受激，用K1/K2组合滤波块(filter block combination)对荧光进行成像。用具有T1/E2多用途组合滤波器的MRC1024共焦显微镜(Bio-Rad，Hercules，CA)分析生物膜。对代表性的部位(选定的同一试样上生物膜中4个相似部位之一)，收集沿全部生物膜厚度0.5-1.0微米的薄光学切片(水平切片)。通过对生物膜的顶部和底部聚焦，并对穿越的距离进行折射率校正(Bakke，R.和Olsson，P.Q.，Journal of Microbiological Methods 6：93-98(1986))，从而找出生物膜的厚度，测定的厚度是同一试样上所分析的4个相似位置的平均值。

图像分析

所有生物膜的图像处理和分析用Bio-Rad MRC600上的COMOS软件进行。光学切片根据像素强度加以辨识以区别活的和死的细胞、多糖和空隙。然后测量被一定范围的像素强度所覆盖的各切片区域的百分比，以获得各切片中组份的相对比例；将各组份的相对比例，作为归一化深度(获得图像的深度除以总的生物膜厚度)的函数进行作图。因此，位置0.0表示生物膜-液体界面，而位置1.0表示生物膜-金属界面。

结果

用P.fragi和大肠杆菌抑制腐蚀

在含P.fragi K或大肠杆菌DH5α(pKMY319)的LB培养液和VNSS培养液中的质量损失，在23℃和30℃的静止批量培养中测试8天，在这些培养中生长培养液或者每天补充，或者在8天不更换。在8天后，与浸入无菌培养液中的试样相比，浸入细菌悬浮液的金属试样表现出的质量损失下降了2.3-6.9倍。这个结果与Jayaraman等人(1997a)以及Pedersen和Hermansson(1989)的结果相比很符合，他们报道，在暴露于VNSS培养液19天后，用假单胞菌S9和灵杆菌可使SIS1146钢的腐蚀下降8倍。我们实验室的早先的工作已表明，SAE1018钢试样的腐蚀情况，在无菌的新鲜LB培养液和用过且过滤的LB培养液中并没有差别(Jayaraman等人，1997a)。

用P.fragi K和大肠杆菌DH5α观察到的8天质量损失，随生长培养液和培养温度而有所变化。在较低温度下，总的质量损失对两种培养液而言较低；然而，腐蚀抑制(作为无菌对照的质量损失的下降百分比)却高于或相当于这两种培养液在较高温度下腐蚀抑制。两种菌株在两个温度下的质量损失，都是LB培养液低于VNSS培养液。每天补充培养液并没有明显影响腐蚀抑制，除了P.fragi K在VNSS培养液(30℃)(腐蚀抑制改善了近2.3倍)之外。不论培养液更换与否，在23℃时大肠杆菌DH5α(pKMY319)导致的质量损失高于P.fragiK，而在30℃时两种菌株的存在所导致的质量损失相当。无论培养液是否每天更换，无菌对照都同样程度地腐蚀。

在大多数细菌悬浮液中金属试样的腐蚀速率，在头4天约为0.03-0.06mg/平方厘米·天。在4天后，腐蚀速率下降。在两个温度下，无菌对照在VNSS培养液中的腐蚀速率都稍高于在LB培养液中，而且腐蚀速率在整个8天期间较为一致。

用CSLM测定生物膜厚度

在2、3、4和8天后，从培养液中取出多个试样，对细胞和多糖同时染色，然后用CSLM分析。在100倍放大倍数(无盖玻片)和600倍放大倍数(有盖玻片)下观察的生物膜，表现出相似的活细胞和死细胞和多糖的深度曲线。

在暴露于生长培养液的前48小时内，P.fragi K和大肠杆菌DH5α(pKMY319)生物膜都发展至可检测厚度(约10-15微米)(数据未示出)。在不同的生长温度、培养液和培养液更换情况下，P.fragi K生物膜的厚度没有明显变化，生物膜在4天后约为14微米厚；生物膜在暴露8天后约为12微米厚。大肠杆菌DH5α(pKMY319)表现出类似的倾向，4天时的生物膜(13微米)稍厚于8天时的生物膜(约11微米)。

生物膜的特性研究

在23℃和30℃，LB和VNSS培养液，更换或不更换培养液情况下的P.fragi K和大肠杆菌DH5α(pKMY319)生物膜，用图像分析进行特性研究和分析，以产生4天的归一化深度曲线。

作为证实“活的/死的”染色能够用于定量含活细胞和死细胞的群体的对照试验，将200微克/毫升卡那霉素加至12小时野生型P.fragi培养物中，在48小时后用CSLM观察。样本主要为红色(约75％)，并有少量绿色和黄色细胞。然后将生物膜样品划线于LB琼脂平板上，沿主划线观察最低程度的生长(不接触抗生素的细胞会沿主划线生长成菌苔)。因此，染色可用于鉴定和定量死细胞。

用共焦显微镜获得P.fragi K和大肠杆菌DH5α(pKMY319)生物膜深度上每1.0微米的水平切片，然后测定活细胞、死细胞、外多糖(EPS)和空隙的分布情况。P.fragi K和大肠杆菌DH5α(pKMY319)生物膜由靠近金属表面的均匀的多糖(只要存在)和细胞层构成。细胞(活细胞和死细胞)与非细胞物质(多糖和水通道)的比例随所有生物膜的深度而变化。两种菌株的生物膜都表现出金字塔型结构，密度大的细胞靠近生物膜的底部(生物膜-金属界面)而稀疏分布的细胞靠近生物膜-液体界面。这与Lawrence等人，J.Bacteriol.173：6558-6567(1991)的报道相符，他报道了在复合和基本培养液中连续培养时，在玻璃载玻片上发展出的P.fluorescens和P.aeruginosa生物膜具有类似的金字塔型结构。在本文报道的工作中，生物膜的上层主要由活细胞构成，而在靠近金属表面处活细胞密度下降。多糖(当存在时)通常在靠近生物膜底部检测到(通常距金属表面3微米之内)。由活细胞和死细胞松散相连构成的厚菌丛(15-40微米厚)位于生物膜的上方(在生物膜-液体界面)，它在测定生物膜厚度时不被考虑在内。在暴露于生长培养液8天后，大肠杆菌DH5α(pKMY319)生物膜还具有覆盖金属试样的薄粘液层，该粘液层在染色过程中无法保留在金属试样上方。

测定了P.fragi K在LB和VNSS培养液(30℃)中的4天深度曲线。在LB培养液中生长的P.fragi K和大肠杆菌DH5α生物膜中，可检测到比在VNSS培养液(30℃)生长时更多的细胞。此外，在LB培养液中，P.fragi在更高温度下可形成更多细胞团，因为在23℃时50％生物膜由活细胞和死细胞构成，而在30℃生长的生物膜有90％活细胞和死细胞。在VNSS培养液中发展的生物膜中，多糖占生物膜的近10-55％，而在LB培养液中，检测到的EPS少于5％。

通过每天替换培养液，生物膜诸组份的相对比例会显著变化；典型地，在所有条件下生物膜中可检测到更多活细胞。生物膜结构也随着每天添加新鲜培养液而变化，在生物膜的所有深度上可观察到几乎等比例的细胞，而不是形成金字塔型结构。细胞物质与非细胞物质之比，在大多数条件下在整个生物膜中保持相对恒定，而多糖仅在VNSS培养液中观察到。多糖(只要存在)产生的程度随着更换培养液而变得更多。在生物膜的上层中观察到更少的菌丛，而且在朝向生物膜底部的方向上活细胞比例也不明显下降。

结论

对生物膜的CSLM成像分析，以及活细胞、死细胞、EPS和空隙的相对比例的定量分析揭示，最大的细胞(活的和死的)密度在暴露4天后达到，在4天之后下降。因此，选择在LB培养液和VNSS培养液中的金属试样上生长的P.fragi K和大肠杆菌DH5α(pKMY319)的4天批量培养生物膜，用于进一步的特性研究以及与每天更换培养液时生长的4天生物膜作比较。

生物膜的组成取决于生长培养液、培养温度和培养液的更换。在LB培养液中4天后生物膜的发展情况表现出细胞数目的下降，这提示多糖基质的缺乏导致细胞的解离。在VNSS培养液中，细胞被包埋在多糖基质中，并且在暴露8天后表现出更不易与金属表面解离的倾向(未示出)。这与Dewanti和Wong，Int′l.J.Food Microbiol.，26：147-164(1995)的观察结果相符，他们观察到在胰蛋白酶大豆肉汤和基本培养液中生长的大肠杆菌O157：H7有类似的生物膜结构。此外，在不同培养液和温度中形成的生物膜，生物膜细菌的生理学和细胞形态不同。在LB培养液中形成的P.fragi和大肠杆菌生物膜是小而独特的细胞；与之相反，在VNSS培养液中的生物膜是长形和成蔟的，这可能是对环境应力的反应。

每天更换生长培养液，会导致生物膜深度范围内细胞含量的轻微下降，并且观察到较少的菌丛。连续地供给养分可能增加了代谢活跃细胞对细胞膜的附着，导致在生物膜的上方增加细胞以替换失去的细胞，这与Costerton(1995)的观察结果是一致的。在生物膜-液体界面处缺乏菌丛可以被解释为，每天添加新鲜生长培养液和染色程序对生物膜结构有最小的干扰。

生物膜的特性(通过CSLM分辨)，与腐蚀结果相比较表明，生物膜中总细胞数的增加可增加对腐蚀的抑制。将温度从23℃提高到30℃，导致了无菌对照的腐蚀增加了100％，而对于8种研究条件(2种细菌、2种培养基、和2种温度)中的6种，细胞团增加了1.6-4.1倍(按生物膜整个深度曲线上平均总活细胞和死细胞计算)。与细胞团和温度的增加相对应，在8种生物膜条件中的6种，腐蚀仅增加了22％(对于大肠杆菌DH5α在每天更换的VNSS培养液中，腐蚀增加了100％；P.fragi K在不更换的VNSS培养液中，腐蚀增加了230％)。因此总体上说，温度上升导致细胞团上升，而受生物膜保护的试样所发生的腐蚀增加远小于无菌培养液中所观察的腐蚀增加(22％对100％)。

我们实验室早先对7种很不相同的细菌属(形成生物膜的程度的不同)的腐蚀抑制作用的观察工作证实，均质生物膜是必要的(Jayaraman等人，1997b)：暴露于链霉菌属(形成细胞分布在菌丛中的松散生物膜)的菌悬浮液的金属试样，其腐蚀速率与无菌对照相当。因为在该研究中用P.fragi在4天后的腐蚀速率于类似无菌对照中的腐蚀速率，在23℃和30℃以及对于LB培养液和VNSS培养液是相当的，然而即使在4种条件下生物膜的厚度、组成和特性很不相同，但是生物膜仍能提供相似的腐蚀抑制作用。因此，对于腐蚀抑制似乎需要某一最小生物膜厚度或密度。类似的结果也发生于大肠杆菌在VNSS培养液(30℃)时。

当生长培养液每天更换时，有趣的是注意到，仅在30℃的VNSS培养液中观察到显著的腐蚀抑制方面的差异。除了生物膜厚度的增加或减少之外，更换培养液时观察到的一个主要差异是，细胞在整个生物膜中分布的均一性上升并且活细胞的相对比例上升。这种均一的细胞层会减少金属表面上用于腐蚀过程的氧气量，从而抑制腐蚀。与其他条件下不更换培养液时相比，腐蚀抑制没有明显变化也提示，对于由极少数目的呼吸活跃细胞快速形成的均一生物膜的特定细菌，其腐蚀抑制存在上限。

