JP2002511105A

JP2002511105A - 抗菌剤を分泌する細菌を用いる、硫酸塩還元細菌媒介性分解の阻害

Info

Publication number: JP2002511105A
Application number: JP55572099A
Authority: JP
Inventors: ケイ．ウッド，トーマス; ジャヤラマン，アルル; シー．アースマン，ジェイムズ
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1998-05-06
Filing date: 1999-05-03
Publication date: 2002-04-09
Also published as: EP1011331A1; US7060486B2; US6630197B1; EP1011331B1; KR20010015564A; CA2294107A1; CN1273509A; NO996555L; AU3878599A; AU764657B2; US20050250179A1; EP1011331A4; WO1999056553A1; NZ502111A; FI20000010A; DE69918933T2; DE69918933D1; NO996555D0; ATE271780T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、抗菌化学組成物を分泌する細菌の使用を通した分解または腐食の防止または阻害の分野に関する。特に、本発明は、天然に、または組換え技術の使用を介してのいずれかで、金属、コンクリート、モルタル、および腐食に供される他の表面上での硫酸塩還元細菌の増殖を阻害する化学組成物を分泌する細菌の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】抗菌剤を分泌する細菌を用いる、硫酸塩還元細菌媒介性分解の阻害関連出願の引用本出願は、１９９８年５月６日に出願された米国特許出願第０９／０７４，０３７号の一部継続出願である。この出願の内容は、参考として援用される。連邦政府に支援された調査および開発の下でなされた発明に対する権利の表明適用なし。連邦政府以外の研究支援本明細書中に記載される本発明は、ＥｌｅｃｔｒｉｃＰｏｗｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅとの契約ＲＰ８０４４−０２の過程で、またはその下でなされた。発明の分野本発明は、抗菌性化学組成物を分泌する細菌の使用による分解感受性表面の分解の予防または阻害の分野に関する。詳細には、本発明は、天然で、または組換え技術の使用によるかのいずれかで、金属、コンクリート、モルタル、および腐食または分解を受ける他の表面上での硫酸塩還元細菌の増殖（生育）を阻害する化学組成物を分泌する細菌の使用に関する。発明の背景分解および腐食による損害は、世界中に莫大な経費を負わせる。米国単独では、腐食損害による毎年の経費は、国民総生産の４．２％に等しいと見積もられている（Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｌ．Ｊ．Ｍｅｔａｌｓ．４５：２１（１９９３））（本明細書以下、Ｍａｒｔｉｎｅｚ，１９９３）。これらの大きな経費は、防食技術の良好かつ広範な使用により大いに低減され得る。微生物は、分解および腐食損害に顕著に寄与する。表面（特に金属）が、自然環境に曝露された場合、これらは大量の液相中に存在する好気性細菌により迅速に住み着かれる（Ｇｅｅｓｅｙ、Ｇ．Ｇ．、Ｗｈａｔｉｓｂｉｏｃｏｒｒｏｓｉｏｎ？工業的生物汚損および生物腐食についての国際的ワークショップで提示された．Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９０））（本明細書以下、Ｇｅｅｓｅｙ，１９９０）。このバイオフィルム（ｂｉｏｆｉｌｍ）の上層は好気性であり、一方、金属表面に近い領域は、バイオフィルムによる酸素の消耗に起因して無酸素性である（Ｂｌｅｎｋｉｎｓｏｐｐ，Ｓ．Ａ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１３８−１４３（１９９１）；Ｂｒｙｅｒｓ，Ｊ．Ｄ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｐｒｏｇ．３：５７−６７（１９８７））。硫酸塩還元細菌（「ＳＲＢ」）は、これらの無酸素ニッチに住み着き（コロニー形成し）得、従って、無酸素環境においてさえも腐食に寄与し得る（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｗ．Ａ．Ｓｕｌｐｈａｔｅ−ｒｅｄｕｃｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｔｈｅｉｒｒｏｌｅｉｎｂｉｏｃｏｒｒｏｓｉｏｎ．工業的生物汚損および生物腐食についての国際的ワークショップで提示された。Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９０））（本明細書以下、Ｈａｍｉｌｔｏｎ，１９９０）。ＳＲＢは、広範囲の環境における金属の劣化と関連している（Ｂｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｗ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄｃｏｒｒｏｓｉｏｎｈａｎｄｂｏｏｋ．ＷｏｏｄｈｅａｄＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＬｉｍｉｔｅｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９４）（本明細書以下、「Ｂｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，１９９４」）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｗ．Ａ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９：１９５−２１７（１９８５）（本明細書以下、「Ｈａｍｉｌｔｏｎ，１９８５」）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｗ．Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１：３６−４０（１９８３）：Ｈａｍｉｌｔｏｎ，１９９０）。石油産業および海運業におけるパイプラインおよび沖合いの石油採掘装置（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｗ．Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１：３６−４０（１９８３））、産業システムにおける冷却水再循環システム（Ｂｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，１９９４；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｄ．Ｍｅｔａｌｓ，１５０−２０１頁．Ｒｏｓｅ，Ａ．Ｈ．（編），ＭｉｃｒｏｂｉａｌＤｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８１））（本明細書以下、Ｍｉｌｌｅｒ，１９８１）、下水処理施設およびパイプライン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，１９８５）；Ｏｄｏｍ，Ｊ．Ｍ．ＡＳＭＮＥＷＳ．５６：４７３−４７６（１９９０））、航空産業におけるジェット燃料タンク（Ｍｉｌｌｅｒ，１９８１）、ならびに発電産業（Ｌｉｃｉｎａ，Ｇ．Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｐｅｒｆｏｒｍ．２８：５５−６０（１９８９））（本明細書以下、Ｌｉｃｉｎａ，１９８９）は全て、ＳＲＢの増殖および住み着きにより有害な影響を受けている。ＳＲＢは、低級炭素鋼（例えば、Ｂｏｒｓｈｃｈｅｖｓｋｉｉ，Ａ．Ｍ．ら，Ｐｒｏｔ．Ｍｅｔａｌｓ．３０：３１３− ３１６（１９９４）；Ｃｈｅｕｎｇ，Ｃ．Ｗ．Ｓ．およびＢｅｅｃｈ，Ｉ．Ｂ．，Ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ．９：２３１−２４９（１９９６）（本明細書以下、ＣｈｅｕｎｇおよびＢｅｅｃｈ，１９９６）；Ｄｕｂｅｙ，Ｒ．Ｓ．ら，Ｉｎｄ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．２：３２７−３２９（１９９５）；Ｇａｙｌａｒｄｅ，Ｃ．Ｃ．Ｉｎｔ．Ｂｉｏｄｅｔ．Ｂｉｏｄｅｇ．３０：３３１−３３８（１９９２）（本明細書以下、Ｇａｙｌａｒｄｅ，１９９２）；Ｌｅｅら，Ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ７：１９７−２１６（１９９３））；ステンレス鋼（Ｂｅｎｂｏｕｚｉｄ−Ｒｏｌｌｅｔ，Ｎ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７１：２４４−２５１（１９９１）；Ｍｏｌｌｉｃａ，Ａ．Ｉｎｔ．Ｂｉｏｄｅｔ．Ｂｉｏｄｅｇ．２９：２１３−２２９（１９９２）；Ｎｅｗｍａｎ，Ｒ．Ｃ．ら，ＩＳＩＪＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．３：２０１−２０９（１９９１）；Ｏｒｉｔｚら，Ｉｎｔ．Ｂｉｏｄｅｔ．２６：３１５−３２６（１９９０））；および銅合金（Ｌｉｃｉｎａ，１９８９；Ｗａｇｎｅｒ，Ｐ．およびＬｉｔｔｌｅ，Ｂ．，Ｍａｔｅｒ．Ｐｅｒｆｏｒｍ．３２：６５−６８（１９９３））（本明細書以下、ＷａｇｎｅｒおよびＬｉｔｔｌｅ，１９９３）のような広範な範囲の金属の腐食を生じ得る。このような金属は全て、加工産業、海運業、および電力産業において頻繁に用いられる。ＳＲＢはまた、世界の基幹施設の非金属部分の分解に実質的に寄与する。ＳＲＢは、硫化水素を生成し、これは次いで、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓのような硫黄酸化生物により硫酸へと代謝される。細菌に起因する硫酸分解は、例えば、水系におけるコンクリートコンジットの耐用年数を劇的に減少させることが見出されている。米国における金属のうちのまさにＳＲＢに起因する腐食損害は、毎年ほぼ４００〜６００万＄を占めると見積もられている（Ｂｅｌｏｇｌａｚｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら，Ｐｒｏｔ．Ｍｅｔ．ＵＳＳＲ．２７：８１０−８１３（１９９１））（本明細書以下、Ｂｅｌｏｇｌａｚｏｖ，１９９１）。従来の腐食阻害ストラテジーは、機器が設置される土壌のｐＨ、レドックス電位、および抵抗率の改変（Ｉｖｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｐ．Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：１−３６（１９８７））（本明細書以下、Ｉｖｅｒｓｏｎ，１９８７）、無機コーティング、陰極防食、および殺生物剤（Ｊａｃｋ、Ｔ．Ｒ．ら，ＣｏｎｔｒｏｌｉｎＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＳｅｔｔｉｎｇｓ，２６５−２９２頁．Ｂａｒｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．（編），Ｓｕｌｆａｔｅ−ｒｅｄｕｃｉｎｇＢａｃｔｅｒｉａ．ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９５））（本明細書以下、Ｊａｃｋら，１９９５）（Ｂａｒｔｏｎ参考文献の全体は、本明細書中に参考として援用される）を含んでいた。塗装およびエポキシのような無機保護コーティングは、過去において広範に用いられている；しかし、これらは永続的なものではなく、これらを維持および置換する経費がかなりかかる（Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａ．ら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４７：６２−６８（１９９７）（本明細書以下、Ｊａｙａｒａｍａｎら，１９９７ａ）；Ｍａｒｔｉｎｅｚ，１９９３）。カソード防食について、カソード反応は、金属を、マグネシウムまたは亜鉛からなる犠牲アノードとカップリングすることにより、または印加電流を外部電源から腐食耐性アノードを介して供給することにより、金属表面上で刺激される。ガルヴァーニ電流または印加電流は、金属表面上の至るところの電気化学電位を低下させ、その結果、金属カチオンは形成されず、溶解は生じない。（（Ｉｖｅｒｓｏｎ，１９８７）；Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂ．Ｊ．ら，Ｍａｔｅｒ．Ｐｅｒｆｏｒｍ．３２：１６−２０（１９９３））。しかし、ＷａｇｎｅｒおよびＬｉｔｔｌｅ（１９９３）は、 −１０７４ｍＶまでの陽極電位の使用がバイオフィルム形成を予防できなかったことを報告する。殺生物剤はまた、冷水塔および貯蔵タンクのような閉鎖系における腐食反応を遅延させるために用いられており（Ｉｖｅｒｓｏｎ，１９８７）、そしておそらく、生物腐食と戦う最も通常の方法である（Ｂｏｉｖｉｎ，Ｊ．，Ｍａｔｅｒ．Ｐｅｒｆｏｒｍ．３４：６５−６８（１９９５）（本明細書以下、Ｂｏｉｖｉｎ，１９９５）；Ｂｒｕｎｔ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｉｏｃｉｄｅｓｆｏｒｔｈｅｏｉｌｉｎｄｕｓｔｒｙ，２０１−２０７頁，Ｈｉｌｌ，Ｅ．Ｃ．，Ｓｃｈｅｎｎａｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｗａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．（編），ＭｉｃｒｏｂｉａｌＰｒｏｂｌｅｍｓｉｎｔｈｅＯｆｆｓｈｏｒｅＯｉｌＩｎｄｕｓｔｒｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８６）；Ｃｈｅｕｎｇ，Ｃ．Ｗ．Ｓ．ら，Ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ．９：２３１−２４９（１９９６））（本明細書以下、Ｃｈｅｕｎｇ，１９９６）。Ｓａｌｅｈら（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２７：２８１−２９３（１９６４））（本明細書以下、Ｓａｌｅｈら，１９６４）は、ＳＲＢに対して殺菌性または静菌性であるほぼ２００個の化合物の使用を概説した。塩素、クロラミン、および塩素化化合物のような酸化殺生物剤は、淡水系において用いられる（Ｂｏｉｖｉｎ，１９９５，前出）。塩素化合物は、最も実用的な殺生物剤である；しかし、それらの活性は、水のｐＨならびに光および温度の程度に依存し（Ｋｅｅｖｉｌ，Ｃ．Ｗ．ら，Ｉｎｔ．Ｂｉｏｄｅｔ．２６：１６９−１７９（１９９０））（本明細書以下、Ｋｅｅｖｉｌら，１９９０）、そしてこれらは、バイオフィルム細菌に対してそれほど有効なわけではない（Ｂｏｉｖｉｎ，１９９５，前出）。四級塩（Ｂｅｌｏｇｌａｚｏｖ、１９９１）、アミン型化合物であるアントラキノン（ＣｏｏｌｉｎｇＩＩＬＦ．Ｂ．ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：２９９９−３００４（１９９６））（本明細書以下、Ｃｏｏｌｉｎｇら，１９９６）およびアルデヒド（Ｂｏｉｖｉｎ，１９９５）のような非酸化殺生物剤はより安定であり、そして種々の環境で用いられ得る。これらの殺生物剤の使用は、殺生物剤自体の経費だけでなく、水源へ大量の無機化合物を放出する環境経費を含む多数の深刻な不利益を被る。さらなる問題は、材料表面上のバイオフィルムの組織化により負わされる。糖衣（Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｌ．ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：１８７−１９３（１９９５）；Ｈｏｙｌｅ，Ｂ．Ｄ．ら，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２６：１−６（１９９０）；Ｓｕｃｉ，Ｐ．Ａ．ら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８：２１２５−２１３３（１９９４））、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａにおけるａｌｇＣ遺伝子の発現のようなバイオフィルムに生じる表現型変化（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ，Ｗ．Ｊ．ら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：７１１−７４５（１９９５））（本明細書以下、Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ，１９９５）、およびバイオフィルムの代謝状態に対する表面化学の効果（Ｋｅｅｖｉｌら，１９９０）は全て、プランクトン細菌について観察された耐性を超えて、バイオフィルムにおける生物の、殺菌剤に対する耐性を増加させるのに役立ち得る（Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｒ．Ｗ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｓｕｐｐｌ．７４：８７Ｓ−９７Ｓ（１９９３））。有機フィルム腐食インヒビターであるポリアクリレート／ホスホネートと２つの殺生物剤との組合せは、冷却水システムにおける腐食を制御するために好首尾に用いられている（Ｉｖｅｒｓｏｎ、前出）。しかし、ＳＲＢは本質的に、広範囲な抗菌剤（Ｓａｌｅｈら、１９６４、前出）に対して耐性であり、ＳＲＢが繁殖する苛酷な嫌気環境（腐食生成物により生成される）はまた、殺菌剤の効率を減少させる（Ｃｈｅｕｎｇ，１９９６；Ｉｖｅｒｓｏｎ，前出）。一旦ＳＲＢがそれらのニッチにしっかりと確立されたら、系を分解せずにＳＲＢを系から除去することは困難である（Ｂｏｉｖｉｎ，１９９５，前出）。微生物によって誘導される腐食を制御する別のストラテジーは、栄養素利用能を操作することにより、大部分の有害な微生物の増殖を抑制し、それによってより良性のバイオフィルムを生成することである（Ｊａｃｋら，１９９５）。近頃、ＪａｎｓｅｎおよびＫｏｈｎｅｎ（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂ．，１５：３９１−３９６（１９９５））は、表而への銀イオンのイオン結合によってポリマー表面を改変することによる、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｓＫＨ６の表面への接着の減少を報告し、そして細菌接着を予防するための抗菌ポリマーの開発を示唆した。Ｗｏｏｄ，Ｐ．ら（１９９６）（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：２５９８−２６０２）は、触媒作用による表面でのモノ過硫酸カリウムおよび過酸化水素の生成が、これらの殺生物剤の活性をＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａバイオフィルムに対して１５０倍増加させたことを報告した。この方法は、必要な化学剤がプラスチックを浸透することに頼っており、そして実行のためには製造技術における広範な、実質的な、そして経費的な変化を必要とする。最終的に、バイオフィルム中の好気性細菌が、金属の電気化学的腐食を、おそらく、金属上のバイオフィルム中の呼吸している細菌がさもなければその金属を酸化するのに利用され得るいくらかの酸素を使用するという事実に一部起因して２〜４０倍阻害し得ることを、他者による研究は示唆し（ＰｅｄｅｒｓｅｎおよびＨｅｒｍａｎｓｓｏｎ，Ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ，１：３１３−３２２（１９８９），ならびにＢｉｏｆｏｕｌｉｎｇ３：１−１１（１９９１））、そして本発明者ら自身の研究は最近確認した（Ｊａｙａｒａｍａｎら，１９９７ａおよびＪａｙａｒａｍａｎら，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂ．１８：３９６−４０１（１９９７））（本明細書以下、Ｊａｙａｒａｍａｎら，１９９７ｂ）。しかし、上記のように、この酸素レベルの低下はまた、好気性であるＳＲＢが金属に住み着く機会をつくる。従って、実用的には、電気化学的腐食を阻害する手段としてのバイオフィルムの有効性は、その後のＳＲＢ関連腐食の速度の増強により減少する。当該分野で必要とされているのは、環境中への毒性薬剤の放出は低下させて、ＳＲＢにより引き起こされる腐食または分解を予防または阻害するための有効かつそれほど高価でない手段である。本発明は、これらおよび他の利点を提供する。発明の要旨本発明は、抗菌化学組成物を分泌する細菌の使用を介する、腐食予防または阻害の分野に関する。詳細には、本発明は、天然で、または組換え技術の使用を介してのいずれかで、金属、コンクリート、モルタル、および腐食または分解を受ける他の表面上の硫酸塩還元細菌の増殖を阻害する化学組成物を分泌する細菌の使用に関する。本発明は、腐食または分解感受性材料上のＳＲＢの増殖を阻害する方法を提供する。本方法は、腐食または分解感受性材料に、化学組成物を分泌する細菌を材料上のＳＲＢの増殖を阻害するに十分な量で適用する工程を包含する。腐食感受性材料は、鉄、アルミニウム、チタン、銅、またはそれらの合金のような金属であり得る。例えば、金属は、軟鋼または種々のステンレス鋼のうちの１つであり得る。分解感受性材料は、コンクリート、鉄筋コンクリート、またはセメントのような材料であり得る。細菌は、好気性であり得、そして例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属またはＢａｃｉｌｌｕｓ属の細菌であり得る。細菌により分泌される化学組成物は、その細菌種の野生型のメンバーによっては通常は分泌されない化学組成物であり得、そしてグラミシジンＳ、インドリシジン（ｉｎｄｏｌｉｃｉｄｉｎ）、ポリミキシン（ｐｏｌｙｍｉｘｉｎ）、もしくはバクテネシン（ｂａｃｔｅｎｅｃｉｎ）のような抗生物質であり得、ポリアスパルテートもしくはポリグルタメートのようなポリアミノ酸であり得、またはシデロフォアであり得る。本発明はさらに、腐食を阻害するためのシステムを提供する。このシステムは、その表面にバイオフィルムを有する腐食または分解感受性材料を含み、ここで、バイオフィルムは、材料上のＳＲＢの増殖を阻害するのに十分な量の化学組成物を分泌する細菌を含む。腐食感受性材料は、前段落に記載したような金属であり得る；分解感受性材料は、セメント、コンクリート、または鉄筋コンクリートのような材料であり得る。細菌は、好気性であり得、特に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属またはＢａｃｉｌｌｕｓ属の細菌であり得る。細菌により分泌される化学組成物は、その細菌種の野生型のメンバーによっては通常は分泌されない化学組成物であり得、そしてグラミシジンＳ、インドリシジン、ポリミキシン、もしくはバクテネシンのような抗生物質であり得、ポリアスパルテートもしくはポリグルタメートのようなポリアミノ酸であり得、またはシデロフォアであり得る。図面の簡単な説明図１インドリシジンおよびバクテネシンのクローニングおよび発現。Ｓ＝セリン、およびＡ＝アラニン。関連する制限部位のみを示す。図１ａ：インドリシジンおよびバクテネシンのクローニングおよび分泌のために用いられる発現系の模式図。図１ｂ：インドリシジンのクローニングのために用いられる相補的なオリゴヌクレオチド。図１ｃ：バクテネシンのクローニングのために用いられる相補的なオリゴヌクレオチド。図２保護プロバーネース（ｐｒｏ−ｂａｒｎａｓｅ）（ｐｒｏ）領域を有するバクテネシンのクローニングおよび発現。図２ａ：プロバクテネシンのクローニングおよび分泌のために用いられる発現系の模式図。一文字アミノ酸コードは、プロ領域およびバクテネシン遺伝子を表す。ＳＰは、アルカリプロテアーゼシグナルペプチドを示す。図２ｂ：プロバクテネシンをクローニングするための関連するヌクレオチド。Ｓ＝セリン、およびＡ＝アラニン。関連する制限部位のみを示す。図３Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＥ１５００（ＳＲＢの非存在下（白四角）および存在下（黒四角）でプラスミドｐＢＥ９２、ｐＢＥ９２−Ｉｎｄ（インドリシジン）（黒菱形）、ｐＢＥ９２−Ｂａｃ（バクテネシン）（白三角）、およびｐＢＥ９２−ＰｒｏＢａｃ（プロ領域を有するバクテネシン）（白丸）の二重培養物（コントロール試行を除く）、ならびにコントロールの細菌Ｐ．ｆｒａｇｉＫ（黒六角）および代表的なＳＲＢＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓを有する改変Ｂａａｒ培地中の３０４ステンレス鋼のインピーダンススペクトル。データは、代表的な実験からである。図３ａ：Ｙ軸：インピーダンスの対数。Ｘ軸：振動数（ヘルツ）。図３ｂ：Ｙ軸：一位相角（度）。Ｘ軸：振動数（ヘルツ）。図３〜９に示すインピーダンススペクトルの解釈についての注意：電気化学インピーダンス分光法は、腐食を調査するために用いられる、材料科学における技術である。図３〜９のそれぞれの上のグラフ（「ａ」図）は、その図について示したように処理した、示した金属のインピーダンスの対数を振動数の範囲に対してプロットしたグラフである。低振動数でのインピーダンスのプラトーは、分極抵抗性と呼ばれ、そして腐食率（腐食速度）と逆に相関する；従って、低振動数でのインピーダンスが上昇すると、これは腐食率が低下したことを反映する。機器は、グラフに示した振動数の範囲を通して掃引するが、腐食研究に適切であると考えられるグラフの部分は、最低振動数での結果である。従って、腐食率に対する、実験における変化の効果は、図のはるかに左にグラフで示された値から決定される。「ａ」グラフのＹ軸は、対数関数である数をプロットし、Ｙ軸の各数の間の差は、１０倍差を反映する。従って、それぞれの線についてのデータ点の相対位置のわずかな差は、腐食率のかなりの差を反映する。分極抵抗性、インピーダンススペクトル、および腐食を測定するための他の技術についてのさらなる情報は、Ｂａｂｏｉａｎ，Ｒ．編，ＣｏｒｒｏｓｉｏｎＴｅｓｔｓａｎｄＳｔａｎｄａｒｄｓ：ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄＩｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＴｅｓｔｉｎｇａｎｄＭａｔｅｒｉａｌｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９５）に見出され得る。各図の下のグラフ（「ｂ」図）は、インピーダンス応答の位相のずれをプロットするグラフである。これらのグラフは、各々の実験について、「ａ」図にグラフで示されたインピーダンスが、単一の時定数を反映すること、および低振動数でのインピーダンスにおけるプラトーが分極抵抗性であることを確認する。図３〜９の全てのグラフ（「ａ」および「ｂ」の両方）についてのＸ軸は、振動数（ヘルツ）である。図４上および下のパネル：Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＷＢ６００（ＳＲＢの非存在下（白四角）および存在下（黒四角）でのプラスミドｐＢＥ９２、ｐＢＥ９２−Ｉｎｄ（インドリシジン）（黒菱形）、ｐＢＥ９２−Ｂａｃ（バクテネシン）（白三角）、およびｐＢＥ９２−ＰｒｏＢａｃ（プロ領域を有するバクテネシン）（白丸）を有する）、ならびにＰ．ｆｒａｇｉＫ（黒六角）の二重培養物を有する改変Ｂａａｒ培地中の３０４ステンレス鋼のインピーダンススペクトル。「ＳＲＢ」は、代表的なＳＲＢＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓを表す。データは、１つの実験からである。図４ａ：Ｙ軸：インピーダンスの対数。Ｘ軸：振動数（ヘルツ）。図４ｂ：Ｙ軸：一位相角（度）。Ｘ軸：振動数（ヘルツ）。図５上および下のパネル：Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ（ＳＲＢの非存在下（白三角）および存在下（黒丸）でのプラスミドｐＢＥ９２、ｐＢＥ９２−Ｂａｃ（バクテネシン）（白四角）、ならびに代表的なＳＲＢであるＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓとともにコントロールの細菌Ｐ．ｆｒａｇｉＫ（黒六角）の二重培養物を有する改変Ｂａａｒ培地中の３０４ステンレス鋼のインピーダンススペクトル。データは、代表的な実験（２つの独立した実験）からである。図５ａ：Ｙ軸：インピーダンスの対数。Ｘ軸：振動数（ヘルツ）。図５ｂ：Ｙ軸：一位相角（度）。Ｘ軸：振動数（ヘルツ）。図６上および下のパネル：ＳＲＢ添加の前および後にＰ．ｆｒａｇｉＫの培養物に精製した抗菌性アンピシリンを添加した改変Ｂａａｒ培地中のＳＡＥ１０１８軟鋼のインピーダンススペクトル。Ｐ．ｆｒａｇｉＫのコントロール培養物：白丸、Ｐ．ｆｒａｇｉおよびＳＲＢ（Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）：黒菱形、ＳＲＢの後にアンピシリンを添加したＰ．ｆｒａｇｉおよびＳＲＢ：黒三角、ＳＲＢの前にアンピシリンを添加したＰ．ｆｒａｇｉ：白四角。データは、代表的な実験（最小で２つの独立した実験）からである。図６ａ：Ｙ軸：インピーダンスの対数。Ｘ軸：振動数（ヘルツ）。図６ｂ：Ｙ軸：一位相角（度）。Ｘ軸：振動数（ヘルツ）。図７上および下のパネル：ＳＲＢ添加の前および後に精製した抗菌性アンピシリンを添加した改変Ｂａａｒ培地中の３０４ステンレス鋼のインピーダンススペクトル。Ｐ．ｆｒａｇｉＫのコントロール培養物：白丸、Ｐ．ｆｒａｇｉおよびＳＲＢ（Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）：黒菱形、ＳＲＢの後にアンピシリンを添加したＰ．ｆｒａｇｉおよびＳＲＢ：黒三角、ＳＲＢの前にアンピシリンを添加したＰ．ｆｒａｇｉ：白四角。データは、代表的な実験（最小で２つの独立した実験）からである。図７ａ：Ｙ軸：インピーダンスの対数。Ｘ軸：振動数（ヘルツ）。図７ｂ：Ｙ軸：一位相角（度）。Ｘ軸：振動数（ヘルツ）。図８上および下のパネル：ＳＲＢ添加の前に精製した抗菌性グラミシジンＳを添加し、そして組換えバイオフィルムによりインサイチュで生成されるグラミシジンＳを有する改変Ｂａａｒ培地中の３０４ステンレス鋼のインピーダンススペクトル。黒丸：コントロール細菌であるＰ．ｆｒａｇｉおよびＳＲＢ；白菱形：Ｐ．ｆｒａｇｉおよびグラミシジンＳおよびＳＲＢＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓ（グラミシジンＳはＳＲＢの前に添加された）；白四角：グラミシジンＳ過剰産生（ｈｙｐｅｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）株Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ１８；黒四角、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ１８およびＳＲＢ。データは、代表的な実験（最小で２つの独立した実験）からである。図８ａ：Ｙ軸：インピーダンスの対数。Ｘ軸：振動数（ヘルツ）。図８ｂ：Ｙ軸：一位相角（度）。Ｘ軸：振動数（ヘルツ）。図９上および下のパネル：ＳＲＢ添加の前に精製した抗菌性グラミシジンＳを添加し、そして組換えバイオフィルムによりインサイチュで生成されるグラミシジンＳを有する改変Ｂａａｒ培地中のＳＡＥ１０１８軟鋼のインピーダンススペクトル。凡例は、図８についての通りである。データは、代表的な実験（最小で２つの独立した実験）からである。図９ａ：Ｙ軸：インピーダンスの対数。Ｘ軸：振動数（ヘルツ）。図９ｂ：Ｙ軸：一位相角（度）。Ｘ軸：振動数（ヘルツ）。詳細な説明Ｉ．序論本発明は、材料の分解を阻害する方法、ならびに分解を阻害するためのシステムを提供する。本発明者らは、近頃、金属上での好気性バイオフィルムの存在が、腐食を２〜４０倍低下させ得ることを示した。（Ｊａｙａｒａｍａｎら，１９９７ａおよびＪａｙａｒａｍａｎら，１９９７ｂ）。この阻害は、部分的に、細菌呼吸に起因する金属表面での酸素レベルの低下に起因し得る。しかし、自然環境下では、この酸素レベルの低下はまた、硫酸塩還元細菌、すなわち、「ＳＲＢ」による金属住み着きの機会を生じる。ＳＲＢの影響はＪａｙａｒａｍａｎら，１９９７ａでも１９９７ｂでも研究されていないが、ＳＲＢは、それらの研究において報告された影響を超えて、腐食率を実質的に増加させると予測される。従って、Ｊａｙａｒａｍａｎら，１９９７ａおよび１９９７ｂの研究は、好気性バイオフィルムが腐食を阻害する手段として役立ち得ることを実証するが、彼らはＳＲＢ媒介腐食の影響をどのようにして低下させるかについてのガイダンスは提供しなかった。本発明は、この問題を解決する。それゆえ、本発明は、分解を阻害する手段としての好気性バイオフィルムの有用性を著しく増加させる。手短には、本発明は、抗菌性物質を分泌する細菌の適用を含む。本発明者らはここで、ＳＲＢ増殖を阻害する物質を分泌する好気性細菌のバイオフィルムを作製することが可能であることを示した。物質は、細菌が導入されるバイオフィルム中に通常は存在しない野生型細菌によって天然に分泌される（変異に起因した、正常よりも高いレベルでの物質の分泌を含む）物質であり得る。細菌はまた、生物により天然で分泌される物質を過剰発現するように、もしくは細菌種の野生型メンバーにより発現されない抗菌剤を分泌するように、またはその両方であるように、組換えにより変更され得る。腐食は、金属に影響を及ぼす問題である。しかし、他の材料は、ＳＲＢによる材料住み着きに関連した分解により深刻に影響される。ＳＲＢは、それらの代謝産物として硫化水素を生じる。硫化物は、鉄、その合金（ステンレス鋼を含む）を攻撃し、そして銅およびその合金を酸化する。硫化水素は、硫酸を生成する多数の任意の硫黄酸化生物（例えば、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）によりスルフェートへと酸化するために利用可能である。この様式で形成された硫酸は、例えば、ロサンゼルスにおけるコンクリート製水路の分解を担うことが見出されており、そしてコンクリート製の水制御システムの予想耐用年数を劇的に減少させている。本発明は、ＳＲＢに関連する腐食または分解に対して特に有用であるが、本発明の方法およびシステムはまた、材料の腐食または分解を増加させる他の生物にも適用され得る。例えば、Ｈｏｒｍｏｃｏｎｉｓｒｅｓｉｎａｅのような真菌はジェット燃料を汚染し、そして燃料系におけるアルミニウム合金の腐食を増加させる有機酸を生成する。例えば、Ｈ．Ａ．Ｖｉｄｅｌａ，ＭａｎｕａｌｏｆＢｉｏｃｏｒｒｏｓｉｏｎ（ＣＲＣＬｅｗｉｓＰｕｂ．，ＮｅｗＹｏｒｋ）（１９９６）１２９頁（本明細書以下、「マニュアル」；マニュアルの全体は、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。抗真菌剤を分泌する細菌もしく抗真菌剤を分泌するように操作された細菌、またはその両方の使用は、これらの供給源による腐食を減少させ得る。同様に、ジェット燃料におけるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの増殖は腐食を増強し、一方、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓは防御的であることが見出された。同書、１２９−１３２。本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ならびにＳＲＢまたは腐食を生じることが見出され得る他の微生物の増殖を阻害する１以上の抗菌性物質を分泌するようにＳ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓを操作することを包含する。この方法による、ＳＲＢ媒介腐食または分解の阻害、ならびに他の細菌（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）または真菌により引き起こされる腐食の阻害は、非常に望ましい。細菌はそれ自体が繁殖するので、抗菌剤を分泌する生物の集団は、それ自体が経時的に補充される。従って、通常は頻繁に繰り返されなければならない有機化学物質または無機化学物質の適用とは対称的に、１回の適用が長期にわたって有用であり得る。さらに、バイオフィルム自体の中での薬剤の分泌は、適切な用量がＳＲＢまたは他の意図される標的生物に到達するのを確実にするために代表的には大量に適用される、外部から適用された化学物質とは異なり、最大濃度の薬剤をその作用点に自動的に配置する。さらに、ＳＲＢがエネルギーを得る機構は、エネルギー的にわずかに好ましいだけであり、そして生物の増殖は他の生物には深刻な影響は与えない薬剤により阻害され得る。従って、周囲の微生物による抗菌剤の分泌は、他の薬剤に対するＳＲＢの耐性を完全に阻害または低下させ得、他の場合に必要とされるレベルよりもずっと低いレベルでの殺生物剤および他の毒性薬剤の外部適用によりＳＲＢ関連腐食または分解を阻害するのを可能にする。本発明のさらなる利点は、バイオフィルムが、液体流れまたは摩耗に起因していくつかの場所で損傷または除去されたとしても、隣接領域からのインヒビターの連続的な供給が、露出した金属または他の表面のインヒビター生成細菌による再住み着きに優先的に有利であることである。バイオフィルムは露出した表面上で迅速に形成し得る（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ，１９９５）ので、細菌の賢明な選択により、バイオフィルムからの他の細菌種の排除をもたらし得る。最終的に、バイオフィルムの分解または腐食阻害効果は、分解または腐食阻害薬剤を分泌する細菌を、抗菌剤と別々に、または組合せてのいずれかで導入することによりさらに増強され得る。このような分解または腐食阻害薬剤は、ポリアスパルテートおよびポリグルタメートのようなポリペプチド、ならびにパラバクチン（ｐａｒａｂａｃｔｉｎ）およびエンテロバクチン（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｉｎ）のようなシデロフォアを含み得る。以下の本文は、本発明についての多くの用途のうちのいくつかおよびそれを如何にして実施するかを示す。用語を定義した後、本文では、抗ＳＲＢ剤または抗真菌剤を分泌する生物（天然でこのような薬剤を分泌する生物およびそのように遺伝子操作された生物の両方を含む）の使用による好気性バイオフィルムの防食効果の増強を議論する。