实施例2：生物膜可抑制铜和铝的腐蚀

该实施例表明了，生物膜可抑制铜和铝的腐蚀。

铜对微生物的毒性导致人们相信，铜的由微生物引起的腐蚀(MIC)是不重要的(Iverson，1987)。然而，微生物所产生的氨以及硫杆菌(Thiobacillus)和硫酸盐还原菌(SRB)所产生的硫酸，可导致铜合金的腐蚀(Iverson，1987；Wagner和Little，1993)。Wagner和Little观察到，铜面上存在生物膜会产生有差异的需氧细胞和氯化物梯度，这会形成点腐蚀(Wagner和Little，1993)。铜合金的腐蚀在热交换器管道、船舶的海水管道以及飞机燃料箱中造成问题(Iverson，1987；Miller，1981)。Iverson还提及，铜在淡水和海水中的腐蚀可通过加入细菌而被抑制，以及在细菌死亡后腐蚀增加(Iverson，1987)。

在所形成的氧化物钝性膜，增强了铝的抗腐蚀性(Iverson，1987；Wagner和Little，1993)。假单胞菌和分支孢子菌通常是与铝及其合金的微生物引发型腐蚀相关的(Iverson，1987)。由绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)产生的腐蚀性有机化合物，可从铝和合金中去除锌和镁并造成腐蚀。已有报道，3种SRB菌可造成铝的点腐蚀，而且与无菌对照相比重量损失增加了100倍(Iverson，1987)。

材料和方法

菌株和生长培养基

P.fragi K是一种抗卡那霉素的P.fragi衍生株(Jayaraman，A.等人，1997a)，短芽孢杆菌(B.brevis)18是一种超量产生短杆菌肽S的菌株(Azuma，T.等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.38：173-178(1992))(以下简称，Azuma等人，1992)。按以前Jayaraman等人所述的系统(Jayaraman，A.等人，1997c)，用改良的Baar氏培养液在连续反应器中形成金属表面上的生物膜，因为这种培养液支持需氧细菌和SRB的生长。

样品制备

从板材上切下非合金化的铜以及铝合金2024板(7.5厘米×7.5厘米见方，1.2厘米厚)，用240粒度的抛光纸(Buehler，Lake Bluff，IL)抛光，并按以前描述的方法(Jayaraman等人，1997c)进行储藏。

用EIS测量持续腐蚀速率

用Solarton-Schlumberger电化学测量仪(SI1280，Schlumberger TechnicalInstruments Division，San Jose，CA)测得阻抗数据(至少2次实验)，该仪器连接于Macintosh计算机(PowerMac 7100/80，Apple Computer，Cupertino，CA)，运行EISIS电化学实验软件(University of California，Irvine)(类似软件，THALESImpedance Measurement and Equivalent Circuit Synthesis/Simulation/FittingSoftware，可从Bioanalytical Systems，Inc.，West Lafayette，IN购得)(以下简称THALES软件)。反应器结构和操作条件早已被描述过(Borenstein，1994，同上)。

结果和论述

铜和铝的所有试验中的极化阻抗R_p、电容C和腐蚀电位E_corr总结于表1。非合金化的铜在改良的Baar氏培养液(30℃)时的腐蚀，用连续反应器加以研究并测得阻抗谱。无菌反应器(5次独立试验)在暴露10天后的最大相角约为56度。在相同的期间，在铜上生长的P.fragi K生物膜(5次独立试验)使得阻抗在测量的最低频率(1.4×10^-3赫兹)处增加了21倍，这表明了腐蚀的下降。这种腐蚀下降还得到了相角增加的证实(56度vs.71度)。对于在铜上形成的短芽孢杆菌18生物膜，也观察到了类似的阻抗谱(2次独立试验)。

用无菌的改良Baar氏培养液和铝合金2024在连续反应器中获得的阻抗谱(2次独立试验)，表明在暴露10天后在低频处的最大相角为71度。当在铝合金上在6天形成P.fragi K生物膜时(5次独立试验)，最大相角变为78度，而且还观察到R_p增加了8倍。与用非合金化的铜所观察到的情况一样，在类似条件下，短芽孢杆菌18生物膜(3次独立试验)也能够使铝2024的R_p增加5倍且使相角增加7度。

观察到的R_p的增加以及阻抗谱的变化，与Jayaraman等人(1997c)的观察结果相似。他们报道，与无菌对照相比，无共生的P.fragi K生物膜使SAE 1018软钢的相角增加了35度，使R_p下降了40倍。

表1非合金化的铜以及铝合金2024在改良Baar氏培养液中(30℃)时的极化阻抗R_p、电容C和腐蚀电位E_corr。数据来自代表性的试验(最少2次独立试验)。

实验	Rp(Ω·cm2)	C(F/cm2)	Ecorr(mV vs.Ag/AgCl)	试样
					无菌	注1	注1	-171	铜
P.fragi K	注2	注2	-118	铜
					短芽孢杆菌18	9.66×105	1.65×10-3	-177	铜
无菌	3.04×104	1.78×10-5	-670	铝2024
					P.fragi K	1.32×105	4.05×10-5	-520	铝2024
短芽孢杆菌18	2.13×105	1.69×10-5	-512	铝2024

注1：无法根据可利用的电路模型估算参数

注2：阻抗揭示存在点腐蚀(C＝8.1×10^-5F/cm²，R_p＝2.97×10^-5Ω·cm²，R_pit/F＝3.52×10³Ω)

实施例3：肽抗微生物剂抑制SRB的生长

该实施例表明，肽抗微生物剂可抑制SRB的生长。

肽抗微生物剂是小的(Marahiel M.等人，Mol.Microbiol.7：631-636(1993)；Nakano M.M.和Zuber，P.，Cirt.Rev.Biotechnol.10：223-240(1990))，可以方便地被克隆入形成生物膜的需氧细菌中，并且可以通过蛋白质工程进行优化(PiersK.K.等人，Gene 134：7-13(1993))(以下简称Piers，1993)；因此它们是将SRB排除出生物膜的有吸引力的候选物质。

Saleh等人(1964)和Postgate(Postgate J.R.＂硫酸盐还原菌＂，CambridgeUniversity Press，New York(1984))(以下简称Postgate，1984)汇编了对各种SRB有抑制作用的抗微生物剂，其中包括肽-多粘菌素B(它在100微克/毫升时抑制D.vulgaris)。本研究描述了代表性的SRB D.vulgaris和D.gigas在悬浮培养中受到下列肽抗微生物剂的抑制：短杆菌肽S(来自短芽孢杆菌的10个氨基酸的环肽(Azuma等人，1992))、短杆菌肽D(短芽孢杆菌产生的15个氨基酸的线性肽(van Dohren H.，Peptides，In L.C.Vining和C.Stuttard(编)，Genetics andBiochemistry of Antibiotic Production.Butterworth-Heinemann，Boston(1995)))、酰胺化和非酰胺化的indolicidin(牛嗜中性白细胞产生的13个氨基酸的线性肽(Falla T.J.等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271：19298-19303(1996)(以下简称Falla等人，1996)；Selsted M.E.等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267：4292-4295(1992)(以下简称Selsted等人，1992)))、杀细菌素(牛嗜中性白细胞产生的12个氨基酸的环肽(Romeo D.等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)263：9573-9575)(1988)(以下简称Romeo等人，1988))和多粘菌素B(多粘芽孢杆菌产生的10个氨基酸的有分支的环十肽(Fujita-Ichikawa Y.和K.Tochikubo，Microbiol.Immunol.37：935-941)(1993))。

材料和方法

菌株和生长培养基

D.vulgaris(ATCC 29579)和D.gigas(ATCC 19364)是从美国典型培养物保藏中心获得，在15毫升带螺旋帽的试管中，于补充有100微升各种除氧剂4％硫化钠和Oxyrase(Oxyrase Inc.，Mansfeld，OH)的10毫升改良的Baar氏培养液(ATCC培养液1249)中培养。最初的培养物是用-85℃甘油母菌液生长；所有随后的培养物用3％最初培养物(不摇动地维持在30℃)的接种物进行生长。两种SRB在牢固密封的带螺旋帽的试管常规培养，并暴露于层流罩中的氧气(它不会抑制培养，如以前Angell，P.和White，D.C.，J.Ind.Microb.15：329-332(1995)所报道的那样)。SRB还定期地在0.1％硫酸亚铁铵存在下培养，然后这些硫酸盐还原菌的存在通过检测培养试管中黑色硫化铁得以证实。在每次MPN分析后还进行脱硫绿毛霉素(desulfoviridin)分析，以便因染料生色团脱硫绿毛霉素的释放而在紫外线下呈红色来证实D.vulgaris或D.gigas的存在。

抗微生物肽

indolicidin(酰胺化和游离酸形式)由UC Irvine的Michael E.Selsted教授友情提供，而游离酸形式由Genosys Biotechnologies Inc.(The Woodlands，TX)合成，纯度为76。短杆菌肽S(纯度96.5％)和短杆菌肽D(纯度100％)，以及多粘菌素B(纯度100％)购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。杀细菌素由Genosys Biotechnologies Inc.(The Woodlands，TX)合成(纯度为32％)并在二硫苏糖醇(DTT)存在下(＜0.1％)运输。合成的indolicidin(酸形式)的分子量(1907道尔顿)和杀细菌素分子量(1486道尔顿)，用MALDI-飞行时间(TOF)质谱仪(VoyagerDE 5-2386-00，Perseptive Biosystems，MA)确证。

用Vydac C18柱(Vydac，Hesperia，CA)，通过反向HPLC(Varian Vista 5000series，Sugar Land，TX)将残留的DTT从杀细菌素中去除(并且有利于在残基3和11形成二硫键)。用乙腈/0.1％三氟乙酸(TFA)在水中(20∶80)的移动相来洗脱DTT，然后步进地换成(step-change)50∶50的乙腈/0.1％三氟乙酸在水中的系统以便洗脱杀细菌素。该组份被认为不含DTT并用于抗微生物分析。

SRB抑制分析

为了测定SRB的活力指数(Romeo等人，1988)，将后指数期的培养物(O.D.₆₀₀为0.16-0.19，它对应的最初细胞数目为5-9×10⁴细胞/毫升)，暴露于30℃的各种浓度的抗微生物剂1小时。收获1毫升细胞，在新鲜的改良Baar氏培养液中洗涤一次以去除细胞碎片，然后重悬浮于1毫升新鲜的改良Baar氏培养液(补充有10微升各Oxyrase(Oxyrase Inc.，Mansfeld，OH)和4％硫化钠)中。将450微升的样品等份置于500微升无菌的Eppendorf管中，加入适量的抗微生物剂，并在30℃温育。处理的有效性通过多试管的最近似值(MPN)发酵技术加以确定(无名氏，Multiple-tube fermentation technique for members ofcoliform group，pp.9-45至9-51，In A.E.Greenberg，L.S.Clesceri，和A.D.Eaton(编)，Stantard Methods for the Examination of Water and Wasterwater，18版，American Public Health Association，American Water Works Association，和Water Pollution Control Federation，New York(1992))(以下简称Greenberg，1992)。