さらに、本文では、防食効果をさらに増強するポリペプチドおよびシデノフォアのような防食剤または抗分解剤（ａｎｔｉ−ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｇｅｎｔ）の使用を記載する。本文では、本発明の方法またはシステムで使用するために適切な生物をどのように選択するか、および生物がＳＲＢ、真菌、または他の標的生物の増殖を阻害する物質を（変更の前または後に）生成するか否かをどのように決定するかをさらに記載する。次いで、本文では、保護される材料を使用する前または後に生物を適用する方法を議論し、そしてこの方法およびシステムのための使用を記載する。最終的に、本文では、実施例を示す。ＩＩ．定義本明細書で用いられる「軟鋼」とは、配管などのために通常用いられる安価な低品質の鋼をいう。「ＳＡＥ１０１８鋼」は、ＳｏｃｉｅｔｙｏｆＡｕｔｏｍｏｔｉｖｅＥｎｇｉｎｅｅｒｓにより設定された工業規格を満たす特定の品質の軟鋼である。本明細書で用いられる「ステンレス鋼３０４」または「３０４ステンレス鋼」とは、そのような名称についての工業規格を満たす特定の品質のステンレス鋼をいう。用語「金属クーポン」とは、小さな、薄い方形または円形の金属をいう。このような「クーポン」は、異なる金属、薬剤、およびインヒビターの腐食特性を比較するために当該分野において慣用的に用いられる。本明細書で用いられる「腐食感受性材料」としては、腐食を受ける全ての金属（特に、鉄、アルミニウム、チタン、銅、ニッケル、およびこれらの各々の合金（軟鋼およびステンレス鋼を含む）を含む）が挙げられる。「腐食」は、金属への損害に特異的に適用し、一方、「分解」とは、コンクリート、セメント、モルタル、および同様の材料のような他の材料の損害をいう。従って、本明細書中で用いられる「分解感受性材料」は、細菌関連の原因からの損害を受ける非金属である。しかし、参照の便宜をはかるために、本明細書中で用いられる用語「腐食」はまた、文脈によりそうでないことが必要とされない限り、金属以外の材料に対する損害を包含し得る。人工歯根はまた、「分解感受性材料」であり得る。本明細書中で用いられる「化学組成物」とは、金属の腐食または非金属材料の分解を生じ得る微生物に対する増殖阻害効果を有する化学物質を意味する。この用語は一般に、本明細書中で用語「抗菌剤」と同義に用いられるが必ずしもそうとはかぎらない。用語「適用する」とは、細菌が表面と接触する、ヒトの作用により媒介または促進される任意の手段を包含することが意図され、文脈において適切に、細菌または細菌を含有する混合物を腐食または分解感受性材料と接触、スプレー、ブラッシング、ホースがけ（ｈｏｓｉｎｇ）、または浸漬させることを含む。「適用する」は、パイプ、コンジット、塔、またはシステムが最初に使われる場合に、例えば、パイプ、コンジット、冷却塔、または水系を介して流される最初の水塊に、抗菌組成物（例えば、抗ＳＲＢ組成物）を分泌する細菌を含ませることもまた包含する。「適用する」はさらに、現存するバイオフィルム内で空間を作るために表面を削り取るかまたは削り取らずに表面へ細菌を物理的に配置することを包含することが意図される。用語「硫酸塩還元細菌の増殖を阻害するのに十分な量」とは、コントロール集団と比較して統計学的に有意な様式でこのような細菌の増殖を減少させるに十分な量を意味する。範囲は、統計学的に有意な差を検出する能力の限界程度の低さから、完全な阻害までであり得る。好ましくは、阻害の程度は、少なくとも約１０％であり、このような細菌の増殖が、コントロール集団の増殖よりも少なくとも約１０％少ないことを意味する。より好ましくは、阻害の程度は約３０〜５０％である。さらにより好ましくは、阻害の程度は約５０〜９０％である。最も好ましくは、阻害の程度は９０％以上である。ＩＩＩ．バイオフィルムの防食効果を増強することＡ．抗菌剤を分泌する細菌による、バイオフィルムの防食効果の増強１．総論自然環境に曝露される表面は、好気性細菌により迅速に住み着かれるようになる。金属および他の表面は、糖衣として知られる多糖コーティング中に閉じ込められた接着微生物集団を発達させる（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ，１９９５）。背景において留意したように、本発明者らによる近年の研究は、バイオフィルムが、単一（すなわち、「純培養」）培養物として増殖したとき、表面に対して保護効果を有することを確認した。しかし、天然では、生物はほとんど単一培養物としては増殖せず、そしてバイオフィルム中の好気性細菌による酸素の消耗に起因して金属または他の材料の表面付近に見出される純培養領域は、硫黄還元細菌、すなわち、「ＳＲＢ」による材料住み着きの機会を生じる。従って、これらの細菌は、好気性環境においてさえ腐食を担う（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，１９９０）。バイオフィルムの保護効果は、現存するバイオフィルムに、ＳＲＢの増殖を阻害する抗菌剤を分泌する１以上の細菌を導入することにより増強され得る。１つの実施態様では、細菌は、通常または変異の結果としてのいずれかで、ＳＲＢ増殖を阻害する薬剤を天然で生成および分泌する種のものであり得る。あるいは、細菌は、その種の変更していないメンバーによって分泌されない抗菌剤を分泌するように、またはより低いレベルもしくは特定の時期にのみ普通は分泌される薬剤をより高いレベルでもしくは連続的に分泌するようにのいずれかで組換え技術を介して変更され得る。２．天然の細菌分泌者いくつかの細菌は、天然で、腐食を生じる微生物（例えば、ＳＲＢ）の増殖を阻害するのに有効である薬剤を生成する。細菌の生物学は、何十年間も研究されており、そして抗菌剤を分泌することが公知の多数の細菌に関する情報を含むかなりの知識が伸展している。導入された変異の結果として抗菌剤グラミシジンＳを過剰発現する、このような細菌のうちの１つは、以下の実施例においてさらに記載され、そしてＳＲＢ媒介腐食を阻害する能力について試験される（化学変異の結果として薬剤を過剰発現する細菌は、本発明の目的のためにこの薬剤の天然の分泌者とみなされる）。抗菌剤を分泌することが公知の他の細菌は、腐食を生じる微生物（例えば、ＳＲＢまたは真菌であるＨｏｒｍｏｃｏｎｉｓｒｅｓｉｎａｅ）に対するその分泌の有効性を、以下の実施例により教示されるかまたは当該分野で公知の通りのアッセイによって決定するために容易に試験され得る。３．組換えにより変更された分泌者ａ）分泌者として用いられる細菌により天然では生成されない化学物質特定の抗菌剤を天然で分泌する細菌が常に見出され得るわけでも、特定の適用のために望ましい抗菌剤を天然に分泌する細菌が、その細菌が曝露される特定の環境において常に繁殖するわけでもない。これらおよび他の例では、天然では問題の抗菌剤を分泌しない細菌が、所望の抗菌剤を分泌するために組換え生物学技術により変更され得る。ｂ）細菌により天然で生成されるが、より多量にまたは構成的に生成される化学物質組換え技術をまた用いて、通常では抗菌剤を分泌しない細菌の抗ＳＲＢ腐食特性を、これらの細菌を、強力な構成性プロモーターに作動可能に連結される薬剤についての遺伝子を含む構築物でトランスフェクトし、分泌される薬剤の量を増加させるか、あるいは通常不連続にまたは特定の環境条件もしくは代謝条件に応答してのみ生成される薬剤の連続的生成を提供することにより改善し得る。あるいは、この構築物は、抗菌剤をコードする遺伝子を、誘導性プロモーターの制御下におき得、その結果、この薬剤の分泌を制御し得る。ｃ）細菌細胞へのＤＮＡ構築物の導入多数の技術が、異種ＤＮＡを含むＤＮＡを細菌細胞に導入するために当該分野において公知であることが認識される。このようにする例示的な方法を、以下の実施例に示す。このようなＤＮＡを細菌に導入し、そしてその発現を得るための特定の方法の選択は、本発明の実施において重要ではない。Ｂ．抗菌組成物の選択１．抗菌剤細菌によって産生され得る多数の抗菌剤が当該分野において公知である。例えば、細菌Lactococcus lactisによって分泌される34アミノ酸のペプチドであるニシン（Nisin）は、食品保存剤として使用される。D2として知られる海洋細菌によって分泌される1700アミノ酸のポリペプチドは、一般的な抗菌活性を有することが示されている。SRBなどの標的生物に阻害的である、これらの抗菌剤の任意のものを本願発明に用い得る。好適な実施態様において、抗菌剤はペプチド抗生物質である。ペプチド抗菌剤は、小分子（代表的には10〜35アミノ酸）であり得、そして小分子は、単一の抗生物質の発現を達成するために大きなオペロンまたは数種の経路が必要とされ得る、多くの従来の抗生物質よりもより容易に細菌にクローニングされ得る。上述のものに加えて、グラミシジンＳおよびＤ（下記実施例で議論される）などの多数のペプチド抗生物質が当該分野において公知である。しかし、細菌において十分な量で発現され得る限り、問題となる特定の適用について所望されるなら、より大きな抗生物質組成物も用い得る。通常は抗生物質と考えられないが抗菌効果を有する、他の小さなペプチドもまた用い得る。例えば、インドリシジン（indolicidin）およびバクテネシン（bac tenecin）は、ウシ好中球からのカチオン性抗菌ペプチドであって、広範囲の生物に対して活性であることが公知である（これらの化合物についての、文献への参照を含む詳細な情報が下記実施例に述べられる）。インドリシジンは最も小さい公知の線状抗菌ペプチドである。特定の抗菌化学物質の選択は、実施者の思慮による裁量の範囲にあり、そして標的生物、抗菌剤を分泌するために選択された生物、および分泌生物が用いられる適用に依存する。選択される抗菌剤は、標的生物に対して阻害的であるべきである（例えば、もし標的が真菌であれば、それは真菌の生育を阻害すべきであり、標的生物がシュードモナス属であれば、シュードモナスの生育を阻害すべきであり、他も同様である。抗菌剤の、一群の生物のメンバーに対する阻害効果を決定するための例示的なアッセイが実施例に教示される）。抗菌剤の経時的に連続した産生を可能にするために、選択される抗菌剤は、代表的には、その抗菌剤を分泌する生物（その生物が導入遺伝子を発現している場合、ときには「宿主生物」と呼ばれる）に対してよりも、標的生物に対してより阻害的である。宿主生物の、抗菌剤に対する感受性を決定するための例示的なアッセイが実施例に述べられる。しかし、一定の状況においては、抗菌剤の連続した産生は不必要であり得、特定の抗菌剤を分泌し得る他の生物が入手不可能であり得、または、標的種が排除されるかもしくは阻害されるのとほぼ同時に産生種も排除することが所望され得る。これらの状況においては、標的生物だけでなく宿主生物にも阻害的な抗菌剤が選択され得る。最後に、抗菌剤の選択は、部分的に、意図される適用に依存する。例えば、インドリシジンおよびバクテネシンは、ウシ好中球由来の抗菌剤である。従って、これらの環境への放出は、少なくともウシ免疫系のこれらの天然抗菌剤に対して耐性の細菌株を発達させる結果となり得、そしてヒト免疫系における同様な抗菌剤に対して耐性の株を発達させる結果となる可能性もある。この理由から、インドリシジンおよびバクテネシンは、開放系（すなわち、分泌生物または分泌された抗菌剤が、代表的には、水道管、排水パイプなどの環境中へ放出される系）における使用のためには好適な抗菌剤ではない。他方、これらの化合物は、閉鎖系、すなわち、生物および分泌された抗菌剤が代表的には環境中へ放出されない系において使用され得る。２．抗腐食剤ａ）ポリペプチドアミノ酸、特にグリシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸は、抗腐食剤として作用することが公知である。例えば、KalotaおよびSilverman，Corrosion 5 0(2):138-145(1994)（以下、KalotaおよびSilverman）およびそこに引用された文献を参照。しかし、多くのアミノ酸が、多重のpK値を伴う複数の酸−塩基定数を有し、そして環境のpHに依存して異なる電荷を有する傾向がある。KalotaおよびSilvermanは、低分子量のアミノ酸が腐食を阻害する能力がpHに依存すること、そして高いpH（pH≧10）においてのみ腐食速度が有意に減少することを見出した。 KalotaおよびSilvermanに基づくと、ポリアスパルテート、ポリグルタメートもしくはポリグリシン、またはこれら３つのアミノ酸からなるポリペプチドを、 pHが約10以上である環境における使用のためのみの腐食阻害剤として、分泌するように細菌を操作することが望ましい。これは、若干の産業上の利用に適用されるが、そのような高pHを含む状況の数はむしろ制限されがちである。我々自身の研究はKalotaおよびSilvermanと矛盾する。我々は、例えば、ポリアスパルテートおよびポリグルタメートが、７という低いpHにおいて金属を腐食から保護することを見出した。従って、我々のデータによれば、もし予期されるまたは測定される金属の環境のpHが約７以上であれば、もし細菌がポリアスパルテート、ポリグルタメートなどのポリペプチド（またはその対応する酸または塩）、ポリグリシン、またはこれらアミノ酸の混合物を分泌するなら、腐食阻害が可能である。従って、もしバイオフィルム中の生物がこれらのポリペプチドをpH が約７以上であるとき分泌するなら、それは好気性バイオフィルムの腐食阻害効果を向上させる。ｂ）親鉄剤パラバクチン（parabactin）(Paracoccus denitrificansから単離された）、およびエンテロバクチン（enterobactin）（E.coliから単離された）などの親鉄剤は、比較的低分子量のキレート剤であって、第二鉄イオンを可溶化してその細胞内に輸送するために、細菌により産生され分泌される（McCaffertyおよびMcAr dle，J．Electrochem．Soc.，142:1447-1453(1995)）。これらの試剤は、試験され、鉄の腐食を阻害することが見出された。同上。バイオフィルムの抗腐食効果を向上させるために、これらの試剤の遺伝子が強力な構成的プロモーターの制御下に置かれて、通常より高いレベルで発現され得、または通常それらを分泌しない細菌に挿入され得る。３．抗菌剤、抗腐食剤、または両方の組合わせ本発明に使用される細菌は、複数の抗菌剤を分泌するように設計され得ることが意図される。例えば、実施例に報告した研究の１つは、変異の結果としてグラミシジンＳを過剰発現し、かつ他の抗菌剤を産生するように遺伝的にも改変されたバチルスの使用を含む。２以上の抗菌剤を分泌する細菌の使用は、標的の腐食起因生物（それがSRBであれ真菌であれ）が耐性を発達させることをより困難にする点でおそらく有利である。さらに、抗菌剤を分泌する細菌は、抗腐食剤（ポリアスパルテート、ポリグルタメート、これら２つのアミノ酸からなるポリペプチド、またはパラバクチン、エンテロバクチンもしくは他の親鉄剤など）をも産生するように操作されることによってその腐食阻害能力が向上され得る。現実的には、細菌が産生するように操作され得る抗菌剤および抗腐食剤の数の限定因は、おそらく、抗菌剤の宿主細胞に対する何らかの毒性効果と、分泌される物質を産生する宿主細胞の代謝的漏出との組合わせである。異なる生物は異なる代謝効率を有するので、そして環境における栄養利用性がおそらく役割を有するので、選択された細菌がどれだけ多くの試剤を分泌し得るかの決定は、通常実験的に決定される。そのような決定は、意図される使用の部位に予期される栄養物を含む培地中で、標的細胞が完全に阻害される点に到達するまで、細菌を所望の抗菌剤および抗腐食剤で逐次的に形質転換することによって、そして次に、（１）バイオフィルムの天然の集団との関係における宿主細胞の競合性と、（２）所望の数の試剤を分泌する宿主細胞の能力との最良の組合わせを選択することによって、容易に行い得る。Ｃ．意図される使用のための適切な生物の決定１．意図される使用の環境に対し外因性である細菌の選択一般に、生物は、意図される使用に従って、SRB、真菌、または他の標的微生物に対する抗菌剤を分泌するように選択される。我々の発見は、好気性細菌が表面を腐食および分解から保護することを示す。従って、選択される生物は好気性であるべきである。さらに、生物は、意図される使用の環境において生存し得なければならない。もし、例えば、目的が海水中に固定されまたは海水上に架けられた橋の鋼およびコンクリートを保護することであれば、海水または塩の噴霧中で生育し得る生物を選択すべきである。逆に、意図が、産業廃液を含む淡水を運ぶパイプまたは管を保護することであれば、生物は、淡水中および予期される排出物の存在下で生育し得るべきである。さらに、生物は、意図される環境の予期される温度およびpH条件下で生育し得るべきである。細菌は、ほぼ百年間熱心に研究されてきたので、大半の種の温度、pH、および他の環境上の必要性および耐性は公知であり文献で利用可能である。好ましくは、生物は、予期される環境条件下で腐食に対して保護効果を奏する。我々は、その結果を刊行した研究において、７つの異なる属を表す15の異なる細菌の、２つの異なる媒体（１つは海水を模倣したもの、１つは栄養素を十分に加えた淡水媒体）中で金属を保護する効果を比較した。Jayaramanら，Appl．Mic robiol．Biotechnol.，48:11-17(1997c)（以下、Jayaramanら，1997c；この文献の全体が参照として援用される）。腐食阻害の程度は、いくつかの細菌では、２つの媒体の間で著しく変化し、他方、試験した生物のうち10のものは両方の媒体中で顕著に良好に金属を保護した。同上、397。この研究のアッセイに従って、当業者は、本発明の方法において、または本発明のシステムの一部として使用が意図される任意の特定の細菌種が、意図された環境によって提供される媒体中で生育し得るか、およびその生物がそれらの条件下で腐食に対して保護的であるかを、容易に決定し得る。さらに、生物がバイオフィルム中で生育可能であれば、好適である。しばしば、それらは「ぬるぬるになる（sliming）」ことができる生物である。例示的な属としてバチルス、シュードモナス、セラチア（Serratia）およびエッシェリヒア（Escherichia）がある（もっとも、シュードモナスは、航空機の燃料タンク（ここで、この生物は腐食を起こすことが見出されている）などの環境での使用に選択されるべきではない。the Manual，上記129を参照）。選択された生物がバイオフィルムを形成する能力を決定するための例示的な方法は、Jayaramanら，1997c，上記に教示される。２．意図される使用の環境に対し内因性である細菌の選択既に使用されている施設に関連して適切な生物を選択する好適な手段は、自然に任せることである。バイオフィルムは天然において広く存在するので、パイプ、管、水冷塔、発電所貯水槽および同様な装置および施設は、おそらく既に存在するバイオフィルムを有し、これは、その環境で生育する能力について既に天然に選択された生物からなる。これらの生物のサンプルを取り出し（例えば、バイオフィルムを掻き取ることによって）、標準的技法によって培養し、そして同定し得る。もし同定された種が他の理由でも適切であれば（例えば、遺伝的改変に簡便であり、そして腐食を阻害せずむしろ促進することが知られていない）、それらの種自体が、所望の抗菌剤を分泌するように改変され得る。しかし、所望により、その地点で見出された生物の純粋培養を購入し、またはその地点で見出された生物から生育した培養物でなくストックから生育し得る。いったん生物が選択された抗菌剤を分泌するように改変されると、それらは管、パイプ、塔、または他の施設に導入され得る。施設への導入は任意の簡便な手段によって、例えば、表面を一定間隔で掻き取ってバイオフィルムに裂け目を設け、その掻き取った部位に培養物のアリコートをピペットにより添加することによって、なし得る。