对SRB进行计数的MPN测试是在3个有1000微升SRB接种物的12毫升试管、3个有500微升接种物的12毫升试管、3个有100微升接种物的12毫升试管中进行的。所有的9个试管都含有终体积为10毫升改良的Baar氏培养液(补充有100微升各Oxyrase(Oxyrase Inc.，Mansfeld，OH)和4％硫化钠)。监测试管72小时，以确定生长呈阳性的试管数目。通过培养液浊度的增加来确定生长情况，MPN指数/毫升是用Thomas公式(Greenberg 1992)计算出。

结果和论述

将D.vulgaris和D.gigas在各种不同的抗微生物肽存在下进行孵育，然后测定其在暴露1小时后的活力。氨苄青霉素被用作D.vulgaris的阳性对照，因为发现氨苄青霉素和氯霉素可在20微克/毫升下抑制该菌株，这与早先的报道相符(Odom和Singleton，The Sulfate-reducing bacteria：contemporary perspectives，Springer Verlag，New York(1993)(以下简称，Odom和Singleton，1993))。然而，氨苄青霉素和氯霉素都不能在100微克/毫升的剂量下有效抑制D.gigas。两种SRB对数种其他抗生素(卡那霉素、四环素、藓霉素、青霉素G和萘啶酮酸)、无机物(钼酸铵、钼酸钠和蒽醌)和肽(乳链球菌肽和多粘菌素B)的敏感性，也用SRB的静止相培养物进行评估。D.gigas受100微克/毫升蒽醌的抑制(Cooling等人，1996)，而且两种SRB都受到100微克/毫升钼酸钠的抑制。这与Saleh等人(1964)的观察结果相似，他调查了近200种化合物对SRB的抑制活性，并且注意到SRB对抑制性化合物有高度的抗性(同上)。

用MPN分析来确定D.gigas和D.vulgaris对肽抗微生物剂的活力指数。对于D.gigas，短杆菌肽S和酰胺化的indolicidin(Ind-NH₂)(它是牛嗜中性白细胞中天然存在的形式(Falla等人，1996；Selsted等人，1992)，两者都能在25微克/毫升暴露1小时后，使后指数期培养物的活力降低92-96％。对于D.vulgaris，25微克/毫升Ind-NH₂可稍更有效地抑制生长(活力下降99.3％)，而短杆菌肽S的效力较低，在100微克/毫升时使活力下降93％。25微克/毫升时，酸形式的indolicidin(Ind-OH)比酰胺化的indolicidin对D.gigas的效力低10倍，比D.vulgaris的效力低174倍。这并不意外，因为翻译后的酰胺化被认为可提高indolicidin的效力(Falla等人，1996)。肽抗微生物剂短杆菌肽D、多粘菌素B和杀细菌素(Postgate，1984)也能在100微克/毫升时使D.vulgaris和D.gigas活力下降约90％。这些MPN分析结果还得到了类似结果的证实，即将D.vulgaris暴露于短杆菌肽S、短杆菌肽D、indolicidin和杀细菌素1小时，接种于Desulfovibrio琼脂平板(ATCC培养基42)，然后在厌氧的GasPak室(FisherScientific Co.，Pittsburgh，PA)中孵育时得到的结果。

这些结果表明，肽抗微生物剂(如短杆菌肽S、indolicidin、多粘菌素B和杀细菌素)可用于抑制SRB生长并且减少微生物造成的钢材腐蚀。5-25微克/毫升的indolicidin能够抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌99.9％(Romeo等人，1988；Selsted等人，1992)；但是在该研究中，D.gigas和D.vulgaris表现出对indolicidin的更强抗性。100微克/毫升的杀细菌素可抑制大肠杆菌95％(Romeo等人，1988)，并且在该研究表现出对D.gigas和D.vulgaris有相当的抑制性(90％)。3-12.5微克/毫升的短杆菌肽S已表明可完全抑制革兰氏阴性菌的生长(Kondejewski L.等人，Int.J.Peptide Protein Res.47：460-466(1996))，而且在该研究中50-100微克/毫升对两种革兰氏阴性SRB菌都表现出抑制作用。根据它们在悬浮培养中对SRB的活性，所有在该研究中测试的抗微生物肽在可比浓度下，效力都高于市售的抗生素(如卡那霉素、萘啶酮酸、四环素)以及无机物(如钼酸钠和蒽醌)。

实施例4：用分泌克隆的抗微生物剂的细菌将SRB从生物膜中除去

该实施例说明了抗微生物的化学物质在细菌中的克隆和表达，以及它们可用于将SRB从不锈钢上的生物膜中除去。

已经从数种细菌(Hancock，R.E.W.等人，Adv.Microb.Physiol.37：135-175(1995))、植物(Hancock，R.W.等人，Cationic peptides：a class of antibiotics ableto access the self promoted uptake pathway across the Pseudomonas aeruginosaouter membrane，p.441-450，In T.Nakazawa(编)Molecular Biology of thePseudomonads，ASM press，Washington D.C.(1996))(以下简称，Hancock等人，1996)、昆虫(Boman，H.G.等人，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)20：23-31(1991))、和哺乳动物(Frank，R.W.等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)265(31)：18871-18874(1990)；Lehrer，R.I.等人，Annu.Rev.Immunol.11：105-128(1993)；Zasloff，M.美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)84：5449-5453(1987)(以下简称Zasloff，1987))中鉴别和分离出抗微生物肽。这些肽被广泛地分成爪蟾抗菌肽(Zasloff，1987)、防卫素(Cullor，J.S.等人，Arch.Opthalmol.108：861-864(1990)(以下简称Cullor等人，1990))、杀菌肽(Calloway，J.W.等人，Antimicrob.Agents Chemother.37：1614-1619(1993)(以下简称Calloway等人，1993))、蜂毒肽(Piers，K.L.等人，Mol.Microbiol.12(6)：951-958(1994)(以下简称Piers等人，1994))，并且已表明它们对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及酵母和真菌有抗微生物活性(Hancock等人，1996)。大多数阳离子型肽有多个赖氨酸和精氨酸残基以及亲水和疏水面(Hancock等人，1996)，它们通过提高细菌细胞膜的通透性或抑制DNA合成而杀灭微生物(Hancock等人，1996；Romeo等人，1988)。

indolicidin(Cullor等人，1990；Del Sal，G.等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.187(1)：467-472(1992))和杀细菌素(Frank，R.W.等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)265(31)：18871-18874(1990)；Romeo等人，1988)是从牛嗜中性白细胞分离出的阳离子型抗微生物剂剂(Lehrer，R.I.等人，Annu.Rev.Immunol.11：105-128(1993))。indolicidin是一种十三肽，它属于防卫素家族(Selsted等人，1992)并且由6种不同氨基酸构成，在所有已知蛋白质中具有最高比例的色氨酸(39％)(Falla等人，1996)。indolicidin还是已知最小的线性抗微生物肽，在天然存在形式中其羧基端是酰胺化的(Falla等人，1996；Selsted等人，1992)。杀细菌素是一种富含精氨酸的环状十二肽，它含有维持环状结构的二硫键(Romeo等人，1988)。

对于在原核和真核表达系统中产生抗微生物肽以用于商业用途方面，所作的尝试较少。Piers等人(Piers等人，1993和Piers等人，1994)已描述了用金黄色葡萄球菌表达系统，在细菌中合成和纯化人嗜中性白细胞肽1(HNP-1)和杀菌肽(cecropin)/蜂毒肽杂合肽的程序。这些肽以融合于蛋白A的形式合成，分泌入培养液，然后用亲和色谱法纯化(Piers等人，1993)。Calloway(Calloway等人，1993)尝试在大肠杆菌中表达杀菌肽A，并且得出结论：羧基端的翻译后修饰是对于高抗微生物活性而言是必需的。Hara和Yamakawa(Hara，S.和M.Yamakawa，Biochem.Biophys.Res.Commun.224(3)877-878(1996))已在大肠杆菌中产生了肽moricin(作为融合于麦芽糖结合蛋白的融合蛋白)，并发现其活性与天然蛋白相当。Haught等人(Biotechnol.Bioeng.57：55-61(1998))已报道了，通过融合于牛前凝乳酶，在大肠杆菌中以包含体形式产生重组的反义抗微生物剂P2；并表达了高水平的蛋白(占全部细胞蛋白的近16％)。Pang等人(《基因》(Gene)，116：165-172(1992))(以下简称Pang等人，1992)已尝试在细菌、酵母和烟草植物中表达和分泌蝎子的昆虫毒素I₅A(没有检测到可测的活性)。所有这些方法都针对大规模且价廉地生产纯化的抗微生物肽而不是活体内(in vivo)应用。

在前面的实施例中，我们显示了纯化的抗微生物肽indolicidin、非酰胺化的indolicidin和杀细菌素可抑制悬浮培养中的厌氧SRB。该实施例表明，在需氧生物膜形成菌中产生抗微生物肽，能够将SRB从生物膜中排除掉并且可抑制SRB所引起的金属腐蚀。具体地，该实施例显示了在革兰氏阳性菌Bacillus中表达阳离子型抗微生物肽indolicidin和杀细菌素，以及它们在将SRB从304不锈钢上生物膜中去除方面的用途。indolicidin和杀细菌素已经以融合于碱性蛋白酶(apr)信号肽的形式被克隆，然后用apr启动子组成型地表达。芽孢杆菌RNA酶(一种来自B.amyloliquefaciens的胞外RNA酶)的pro区域已经被用于在Bacillus中产生pre-pro-肽形式的杀细菌素。研究了这些菌株对连续反应器中SAE1018软钢和304不锈钢上SRB生长的抑制能力。

材料和方法

菌株、质粒和生长培养液

大肠杆菌XL1(Blue){recAl endAlgyrA96 thi-l hsdR17 supE44 relAllac[FlproAB lacl^qZDM15 Tn10(Tet^r)]}购自Stratagene(LaJolla，CA)。枯草杆菌BE1500{trpC2，metB10，lys-3，ΔaprE66，Δnpr-82，ΔsacB∷ermC}和质粒pBE92(含碱性蛋白酶(apr)启动子、信号序列和碱性磷酸酶报道基因)，得自E.I.du Pont deNemours Inc.(Wilmington，DE)。蛋白酶缺陷型菌株枯草杆菌WB600株(Wu，X.-C，等人，J.Bacteriol. 173(16)：4952-4958(1991))(以下简称Wu等人，1991){trpC2，ΔnprE，ΔaprA，Δepr，Δbpf，Δmpr，ΔnprB}得自Dr.Sui-LamWong(University of Calgary，Alberta，Canada)。多粘芽孢杆菌得自美国典型培养物保藏中心(ATCC 10401)。D.vulgaris(ATCC菌株29579)被用作该研究中的参照SRB。用枯草杆菌BE1500和P.fragi K(Jayaraman，A.等人，1997a)进行的所有腐蚀试验，都在用于硫酸盐还原菌的改良Baar培养液(ATCC培养基1249)中进行。多粘芽孢杆菌的腐蚀试验，是在补充有1/10体积10×TY培养液(10克胰蛋白胨，5克酵母提取物，100毫升水)的改良Baar培养液中进行。

酶和化学试剂

所有的限制性酶、T4DNA连接酶、和Taq聚合酶得自Promega(Madison，WI)。BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。indolicidin(游离酸形式，纯度76％)和杀细菌素(纯度32％)由GenosysBiotechnologies Inc.(The Woodlands，TX)合成。