好適な方法においては、細菌は単に、保護されるべき材料上を、高濃度の細菌を含む水の「栓」（すなわち、水の塊）を通過させることによって導入される。細菌は、水が通過した経路にわたってバイオフィルムに付着し、バイオフィルムの一体化した部分となるか、または未だバイオフィルムが存在しない場合、バイオフィルムを形成する。Ｄ．適用方法１．設備が最初の運転に入る前の生物の適用我々の研究は、表面のSRB関連分解の低減が、既に生じたコロニーの除去を試みるよりも、むしろSRBによる表面のコロニー化（コロニー形成）が防がれた場合、より成功することを示した。従って、本発明を実施する好適な方法は、装置、システムまたは施設が運転に供される前に、適切な抗菌剤（SRBの生育を阻害するために適切なものなど）を分泌する細菌で、腐食または分解に感受性の材料を処置することである。もし選択された細菌が胞子形成性であれば、その生物は胞子形成を生じる条件下で培養され、胞子は使用前の設備の乾燥表面に適用され、そして、設備が運転に入る直前に表面が濡らされて胞子が活性化され得る。細菌が胞子形成性でない場合、または、例えば時間の制約により、胞子形成細菌に最初に胞子を形成させることが簡便でない場合、任意の簡便な手段によって、例えば、ブラシで、スプレーで、エアゾール噴霧で、ピペットで、ホースで、または滴下により培養物を表面に適用することによって、細菌を含む媒体がその表面に適用され得る。もし表面が不規則であり、または隅および割れ目がある場合、表面へのスプレーがけまたはエアゾール噴霧が、隅および割れ目への良好な接種を可能にするので好適である。ある種の施設、例えば野外の泉、水冷塔、加熱および冷却システムなどは、水、油、または他の液体を、システムを通じて再循環させるように設計されている。そのような施設は、最初に水の塊を投入することによって簡便に接種され得、次にその水を用いてシステムが充填または洗い流される。開放され、または他の理由でシステムに配置された液体を再循環させない他の施設、例えばパイプもまた、このようにして接種され得る。２．施設の運転後の生物の適用 SRBがいったんバイオフィルム中に確立された後のその除去は難しい。ある種の状況では、器具、装置、または設備の全体または一部を分解し、そして表面の全体または一部を、例えば、濃縮された殺生物剤または「生の」スチームで、滅菌することが可能であり得る。他の状況では、分解し得ない施設を強力な殺生物剤または生のスチームで洗い流してバイオフィルムを殺菌することが可能である。そのように処置された施設は、使用前の処置のための直前の項目に記載されたのと同じ手段で、接種され得る。そのように処置され得ない施設、または、バイオフィルムを効率的に除去し得ない施設については、上記のように、既に存在する生物を所望の抗菌剤を分泌するように改変することによって、現存するバイオフィルムを有利に利用し得る。所望の試剤を分泌する細菌が、次にバイオフィルム中に再導入され得る。所望であれば、生物は単に液体または他の媒体中に導入され得、またはブラシでもしくはスプレーで表面に適用され得る。新しい菌が自身を確立し得る空間を創るために、その新しい菌を導入する前に、掻き取るかまたは他の方法でバイオフィルムを破壊することで、細菌がより首尾よく導入され得る。Ｅ．本発明の使用１．閉鎖系産業的、商業的および実用的装置において使用される多数の閉鎖系（すなわち、通常はその内容物を環境に放出しない系）がある。その例として、一般にその場で圧力試験されそして長期間液体を保存するために使用される、鉄鋼の保存容器、発電所、および工場、オフィスビル、および他の商業ビルの加熱および冷却プラントの両方において使用される水冷塔、熱交換器（これは、SRB関連腐食によって故障することが知られている）、ならびに防火システムが含まれる。これらの系は、代表的には金属のパイプおよび貯蔵コンテナを用いる。適切な抗菌剤、もしくは抗腐食剤、またはその両方を分泌する好気的細菌は、これらの装置に使用されて、SRB関連腐食を阻害する能力の向上したバイオフィルムを形成し得る。ヒトの消費のために作成された液体（例えば、ミルクおよびビール）を保存するために使用する容器、および、例えば生のスチームとの接触により、定期的に滅菌される容器は、代表的に本発明を用いて腐食から保護されることはない。航空機および他の燃料タンクもまた閉鎖系を構成する。前述のように、これらの系における腐食は細菌（シュードモナス属）または真菌の混入によて生じ得る。この装置においては、標的生物（シュードモナス属など）を阻害する抗真菌または抗菌剤を分泌するように改変された、セラチアなどの細菌が、これらの源からの腐食を低減するために導入され得る。系の継続的な保護のためには、一般的に、分泌のために選択される抗菌剤が、真菌、シュードモナス属、または他の標的生物に対するよりも、それを分泌する生物に対して低毒性であることが望ましい。２．開放系慣習的にまたは定期的にその内容物を（介在する処置を伴ってまたは伴わずに）環境に放出する系は、開放系と考慮され得る。このような系は、地方自治体の下水システム、雨どい、および排水システムを含み、これらは、代表的には、水または他の液体への比較的長期間のまたは繰り返される浸漬または露出に付されるコンクリート管を含む。それらの管は、SRBによって生成される硫化水素からの、硫黄酸化細菌による硫酸の形成のために、SRB関連腐食を受けやすい。従って、本発明による、それらのおよび同様なコンクリート管におけるSRBの阻害はこれらの構造物の腐食を低減し得る。３．環境に露出される構造物極めて多数の金属およびコンクリート構造物、例えば橋、鉄道の橋脚、高速道路の陸橋などが、水と頻繁にまたは継続的に接触する環境に晒され、その表面にバイオフィルムを発達せしめる。これら構造物のSRB関連腐食は、本発明の使用によって阻害され得る。実施例本発明を以下の実施例によって例示する。これらの実施例は、本発明を限定するためでなく、例示するために提供される。例１：バイオフィルムの構成および腐食阻害との相関本研究の主目的は、保護的バイオフィルムの構成を特徴付け、そしてバイオフィルムの構成要素を腐食阻害と相関させることであった。バイオフィルムは、生細胞、死細胞、およびエキソ多糖（exopolysaccharide）について染色し、共焦点走査レーザー顕微鏡（「CSLM」）を用いて可視化し、そして定量して深度プロフィール（depth profiles）を得た。温度および生育培地塩含量を増加させることの、バイオフィルム組成および腐食阻害の両方への効果を調べた。材料および方法細菌株、生育培地、および培養条件カナマイシン耐性のトランスポゾン変異体である腐肉細菌P．fragi ATCC 4973 (「P．fragi K」)，（Jayaraman，A．ら．1997a）およびテトラサイクリン耐性の腸内細菌E，coli DH5α(pKMY319)（Jayaraman，A．ら．1997a）が用いられたが、これはそのバイオフィルムを形成する能力に基づく(Parolis，L.A.S，ら．C arbohydrate Research 216:495-504(1991);Huang，C.-T．ら．Biotechnology an d Bioengineering 41:211-220(1993))。両方の株の培養とも、振盪を伴うことなく、23℃または30℃で、250mlエーレンマイヤーフラスコ中、フラスコには複数のSAE 1018金属クーポンを備えて、35mlのLuria-Bertani培地（以下「LB」）（M aniatis，T．ら，Molecular cloning:A Iaboratory manual，Cold Spring Harbo r Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1982)）（以下、Maniatisら，19 82）およびVaatanen nine salts溶液（"VNSS,"Hernandez，G．ら．Corrosion 50 :603-608(1994)）（以下、Hernandezら，1994）中で、これらに50μg ml^-1のカナマイシン（Jayaraman，A．ら．1997a）または25μg ml^-1のテトラサイクリン（Yen，K.-M．Journal of Bacteriology173:5328-5335(l991)）を補足して、行った。全ての株は、-85℃のグリセロールのストックから、適切な抗生物質を含むLB寒天培地上に縞状に稙菌した。次に単一のコロニーを取りだし、そして適切な抗生物質を含む10mlの生育培地に接種し、そして一晩30℃で、250rpm(Series2 5シェーカー，New Brunswick Scientific，Edison．NJ)にて生育した。0.1％の接種物（350μl）を用いて、腐食実験のためにバイオフィルムを形成させた。培地の再補充には、古い培地をゆっくりと除去し、そして新鮮な培地をエーレンマイヤーフラスコの壁に沿って穏やかに添加した。金属クーポンの調製および物質損失の決定 SAE 1018鋼クーポンは、重さ5.1グラム、直径25.5mm、厚さ1.2mmであり、鋼ストックから切り出し、そして240gritのポリッシングペーパー（Buehler，Lake B luff，IL）で研磨し、そして以前に報告したように調製した(Jayaramanら，1997 a)。観察される特定の物質損失（mg平方cm^-1）は、クーポンの全表面積（11.18 平方cm）で割ることにより決定し、そして腐食の程度の指標として用いた(Jayar amanら．1997a)。全ての腐食実験は、３連で行った。共焦点走査レーザー顕微鏡観察（CSLM）およびバイオフィルム厚さの決定表面にバイオフィルムが付着した金属クーポンをエーレンマイヤーフラスコから取りだし、そして0.85％ NaCl中に一度浸漬して大部分の上清細胞を除去した。細胞および多糖の染色は、30分間同時に、４mlの染色溶液中で行い、この染色にはLive/Dead Baclit bacteria viability assay kit protocol（1.125μl各染色成分ml^-1，Molecular Probes(Eugene，OR)）およびcalcofluor（300μg ml^-1 ，Sigma(St．Louis，MO)，Stewartら．1995）を用いた。live/dead viability k itは、生細胞と死細胞とを膜の一体性に基づいて識別する、すなわち、無傷の膜を有する生細胞は緑色に染められ、そして膜が傷つけられた死細胞は赤色に染められる。染色したクーポンは、共焦点走査レーザー顕微鏡（MRC 600，Bio-Rad， Hercules，CA）のステージ上に運ばれ、この顕微鏡はクリプトン／アルゴンレーザーおよび60X，1.4 NA油浸漬レンズを備える。この倒立顕微鏡のステージに置かれたバイオフィルムへの損傷を最小限にするために、直径1.8cmのカバースリップ（circlcs No.1，1.3〜1.7cm厚，Fisher Scientific Co.，Pitts burgh，PA ）クーポンの表面に穏やかに置き(これはキャピラリー作用によって保持される) 、そしてカバースリップの外側の領域では、このクーポン（直径2.55cm）は円形の顕微鏡開口（直径2.0cm）によって保持される。バイオフィルムの中央領域はクーポンの重さで圧迫されず、そしてこの領域のみが可視化された。サンプルは488nmで励起し、そして蛍光をK1/K2フィルターブロックの組合わせを用いてイメージングした。バイオフィルムは、MRC 1024共焦点顕微鏡（Bio-Ra d，Hercules，CA）で、T1/E2多目的フィルター組合わせを用いて分析した。0.5 〜1.0μmの薄い光学切片（水平の切片化）を、全体のバイオフィルムの厚みから、代表的な位置（同一のクーポン上のバイオフィルム中、４つの類似の位置の１つとして選ばれたもの）で採集された。バイオフィルムの厚さは、その上面と底面とに焦点を合わせ、その間隔を屈折率について補正することで観察し(Bakke， R.およびOlsson，P.Q.，Journal of Microbiological Methods 6:93-98(1986)) 、そして同一のクーポン上で分析された４つの類似の位置の平均値として厚さを決定した。イメージ分析全てのバイオフィルムのイメージ処理および分析は、COMOSソフトウエア（Bio -Rad MRC600で入手可能）で行った。光学切片は、画素強度に基づいて区別し、生細胞および死細胞、多糖、ならびに空隙を差別化した。一連の画素強度によってカバーされた各切片領域のパーセントを次に測定して、各切片中の構成成分の相対比率を得た。これら各構成成分の相対比率を、標準化された深さ（イメージが得られた深さをバイオフィルム厚さ全体で割ったもの）の関数としてプロットした。従って、位置0.0は、バイオフィルム一液体の界面を、そして位置1.0は、バイオフィルム一金属の界面を表す。結果Ｐ．ｆｒａｇｉおよびＥ．ｃｏｌｉでの腐食阻害Ｐ．ｆｒａｇｉＫまたはＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＫＭＹ３１９）を含むＬＢ培地およびＶＮＳＳ培地における質量喪失を、２３℃および３０℃にての静止バッチ培養において８日間試験した。ここで、増殖培地は、８日間毎日補充されるかまたは８日間変化させないままのいずれかであった。細菌懸濁物に浸漬させた金属クーポンは、滅菌培地に浸漬したクーポンと比較して、８日後の質量喪失に２.３〜６.９倍の減少を示した。これらの結果は、Ｊａｙａｒａｍａｎら（１９９７ａ）ならびにＰｅｄｅｒｓｅｎおよびＨｅｒｍａｎｓｓｏｎ（１９８９）の結果に良好に匹敵する。彼らは、ＶＮＳＳ培地中での１９日間の曝露後、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＳ９およびＳｅｒｒａｔｉａｍａｒｓｃｅｎｓを使用して、ＳＩＳ１１４６鋼の腐食の８倍減少を報告した。本発明者らの研究室での以前の研究は、滅菌新鮮ＬＢ培地および消費濾過ＬＢ培地におけるＳＡＥ１０１８鋼クーポンの腐食に差がないことを示した（Ｊａｙａｒａｍａｎら、１９９７ａ）。Ｐ．ｆｒａｇｉＫおよびＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αを用いて観察された８日間の質量喪失は、増殖培地および培養温度により変化した。合計の質量喪失は、低い方の温度で、両方の培地について少なかった。しかし、腐食阻害（滅菌コントロールの質量喪失の減少割合として）は、両方の培地において、高い方の温度で匹敵したかまたはより高かった。両温度にての両株での質量喪失は、ＶＮＳＳ培地と比較して、ＬＢ培地中でより少なかった。培地の毎日の補充は、３０℃のＶＮＳＳ培地中のＰ．ｆｒａｇｉＫ（ここで、腐食阻害は２.３倍近く良好であった）を除いて、腐食阻害に顕著に影響しなかった。培地補充に拘わらず、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＫＭＹ３１９）は、２３℃のＰ．ｆｒａｇｉＫより高い質量喪失を生じ、そして両方の株の存在下での質量喪失は、３０℃で匹敵した。滅菌コントロールは、培地が毎日置換されたかどうかに拘わらず、同程度に腐食した。細菌のほとんどの懸濁物中の金属クーポンは、最初の４日間の間に、約０.０３〜０.０６ｍｇ/ｃｍ²/日の速度で腐食した。腐食速度は４日を過ぎて減少した。滅菌コントロールは、両方の温度で、ＬＢ培地中より、ＶＮＳＳ培地中で、わずかに速い速度で腐食し、そして８日間の全期間、腐食速度は相対的に均一であった。ＣＳＬＭによるバイオフィルム厚の決定多クーポンを、２、３、４および８日後に培地から取り出し、細胞および多糖について同時に染色し、そしてＣＳＬＭによって分析した。１００×倍率（カバーガラスなし）および６００×倍率（カバーガラスあり）の下で観察されたバイオフィルムは、生存および死細胞ならびに多糖の同様な深度プロフィールを示した。Ｐ．ｆｒａｇｉＫおよびＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＫＭＹ３１９）バイオフィルムは共に、増殖培地への曝露の最初の４８時間以内に、検出可能な厚さ（約１０〜１５μｍ）まで発達した（データを示さず）。Ｐ．ｆｒａｇｉＫバイオフィルムは、異なる増殖温度、培地、および培地補充に関して、厚さが有意に変化しなかった。４日後、このバイオフィルムは約１４μｍ厚であった。８日間の曝露後、バイオフィルム厚は約１２μｍであった。Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＫＭＹ３１９）は、同様な傾向を示した。４日目のバイオフィルム（１３μｍ）は８日目のバイオフィルム（約１１μｍ）よりわずかに厚かった。バイオフィルムの特徴付け２３および３０℃の、培地補充を伴うおよび伴わない、ＬＢおよびＶＮＳＳ培地におけるＰ．ｆｒａｇｉＫおよびＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＫＭＹ３１９）バイオフィルムを特徴付け、そして画像解析を使用して分析し、４日目の正規化深度プロフィールを作成した。生存/死亡染色が生存および死亡細胞を有する集団を定量するために使用され得ることを確認するためのコントロール実験として、２００μｇ/ｍｌのカナマイシンを、１２時間、野生型Ｐ．ｆｒａｇｉ培養物に添加し、そして４８時間後ＣＳＬＭで可視化した。サンプルは赤（約７５％）が優勢であり、少数の緑および黄色細胞が存在した。バイオフィルムサンプルをまた、ＬＢ寒天プレート上にストリークし、そして主なストリーク路に沿った最小増殖を観察した（他方、抗生物質にさらされなかった細胞は、主なストリークに沿って細菌ローンとして増殖した）。したがって、染色は、死細胞を同定および定量するために使用され得る。Ｐ．ｆｒａｇｉＫおよびＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＫＭＹ３１９）バイオフィルムの深さ各１.０ｐｍの水平切片を、共焦点顕微鏡を用いて得た。そして、生存細胞、死細胞、エキソポリサッカリド（ＥＰＳ）、および空隙容量の分布を決定した。Ｐ．ｆｒａｇｉＫおよびＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＫＭＹ３１９）バイオフィルムは共に、金属表面近傍の細胞および多糖（存在する場合には）均一層からなった。細胞（生存および死細胞）対非細胞性物質（多糖および水チャンネル）の比は、すべてのバイオフィルムについて深度と共に変化した。両方の株のバイオフィルムは、ピラミッド状構造を示し、細胞は、バイオフィルムの底（バイオフィルム−金属界面）付近で、濃密な濃度で存在し、バイオフィルム−液体界面近くでは、まばらな分布をした。これは、Ｌａｗｒｅｎｃｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｌ．１７３：６５５８−６５６７（１９９１）と一致する。彼らは、連続培養した、複合および最小培地中のスライドガラス上に発達したＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓおよびＰ．ａｅｒｕｇｉｏｎｓａバイオフィルムについて同様なピラミッド状構造を報告した。ここで報告された研究では、バイオフィルムの上層は、生存細胞から優勢になり、生存細胞密度は、金属表面付近で減少した。多糖（存在する場合）を、通常、バイオフィルムの底付近（代表的には、金属表面から３μｍ）で検出した。緩やかに結合した生存および死細胞の厚い凝集塊（１５〜４０μｍ厚）が、バイオフィルムの上部（バイオフィルム−液体界面）に存在し、そしてこれはバイオフィルムの厚さの決定には考慮しなかった。Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＫＭＹ３１９）バイオフィルムはまた、増殖培地への８日間の曝露後、金属クーポンを覆う粘液物の薄層を有した。