质粒构建

按Maniatis(Maniatis，T.等人，1982)和Rodriguez和Tait(Rodriguez，R.L.等人，Recombinant DNA Techniques.An introduction，The Benjamin/CummingsPublishing Company Inc.，Menlo Park，CA(1983))所述，进行重组DNA法的操作。根据Bramucci和Nagarajan(Bramucci，M.G.和V.Nagarajan，应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)62(11)：3948-3953(1996))(以下简称Bramucci，1996)的程序，从Bacillus中分离质粒DNA。非酰胺化indolicidin的氨基酸序列[NH₂-Ile-Leu-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-OH](Selsted等人，1992)和杀细菌素的氨基酸序列[NH₂-Arg-Leu-Cys-Arg-Ile-Val-Val-Ile-Arg-Val-Cys-Arg-OH](Romeo等人，1988)，被用于设计编码这些肽基因的寡核苷酸。质粒pBE92-Ind被设计用于表达非酰胺化的indolicidin，其12个氨基酸的肽融合于apr信号序列；pBE92-Bac被设计用于表达杀细菌素，其13个氨基酸的肽融合于apr信号序列；而pBE92-ProBac被设计用于表达杀细菌素，其融合于B.amyloliquefaciens胞外RNA酶的pro-区域(Paddon，C.J.等人，J.Bacteriol.171(2)：1185-1187(1989))(以下简称Paddon等人，1989)和apr信号序列。

合成的寡核苷酸(图1)是由Gibco-BRL Life Technologies(Long Island，NY)以200nmol规模合成并用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化。合成的寡核苷酸具有侧翼的HindIII和NheI限制性位点，并且在两端都有额外的6个碱基以便有效地进行限制性消化。将每种构建物的两种完全互补的寡核苷酸重悬浮在TE缓冲液(50ng/μl)中，等摩尔地混合，在沸水中孵育3分钟。当冷却至室温时，寡核苷酸在水浴中退火(约2小时)。退火的寡核苷酸用HindIII和NheI消化过夜，在-85℃用乙醇沉淀1小时，然后再悬浮于去离子的蒸馏水中。质粒载体pBE92是从大肠杆菌XL1(Blue)的细胞提取物中，用质粒midi试剂盒(QiagenInc.，Chatsworth，CA)分离出的。用HindIII、NheI和SalI在37℃同时消化DNA14小时。三重消化的载体和抗微生物剂基因插入片段，以28∶1的插入片段∶载体摩尔比，在16℃连接17小时。连接混合物用苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)萃取、乙醇沉淀，然后再悬浮于30微升ddH₂O中。

Pro-杀细菌素的合成是合成两条寡核苷酸链，它具有21个碱基对的互补区域并且在两条链的末端有HindIII和NheI限制性位点。在终止密码子下游还引入一个NotI位点，它用于将一个独特位点引入pBE92。如前所述使两条链退火，在Perkin-Elmer热循环仪N801-0150(Perkin Elmer，Norwalk，CT)上，用Taq聚合酶补平互补区域(一个循环，94℃30秒，55℃30秒，和72℃2小时)。终产物用苯酚/氯仿/异戊醇萃取、在-85℃和1mM硫酸镁存在下用乙醇沉淀1小时，然后再悬浮于50微升ddH₂O中。

转化子通过用BglI(indolicidin)、BssH II(杀细菌素)和NotI(Pro-杀细菌素)限制性消化而加以鉴别，并用改良的Boehringer-Mannhein菌落转移分析法加以证实。将200毫微克质粒DNA(来自带抗微生物剂基因的推定大肠杆菌转化子的小量制备物)点样于带正电荷的尼龙膜上(产品编号No.1209272，Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，按制造商说明书用抗微生物剂基因合成寡核苷酸DNA(用Boehringer Mannheim的随机引发DNA标记方案标记)(图1)进行检测。

大肠杆菌和芽孢杆菌的转化

用Smith和Iglewski的方法(Smith，A.W.等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)17：10509(1989))，使大肠杆菌XL1(Blue)细胞变为电感受态。用基因脉冲仪/脉冲控制仪(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，用10微升连接混合物来使细菌电穿孔(1.2kV/cm，200Ohm，25μF)，然后在含100微克/毫升氨苄青霉素和40微克/毫升BCIP的LB琼脂平板上，用蓝色/白色选择技术，选出含正确插入件(pBE92-indolicidin、pBE92-杀细菌素和pBE92-Pro杀细菌素)的克隆(带正确插入件的转化子产生白色菌落，而重合(reclosed)载体形成蓝色菌落)。

根据Cutting和Vander Horn的两步法(Genetic analysis，p.27-74，In C.R.Harwood和S.Cutting，M.(编)，Molecular biological methods for Bacillus，JohnWiley & Sons，New York(1990))，使枯草杆菌BE1500活化和转化。将后指数期的感受态细胞与质粒DNA(约1微克，分离自大肠杆菌XL1(Blue))一起孵育30分钟。培养物用1毫升10％酵母提取物稀释，在回旋式摇床(New BrunswickScientific，Edison，NJ，25序列摇床)上37℃孵育，之后接种于含25微克/毫升卡那霉素的LB琼脂平板上。多粘芽孢杆菌的感受态细胞是根据Rosado等人(J.Microbiol.Meth.19：1-11(1994))的程序制备的。用Bramucci和Nagarajan的程序(Bramucci，1996)，从枯草杆菌BE1500分离出的约1微克DNA(基于pBE92的构建物)(Nagarajan，V.等人，基因(Gene)114：121-126(1992))，用于使多粘芽孢杆菌电穿孔(6.25kV/cm，200Ohm，25μF)。然后，细胞在37℃摇动孵育细胞3小时，在含150微克/毫升卡那霉素的LB琼脂平板上加以选择。

SDS-PAGE

将含表达抗微生物肽基因、基于质粒pBE92的构建物的枯草杆菌BE1500，在25毫升LB培养液中37℃生长至后指数期(O.D.₆₀₀＝0.70-1.0)。在4℃，10000×g离心10分钟而收集细胞，然后用Speed Vac浓缩器(Model 200H，Savant Instruments Inc.，Holbrook，NY)将上清液浓缩25倍。浓缩后的上清液与2×样品缓冲液(0.125M Tris-碱，0.4％SDS，20％甘油，和0.1毫升1毫克/毫升溴酚蓝，并且对于每100微升2×缓冲液添加5微升2-巯基乙醇)混合，煮沸5分钟，然后在16.5％Tris-Tricine凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA)上电泳。

持续腐蚀试验

用SAE1018软钢试样(直径2.5厘米，厚1.2毫米)进行的批量培养腐蚀试验，如前所述(Jayaraman等人，1997a)在30℃，250毫升锥形烧瓶中不摇动条件下进行三次。还用连续反应器(Jayaraman等人，1997c)在304不锈钢上形成生物膜，并在最少2个独立的反应器中用Solarton-Schlumberger电化学测量仪(SI1280，Schlumberger Technical Instruments Divisio，San Jose，CA)通过电化学阻抗光谱法(EIS)监测腐蚀情况。该测量仪连接于Macintosh计算机(PowerMac 7100/80，Apple Computer，Cupertino，CA)，运行EISIS电化学实验软件(University of California，Irvine)(也可使用类似的商业软件THALES)。测量开路电势(OCP)作为金属试样和Ag/AgCl参考电极之间的电势，测量极化阻抗(R_p)作为低频的阻抗值(阻抗的虚数部分为0或忽略不计)。连续培养的腐蚀速率估算为极化阻抗的反量(Macdonald，D.D.和M.C.H.McCubre，Applications ofimpedance spectroscopy，p.262-267，In J.R.Macdonald(编)，Impedancespectroscopy：Emphasizing solid materials and systems，John Wiley & Sons，NewYork(1987)；Stern，M.，Journal of Electrochemical Society，105(11)：638-647(1958))。

抗微生物性分析

为了测定宿主枯草杆菌BE1500和多粘芽孢杆菌对表达的抗微生物剂的敏感性，让这些菌株从单一菌落在25毫升LB培养液中，于37℃摇动生长至O.D₆₀₀为0.40-0.45。收集1毫升的等份样品，用新鲜LB培养液洗涤，然后重新悬浮于无菌Eppendorf管中的100微升新鲜LB培养液中。加入抗微生物剂indolicidin和杀细菌素(50-100微克/毫升)，将管子在30℃不摇动地孵育1小时。将适当稀释的各份样品铺在LB琼脂平板上，在37℃孵育过夜以确定存活度。这些结果通过2次独立实验而加以证实。

通过将悬浮的大肠杆菌BK6暴露于浓的培养物上清液，确定indolicidin和杀细菌素在芽孢杆菌中的表达(重复2次)。大肠杆菌BK6生长至O.D₆₀₀为0.20-0.25，在室温下离心，然后再悬浮于不同体积(50或100微升)的浓缩上清液中。细胞悬浮液在不通气下30℃孵育1小时，然后将合适的稀释液接种于LB琼脂平板以确定上清液的抗微生物活性。

枯草杆菌构建物上清液抑制悬液中SRB的能力，是通过将500微升后指数期D.vulgaris培养物(O.D₆₀₀＝0.15-0.20)悬浮于等体积的25倍浓缩的枯草杆菌BE1500培养物上清液(抗微生物剂构建物在前面实施例中所述的厌氧条件下)而加以测定。细胞在30℃孵育1小时，存活的SRB用3管最近似值(MPN)分析法(Greenberg，1992)进行计数。

为了用3管最近似值(MPN)法测定生物膜中的活SRB数目，将生物膜在无菌水中淋洗一次以去除松散附着的细胞，从304不锈钢试样(直径2.5厘米，厚1.2毫米)上刮下，再悬浮，然后在如Jayaraman等人所述的厌氧条件下以新鲜的改良的Baar培养液作系列稀释。生物膜中的需氧细菌数目，通过将合适的稀释液接种于LB琼脂平板而加以确定。

结果

表达宿主对抗微生物肽的敏感性

在30℃暴露1小时后，与多粘芽孢杆菌相比，枯草杆菌BE1500和枯草杆菌WB600表现出对纯化的抗微生物肽indolicidin(非酰胺化形式，50和100微克/毫升)的敏感性高数千倍，对纯化的肽杀细菌素(50微克/毫升)的敏感性高数百倍(见表II)。因此，对于表达所测试的抗微生物肽，多粘芽孢杆菌是一种优于其他测试物种的宿主，因为它对非酰胺化indolicidin和杀细菌素有抗性。

表II.在30℃暴露1小时后，宿主菌株对纯化的抗微生物剂的敏感性

                              细胞数目的下降倍数细菌                   indolicidin   indolicidin    杀细菌素

                   50μg/mL      100μg/mL      50μg/mL枯草杆菌BE1500         6000          10,000         100多粘芽孢杆菌10401      4             4              2枯草杆菌WB600          20,000        40,000         400

用大肠杆菌穿梭载体克隆抗微生物肽

用大肠杆菌穿梭载体pBE92构建细菌表达系统，以产生pBE92-Ind、pBE92-Bac和pBE92-ProBac。它们利用了apr启动子和信号序列，从而在芽孢杆菌(Bacillus)中组成型地表达和分泌抗微生物肽。在pBE92中的碱性磷酸酶被含apr信号序列最后3个氨基酸(Ser-Ala-Ser)以及完整抗微生物剂基因的NheI-HindIII插入片段所替换。