これは、染色手順の間、金属クーポンの上部に保持され得なかった。３０℃のＬＢおよびＶＮＳＳ培地におけるＰ．ｆｒａｇｉＫの４日目深度プロフィールを決定した。多くの細胞が、３０℃にて、ＶＮＳＳ培地中より、ＬＢ培地において成長したＰ．ｆｒａｇｉＫおよびＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αバイオフィルムにおいて検出された。さらに、多くの細胞質量ＬＢ培地において、より高い温度でＰ．ｆｒａｇｉで形成された。なぜならば、２３℃にて、５０％のバイオフィルムは、生存および死細胞から作製されるが、３０℃で成長したバイオフィルムは、９０％の生存および死細胞を有した。ＶＮＳＳ培地において発達したバイオフィルムにおいて、多糖が、バイオフィルムのほぼ１０〜５０％を説明し、そしてＬＢ培地において、５％未満のＥＰＳが検出された。培地を毎日置換することによって、バイオフィルム構成成分の相対的比率が、顕著に変化した。代表的には、より多くの生存細胞が、すべての条件下で、バイオフィルムにおいて検出される。バイオフィルムの造はまた、毎日の新鮮培地の添加により変化した。ほぼ等しい比率の細胞が、ピラミッド構造の代わりに、バイオフィルムのすべての深度で観察された。細胞性物質対非細胞性物質の比は、ほとんどの条件について、バイオフィルム全体を通じて、相対的に一定のままであった。そして多糖をＶＮＳＳ培地においてのみ検出した。多糖産生（存在する場合）の程度は、培地補充でより大きかった。バイオフィルムの上方層でより小さな凝集塊が観察された。生存細胞の比率はまた、バイオフィルムの底に向けて顕著に減少しなかった。結論バイオフィルムのＣＳＬＭ画像解析、および生存細胞、死細胞、ＥＰＳ、および空隙容量の定量は、最大細胞（生存および死）密度が、４日間の曝露の後得られ、そして４日以降減少することを明らかにした。したがって、ＬＢ培地およびＶＮＳＳ培地における金属クーポン上で増殖したＰ．ｆｒａｇｉＫおよびＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＫＭＹ３１９）の４日間バッチ培養バイオフィルムを、毎日培地補充し増殖した、４日目バイオフィルムのさらなる特徴付けおよび比較のために選択した。バイオフィルムの組成は、増殖培地、培養温度、および培地補充に依存する。４日目以降のＬＢ培地におけるバイオフィルムの発達は、細胞数の減少を示した。このことは、多糖マトリクスの不在が細胞の脱着を引き起こすことを示唆する。ＶＮＳＳ培地において、細胞は多糖マトリクス中に包埋され、そして８日目以降、曝露の際、金属表面からの脱着するよりすくない傾向を示した（データを示さず）。これは、ＤｅｗａｎｔｉおよびＷｏｎｇ，Ｉｎｔ’ｌ．Ｊ．ＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２６：１４７−１６４（１９９５）と十分に同等である。彼らは、トリプチカーゼダイズブロスおよび最小培地において増殖するＥ．ｃｏｌｉ０１５７：Ｈ７を有する同様なバイオフィルム構造を観察した。さらに、バイオフィルム細菌の生理学および細胞形態学は、異なる培地および温度で発達したバイオフィルムにおいて異なった。ＬＢ培地において発達したＰ．ｆｒａｇｉおよびＥ．ｃｏｌｉバイオフィルムは、小さく異なる細胞として観察された。対照的に、ＶＮＳＳ培地におけるバイオフィルムは、恐らくは環境ストレスに対する応答として、長く伸び、そしてクラスターであった。増殖培地を毎日補充することは、バイオフィルムの深さを通じて細胞含有量の少しの減少を引き起こし、より少ない凝集塊が観察された。栄養素の連続的利用可能性は、バイオフィルムへの代謝的に活性な細胞の付着をたぶん増大し得る。このことは、バイオフィルムの上部での細胞の添加が喪失細胞と置き換わり、そしてＣｏｓｔｅｒｔｏｎ（１９９５）の観察と一致する。バイオフィルム−液体界面での凝集塊の不在はまた、新鮮な増殖培地の毎日の添加および染色手順によって引き起こされるバイオフィルム構造に対する最小限の撹乱によって説明され得る。腐食結果と比較した場合のバイオフィルムの特徴（ＣＳＬＭにより見分ける）は、バイオフィルム中の合計細胞を増加させると、腐食阻害が増大することを示す。温度が２３℃から３０℃へ上昇することは、滅菌コントロールについて、腐食の１００％増大を生じ、そして研究した８つの条件（２つの細菌、２つの培地、および２つの温度）のうち６つに関して、細胞質量（バイオフィルムの全体の深度プロフィール沿って、生存および死細胞の合計の平均として算出）の１.６〜４.１倍の増加を生じた。細胞質量および温度のこの増加に対応して、８つのバイオフィルム条件のうちの６について腐食がわずか２２％増加した（毎日補充したＶＮＳＳ培地中のＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αについて、腐食は１００％増加し、そして補充なしのＶＮＳＳ培地中のＰ．ｆｒａｇｉＫについて、腐食は２３０％増加した）。したがって、一般に、温度上昇は細胞質量を増大させ、そしてバイオフィルムにより保護されたクーポンについて腐食の増加が、滅菌培地で観察される腐食よりずっとより小さかった（２２％対１００％）。７つの広範な細菌属（異なる程度のバイオフィルム形成）を用いる腐食阻害に関する本発明者らの研究室のおける以前の研究は、均質なバイオフィルムが必要であることを確認する（Ｊａｙａｒａｍａｎら、１９９７ｂ）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（これは、細胞が凝集塊で分布する、まばらなバイオフィルムを形成する）の細菌懸濁物に曝露された金属クーポンは、滅菌コントロールに匹敵する速度で腐食した。同様な滅菌コントロールにおける腐食に対する、Ｐ．ｆｒａｇｉを用いる４日後のこの研究における腐食の比が、２３℃および３０℃にて、ＬＢ培地およびＶＮＳＳ培地で等価であるので、４つの条件下でのバイオフィルムの厚さ、組成、および特徴が劇的に異なるとしても、同様な腐食阻害が、バイオフィルムによってもたらされる。したがって、特定の最小バイオフィルム厚または密度が腐食阻害に必要とされるようである。同様な結果が、３０℃のＶＮＳＳ培地中のＥ．ｃｏｌｉで生じた。増殖培地が毎日補充された場合、興味あることに、腐食阻害における顕著な差異が、３０℃のｄＶＮＳＳ培地においてのみ観察されたことに気づいた。バイオフィルムの厚さの増加または減少とは別に、培地の補充によって見られる主な差異のうちの１つは、バイオフィルムを通じての細胞分布の均一性の増大、および生存細胞の相対的比率の増大であった。この均一な細胞層は、腐食プロセスのために金属表面で利用可能な酸素の量を減少させ、それによって腐食を阻害し得る。他の条件については培地を補充しないと匹敵する腐食阻害の顕著な変化の欠如はまた、最小限の数の活性に呼吸している細胞により均一なバイオフィルムにおいて急速に達成される、特定の細菌による腐食阻害のための上限を示唆する。実施例２：バイオフィルムは銅およびアルミニウムの腐食を阻害し得るこの実施例は、バイオフィルムが銅およびアルミニウムの腐食を阻害し得ることを示す。微生物に対する銅の毒性は、銅の微生物誘導性腐食（ＭＩＣ）は取るに足らないという考えに至らせる（Ｉｖｅｒｓｏｎ、１９８７）。しかし、微生物により生成されるアンモニア、ならびにＴｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびスルフェート還元細菌（ＳＲＢ）による生成される硫酸は、銅合金の腐食を引き起こし得る（Ｉｖｅｒｓｏｎ、１９８７；ＷａｇｎｅｒおよびＬｉｔｔｌｅ、１９９３）。ＷａｇｎｅｒおよびＬｉｔｔｌｅは、銅におけるバイオフィルムの存在が、異なる曝気細胞、およびピッチングを引き起こし得る塩化物勾配を生じることを観察する。銅合金の腐食は、熱交換体、管類、船の海水配管、および飛行機の燃料タンクにおいて問題である（Ｉｖｅｒｓｏｎ，１９８７；Ｍｉｌｌｅｒ，１９８１）。Ｉｖｅｒｓｏｎはまた、真水および海水における銅の腐食が、細菌の添加により阻害され、細菌が死亡した後、腐食が増大したことに言及する。アルミニウムによる酸化物受動的フィルムの形成は、その腐食耐性を増強する（Ｉｖｅｒｓｏｎ，１９８７；ＷａｇｎｅｒおよびＬｉｔｔｌｅ、１９９３）。ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍは、アルミニウムおよびその合金のＭＩＣと一般的に関連づけられてきた（Ｉｖｅｒｓｏｎ，１９８７）。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによる腐食性有機化合物の産生は、アルミニウムおよび合金から亜鉛およびマグネシウムを除去し、そして腐食を引き起こし得る。ＳＲＢの３つの株によるアルミニウムのピッティングは、報告されており、そして滅菌コントロールに比較して重量の損失の１００倍の増加が観察された（Ｉｖｅｒｓｏｎ，１９８７）。材料および方法細菌株および増殖培地Ｐ．ｆｒａｇｉＫは、Ｐ．ｆｒａｇｉのカナマイシン耐性誘導体であり（Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａ．ら、１９９７ａ）、そしてＢ．ｂｒｅｖｉｓ１８は、グラミシジンＳ過剰産生株である（Ａzｕｍａ，Ｔ．ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１７３−１７８（１９９２））（本明細書以下で、Ａｚｕｍａら、１９９２）。金属表面上のバイオフィルムを、以前にＪａｙａｍａｎら（Ｊａｙａｍａｎ，Ａ．ら、１９９７ｃ）によって記載されたように改変されたＢａａｒ培地を有する連続的なリアクターにおいて発色させた。なぜなら、この培地は、好気性菌およびＳＲＢの増殖を支持するからである。サンプル調製非合金化銅およびアルミニウム合金２０２４プレート（7.5cm×7.5cm平方および1.2cm厚）を、シートストックから切除し、２４０グリット紙で研磨し（Ｂｕｅｈｌｅｒ，ＬａｋｅＢｌｕｆｆ，ＩＬ）、そして以前に記載されたように保存した（Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａ．ら、１９９７ｃ）。ＥＩＳを使用する連続的腐食速度インピーダンスデータ（最低２回の実験から）を、ＥＩＳＩＳ電気化学実験ソフトウェア（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｒｖｉｎｅ）（等価ソフトウエア、ＴＨＡＬＥＳＩｍｐｅｄａｎｃｅＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔａｎｄＥｑｕｉｖａｌｅｎｔＣｉｒｃｕｉｔＳｙｎｔｈｅｓｉｓ／Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ／ＦｉｔｔｉｎｇＳｏｆｔｗａｒｅが、ＢｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＷｅｓｔＬａｆａｙｅｔｔｅ，ＩＮ）（本明細書中以下で、ＴＨＡＬＥＳソフトウェア）から市販されている）を使用するＭａｃｈｉｎｔｏｓｈコンピュータ（ＰｏｗｅｒＭａｃ７１００／８０、ＡｐｐｌｅＣｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）に接続したＳｏｌａｒｔｏｎ−Ｓｃｈｌｕｍｂｅｒｇｅｒ電気化学測定ユニット（ＳＩ１２８０，ＳｃｈｌｕｍｂｅｒｇｅｒＴｅｃｈｎｉｃａｌＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＤｉｖｉｓｉｏｎ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）を使用して得た。リアクターの構成および操作条件は、以前に記載されたとおりであった（Ｂｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，１９９４，前出）。結果および考察銅およびアルミニウムを使用する全ての実験の分極抵抗Ｒ_p、キャパシタンスＣ、および腐食電位Ｅ_corrは、表Ｉに要約される。３０℃での改変Ｂａａｒ培地中の非合金化銅での腐食を、連続的リアクターを使用して研究し、そしてインピーダンススペクトルを得た。滅菌リアクター（５つの独立実験）は、曝露の１０日後に約５６°の最大位相角を有していた。銅上で増殖したＰ．ｆｒａｇｉＫバイオフィルム（５つの独立した実験）は、測定した最低の振動数（1.4×１０^-3 Ｈｚ）で同じ期間にインピーダンスを２１倍増大させた。これは、腐食の減少を示す。この腐食の減少はまた、位相角の増加（ｃ．ｆ．，５６°対７１°）によって実証された。同様のインピーダンススペクトル（２つの独立した実験）をまた、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ１８バイオフィルムが銅上で発色させた場合に、観察された。連続的なリアクターにおいてアルミニウム合金２０２４を有する滅菌改変Ｂａａｒ培地を用いて得たインピーダンススペクトル（２つの独立した実験）は、曝露の１０日後に低振動数で７１°の最大位相角を示した。Ｐ．ｆｒａｇｉＫバイオフィルムを、アルミニウム合金上で６日間発色させた場合（５つの独立した実験）、最大位相角は、７８°にシフトし、そしてＲ_pにおける８倍の増加もまた観察された。非合金化銅で観察されたように、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ１８バイオフィルム（３つの独立した実験）もまた、アルミニウム２０２４のＲ_pを５倍、そして位相角は、同様の条件下で７°増大させることができた。観察されたＲ_pの増加およびインピーダンススペクトルの変化は、滅菌コントロールに比較して、純培養Ｐ．ｆｒａｇｉＫバイオフィルムで、ＳＡＥ１０１８軟鋼のＲ_pの４０倍の減少および位相角の３５°の増大を報告したＪａｙａｒａｍａｎら、１９９７ｃの観察に類似している。実施例３：ペプチド抗菌剤は、SRBの増殖を阻害する。本実施例は、ペプチド抗菌剤がSRBの増殖を阻害することを示す。ペプチド抗菌剤は、低分子であり(Marahiel M．ら、Mol.Microbiol.7:631-636 (1993)；Nakano M.M.およびZuber,P.,Crit.Rev.Biotechnol.10:223-240(1990)) 、バイオフィルム形成好気性細菌において容易にクローニングされ得、そしてタンパク質工学を介して最適化され得る(Piers K.K.ら、Gene 134:7-13(1993))(本明細書中以降、Piers、1993)；それゆえ、バイオフィルムからSRBを排除するための魅力的な候補物である。 Salehら(1964)およびPostgate(Postgate J.R．The sulphate-reducing bacter ia．Cambridge University Press,New York(1984))(本明細書中以降、Postgate, 1984)は、種々のSRBに対して阻害性である抗菌剤のリストを編集した。これには、ペプチドポリミキシンＢ(これは、D.vulgarisを100ng/mlで阻害する)が含まれる。現在の研究によって、ペプチド抗菌剤のグラミシジンＳ(B.brevis由来の10 アミノ酸の環状ペプチド(Azumaら.,1992))、グラミシジンＤ(B.brevis由来の15 アミ (編),Genetics and Biochemistry of Antibiotic Production.Butterworth−Hei nemann，Boston(1995)))、アミド化(amidate)および非アミド化インドリシジン( indolicidin)(ウシ好中球由来の13アミノ酸の直鎖状ペプチド(Falla T.J.ら、J. Biol.Chem.271:19298-19303(1996))(本明細書中以降、Fallaら.,1996)；Selsted M.E.ら.,J.Biol.Chem.267:4292-4295(1992))(本明細書中以降、Selstedら.,199 2)、バクテネシン(ウシ好中球由来の12アミノ酸の環状ペプチド(Romeo D.ら,J.B iol.Chem.263:9573-9575(1988))(本明細書中以降、Romeoら.,1988))、ならびにポリミキシンＢ(Bacillus polymyxa由来の10アミノ酸の分岐した環状デカペプチド(Fujita-Ichikawa Y.およびK.Tochikubo,Microbiol.Immunol.37:935-941(1993 )))による、懸濁培養物における代表的なSRBであるD.vulgarisおよびD.gigasの阻害が記載される。材料および方法細菌株および増殖培地 D．vulgaris(ATCC 29579)およびD．gigas(ATCC 19364)を、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手し、そして各々100μLの酸素スカベンジャー４％硫化ナトリウムおよびOxyrase(Oxyrase Inc,．Mansfeld OH)を補充した、10mL の改変Baar培地（ATCC培地1249）を有する15mLのスクリューキャップ管で培養した。最初の培養物を、-85℃グリセロールストックから増殖し；すべてのその後の培養物を、振盪することなく30℃にて維持した最初の培養物からの３％接種物とともに増殖した。両方のSRBを、きつく締めたスクリューキャップ管において慣用的に培養し、そして層流フードにおいて酸素に曝露した（このことは、Ange ll，P.およびWhite，D.C.，J．Ind．Microb．15:329-332(1995)によって以前に報告されたように、培養を阻害しなかった）。SRBをまた、0.1％硫酸鉄(I I)アンモニウムの存在下で定期的に培養し、そしてこれらの硫酸塩還元剤の存在を、培養管における硫化鉄黒の検出によって確認した。各MPNアッセイ後にデスルホビリジンアッセイもまた行い、色素デスルホビリジンの発色団の放出に起因する、UV光下での赤色によって、D.vulgarisまたはD．gigasの存在を確認した(P ostgate，1984)。抗菌性ペプチドインドリシジン（アミド化かつ遊離酸形態）は、Prof．Michael E．Selsted o f UC Irvineの好意によって提供され、そして遊離酸形態は、Genosys Biotechno logies Inc．(The Woodlands，TX)によって76％の純度で合成された。グラミシジンＳ（96.5％の純度）およびグラミシジンＤ（100％の純度）、ならびにポリミキシンＢ（100％の純度）を、Sigma Chemical Co．(St．Louis，MO)から購入した。バクテネシンは、Genosys Biotechnologies Inc.によって32％の純度で合成され、そしてジチオトレイトール（「DTT」）の存在下（＜0.1％）で輸送した。合成したインドリシジン(酸形態、1907Da)およびバクテネシン(1486Da)の分子量を、MALDI飛行時間(TOF)質量分析計(Voyager DE5-2386-00，Perseptive Biosy stems，MA)を使用して確認した。 Vydac C18カラム(Vydac，Hesperia，CA)を、逆相HPLC(Varian Vista 5000シリーズ、Sugar Land，TX)に用いて、バクテネシンから残りのDTTを除去した（そして、残基３と残基11との間のジスルフィド結合の形成を促進した）。水中、アセトニトリル/0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)の移動相(20:80)を使用して、DTTを溶出し、続いて水系において50：50アセトニトリル/0.1％ TFAまで段階変化させ、バクテネシンを溶出させた。