检测芽孢杆菌分泌的抗微生物肽

纯化的indolicidin(非酰胺化形式)，当以230ng/孔上样时可用考马斯染色检测到，但是以23ng/孔上样时无法检测。纯化的indolicidin和杀细菌素，以250ng/孔上样时也无法用银染法检测到。用兔产生的针对indolicidin的多克隆抗体(1∶250稀释液，使用枯草杆菌BE1500(pBE92-Ind)培养上清液(浓缩25倍)稀释)进行Western印迹，也不能揭示出对应于indolicidin的条带；然而，抗体对indolicidin是非特异性的并且结合于许多细胞蛋白。杀细菌素的一级氨基酸序列表明，产生多克隆抗体是非常困难的(Dr.Shing-Erh Yen，ZymedLabortories Inc.，个人交流)；因此，没有合成针对该肽的多克隆抗体。

在芽孢杆菌培养上清中的indolicidin和杀细菌素对悬浮培养和生物膜中大肠杆菌和D.vulgaris的抗微生物活性

测定了带有抗微生物质粒的枯草杆菌BE1500的浓缩培养上清杀灭大肠杆菌BK6和D.vulgaris的能力。对于阴性对照实验(其中使用枯草杆菌BE1500(pBE92)和枯草杆菌BE1500(pBE92-Ind)的上清液)没有观察到大肠杆菌BK6和D.vulgaris活力的下降(表III)；然而，用枯草杆菌BE1500(pBE92-Bac)和枯草杆菌BE1500(pBE92-ProBac)的上清液时观察到杀灭了近93％的大肠杆菌BK6和杀灭了83％D.vulgaris。该结果表明，杀细菌素已经被表达、分泌入培养上清中，而且在胞外环境中二硫键被正确地处理从而形成了环状的活性杀细菌素(在该研究中大肠杆菌被用作阳性对照，以显示该肽被表达且具有活性，并且表明SRB的抑制是由于该肽而不是由于暴露于氧气或其他外部因素)。

在304不锈钢暴露于表达克隆的抗微生物剂的枯草杆菌BE1500之后5天，用三管MPN分析法(表IV)计数活SRB的数目。在枯草杆菌BE1500(pBE92-Bac)形成的生物膜中存在的SRB，比枯草杆菌BE1500(pBE92)和枯草杆菌BE1500(pBE92-Ind)所形成的生物膜中少近60倍，而用枯草杆菌BE1500(pBE92-ProBac)时发现SRB少了10倍。表III 大肠杆菌BK6和D.vulgaris对表达抗微生物剂的枯草杆菌BE1500

  浓缩培养上清的敏感性。数据是两次独立实验的平均值

                            E.coli BK6                  D.vulgaris

                         CFU/mL      抑制           MPN/mL       抑制

                                     (％)                        (％)新鲜培养液                   9×10⁷      0             8.29×10⁵    0缓冲液+卡那霉素100μg/mL     4×10³      99.996             -        -枯草杆菌BE1500(pBE92)        8.7×10⁷    3             8.29×10⁵    0枯草杆菌BE1500(pBE92-Ind)    7.9×10⁷    12            8.29×10⁵    0枯草杆菌BE1500(pBE92-Bac)    6×10⁶      93            1.43×10⁵    87枯草杆菌BE1500(pBE92-ProBac) 7×10⁶      92            1.43×10⁵    83表IV 5天后，在304不锈钢上表达抗微生物质粒的枯草杆菌BE1500生物

 膜的需氧生物膜中，对SRB的抑制作用(用MPN法测定)。数据来自

 两次独立实验的生物膜。质粒                 活的SRB       抑制          活的枯草杆菌

                 MPN/mL                      BE1500，CFU/mLpBE92                5.13×10⁵     0            2.3×10⁸pBE92-Indolicidin    3.59×10⁵     30           2.3×10⁸pBE92-杀细菌素       8.64×10³     98           1.9×10⁸pBE92-Pro杀细菌素    5.13×10⁴     90           6.2×10⁸

用产生克隆的抗微生物肽的芽孢杆菌菌株进行批量和连续培养腐蚀研究

研究了产生抗微生物剂的构建物对静态摇瓶中SAE1018软钢上SRB生长的抑制作用。一旦将SRB(O.D₆₀₀＝0.16-0.20)加至不产生抗微生物剂的P.fragi K培养液中，就在18小时内检测到强烈的硫化氢气味。还伴随着形成硫化铁黑色沉淀，这表明SRB在金属表面上的需氧生物膜中生长和定居。与P.fragi K相比，枯草杆菌BE1500能够延缓SRB腐蚀的发生36-48小时(以硫化铁黑色沉淀和硫化氢气味出现的延迟为证)。

与P.fragi K和枯草杆菌BE1500相比，所有3种产生抗微生物剂的构建物在枯草杆菌BE1500中都能延迟SRB腐蚀发生96-120小时。然而，在7天后更新生长培养液会导致所有菌株都在36小时内出现黑色沉淀。

将SRB添加到带P.fragi K的304不锈钢连续反应器中，使得加入SRB后36小时内，在测量的最低频率处(1.4×10^-3Hz)的阻抗值下降了5倍。该下降还伴随着反应器出口处有硫化氢气味，并且反应器因硫化铁的形成而变成灰色。低频相角也下降(c.f.，82度vs.68度)。对于阴性对照枯草杆菌BE1500(数据未给出)和枯草杆菌BE1500(pBE92)(图3)也观察到阻抗谱的类似变化，尽管变化也延迟了24小时。与之相反，3种产生抗微生物剂的构建物能够减少阻抗谱变化的程度(图3)。indolicidin构建物抑制SR表达效力最低，低频相角从80度变为69度；然而它仍小于对照pBE92(从80度至61度)中所观察到的变化。杀细菌素构建物(具有或不具有pro区域)比indolicidin构建物更有效，低频相角仅下降至76度。这些结果表明，SRB在304不锈钢上的生长受到杀细菌素构建物的明显抑制。

用表达克隆的抗微生物剂的枯草杆菌WB600(一种6个胞外蛋白酶有缺陷的菌株)(Wu等人，1991)，也获得了类似结果(图4)。将SRB添加到304不锈钢上的枯草杆菌WB600(pBE92)和枯草杆菌WB600(pBE92-Ind)生物膜上，分别使低频相角下降了35度和17度；相应地，低频阻抗也分别下降了7倍和5.5倍。然而，用两种表达杀细菌素的生物膜没有观察到这种下降，尽管杀细菌素构建物似乎比pro-杀细菌素(原杀细菌素)构建物稍更有效(图4)。这暗示，在该蛋白酶缺陷菌株中没有有效地对pro-区域进行加工以释放成熟的杀细菌素。

用除天然产生的抗微生物剂之外还产生克隆的抗微生物剂的芽孢杆菌菌株，进行批量和连续培养腐蚀研究

在批量和连续培养中，研究了多粘芽孢杆菌ATCC10401(它产生抗微生物肽-多粘菌素)对SRB在软钢上定居的抑制作用。在批量培养中，与不产生抗微生物剂的P.fragi K相比，多粘芽孢杆菌能够延迟SRB腐蚀的发生60小时。更换生长培养液并不导致金属立刻被SRB占据(该现象见于P.fragi K和枯草杆菌BE1500)，并且在72小时内检测不到黑色沉淀。因此，产生多粘菌素的多粘芽孢杆菌能延迟SRB在批量培养中的生长。

在304不锈钢的连续反应器中，添加SRB在近250小时内并不改变阻抗谱(这与P.fragi K在36小时导致阻抗谱变化相对，图5)。在反应器的出口处没有检测到硫化物气味，而且反应器的浊度也不增加，这在P.fragi K、枯草杆菌BE1500和枯草杆菌WB600中也观察到。因此，多粘芽孢杆菌能够在连续反应器中抑制SRB在304不锈钢上的生长。类似的腐蚀抑制作用，用具有抗微生物构建物的多粘芽孢杆菌中也观察到(图5)，而且抑制程度与野生型菌株无法区分。

讨论

按Piers等人，1993和Pang等人(1992)类似的方法，阳离子型抗微生物肽indolicidin和杀细菌素在枯草杆菌BE1500中，以融合于胞外碱性蛋白酶(apr)信号肽的融合形式组成型地表达。indolicidin和杀细菌素的合成寡核苷酸被设计成与信号序列精确融合，从而不会将额外的氨基酸添加到该肽的N端。这保证了表达的肽有最高活性而且避免了Pang等人(1992)观察到的不当加工(Pang等人的表达系统在蝎子昆虫毒素I₅A的N端添加了7个氨基酸)。通过在信号肽和杀细菌素基因之间插入B.amyloliquefaciens的芽孢杆菌RNA酶的pro-部分(Paddon等人，1989)，还产生了pre-pro-肽形式的杀细菌素。类似的pre-pro-防卫素融合物，可导致完全防止分泌的肽在金黄色葡萄球菌中发生蛋白水解降解(Piers等人，1993)并且对于在阴离子的pro-区域和阳离子的肽之间形成二级结构有贡献。

indolicidin在芽孢杆菌中以酸形式表达，而在牛嗜中性白细胞中天然存在的indolicidin在其C末端是酰胺化的。枯草杆菌的活力因indolicidin下降了4个数量级，而多粘芽孢杆菌对indolicidin并不表现出相同程度的敏感性。这暗示枯草杆菌不是一种理想的在生物膜中表达indolicidin的表达宿主，尤其是在生物膜中indolicidin并不象悬浮培养中会扩散开来并因此攻击宿主细胞。

大肠杆菌BK6对枯草杆菌BE1500浓缩培养上清的敏感性，被用作上清液的抗微生物活性的指标，因为该细菌通常被用于评估阳离子型肽的抗微生物活性(Romeo等人，1988；Selsted等人，1992)。我们的研究表明，枯草杆菌BE1500(pBE92-Ind)的上清液不能抑制大肠杆菌，而枯草杆菌BE1500(pBE92-Bac)和枯草杆菌BE1500(pBE92-ProBac)的上清液可有效地降低大肠杆菌BK6的活力。

在我们的连续反应器试验中，我们观察到枯草杆菌BE1500(pBE92)和枯草杆菌BE1500(pBE92-Ind)的生长没有差别，这暗示indolicidin的表达很差。这也得到了如下情况的证实：根据阻抗谱变化推断出，在连续反应器中用该构建物表现SRB缺乏抑制(图3)。枯草杆菌BE1500对杀细菌素的抗性高于对indolicidin的抗性(因子为60)，这可解释杀细菌素构建物对不锈钢上SRB的抑制能力。

304不锈钢连续反应器试验清楚地表明，SRB的生长被抑制了(根据定性指标例如硫化氢气味和硫化铁沉淀，以及根据定量的极化阻抗R_p的下降)。杀细菌素构建物能比indolicidin构建物更有效地抑制SRB生长，这表明杀细菌素被表达且正确加工从而形成了二硫键，因为二硫键加工不正确的防卫素通常是无活性的(Piers等人，1993)。然而，很明显SRB没有被完全从生物膜中去除，因为所有的反应器在加入SRB后变得更浑浊，而且在含枯草杆菌BE1500(pBE92-Bac)的反应器中仍可检测到轻微的硫化物气味。与对照pBE92相比，产生杀细菌素的构建物对SRB的抑制作用，还得到了在7天批量培养的304不锈钢生物膜上存活的SRB下降了36倍这一事实的证实(表IV)。然而，即使在杀细菌素存在下，仍检测到近1×10⁴SRB/毫升，这证实SRB没有被克隆的抗微生物肽完全杀灭。