この画分は、DTTを含まないと考えられ、そして抗菌アッセイのために使用された。 SRB阻害アッセイ SRBの生存指数（Romeoら、1988）を決定するために、対数後期培養物（O.D₆₀₀ 0.16〜0.19、これは、５〜９×10⁴細胞/mLという最初の細胞数に対応する）を、種々の濃度の抗菌剤に、30℃にて１時間曝露した。１mLの細胞を収集し、新しい改変Baar培地中で１回洗浄して細胞細片を除去し、そして各々10μLのOxyrase (Oxyrase Inc.，Mansfeld，OH)および４％硫化ナトリウムを補充した１mLの新しい改変Baar培地中に再懸濁した。450μLのアリコートを、500μLの滅菌エッペンドルフチューブ中に分散させ、そして適切な量の抗菌剤を添加し、そして30℃にてインキュベートした。処理の有効性を、複数管での最も確かな数(MPN)の発酵技術（multiple-tube most-probable-number（MPN）fermentation technique）によって決定した。（Anonymous．Multiple-tube fermentation technique for members of the coli form group，9-45〜9-51頁、A.E．Greeenberg，L.S．Cles ceri、およびA.D．Eaton(編)、Standard Methods for the Examlnation of Wate r and Wastewater，第18版、American Public health Association，American W ater Works Association，およびWater Pollution Control Federation，New Yo rk(1992)）(本明細書中以下で、Greenberg，1992)。 SRBを計数するためのMPNテストを、SRBの1000μL接種物を含む３つの12mL管、 500μL接種物を含む３つの12mL管、および100μLの接種物を含む12mL管において実施した。９つのすべての管は、各々100μLの４％硫化ナトリウムおよびOxyras e(Oxyrase Inc,．Mansfeld，OH)を補充した、最終容量10mLの改変Baar培地を含んだ。管を72時間モニタリングし、増殖について陽性である管の数を決定した。増殖を、培養懸濁度における増加によって決定し、そしてMPN指数/mLを、Thomas の式を使用して計算した(Greenberg 1992)。結果および考察Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓおよびＤ．ｇｉｇａｓを、種々の抗菌ペプチドの存在下でインキュベートし、そして１時間曝した後のそれらの生存率を測定したアンピシリンを、Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓのポジティブコントロールとして用いた。なぜなら、これとクロラムフェニコールがこの株を２０μｇ/ｍＬで阻害することが見出されたからであり、これは先の報告と一致する(ＯｄｏｍおよびＳｉｎｇｌｅｔｏｎ、Ｔｈｅｓｕｌｆａｔｅ−ｒｅｄｕｃｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ：ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ、ＮｅｗＹｏｒｋ(１９９３)(以後ＯｄｏｍおよびＳｉｎｇｌｅｔｏｎ、１９９３)；しかし、アンピシリンまたはクロラムフェニコールのいずれも、１００μｇ/ｍＬでＤ．ｇｉｇａｓを阻害することにおいては有効ではなかった。いくつかのさらなる抗生物質(カナマイシン、テトラサイクリン、チオストレプトン、ペニシリンＧ、およびナリジクス酸(ｎａｌａｄｉｘｉｃａｃｉｄ))、無機物(モリブデン酸アンモウニム、モリブデン酸ナトリウム、およびアントラキノン)、およびペプチド(ナイシンおよびポリミキシンＢ)に対する両方のＳＲＢの感受性もまた、ＳＲＢの定常相培養物を用いて評価した。Ｄ．ｇｉｇａｓは、１００μｇ/ｍｌのアントラキノンで阻害され(Ｃｏｏｌｉｎｇら、１９９６) 、そして両方のＳＲＢは、１００μｇ/ｍｌのモリブデン酸ナトリウムで阻害された。これは、ほぼ２００の化合物を、それらのＳＲＢ阻害活性について調査し、そしてＳＲＢが阻害性化合物(前出)に対する高い程度の耐性を示すことを注記した、Ｓａｌｅｈら、１９６４の観察に類似している。ＭＰＮアッセイを用いて、Ｄ．ｇｉｇａｓおよびＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓのペプチド抗菌剤に対する生存率指数を決定した。Ｄ．ｇｉｇａｓに対しては、グラミシジンＳ、およびインドリシジン、Ｉｎｄ−ＮＨ₂(これはウシ好中球中の天然に存在する形態である(Ｆａｌｌａら、１９９６)；Ｓｅｌｓｔｅｄら、１９９２) のアミデート形態は、２５μｇ/ｍＬに１時間曝した後、後期指数相培養の生存率を９２−９６％減少し得た。Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓについては、２５μｇ/ｍＬのＩｎｄ−ＮＨ₂は、増殖を阻害することにおいてわずかにより効果的であり( 生存率を９９．３％減少させた)、その一方グラミシジンＳは、より効果的ではなく、そして１００μｇ/ｍＬで９３％生存率を減少させた。インドリシジンの酸形態(Ｉｎｄ−ＯＨ)は、Ｄ．ｇｉｇａｓに対して、インドリシジンのアミデート形態に比べ１０倍より効果的ではなく、そして２５μｇ/ｍＬで、Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓに対して１７４倍より効果的ではなかった。これは、翻訳後のアミデーションがインドリシジンの効力を増加すると考えられているので(Ｆａｌｌａら、１９９６)驚くことではない。ペプチド抗菌剤グラミシジンＤ、ポリミキシンＢ、およびバクテネシン(Ｐｏｓｔｇａｔｅ、１９８４）もまた、１００μｇ/ ｍＬでＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓおよびＤ．ｇｉｇａｓの生存率を約９０％減少し得た。これらのＭＰＮアッセイ結果はまた、Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓをグラミシジンＳ、グラミシジンＤ、インドリシジン、およびバクテネシンに１時間の間曝し、Ｄｅｓｕｆｏｖｉｂｒｉｏ寒天(ＡＴＣＣ培地４２)上に播き、そして嫌気ＧａｓＰａｋチャンバー(ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏ．、Ｐｉｔｔｓｂｒｕｇｈ、ＰＡ)中でインキュベートしたとき、得られる同様の結果により確証された。これらの結果は、グラミシジンＳ、インドリシジン、ポリミキシンＢ、およびバクテネシンのようなペプチド抗菌剤が、ＳＲＢの増殖を阻害するために用いられる能力をもち、そして微生物的に影響された鋼の腐食を低減することを示す。インドリシジンは、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓを５−２５μｇ/ｍＬで９９．９％阻害し得る(Ｒｏｍｅｏら、１９８８；Ｓｅｌｓｔｅｄら、１９９２)；しかし、この研究では、Ｄ．ｇｉｇａｓおよびＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓは、インドリシジンに対してより大きな抵抗性を示した。バクテネシンは、１００μｇ/ｍＬで９５％Ｅ．ｃｏｌｉを阻害し(Ｒｏｍｅｏら、１９８８)、そしてこの研究で、Ｄ．ｇｉｇａｓおよびＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓの比較し得る阻害を示した。グラミシジンＳもまた、３− １２．５μｇ/ｍＬでグラム陰性細菌の増殖を完全に阻害することが知られ(ＫｏｎｄｅｊｅｗｓｋｉＬら、Ｉｎｔ．Ｊ．ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ．４７：４６０−４６6(１９９６))、そしてこの研究で５０−１００μｇ/ｍＬで両方のグラム陰性ＳＲＢに対する阻害効果を示した。懸濁培養におけるＳＲＢに対するそれらの活性を基に、この研究で試験されたすべての抗菌ペプチドは、比較し得る濃度で、市販の抗生物質である、カナマイシン、ナリジクス酸、およびテトラサイクリン、ならびにモリブデン酸ナトリウムおよびアントラキノンのような無機物より強力であった。実施例４：クローン化抗菌剤を分泌する細菌を用いるバイオフィルムからのＳＲＢの排除この実施例は、細菌における抗菌化学薬剤のクローニングおよび発現、ならびにステンレス鋼上のバイオフィルムからＳＲＢを排除するそれらの使用を示す。抗菌ペプチドは、いくつかの細菌(Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｒ．Ｅ．Ｗら、Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：１３５−１７５(１９９５))、植物(Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｒ．Ｗ．ら、Ｃａｔｉｏｎｉｃｐｅｐｔｉｄｅｓ：あるクラスの抗生物質は、Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外膜を横切る自己促進取り込み経路に接近し得る、４４１−４５０頁、Ｔ．Ｎａｋａｚａｗａ編、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＰｓｕｄｏｍｏｎａｓ、ＡＳＭｐｒｅｓｓ、ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．(１９９６))(以後、Ｈａｎｃｏｃｋら、１９９６)、昆虫(Ｂｏｍａｎ，Ｈ．Ｇ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０：２３−３１(１９９１))、および哺乳動物(Ｆｒａｎｋ，Ｒ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５(３１)：１８８７１−１８８７４(１９９０)；Ｌｅｈｒｅｒ，Ｒ．Ｉ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１０５− １２８(１９９３)；Ｚａｓｌｏｆｆ，Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：５４４９−５４５３(１９８７))(以後、Ｚａｓｌｏｆｆ、１９８７) から同定されかつ単離されている。これらのペプチドは、ひろく、マゲイニン( ｍａｇａｉｎｉｎ)(Ｚａｓｌｏｆｆ、１９８７)、ディフェンシン(ｄｅｆｅｎｓｉｎ)(Ｃｕｌｌｏｒ，Ｊ．Ｓ．ら、Ａｒｃｈ．Ｏｐｈａｌｍｏｌ．１０８：８６１−８６４(１９９０))(以後、Ｃｕｌｌｏｒら、１９９０)、セクロピン(ｃｅｃｒｏｐｉｎ)(Ｃａｌｌｏｗａｙ、Ｊ．Ｗら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．３７：１６１４−１６１９(１９９３))(以後Ｃａｌｌｏｗａｙら、１９９３)；メリチン(ｍｅｌｉｔｔｉｎ)(Ｐｉｅｒｓ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２(６)：９５１−９５８(１９９４))(以後、Ｐｉｅｒｓら、１９９４)に分類され得、そしてグラム陰性およびグラム陽性細菌ならびに酵母および真菌に対して抗菌活性を表すことが示されいる(Ｈａｎｃｏｃｋら、１９９６)。多くのカチオン性ペプチドは、複数のリジンおよびアルギニン残基ならびに疎水性および親水性面を有し(Ｈａｎｃｏｃｋら、１９９６) 、そして細菌細胞膜の透過性を増加することにより、またはＤＮＡ合成を阻害することにより微生物を殺す(Ｈａｎｃｏｃｋら、１９９６；Ｒｏｍｅｏら、１９８８)。インドリシジン(Ｃｕｌｌｏｒら、１９９０；ＤｅｌＳａｌ，Ｇ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８７(１)：４６７−４７２( １９９２))およびバクテネシン(Ｆｒａｎｋ，Ｒ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５(３１)：１８８７１−１８８７４(１９９０)；Ｒｏｍｅｏら、１９８８)は、ウシ好中球から単離されたカチオン性抗菌ペプチドである(Ｌｅｈｒｅｒ，Ｒ．Ｉ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１０５−１２８( １９９３))。インドリシジンは、ディフェンシンのファミリーに属するトリデカペプチドであり(Ｓｅｌｓｔｅｄら、１９９２)、そして任意の既知のタンパク質の中で、トリプトファンが最も高い比率を占める(３９％)６種の異なるアミノ酸のみから成る(Ｆａｌｌａら、１９９６)。インドリシジンはまた、最も小さな既知の直鎖状抗菌ペプチドであり、そしてそのカルボキシ末端は、その天然に存在する形態においてアミデート化されている(Ｆａｌｌａら、１９９６；Ｓｅｌｓｔｅｄら、１９９２)。バクテネシンは、アルギニンに富む、環状ドデカペプチドであり、そして環状構造を維持するジスルフィド結合を含む(Ｒｏｍｅｏら、１９８８)。商業的適用のために原核および真核発現系において抗菌ペプチドを産生するためになされた試みは少ない。Ｐｉｅｒｓら(Ｐｉｅｒｓら、１９９３およびＰｉｅｒｓら、１９９４)は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ発現系を用いる細菌において、ヒト好中球ペプチド１(ＨＮＰ−１)およびセクロピン/メリチンハイブリッドペプチドを合成および精製する手順を記載している。これらのペプチドは、プロテインＡへの融合物として合成され、培養培地中に分泌され、そしてアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製された(Ｐｉｅｒｓら、１９９３)。Ｃａｌｌｏｗａｙ(Ｃａｌｌｏｗａｙら、１９９３)は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でセクロピンＡの発現を試み、そしてカルボキシ末端の翻訳後修飾が高抗菌活性に必要であったと結論づけた。ＨａｒａおよびＹａｍａｋａｗａ(Ｈａｒａ，ＳおよびＭ．Ｙａｍａｋａｗａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２４(３)：８７７−８７８(１９９６))は、ペプチドモリシン(ｍｏｒｉｃｉｎ)を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で、マルトース結合タンパク質への融合物として生産し、そして活性がネイティブタンパク質に匹敵することを見いだした。Ｈａｕｇｈｔら(Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５７：５５−６１(１９９８))は、ウシプロキモシンへの融合物を用いて、封入体としてＥ．ｃｏｌｉ中の組換えアンチセンス抗菌ペプチドＰ２の産生を報告した；高レベルのタンパク質が発現された(総細胞タンパク質のほぼ１６％)。Ｐａｎｇら(Ｇｅｎｅ、１１６：１６５−１７２(１９９２))(以後、Ｐａｎｇら、１９９２)は、スコルピオン昆虫トキシンＩ₅Ａの細菌、酵母、およびタバコ植物における発現および分泌を試みた(測定可能な活性は検出されなかった)。これらアプローチのすべては、インビボ適用よりもむしろ、精製された抗菌ペプチドの大スケール、安価な生産を標的にした。先の実施例では、本発明者らは、精製抗菌ペプチドであるインドリシジン、非アミデート化インドリシジン、およびバクテネシンが、懸濁培養において嫌気性ＳＲＢを阻害することを示した。この実施例では、好気性バイオフィルム形成性細菌における抗菌ペプチドの産生が、バイオフィルムからＳＲＢを排除し、そしてＳＲＢが誘導する金属の腐食を阻害し得ることを示す。特に、この実施例は、グラム陽性Ｂａｃｉｌｌｕｓにおけるカチオン性抗菌ペプチドインドリシジンおよびバクテネシンの発現、および３０４ステンレス鋼上のバイオフィルム中のＳＲＢの排除におけるそれらの使用を示す。インドリシジンおよびバクテネシンは、アルカリプロテアーゼ(apr)シグナル配列への融合物としてクローン化され、そしてaprプロモーターを用いて構成的に発現された。バルナーゼ(Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来の細胞外ＲＮａｓｅ)のプロ領域もまた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ中のプレプロペプチドとしてバクテネクチンを生産するために利用された。これらの株の、連続リアクターにおけるＳＡＥ１０１８軟鋼および３０４ステンレス鋼上のＳＲＢの増殖を阻害する能力を特徴付けた。材料および方法細菌株、プラスミドおよび増殖培地Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１(Ｂｌｕｅ)｛ｒｅｃＡ１ｅｎｄＡ１ｇｙｒＡ９６ｔｈｉ−１ｈｓｄＲ１７ｓｕｐＥ４４ｒｅｌＡ１ｌａｃ［Ｆ'ｐｒｏＡＢｌａｃ１^qＺＤＭ１５Ｔｎ１０(Ｔｅｔ^r)］｝は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ(ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ)から購入した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＥ１５００｛ｔｒｐＣ２，ｍｅｔＢ１０，ｌｙｓ−３，ΔａｐｒＥ６６，Δｎｐｒ−８２，ΔｓａｃＢ：：ｅｒｍＣ｝、およびアルカリプロテアーゼ(ａｐｒ)プロモーター、シグナル配列、およびアルカリホスファターゼレポーター遺伝子を含むプラスミドｐＢＥ９２は、Ｅ．Ｉ．ｄｕＰｏｎｔｄｅＮｅｍｏｕｒｓＩｎｃ．(Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ)から得た。プロテアーゼ欠損株Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＷＢ６００(Ｗｕ，ｘ．-Ｃら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３(１６)：４９５２−４９５８(１９９１))(以後Ｗｕら、１９９１)｛ｔｒｐＣ２，ΔｎｐｒＥ，ΔａｐｒＡ，Δｅｐｒ，Δｂｐｆ，Δｍｐｒ，ΔｎｐｒＢ｝は、Ｓｕｉ−ＬａｍＷａｎｇ(ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｇａｒｙ，Ａｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ)から得た。Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａは、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ＡＴＣＣ１０４０１)から得た。Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓ(ＡＴＣＣ株２９５７９)を、本研究における参照ＳＲＢとして用いた。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＥ１５００およびＰ．ｆｒａｇｉＫ(Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａ．ら、１９９７ａ)を用いたすべての腐食実験は、硫酸塩還元細菌のための改変Ｂａａｒ培地(ＡＴＣＣ培地１２４９)中で実施した。Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａを用いる腐食実験は、１／１０容量の１０×ＴＹ培地(１００ｍＬＨ₂Ｏ中１０ｇトリプトン、５ｇ酵母エキス)を補填した改変Ｂａａｒ培地中で実施した。酵素および化学薬品すべての制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、およびＴａｑポリメラーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａ(Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ)から得た。ＢＣＩＰ(５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート)は、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．(Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ)から購入した。インドリシジン(遊離酸形態、７６％純度 )およびバクテネシン(３２％純度)は、ＧｅｎｏｓｙｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．(Ｔｈe Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ)により合成された。プラスミド構築組換えＤＮＡ法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ(Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、１９８２) およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＴａｉｔ(Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．ら、ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｎｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ＴｈｅＢｅｎｊａｍｉｎ/ＣｕｍｍｉｎｇｓＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙＩｎｃ．，ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，ＣＡ(１９８３))により記載のように実施した。プラスミドＤＮＡは、ＢｒａｍｕｃｃｉおよびＮａｇａｒａｊａｎ(Ｂｒａｍｕｃｃｉ，Ｍ．Ｇ．およびＶ．Ｎａｇａｒａｊａｎ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２(１１)：３９４８−３９５３( １９９６))(以後、Ｂｒａｍｕｃｃｉ、１９６６)の手順に従ってＢａｃｉｌｌｕｓから単離した。非アミデート化インドリシジン［ＮＨ₂−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＯＨ］(Ｓｅｌｓｔｅｄら、１９９２)およびバクテネシンＮＨ₂ −Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ −Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−ＯＨ］(Ｒｏｍｅｏら、１９８８)のアミノ酸配列を用いて、これらペプチドの遺伝子をコードするオリゴヌクレオチドを設計した。プラスミドｐＢＥ９２−Ｉｎｄは、ａｐｒシグナル配列に融合した１２アミノ酸ペプチドとして非アミデート化インドリシジンを発現するように設計し、ｐＢＥ９２−Ｂａｃは、ａｐｒシグナル配列に融合した１３アミノ酸ペプチドとしてバクテネシンを発現するように設計し、そしてｐＢＥ９２−ＰｒｏＢａｃは、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓからの細胞外ＲＮａｓｅバルナーゼのプロ領域(Ｐａｄｄｏｎ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１(２)：１１８５−１１８７(１９８９))(以後、Ｐａｄｄｏｎら、１９８９)およびａｐｒシグナル配列に融合したバクテネシンを発現するように設計した。合成オリゴ(図１)は、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ(ＬｏｎｇＩｓｌａｎｄＮＹ)により２００ｎｍｏｌｅスケールでポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)精製を用いて合成された。このオリゴは、有効な制限消化のためにいずれかの末端にさらなる６塩基をもつ隣接のＨｉｎｄ III およびＮｈｅＩ制限部位とともに合成された。各構築物の２つ完全に相補的なオリゴを、ＴＥ緩衝液に再懸濁し(５０ｎｇ/μＬ)、等モル比で混合し、そして沸騰水中３分間インキュベートした。これらオリゴは、それらが室温に冷却されるにつれ水浴中でアニールした(約２時間)。アニールしたオリゴを、Ｈｉｎｄ III およびＮｈｅＩで一晩消化し、−８５℃で１時間エタノール沈澱し、そして脱イオン蒸留Ｈ₂Ｏに再懸濁した。プラスミドベクターｐＢＥ９２は、プラスミドｍｉｄｉキット(ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ)を用いてＥ．ｃｏｌｉＸＬＩ(Ｂｌｕｅ)細胞抽出物から単離し、そしてＤＮＡを、Ｈｉｎｄ III、ＮｈｅＩ、およびＳａｌＩ、で同時に３７℃で１４時間消化した。３重消化ベクターおよび抗菌遺伝子挿入物を、２８：１の挿入物：ベクターモル比で１７時間１６℃で連結した。連結混合物を、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(２５：２４：１)で抽出し、エタノール沈澱し、そして３０μＬのｄｄＨ₂Ｏ中に再懸濁した。プロバクテネシンを、２つの鎖の末端に、Ｈｉｎｄ IIIおよびＮｈｅＩ、制限部位をもつ２１塩基対の相補的領域を備えた２つのオリゴ鎖として合成した(図２)。ＮｏｔＩ部位もまた、停止コドンの下流に加工され、ｐＢＥ９２中に唯一の部位を導入するために供された。２つの鎖を上記のようにアニールし、そして相補的領域を、Ｔａｑポリメラーゼ(１サイクル、９４℃で３０秒、次いで５５ ℃で３０秒、および７２℃で２時間)をＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒＮ８０１−０１５０(ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ)とともに用いて完成した。最終産物を、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールで抽出し、１ｍＭＭｇＣｌ₂存在下で１時間−８５℃でエタノール沈澱し、そして５０μＬｄｄＨ₂Ｏ中に再懸濁した。形質転換体は、ＢｇｌＩ(インドリシジン)、ＢｓｓＨ II(バクテネシン)、およびＮｏｔＩ(プロバクテネシン)を用いた制限消化により同定し、そしてＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｎコロニーリフトアッセイの改変を用いて確認した。２００ナノグラムのプラスミドＤＮＡ(抗菌遺伝子をもつ推定の形質転換体のミニプレップ由来のＥ．ｃｏｌｉ)を、正に荷電したナイロンメンブレン(製品番号１２０９２７２、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ)上にスポットし、そしてＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍからのランダムプライムＤＮＡ標識プロトコールを用いて標識した抗菌遺伝子合成オリゴＤＮＡ(図１)を用いる製造業者の仕様に従ってプローブした。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓの形質転換Ｅ．ｃｏｌｉＸＬＩ(Ｂｌｕｅ)細胞を、ＳｍｉｔｈおよびＩｇｌｅｗｓｋｉ (Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｗ．ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：１０５０９(１９８９))の方法に従ってエレクトロコンピテントにした。１０μＬの連結混合物を用い、遺伝子パルサー/パルスコントローラー(Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ)を用いて細菌をエレクトロポーレートし(１．２ｋＶ/ｃｍ、２００オーム、２５μＦ)、そして正確な挿入物を含むクローン(ｐＢＥ９２−インドリシジン、ｐＢＥ９２−バクテネシン、およびｐＢＥ９２−プロバクテネシン)を、青/白選択技法を用いて１００μｇ/ｍＬのアンピシリンおよび４０μｇ/ｍＬのＢＣＩＰを含むＬＢ寒天平板上で選択した(正確な挿入物をもつ形質転換体は白コロニーを生じ、その一方再閉鎖したベクターは青コロニーを生じる)。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＥ１５００をコンピテントにし、そしてＣｕｔｔｉｎｇおよびＶａｎｄｅｒＨｏｒｎ(Ｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓ，２７− ７４頁、Ｃ．Ｒ．ＨａｒｗｏｏｄおよびＳ．Ｃｕｔｔｉｎｇ，Ｍ．編、ＭｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒＢａｃｉｌｌｕｓ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ(１９９０))の２段階法に従って形質転換した。後期指数相のコンピテント細胞を、プラスミドＤＮＡ(Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１(Ｂｌｕｅ)から単離された約１μｇ)と３０分間インキュベートした。培養物を、１ｍＬの１０％酵母エキスで希釈し、そして２５μｇ/ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天平板に播く前に、ロータリーシェーカー(ＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ，シリーズ２５シェーカー)中３７℃でインキュベートした。Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａコンピテント細胞は、Ｒｏｓａｄｏら(Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．１９：１−１１(１９９４))の手順に従って調製した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＥ１５００(Ｎａｇａｒａｊａｎ，Ｖ．ら、Ｇｅｎｅ１１４：１２１−１２６(１９９２))からＢｒａｍｕｃｃｉおよびＮａｇａｒａｊａｎ(Ｂｒａｍｕｃｃｉ，１９９６)の手順を用いて単離した約１μｇのＤＮＡ(ｐＢＥ９２を基礎にした構築物)を用いて、Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａをエレクトロポーレートした(６．２５ｋＶ/ｃｍ、２００オーム、２５μＦ)。次いで細胞を、振とうしながら３７℃で３時間インキュベートし、そして１５０μｇ/ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天平板上で選択した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ抗菌ペプチド遺伝子を発現するプラスミドｐＢＥ９２を基礎にした構築物を含むＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＥ１５００を、２５ｍＬのＬＢ培地中、３７℃で後期指数相(Ｏ．Ｄ₆₀₀＝０．７０−１．０)まで増殖させた。細胞を、１０，０００×ｇで１０分間４℃で遠心分離により集め、そして上清を、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器(モデル２００Ｈ，ＳａｖａｎｔＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＩｎｃ．，Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，ＮＹ)を用いて２５倍濃縮した。濃縮された上清を、２×試料緩衝液(１００μＬの２×緩衝液毎に添加された５μＬの２−メルカプトエタノールとともに、０．１２５ＭＴｒｉｓベース、０．４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、および０．１ｍＬの１ｍｇ/ｍＬブロモフェノールブルー)と混合し、５分沸騰させ、そして１６．５％Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅゲル(Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ)上で電気泳動した。連続腐食実験ＳＡＥ１０１８軟鋼クーポン(２．５ｃｍ直径、１．２ｍｍ厚さ)を用いた回分培養腐食実験を、先に記載のように(Ｊａｙａｒａｍａｎら、１９９７ａ)振とうすることなく３０℃で２５０ｍＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中３つ重複して行った。連続リアクター(Ｊａｙａｒａｍａｎら、１９９７ｃ)もまた、３０４ステンレス鋼上にバイオフィルムを生成するために用い、そして電気化学的インピーダンススペクトル法(ＥＩＳ)を用い、最低限２つの独立したリアクター内で、ＥＩＳＩＳ電気化学実験ソフトウェア(ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｒｖｉｎｅ)を走らせた(類似の市販のソフトウェア，ＴＨＡＬＥＳもまた使用され得る)Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピューター(ＰｏｗｅｒＭａｃ７１００/８０，ＡｐｐｌｅＣｏｍｐｕｔｅｒ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ)にインターフェースされたＳｏｌａｒｔｏｎ−Ｓｃｈｌｕｍｂｅｒｇｅｒ電気化学的測定ユニット(ＳＩ１２８０，ＳｃｈｌｕｍｂｅｒｇｅｒＴｅｃｈｎｉｃａｌＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＤｉｖｉｓｉｏｎ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ)を用いてモニターした。開放回路ポテンシャル(ＯＣＰ)を、金属標本とＡｇ/ＡｇＣｌ参照電極との間のポテンシャルとして測定し、そしてポーラリゼーション抵抗(Ｒｐ)をインピーダンスの低振動数値として測定した(ここではインピーダンスの想像上の部分はゼロまたは無視した)。連続培養腐食速度は、ポーラリゼーション抵抗の逆数として推定された(Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｄ．Ｄ．およびＭ．Ｃ．Ｈ．ＭｃＣｕｂｒｅ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｉｍｐｅｄａｎｃｅｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，２６２−２６７頁、Ｊ．Ｒ．Ｍａｃｄｏｎａｌｄ編、Ｉｍｅｐｅｄａｎｃｅｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｅｍｐｈａｓｉｚｉｎｇｓｏｌｉｄｍａｔｅｒｉａｌｓａｎｄｓｙｓｔｅｍｓ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ(１９８７)；Ｓｔｅｒｎ，Ｍ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ，１０５(１１)：６３８−６４７(１９５８))。抗菌アッセイ宿主Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＥ１５００およびＢ．ｐｏｌｙｍｙｘａの発現された抗菌剤に対する感受性を測定するために、これらの株を、単一コロニーから、２５ｍＬのＬＢ培地中で振とうしながら、３７℃で０．４０−０．４５のＯ．Ｄ₆₀₀まで増殖させた。１ｍＬのアリコートを集め、新鮮ＬＢ培地で洗浄し、そして殺菌エッペンドルフチューブ中の１００μｌ新鮮ＬＢ培地中に再懸濁した。抗菌剤インドリシジンおよびバクテネシンを添加し(５０−１００μｇ/ｍＬ)、そしてチューブを振とうせずに１時間３０℃でインキュベートした。適切な希釈液をＬＢ寒天平板上に播き、そして３７℃で一晩インキュベートし、生存の程度を測定した。結果は、２つの独立した実験を行うことにより確実にした。Ｂａｃｉｌｌｕｓにおけるインドリシジンとバクテネシンの発現は、懸濁Ｅ．ｃｏｌｉＢＫ６を、濃縮した培養上清に曝すことにより２重の実験で測定した。Ｅ．ｃｏｌｉＢＫ６を、０．２０−０．２５のＯＤ₆₀₀まで増殖させ、室温でペレット化し、そして異なる容量(５０または１００μＬ)の濃縮した上清に再懸濁した。この細胞懸濁液を、通気なしで１時間３０℃でインキュベートし、そして適切な希釈液をＬＢ寒天平板上に播き、上清の抗菌活性を測定した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ構築物由来の上清の懸濁ＳＲＢを阻害する能力は、５００μＬの後期指数相のＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓ培養(Ｏ．Ｄ₆₀₀＝０．１５−０．２０)を、等容量の抗菌構築物をもつＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＥ１５００からの２５倍濃縮培養上清中に、先の実施例で記載したように嫌気条件下で再懸濁することにより決定された。細胞を、３０℃で１時間インキュベートし、そして生存するＳＲＢを、３チューブ最可能性数(ＭＰＮ)アッセイ(Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、１９９２)を用いて数えた。バイオフィルム中の生存ＳＲＢの数を３チューブＭＰＮ法により測定するために、バイオフィルムを、殺菌水中で１回すすぎ、緩く付着した細胞を取り除き、３０４ステンレス鋼クーポン(２．５ｃｍ直径、１．２ｍｍ厚さ)から掻き取り、再懸濁し、そして新鮮改変Ｂａａｒ培地中に、Ｊａｙａｒａｍａｎらにより記載されるように嫌気条件下で系列希釈した。バイオファルム中の嫌気性細菌の数を、ＬＢ寒天平板上に適切な希釈液を播くことにより測定した。結果抗菌ペプチドに対する発現宿主の感受性Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＥ１５００およびＢ．ｓｕｂｔｉ１ｉｓＷＢ６００は、Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａより、３０℃で１時間曝した後、精製された抗菌ペプチドインドリシジン(非アミデート形態、５０および１００μｇ/ｍＬ)に対して数千倍の感受性、そして精製されたペプチドパクテネシン(５０μｇ/ｍＬ)に対して数百倍の感受性を示した(表IIを参照のこと)。