产生多粘菌素的多粘芽孢杆菌(野生型)也能延缓SRB在软钢上批量培养中的生长60小时(以及SRB所导致的腐蚀发生)。将产生抗微生物剂的质粒引入多粘芽孢杆菌并不显著提高其杀灭软钢上SRB的能力。但是在连续反应器中304不锈钢上生长的多粘芽孢杆菌，能够完全抑制SRB的生长(可达275小时)。我们观察到，D.vulgaris不能以单培养物形式在不锈钢上生长(而在软钢上能生长)，这也能解释这些抗微生物剂仅在不锈钢上有效抑制SRB。

该实施例的数据表明，SRB在不锈钢上的生长可通过在生物膜内产生肽抗微生物剂而加以控制，并且表明它可用于防止微生物引起的钢腐蚀。多粘芽孢杆菌抑制SRB生长的有效性，提供了对与SRB型腐蚀作斗争的双重杀灭系统进行优化的基础，在这些系统中，低水平的两种抗微生物剂(天然产生的一种抗微生物剂和克隆的抗微生物剂)能够同时抑制SRB。

实施例5：用分泌克隆的抗微生物剂的细菌抑制SRB在软钢和不锈钢上的定居和腐蚀

该实施例表明了，通过使用分泌抗微生物剂的细菌，能在软钢和不锈钢上生物膜中抑制SRB的定居和厌氧腐蚀。

常用的抗生素氨苄青霉素被用作该研究中的对照抗微生物剂，以显示在SRB定居之前加入抗微生物剂可能是一种减少SRB引起的腐蚀的有力手段。如前面实施例中所示，10个氨基酸的环状肽-短杆菌肽S可抑制SRB，而且它还可作为典型的肽抗生素从外部加入，以显示在生物膜中产生肽抗微生物剂能否抑制软钢和不锈钢的腐蚀。此外，用超产生短杆菌肽S的短芽孢杆菌18菌株(Azuma等人，1992)，可形成分泌短杆菌肽S并且抑制不锈钢上SRB的生物膜。

材料和方法

菌株、生长培养基和培养条件

所有的需氧细菌在10毫升改良的Baar培养液(ATCC培养液1249)中，于30℃和250rpm(Series 25摇床，New Brunswick Scientific，Edison，NJ)下从单菌落生长而得，并用作形成生物膜的接种物。D.vulgaris在15毫升带螺旋帽的试管中，与补充有100微升每种除氧剂4％硫化钠和Oxyrase(Oxyrase Inc.，Mansfeld，OH)的10毫升改良的Baar氏培养液中培养。最初的培养物是用-85℃甘油母菌液生长而得；所有随后的培养物用3％最初培养物的接种物，在30℃不摇动地生长。D.vulgaris在牢固密封的带螺旋帽的试管常规培养，并暴露于空气中的氧气而无任何培养上的困难(如Angell和White(1995，同上)所报道的那样)。D.vulgaris培养物还定期地在0.1％硫酸亚铁铵存在下培养，然后通过检测培养试管中黑色硫化铁证实这些硫酸盐还原菌的存在。常规地进行脱硫绿毛霉素(desulfoviridin)分析(Postgate，1984)，并在紫外线下检测粉红色来证实D.vulgaris的存在。短杆菌肽S得自Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)，氯霉素得自Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)，而钼酸铵购自Aldrich ChemicalCompany(St.Louis，MO)。

金属试样的制备

从片材上切下用于批量培养试验的软钢SAE1018试样(直径25.5毫米，厚1.2毫米)以及用于连续培养试验的SAE1018软钢和304不锈钢片(7.5×7.5厘米见方，厚1.2毫米)，并按以前报道的方法(Jayaraman等人，1997a)进行制备。

批量培养腐蚀试验

批量培养腐蚀试验是如前所述(Jayaraman等人，1997a)，在30℃，250毫升锥形烧瓶中不摇动条件下进行。将暴露于D.vulgaris的软钢试样(一式三份)，通过用0.01％铬酸擦拭表面然后以温水反复洗涤而加以清洁；所有的其他试样都按以前所述(Jayaraman等人，1997a)进行清洁。比质量损失(mg/cm²表示的试样总表面积，11.18平方厘米)被用作腐蚀程度的指标(假设腐蚀程度是均匀的)。每隔7天补充生长培养液，并且通过缓慢沿瓶壁加入而替换(含有合适的抗生素)。在形成需氧生物膜3天后，将3％(体积/体积)SRB接种物加至烧瓶中。

用EIS进行连续培养腐蚀试验

如前所述(Jayaraman等人，1997c)，用连续反应器在金属表面上形成生物膜。用Solarton-Schlumberger电化学测量仪(SI1280，Schlumberger TechnicalInstruments Division，San Jose，CA)在至少2次重复试验中用电化学阻抗光谱法(EIS)来测定阻抗数据。该仪器连接于Macintosh计算机(PowerMac 7100/80，Apple Computer，Cupertino，CA)，运行EISIS电化学实验软件(University ofCalifornia，Irvine)(也可使用类似的商业软件THALES)。测量开路电势(OCP)作为金属试样和Ag/AgCl参考电极之间的电势，并且用Mansfeld等人开发的ANALEIS软件(ASTM Special Technical Protocol 1154：186(1992))测定极化阻抗作为阻抗的dc极限。用试验的极化阻抗R_p，根据Stern-Geary等式R_p＝B/I_corr来估算连续培养腐蚀速率，其中B是基于Tafel斜率的参数而I_corr是腐蚀电流强度(可用Faraday法则将其转化为腐蚀速率)(Mansfeld，F.，The polarizationresistance technique for measuring corrosion currents，In Fontana，M.G.，Staehle，R.W.(编)，Advances in Corrosion Science and Technology，Plenum Press，NewYork(1976))。

在形成需氧生物膜3-5天后，将3％(v/v)SRB接种物(培养时间为24-48小时)加至反应器中。根据文献(Saleh等人，1964)中可用的最低抑制浓度，并且根据本实验室得出的悬浮培养中SRB对各种无机物和抗微生物剂的敏感性数据，将氨苄青霉素(200微克/毫升)、氯霉素(200微克/毫升)、氨苄青霉素(200微克/毫升)和氯霉素(200微克/毫升)两者、以及氨苄青霉素(200微克/毫升)和钼酸铵(200微克/毫升)两者加至反应器(在SRB定居于金属之前或之后)，以抑制SRB。所有的抗微生物剂都以合适的浓度同时加至养料和反应器。

对生物膜中活SRB的计数

在250毫升锥形烧瓶中的304不锈钢试样(直径25.5毫米，厚1.2毫米)上，用改良的Baar培养液，30℃2天，产生了需氧生物膜。将1.0％(体积/体积)D.vulgaris接种物(O.D₆₀₀＝0.16-0.18)加入，并让其在生物膜上再定居4天。小心地将金属试样从烧瓶中取出，通过浸入蒸馏水漂洗2次而去除松散附着的细胞。用无菌刮勺将生物膜刮下，然后悬浮于500微升改良的Baar培养液中。通过平板计数确定需氧细菌，并用3管MPN分析法(Greenberg，1992，同上)计数活的SRB。

结果

不产生抗微生物剂的P.fragi K和D.vulgaris对SAE1018软钢的批量和持续腐蚀

在静态批量培养(30℃)中，在P.fragi K和D.vulgaris存在下，检测改良的Baar培养液中软钢SAE1018试样的质量损失28天。只要D.vulgaris存在于生物膜中，试样就覆盖着厚的黑色沉积物并且难以清洁。与P.fragi K的单培养物相比，P.fragi K和D.vulgaris的双重培养物在21天暴露期后腐蚀速率上升了1.8倍。然而，在两种情况下观察到的腐蚀速率都总低于用无菌改良的Baar培养液所观察到的腐蚀速率(表V)。用D.vulgaris单培养物在SAE1018钢上所观察到的腐蚀速率高于无菌培养液中的腐蚀速率，在14天后高1.4倍，在21天后高2.5倍(根据表V推出)。当D.vulgaris在金属试样上定居之前将氨苄青霉素(100微克/毫升)加入烧瓶时，与将氨苄青霉素在SRB之后加入时相比，测得的质量损失下降了40％(1周)至14％(3周)(表V)。对暴露于D.vulgaris的金属试样的宏观检查揭示，对于所有试验都存在无数的点腐蚀。

在连续反应器(顶部空间空气流速为200毫升/分钟)中，厌氧的D.vulgaris以单培养物形式生长，其标志是形成黑色硫化铁沉淀和反应器出口有硫化氢气味。与无菌对照相比，D.vulgaris在连续反应器中的生长在72小时后使R_p上升了90倍。在SRB生长后240小时加入200微克/毫升氨苄青霉素不改变R_p，而且反应器仍为黑色且排放处有硫化氢的独特气味(表VI)。然而，320小时后一起加入200微克/毫升氨苄青霉素和200微克/毫升钼酸铵可使反应器上清液澄清；然而，仍检测到硫化物气味，这表明腐蚀速率并没有下降而且SRB的生长没有被抑制。

将D.vulgaris加入到连续的P.fragi K反应器中，会在36小时后使软钢的R_p提高3倍并改变相角的频率相关性；反应器变为黑色而且在反应器出口检测到硫化物的气味(表VI和图6)。在加入D.vulgaris之前，阻抗在低频下达到稳定的渐近值(4.52×10⁴Ohm·cm²)；然而，在加入SRB的24小时内，反应器变黑并检测到硫化物的气味，而且阻抗在低频下(1.4×10^-3赫兹)不再达到渐近值。在SRB生长120和150小时后，加入200微克/毫升氨苄青霉素(表VI)和一起加入100微克/毫升氨苄青霉素和25微克/毫升氯霉素(数据未示出)也不能使R_p回复至加入SRB之前的值，这表明对SRB没有抑制作用。

表V在需氧细菌和代表性SRB^*的双重培养物的批量培养中，SAE1018钢的腐蚀损失

                    产生的抗                                        腐蚀损失mg/cm²菌株                    微生物剂   3天             7天             10天          14天               21天              28天            32天无菌培养液              -          -               0.54±0.08      0.77±0.11    -                  1.03±0.04        -               2.05±0.11P.fragi K               无         0.04±0.01      -               0.19±0.05    0.33±0.05         0.38±0.01        -               0.43P.fragi K+SRB           无         0.04±0.01      -               0.35±0.01    0.52±0.08         0.71±0.08        -               0.86±0.17P.fragi K+SRB+Amp100    无         0.04±0.01      -               0.35±0.01    0.42±0.04         0.56±0.08        -               0.65±0.07P.fragi K+Amp+SRB       无         0.04±0.01      -               0.25±0.04    0.33±0.04         0.49±0.07        -               -D.vulgaris ATCC29579    无         0.095           0.191           -             1.225              -                 3.83            -枯草杆菌ATCC6633        枯草菌素   0.13±0.01      0.45±0.08      -             0.57±0.08         -                 -               -枯草杆菌ATCC6633+SRB    枯草菌素   0.13±0.01      0.52±0.03      -             0.81±0.04         -                 -               -短芽孢杆菌ATCC35690     伊短菌素   0.07±0.01      0.16±0.03      -             0.19±0.01         -                 -               -短芽孢杆菌ATCC35690+SRB 伊短菌素   0.07±0.01      0.23±0.04      -             0.28±0.03         -                 -               -短芽孢杆菌18            短杆菌肽S  0.09±0.01      0.16±0.02      -             0.28±0.06         -                 0.40±0.06      -短芽孢杆菌18+SRB        短杆菌肽S                  0.19±0.02      -             0.30±0.07         -                 0.44±0.06      -

^*：列于第1列中的次序表示了它们被加至培养物中的次序。例如“P.fragi K+SRB+Amp 100”表示将P.fragi K细菌加入培养中并让其形成生物膜，加入SRB并让其在生物膜中定居，然后再将氨苄青霉素加至培养液中。

表VI  在各种杀灭SRB的方法后，在需氧菌和SRB双重培养物的连续反应器中SAE1018钢的腐蚀行为^*

实验	加入杀灭SRB的抗微生物剂，μg/ml	加入抗微生物剂后过去的时间，小时	反应器特征	加入SRB之前的Rp(Ohm·cr2)(天)	加入抗微生物剂之后的Rp(Ohm·cm2)(天)	基于表V中质量损失数据的Rp(Ohm·cm2)(天)	EIS谱
								D.vulgaris(2次实验之一)	在SRB生长后240小时加入氨苄青霉素(200μg)	200	反应器变黑，出口有硫化物气味。在加入抗微生物剂后没有变化。	3.58×103(0)	3.24×105(10)	5.7×103(14)	未示出
P.fragi K+SRB+氨苄青霉素(2次实验之一)	在SRB生长后120小时加入氨苄青霉素(200μg)	200	反应器变黑，出口有硫化物气味。在加入抗微生物剂后没有变化。	4.52×104(2)	1.35×105(7)	3.76×104(14)	图6
								P.fragi K+氨苄青霉素+SRB(3次实验之一)	在加入SRB之前加入氨苄青霉素(100μg)	100	反应器不变黑，出口没有硫化物气味。	4.52×104(2)	2.60×104(9)	2.00×104(10)	图6
P.fragi K+短杆菌肽S+SRB(1次实验之一)	在加入SRB之前加入短杆菌肽S(100μg)	80	反应器不变黑，但出口有硫化物气味。	4.52×104(2)	3.89×104(6)	注1	图9
								短芽孢杆菌+SRB(2次实验之一)	短杆菌肽S(在加入SRB之前原位产生)	48	反应器不变黑，但出口有硫化物气味。	3.43×104(3)	5.78×104(8)	2.34×104(14)	图9
短芽孢杆菌35690(2次实验之一)	伊短菌素(在加入SRB之前原位产生)	250	反应器不变黑，但出口有硫化物气味。	3.75×104(3)	未计算	未计算	未示出

^*：列于第1列中的次序表示了它们被加至培养物中的次序。例如“P.fragi K+SRB+Amp 100”表示将P.fragi K细菌加入培养中并让其形成生物膜，加入SRB并让其在生物膜中定居，然后再将氨苄青霉素加至培养液中。

注1：根据可利用的等价电路模型，无法计算阻抗谱的R_p

不产生抗微生物剂的P.fragi K和D.vulgaris对S.S304不锈钢的持续腐蚀

对于暴露了近900小时后的304不锈钢，在无菌Baar培养液和P.fragi K的阻抗谱之间没有观察到差别。D.vulgaris不能在304不锈钢上以单培养物形式生长，并且将D.vulgaris加至P.fragi K反应器会在48小时内改变更低频率处阻抗的频率相关性(图7)。在加入SRB后，相角显示出最小值，这表明在非常低的频率处出现新的时间常数(图7)，而且相角的最大值从81度下降为69度。

阻抗谱的变化伴随着在反应器出口处检测到硫化物气味，而且反应器还变灰。向双重培养物反应器中添加200微克/毫升氨苄青霉素(图7)、一起加入200微克/毫升氨苄青霉素和100微克/毫升氯霉素(表VII，第2列)、或一起加入200微克/毫升青霉素和200微克/毫升钼酸铵(数据未示出)，并不能使阻抗谱变成在加入D.vulgaris之前(图7)所观察到的简单的单时间常数行为，也不能使硫化氢和硫化铁的产生停止，这表明SRB没有被杀死。

表VII在各种杀灭SRB的方法后，在需氧菌双重培养物的连续反应器中304不锈钢的腐蚀行为^*

实验	加入杀灭SRB的抗微生物剂，μg/ml	加入抗微生物剂后过去的时间，小时	反应器特征	EIS谱
					P.fragi K+SRB+氨苄青霉素(3次实验之一)	在SRB生长后170小时加入氨苄青霉素(200μg)，在400小时后加入氯霉素(100μg)	490	加入SRB后，反应器变灰且出口有硫化物气味。在加入抗微生物剂后没有变化。	图7
P.fragi K+氨苄青霉素+SRB(3次实验之一)	在加入SRB之前加入氨苄青霉素(100μg)	120	加入SRB后，反应器不变灰，出口没有硫化物气味。	图7
					P.fragi K+短杆菌肽S+SRB(1次实验之一)	在加入SRB之前加入短杆菌肽S(100μg)	130	加入SRB后，反应器不变灰，出口没有硫化物气味。	图8
短芽孢杆菌+D.vulgaris(3次实验之一)	短杆菌肽S(在加入SRB之前原位产生)	150	加入SRB后，反应器不变灰，出口有轻微的硫化物气味。	图8
					短芽孢杆菌18+(Nagano)+D.vulgaris(2次实验之一)	短杆菌肽S(在加入SRB之前原位产生)	190	加入SRB后，反应器变灰，出口有硫化物气味。	未示出

^*：列于第1列中的次序表示了它们被加至培养物中的次序。例如“P.fragi K+SRB+Amp100”表示将P.fragi K细菌加入培养中并让其形成生物膜，加入SRB并让其在生物膜中定居，然后再将氨苄青霉素加至培养液中。

在加入D.vulgaris之前，生物膜暴露于纯化的抑制SRB的抗微生物剂下的持续腐蚀速率

为了确定在SRB定居之前加入抗微生物剂是否能够有效地抑制SRB，在加入D.vulgaris之前，将SAE1018软钢和304不锈钢上的不产生抗微生物剂的P.fragi K生物膜暴露于100微克/毫升氨苄青霉素或短杆菌肽S24小时。使过夜悬浮培养中生长至饱和的P.fragi K暴露于100微克/毫升的两种抗微生物剂；因此，它不因加入这些抗微生物剂而受影响。

在加入氨苄青霉素后将D.vulgaris加至软钢和不锈钢反应器时，在100小时内没有观察到阻抗谱和R_p的变化(图6和7，表VI和VII)。在反应器出口没有观察到硫化物气味；因此，在反应器中D.vulgaris被这种抗微生物剂完全抑制。从外部加入100微克/毫升的环状十肽抗微生物剂-短杆菌肽S，也能完全有效地抑制D.vulgaris在304不锈钢试验中的生长，这可从阻抗谱的电容特性看出(图7和表VI)；然而，对于软钢而言，在暴露于SRB80小时后反应器变灰尽管R_p没有上升(图8和表VII)。因此，与没有短杆菌肽S存在的D.vulgaris和P.fragi K相比，D.vulgaris所引发的软钢腐蚀的发生被延迟了。

产生抗微生物剂的芽孢杆菌和D.vulgaris对SAE1018软钢和304不锈钢的批量和持续腐蚀速率

用D.vulgaris和产生抗微生物剂的芽孢杆菌生物膜(根据所报道有抗微生物肽产生，表V)对SAE1018钢试样进行的批量腐蚀研究表明，所有的芽孢杆菌都能在1周内限制D.vulgaris的定居(证据是与改良的Baar培养液中P.fragi K较大的1.8倍增加相比，腐蚀速率增加得较小，为1.2-1.4倍(表V)，而且不显现黑色也不产生硫化物气味)。然而，在7天后更换培养液时，除了短芽孢杆菌18之外的所有烧瓶都变黑，而且在24小时内检测到硫化铁。在该芽孢杆菌存在下D.vulgaris的腐蚀速率的增加(增加1.2-1.5倍)，与用P.fragi K和D.vulgaris所见的增加相当(增加1.6倍)。用短芽孢杆菌18和SRB时所观察到的质量损失，与仅用P.fragi时相当，比用P.fragi K和SRB时好近2倍(表V)。在试验过程中没有检测到硫化物气味。短杆菌肽S对SRB在批量培养物中生长的抑制有效性得到了如下的证实：与不产生抗微生物剂的P.fragi K生物膜相比，在生长4天后304不锈钢上短芽孢杆菌18生物膜中检测到的活SRB下降了3个数量级(c.f.，5.47×10²/mLvs.8.47×10⁵/mL)(用3管MPN分析法)。

用短芽孢杆菌18(一种高产生短杆菌肽S的菌株)(Azuma等人，1992)时获得的连续培养腐蚀速率，是在SAE1018软钢上存在D.vulgaris下获得的(图9和表VI)；将D.vulgaris加入到软钢上的P.fragi K之后所观察到的R_p增加，被延迟了24小时。最后，SRB似乎在生物膜上定居了，其证据是反应器出口有硫化氢气味；然而R_p仍恒定在5.78×10⁴Ohm·cm²(与加入SRB之前的3.43×10⁴Ohm·cm²相对)。

图8和表VII表明，将D.vulgaris加至304不锈钢上的短芽孢杆菌18生物膜，在120小时后不导致R_p下降，尽管在加入D.vulgaris后48小时在反应器出口检测到硫化物的气味。因此，产生短杆菌肽S的短芽孢杆菌18能够抑制SRB在304不锈钢上定居，尽管它不能延迟SRB在SAE1018软钢上的生长。

讨论

选择D.vulgaris作为代表性的硫酸盐还原菌，以研究原位产生的抗微生物剂在抑制厌氧腐蚀方面的有效性，因为已报道D.vulgaris会加速腐蚀(Gaylarde，1992)，而且该物种的菌株能够耐受氧应力(Hardy，J.A.，Hamilton，W.A.，Curr.Microbiol.6：259-262(1981))。在静态批量培养和具有氧饱和顶部空间的连续反应器中，以及在腐蚀的软钢试样中，D.vulgaris表现出作为单培养物生长的出色适应性，证据是培养液的黑色褪去了(Gaylarde，1992，同上)。D.vulgaris还能在摇瓶(在液体上方的顶部空间氧气饱和条件下)以及在连续反应器(进入反应器顶部空间的空气流速为200毫升/分钟)中的需氧生物膜中生长。在该研究中，D.vulgaris的生长条件与Gaylarde(1992，同上)以及Hamilton和Lee(1995)(Biocorrosion，p.243-264，In Barton，L.L.(编)，Sulfate-reducing Bacteria，Plenum Press，New York)所用的条件非常相似，并且该条件被称为是最具侵蚀性的(当少量氧气存在于SRB培养物中，它导致最大的腐蚀速率)。

与暴露于P.fragi K单培养物相比，暴露于P.fragi K和D.vulgaris的批量培养物的软钢金属试样表现出腐蚀速率上升，这与Jack等人(Corr.Sci.33：1843-1853(1992))和Gaylarde(1992，同上)所报道的情况相似。为了抑制D.vulgaris的生长而向批量培养物中加入各种组合的抗生素，并不能成功地抑制腐蚀(表V)。然而，与单培养物对照相比，产生抗微生物剂的芽孢杆菌批量培养物能够在7天内延缓发生SRB引起的腐蚀。大多数芽孢杆菌的这种SRB抑制作用在更换了生长培养液后而大幅下降。因为大多数抗微生物剂是次生的代谢产物(Bailey，J.E.，Ollis，D.F.，Biochemical Engineering Fundamentals，2版，McGraw-Hill PublishingCompany，New York(1986))，并且是在生长稳定期中产生的(Doi，R.H.，McGlouglin，M.1992.Biology of Bacilli，Application to industry，Butterworth-Heinemann，Boston，MA(1992))，因此在7天后更换生长培养液可能会除去生物膜中的绝大部分抗微生物剂，因而使得D.vulgaris能够在再次产生抑制水平的抗微生物剂之前在金属表面上定居。然而，短芽孢杆菌18可在28天内完全抑制SRB生长，因为制备该菌株所用的诱变导致它过度产生短杆菌肽S(Azuma，等人，1992)。该结果表明短杆菌肽S能够杀灭SRB，并且还表明不仅抗微生物剂能够在SRB定居之前通过其他细菌而成功引入生物膜中，而且以这种方式引入的抗微生物剂物质能够成功地抑制SRB生长。

软钢和不锈钢的阻抗谱，被用于研究在这些金属的连续培养中所观察到的腐蚀行为。将D.vulgaris添加至软钢反应器中SAE1018上的P.fragi K时，会使R_p上升，这表明腐蚀速率降低了。这种看上去矛盾的观察结果可以被解释为在金属表面上形成了氧化物层；因为改良的Baar培养液的pH为7.5(中性)，形成的铁锈层不能象在更酸性环境中所预计的那样溶解。铁锈的这种积累导致R_p上升以及腐蚀速率的表观下降。有关SRB抑制的EIS结果有效性，得到了证实，即根据批量培养的质量损失试验计算出的R_p值与用EIS法对软钢获得数值之间有良好的相关性(表VII)。

对于软钢上的P.fragi K以及P.fragi K+氨苄青霉素+SRB(图6)，观察到简单的单时间常数(OTC)，这在中性培养液中均一腐蚀情况下是典型的(Mansfeld，F.，Lorenz，W.J.，Electrochemical impedance spectroscopy(EIS)：Application incorrosion science and technology，In Varma，R.，Selman，J.R.(编)，Techniques forcharacterization of electrodes and electrochemical processes，John Wiley & Sons，New York(1991))(以下简称Mansfeld和Lorenz，1991)，而且这两个试验中所获得的R_p和电容值(C)是相似的(表VII)。对于P.fragi K和SRB在软钢上，在最低频率处的相角的频率相关性暗示，存在一新时间常数(这可能是因为点腐蚀)，而对P.fragi K+SRB+氨苄青霉素的对称频率相关性以及与P.fragi K相比整个阻抗曲线的位移，可能是因为更高的R_p(图6)。类似的电容值也出现在P.fragi K+SRB以及P.fragi K+SRB+氨苄青霉素在软钢上的谱中；然而，不可能将这些谱与简单的等价电路相拟合并获得定量的R_p和C值。短芽孢杆菌18、短芽孢杆菌18+SRB以及P.fragi K+短杆菌肽S+SRB在软钢上的阻抗谱表现出均一腐蚀中常见的频率相关性，而且R_p可以被确定为阻抗模量|Z|的dc限度(＝0度)(图9)。

暴露于具有无菌培养液的反应器的不锈钢样品，也不能达到稳定的低频阻抗值。在无菌对照和具有P.fragi K或短芽孢杆菌的304不锈钢反应器之间的阻抗谱缺乏差别，这表明在此期间发生了非常少的腐蚀。该结果与Hernandez等人(1994)的观察结果类似。对于9种盐溶液中的软钢，在20天内他们没有观察到稳定的低频阻抗值并将此归咎于没有腐蚀。

P.fragi K和P.fragi K+氨苄青霉素+SRB的304不锈钢阻抗谱是电容式的(capacitive)，其中高的R_p值接近2×10⁷Ohm·cm²且电容值在100和200μF/平方厘米之间。这表明了在中性培养液中不锈钢发生的典型的均一腐蚀(Mansfeld和Lorenz，1991)。对于P.fragi K+SRB以及P.fragi K+SRB+氨苄青霉素在304不锈钢上，观察到类似于软钢的、与纯电容式行为的偏差现象(图7)，而且不可能将这些阻抗值与简单EC相拟合。对于P.fragi K+SRB还观察到一个新的时间常数，这以最小的值在约0.01Hz为证(图7)。短芽孢杆菌18、短芽孢杆菌18+SRB以及P.fragi K+短杆菌肽S+SRB的阻抗谱都是电容式的，而且用短芽孢杆菌18和短芽孢杆菌18+SRB所观察到的R_p和C值类似于用P.fragi K所观察的数值(图8)。

尽管在不将试验数据与合适的等价电路相拟合的情况下，所有暴露条件下腐蚀速率变化的程度不能被精确地确定，但人们能够得出结论：在加入SRB后因硫化氢的产生会导致腐蚀速率增加。类似地，在加入SRB后304不锈钢相角的变化(图7b)，表明发生了额外的电化学过程并且暗示有局部的腐蚀(Mansfeld和Lorenz，1991)。因此，在加入SRB之前就存在纯化的抗微生物剂时，或者在短杆菌肽S由生物膜产生时，阻抗谱缺乏变化表明了在不锈钢上的SRB受到抑制(图8)。

已知氨苄青霉素和氯霉素分别在1微克/毫升和3微克/毫升时能够抑制D.vulgaris的悬浮培养物(Odom和Singleton，1993)。因为已知生物膜对生物杀伤剂的抗性大10-1000倍(Cheung和Beech，1996)，因此在该研究中使用的两种抗生素高达200微克/毫升的剂量。然而，在SRB已定居于金属表面之后加入时，这些添加物质不能停止硫化物的进一步产生，也不能使两种钢的腐蚀速率下降。这与Franklin等人(1991)(Corrosion 47：128-134)的观察结果相符(他们观察到SRB能够在暴露于卤素型生物杀伤剂后存活至少26小时)，并且也与Franklin等人(1989)(An analogue MIC system with specific bacterial consortia，to test effectivenessof materials selection and countermeasures，Presented at the Corrosion 89，NewOrleans，LA，National Association of Corrosion Engineers，Houston，TX)的观察结果相符(他们报道，在加入生物杀伤剂后生物膜菌群下降了3-4个数量级，但是注意到在停止生物杀伤剂后24小时内菌群就恢复到处理前的密度)。对于该研究中的软钢反应器，也观察到类似的结果；当含氨苄青霉素的培养液停止后，在36小时内明显发生了SRB引起的腐蚀。

实施例6：对水冷却塔进行接种以防止SRB相关腐蚀的用法

本实施例显示了将本发明用于“接种”水冷却塔以防止SRB引起的腐蚀。一个新的水冷却塔被安装在发电厂。当塔准备投入使用时，将多粘芽孢杆菌培养物(该菌已重组改造以分泌浓度约1-10微克/毫升的杀细菌素)，以约10³至10⁶细胞/毫升的浓度加至水源中(较佳地该菌被置于稀释的价廉复合营养肉汤(如LuriaBertani培养液)中)，然后通过水塔循环。在用于“接种”塔的水干燥之前，将正常的自来水源接于水塔，然后塔开始正常的运作。

实施例7：用于保护现有设施的用法

本实施例显示了处理早已投入使用的管线的方法。从表面上刮下管道潮湿部分，然后培养管道的生物膜中的细菌。根据标准(例如遗传转化和培养的方便性和可靠性)，选择一种或多种培养的革兰氏阳性菌品种(它们是优选的，因为这种细菌仅有一层细胞膜，通过该细胞膜可分泌抗微生物剂或抗腐蚀剂或者两者)。然后，通过与编码杀细菌素基因的染色体插入载体(如pCNB5)结合，而转化选定的革兰氏阳性菌。转化后的细菌被培养然后测试，以证实抗-SRB剂的分泌。使抗-SRB剂分泌测试中呈阳性的培养物大量生长，然后将等份的所得的培养物以约10³至10⁶细胞/毫升的终浓度，定期地引入管线。

在本说明书中提及的所有出版物和专利申请都在此全部引用作为参考，就好象每个出版物或专利申请被具体和单独地指明被引用作为参考。

尽管为了清楚理解，已通过阐述方式和实施例详细地描述了上述的本发明，然而对于本领域的一般技术人员而言，很明显在本发明教导之后，可以在不背离所附权利要求的精神和范围的情况下，对本发明进行某些改变或修改。

Claims (40)

1.一种抑制硫酸盐还原菌在选自易腐蚀材料和易降解材料的材料上生长的方法，其特征在于，该方法包括在该材料上施用细菌，该细菌分泌数量足以抑制硫酸盐还原菌在该材料上生长的化学物质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该易腐蚀材料是金属。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该金属是钢。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，该钢是软钢。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，该钢是不锈钢。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该金属是铝或铝合金。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该金属是铜或铜合金。

8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该金属选自下组：钛、镍、钛合金和镍合金。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该易降解材料是混凝土。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该易降解材料是钢筋混凝土。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该易降解材料是水泥。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该细菌是需氧细菌。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该细菌是假单胞菌属。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该细菌是芽孢杆菌属。

15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该化学物质是施用于该材料的细菌物种的野生型细菌不分泌的。

16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该细菌已经过重组改变，从而分泌比该细菌物种的野生型细菌更高水平的化学物质。

17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该化学物质是抗生素。

18.如权利要求16所述的方法，其特征在于该抗生素选自下组：短杆菌肽S、indolicidin、多粘菌素和杀细菌素。

19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该化学物质是聚天冬氨酸。

20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该化学物质是聚谷氨酸。

21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该化学物质是聚甘氨酸。

22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该化学物质是铁载体。

23.一种抑制材料腐蚀的系统，该材料选自易腐蚀材料和易降解材料，其特征在于，该系统包括在表面上有生物膜的材料，所述生物膜包含细菌，该细菌分泌数量足以抑制硫酸盐还原菌在该材料上的生长的化学物质。

24.如权利要求23所述的系统，其特征在于，该易腐蚀材料是金属。

25.如权利要求24所述的系统，其特征在于，该金属是钢。

26.如权利要求25所述的系统，其特征在于，该钢是软钢。

27.如权利要求25所述的系统，其特征在于，该钢是不锈钢。

28.如权利要求24所述的系统，其特征在于，该金属是铝或铝合金。

29.如权利要求24所述的系统，其特征在于，该金属是铜或铜合金。

30.如权利要求24所述的系统，其特征在于，该金属选自下组：钛、镍、钛合金和镍合金。

31.如权利要求23所述的系统，其特征在于，该易降解材料是混凝土。

32.如权利要求23所述的系统，其特征在于，该易降解材料是钢筋混凝土。

33.如权利要求23所述的系统，其特征在于，该易降解材料是水泥。

34.如权利要求23所述的系统，其特征在于，该细菌是芽孢杆菌属。

35.如权利要求23所述的系统，其特征在于，该细菌是假单胞菌属。

36.如权利要求23所述的系统，其特征在于，该化学物质是施用于该材料的细菌物种的野生型细菌不分泌的。

37.如权利要求23所述的系统，其特征在于，该细菌已经过重组改变，从而分泌比该细菌物种的野生型细菌更高水平的化学物质。

38.如权利要求23所述的系统，其特征在于，该化学物质是抗生素。

39.如权利要求38所述的系统，其特征在于该抗生素选自下组：短杆菌肽S、indolicidin、多粘菌素和杀细菌素。

40.如权利要求23所述的系统，其特征在于，该化学物质选自下组：聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚甘氨酸和铁载体。

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