従って、Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａは、試験された抗菌ペプチドを発現することのために試験されたその他の種よりも良好な宿主である。なぜなら、それは、非アミデート化インドリシジンおよびバクテネシンの両方に耐性であるからである。Ｅ．ｃｏｌｉシャトルベクターを用いた抗菌ペプチドのクローニング細菌発現系を、Ｅ．ｃｏｌｉ−ＢａｃｉｌｌｕｓシャトルベクターｐＢＥ９２を用いて構築し、Ｂａｃｉｌｌｕｓにおいて抗菌ペプチドを構成的に発現し、かつ分泌するａｐｒプロモーターおよびシグナル配列を利用するｐＢＥ９２−Ｉｎｄ、ｐＢＥ９２−Ｂａｃ、およびｐＢＥ９２−ＰｒｏＢａｃを生成した。ｐＢＥ９２中のアルカリホスファターゼ遺伝子を、ａｐｒシグナル配列の最後の３アミノ酸を(Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ)を含むＮｈｅｌ−Ｈｉｎｄ III挿入物により置き換え、そして抗菌遺伝子を完成した。Ｂａｃｉｌｌｕｓにより分泌される抗菌ペプチドの検出精製されたインドリシジン(非アミデート形態)は、クマシー染色により、２３０ｎｇ/ウェルでロードされたとき検出可能であったが、２３ｎｇ/ウェルでロードされたとき検出されなかった。精製されたインドリシジンおよびバクテネシンはまた、銀染色を用いて、２５０ｎｇ/ウェルでロードしたとき検出可能ではなかった。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＥ１５００(ｐＢＥ９２−Ｉｎｄ)培養上清(２５倍濃縮)を用いた、ウサギで生成したインドリシジンに対するポリクローナル抗体(１：２５０希釈)でのウェスタンブロットは、インドリシジンに対応するバンドを示さなかった；しかし、この抗体は、インドリシジンに特異的ではなく、そして多くの細胞タンパク質に結合した。バクテネシンの１次アミノ酸配列は、ポリクローナル抗体を生成するには顕著な困難性を示した(Ｓｈｉｎｇ−ＥｒｈＹｅｎ博士，ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．，私信)；それ故、ポリクローナル抗体は、このペプチドに対して合成されなかった。Ｂａｃｉｌｌｕｓ培養上清におけるインドリシジンおよびバクテネシンの、懸濁培養中およびバイオフィルム中のＥ．ｃｏｌｉおよびＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓに対する抗菌活性。Ｅ．ｃｏｌｉＢＫ６およびＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓを殺す抗菌プラスミドをもつＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＥ１５００からの濃縮培養上清の能力を測定した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＥ１５００(ｐＢＥ９２)およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＥ１５００(ｐＢＥ９２−Ｉｎｄ)からの上清が用いられたネガティブコントロール実験については、Ｅ．ｃｏｌｉＢＫ６およびＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓの生存率に減少は観察されなかった(表III)；しかし、Ｅ．ｃｏｌｉＢＫ６のほぼ９３％の殺傷、およびＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓの８３％の殺傷が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＥ１５００(ｐＢＥ９２−Ｂａｃ)およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＥ１５００(ｐＢＥ９２−ＰｒｏＢａｃ)からの上清で観察された。この結果は、バクテネシンが発現され、培養上清中に分泌され、しかもジスルフィド結合が細胞外環境で適切にプロロセッシングされ、環状の活性なバクテネシンが形成されたことを示す。（このペプチドが発現されかつ活性であることを示すため、およびＳＲＢの阻害が酸素またはその他の外因性の原因にさらされたためではなくこのペプチドに起因したことを示すためのポジティブコントロールとしてＥ．ｃｏｌｉが用いられた。）クローン化抗菌剤を発現するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＥ１５００をともなう３０４ステンレス鋼上のバイオフィルム中の５日後の生存ＳＲＢの数は、３チューブＭＰＮアッセイにより数えた(表ＩＶ)。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＥ１５００(ｐＢＥ９２)およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＥ１５００(ｐＢＥ９２−Ｉｎｄ )により形成されたバイオフィルムより、ほぼ６０倍より少ないＳＲＢが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＥ１５００(ｐＢＥ９２−Ｂａｃ)により形成されたバイオフィルム中に存在し、その一方、１０倍より少ないＳＲＢが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＥ１５００(ｐＢＥ９２−Ｐｒｏｂａｃ)で見いだされた。クローン化された抗菌ペプチドを産生するBacillus株を用いた、バッチおよび連続培養の腐食研究。静止状態の振盪フラスコ中において、抗菌産生構築物が、SAE1018軟鋼におけるSRBの増殖を阻害する活性を研究した。SRBを非抗菌産生性P.fragi K培養物に対して添加した場合（0.D.₆₀₀＝0.16〜0.20）、硫化水素の強力な匂いが、18時間以内に検出された。これはまた、硫化鉄の黒色の沈殿の形成を伴った。これは、金属表面上の好気性バイオフィルム増殖におけるSRBの増殖およびコロニー形成を示す。B．subtilis BE1500は、P．fragi Kと比較して、SRB腐食の開始を36 〜48時間遅延させ得た（硫化鉄沈殿および硫化水素の匂いの出現の遅延によって、証明される）。 B．subtilis BE1500中の抗菌産生構築物の３つ全ては、P．fragi KおよびB．s ubtilis BE1500と比較して、96〜120時間SRB腐食の開始を遅延し得た。しかし、 7日後の増殖培地の補充は、全ての株において36時間以内に、黒色沈殿の出現を生じた。 SRBのP．fragi Kをともなう304ステンレス鋼連続リアクターへの添加は、測定した最低の振動数（1.4×10^-3Hz）でのインピーダンス値を、SRB添加の36時間以内に、5分の１にまで、減少させた。この減少はまた、リアクターの出口からの硫化水素の匂いを伴い、リアクターは硫化鉄の形成に起因して、灰色になった。低振動数位相角もまた、減少した（c.f.82°対68°）。インピーダンススペクトルにおける同様の変化もまた、B．subtilis BE1500（データは示さず）およびB ．subtilis BE1500(pBE92)（図３）のネガティブコントロールにおいて観察されたが、変化はさらに２４時間遅延された。対照的に、３つの抗菌産生構築物は、インピーダンズスペクトルの変化の程度を減少し得た（図３）。インドリシジン（indolicidin）構築物は、SRBの阻害において最も非効果的であり、そして低振動数位相角は80°から69°に変化した；しかし、これは、コントロールpBE92を用いて観察されたものよりも、なお少なかった（80°から61°）。バクテネシン（bactenecin）構築物（プロ領域を有する、または有しない）は、インドリシジン構築物よりも効果的であり、そして低振動数位相角は76°にしか減少しなかった。これらの結果は、SRBの304ステンレス鋼上での増殖が、抗菌構築物によって有意に阻害されたことを示した。同様の結果もまた、クローン化された抗菌剤を発現するB．subtilis WB600（6 つの細胞外プロテアーゼにおいて欠損する株）（Wuら、1991）を用いて観察された（図４）。304ステンレス鋼上のB．subtilis WB600(pBE92)およびB．subtilis WBN600(pBE92-Ind)バイオフィルムへのSRBの添加は、低振動数位相角をそれぞれ35°および17°に減少し；相応じて、低振動数インピーダンスもまた、それぞれ、7分の1および5.5分の1に減少した。しかし、そのような減少は、両方のバクテネシン発現バイオフィルムを用いて観察されなかったが、バクテネシン構築物は、プロバクテネシン構築物よりもわずかにより効果的であるようであった（図４）。これは、成熟バクテネシンを放出するためのプロ領域のプロセシングは、このプロテアーゼ欠損株においては、効果がないことを示唆する。天然に産生される抗菌剤に加えて、クローン化された抗菌剤を産生するBacili us株を用いた、バッチおよび連続培養の腐食研究。 B．polymyxa ATCC 10401（ペプチド抗菌剤のポリミキシンを産生する）が、軟鋼上のSRBのコロニー形成を阻害する活性を、バッチおよび連続培養において研究した。バッチ培養において、B．polymyxaは、非抗菌産生性P.fragi Kと比較すると、SRB腐食の開始を60時間遅延させ得た。増殖培地の補充は、SRBによる即時の金属のコロニー形成を生じず（P．fragi KおよびB．subtilis BE1500の両方を用いて見られるように）、そして72時間の間、黒色の沈殿は検出されなかった。従って、ポリミキシン産生B．polymyxaは、バッチ培養においてSRBの増殖を遅延させ得た。 304ステンレス鋼を用いる連続リアクターにおいて、SRBの添加は、ほぼ250時間の間、インピーダンススペクトルを変化させなかった（P.fragi Kを用いるインピーダンススペクトルは36時間で変化したこととは対照的に、図5）。硫化物の匂いはリアクター出口からは、検出されず、そしてリアクターは濁度を増加させなかった（P．fragi K、B．subtilis BE1500およびB．subtilis WB600を用いて観察されたように）。従って、B．polymyxaは、連続リアクターにおける304ステンレス鋼上のSRB増殖を阻害し得た。同様の腐食阻害もまた、抗菌構築物を有するB．polymyxaを用いて観察され（図５）、阻害の程度は野生型株のものと区別し得なかった。考察カチオン性抗菌ペプチドインドリシジンおよびバクテネシンは、Piersら、199 3およびPangら（1992）と類似のアプローチによって、細胞外アルカリ性プロテアーゼ（apr）のシグナルペプチドとの融合物として、B．subtilis BE1500において、構成性に発現した。インドリシジンおよびバクテネシンについての合成オリゴは、さらなるアミノ酸がペプチドのN末端に添加されるように、シグナル配列に対する正確な融合物として設計した。これは、発現されたペプチドが、最大に活性であることを確実にして、そしてPangら（1992）（その発現系は、サソリ昆虫毒I₅AのN末端に７アミノ酸残基を付加した）によって観察された不適切なプロセシングを回避した。バクテネシンはまた、B．amyloliquefaciens由来のバルナーゼ（barnase）のプロ部分についてのDNA配列(Paddonら、1989)を、バクテネシン遺伝子とシグナルペプチドとの間に挿入することにより、プレプロペプチドとして、産生された。プレプロディフエンシンの類似融合物は、S．aureusにおける分泌タンパク質のタンパク分解性の分解の完全な阻止を生じ（Piersら、199 3）、そしてこれはアニオン性プロ領域とカチオン性ペプチドとの間の2次構造の形成に起因する。インドリシジンは、Bacillusにおいて、酸性形態において発現されたが、ウシ好中球におけるその天然に存在する形態においては、Ｃ末端においてアミド化している。B．subtilisの生存可能性は、インドリシジンによって、4桁減少した。一方、B．polymyxaは、インドリシジンに対する同程度の感受性を示さなかった。このことは、B．subtilisが、バイオフィルムにおけるインドリシジン発現のための理想的な発現宿主ではないことを示唆する。特にバイオフィルムの場合、インドリシジンは、懸濁培養におけるのと同程度には拡散せず、従って、宿主細胞を攻撃し得る。 B．subtilis BE1500由来の濃縮培養上清に対する、E．coli BK6の感受性は、上清の抗菌活性の指標として使用された。なぜなら、この細菌はカチオン性ペプチドの抗菌活性を評価するために一般に使用されているからである（Romeoら、1 988；Selstedら、1992）。本発明者らの結果は、B．subtilis BE1500(pBE92-Ind )からの上清は、E．coliに対して阻害的ではないが、B．subtilis BE1500(pBE92 -Bac)およびB．subtilis BE1500(pBE92-Probac)からの上清は、E．coli BK6の生存可能性を減少させることにおいて活性であったことを示す。本発明者らの連続リアクター実験において、本発明者らは、B．subtilis BE15 00(pBE92)およびB．subtilis BE1500(pBE92-Ind)の増殖において差異を観察しなかった。このことは、インドリシジンの乏しい発現を示唆する。このことはまた、インピーダンススペクトルの変化から推測されるように、連続リアクターにおいてこの構築物を用いて実証されたSRB阻害の欠如によって実証された（図３）。B.subtilis BE1500は、バクテネシンに対して、インドリシジンに対するよりも60倍耐性であった。このことは、ステンレス鋼上のSRBを阻害するバクテネシン構築物の能力を説明し得る。 304ステンレス鋼を用いた連続リアクター実験は、SRBの増殖が阻害されたことを、明らかに実証した（硫化水素の匂いおよび硫化鉄の沈殿のような定性的指標、および、分極耐性R₂における減少の両方に基づく）。バクテネシン構築物は、 SRBの増殖の阻害においてインドリシジン構築物よりも効果的であった。このことは、ディフェンシンが不適切なジスルフィド結合プロセシングにより通常不活性であるように（Piersら、1993）、バクテネシンが、発現されそしてプロセスされ、ジスルフィド結合を形成することを示唆する。しかし、SRBがバイオフィルムから完全には除外されなかったことは、明らかであった。なぜなら、全てのリアクターは、SRBの添加において、より濁るようになり、そしてB．subtilis B E1500(pBE92-Bac)を用いたリアクターからの硫化物の匂いがなお検出されたからである。コントロールpBE92と比較して、バクテネシン産生構築物を用いたSRBの阻害はまた、304ステンレス鋼上の7日間バッチ培養バイオフィルムにおいて、生存可能なSRBの存在が36分の１減少することによって実証された（表IV）。しかし、バクテネシンの存在下であっても、ほぼ1×10⁴SRB／mlが検出され、このことは、SRBがクローン化抗菌ペプチドによって、完全には殺傷されなかったことを確認した。ポリミキシン産生B．polymyxa（野生型）はまた、軟鋼上のバッチ培養において、60時間の間、SRBの増殖（およびSRB誘導性腐食の開始）を遅延し得た。B．p olmyxaへの抗菌剤産生プラスミドの添加は、軟鋼上で、SRBを殺傷するその能力有意に改善しなかった。しかし、連続リアクターにおける304ステンレス鋼上で増殖したB．polymyxaは、SRBの増殖を完全に阻害し得た（275時間まで）。D．vu lgarisがステンレス鋼上で単一カルチャーとして増殖し得ない（それゆえ、軟鋼上では増殖し得る）という本発明者らの観察はまた、これらの抗菌剤の、ステンレス鋼上のみでのSRB阻害についての効果を説明し得る。この実施例に示されるデータは、304ステンレス鋼上のSRBの増殖は、バイオフィルム内からのペプチド抗菌剤の生成により制御され得ることを実証し、そして、微生物学的に影響を受けた鋼の腐食の防止における使用のための可能性を説明する。SRB増殖の阻害におけるB.polymyxaの効力は、低いレベルの２つの抗菌剤（天然に産生された抗菌剤、およびクローン化抗菌剤）がSRBを阻害するために同時に作用し得る場合、SRB誘導性腐食と闘うための２重殺傷系の最適化のための基礎を提供する。実施例５：細菌分泌性抗菌剤による、SRBコロニー形成阻害ならびに軟鋼およびステンレス鋼上の腐食の阻害この実施例は、細菌の分泌する抗菌剤の使用を介する、軟鋼およびステンレス鋼上のバイオフィルムにおけるSRBコロニー形成および嫌気性腐食の阻害を実証する。一般的に使用される抗生物質アンピシリンは、この研究において参照抗菌剤として使用され、SRBコロニー形成の前の抗菌剤の添加がSRB誘導性腐食の減少のための実行可能なアプローチであり得ることを示す。以前の実施例において示されるように、10アミノ酸の環状ペプチドであるグラミシジンSは、SRBを阻害し、そしてまたモデルペプチド抗生物質として外部から添加され、軟鋼およびステンレス鋼の腐食を阻害するための、バイオフィルムにおけるペプチド抗菌剤の産生の実現可能性を実証する。さらに、グラミシジンS過剰産生Bacillus brevis18株（ Azumaら、1992）を使用して、グラミシジンSを分泌して、そしてステンレス鋼上のSRBを阻害するバイオフィルムを確立する。材料および方法細菌株、培地、および増殖条件すべての好気性細菌を、単一のコロニーから、10mlの改変Baa培地（ATCC培地1 249）において、30℃で、250rpm（シリーズ25シェーカー、New Brunswick Scien tific，Edison，NJ）で増殖させ、バイオフィルムの開発のために接種材料として使用した。D．vulgarisを、10mlの改変Baa培地（各100μlの酸素捕捉剤、4％硫化ナトリウムおよびオキシラーゼ(Oxyrase)(Oxyrase Inc.，Mansfeld，OH)）を含む15mlのスクリューキャップにおいて培養した。最初の培養物を、-85℃グリセロルストックから増殖し；全てのその後の培養物は、30℃の振盪しない初期の培養物からの3％播種を用いて増殖させた。D．vulgarisを、厳密に密閉したスクリューキャップチューブにおいて慣用的に培養して、そしてAngellおよびWhit e（1995、前出）によって報告されているように、培養において、いかなる困難さもともなわず、空気中の酸素に曝露した。D．vulgaris培養をまた、0.1％硫酸アンモニウム第一鉄の存在下で、定期的に培養し、そして硫酸塩還元剤の存在を、培養試験管内の黒色の硫化鉄の検出により、確認した。デスルフォビリジン（ desulfoviridin）アッセイ（Postgate、1984）をまた、紫外光線下でのピンク色の検出を用いて慣用的に行い、これはD．vulgarisの存在を確認した。グラミシジンSは、Sigma Chemical Company(St．Lois，MO)から、クロラムフェニコールは、Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)から、そしてモリブデン酸アンモニウムは、Aldrich Chemical Company(St．Lois，MO)から得た。金属クーポン調製バッチ培養実験のための軟鋼SAE1018クーポン（直径25.5mmおよび厚さ1.2mm）およびSAE1018軟鋼ならびに連続培養実験のためのステンレス鋼304プレート（7. 5×7.5cm²、厚さ1.2mm）を、シートストックから切り出して、そして以前に報告されているように調製した（Jayaramanら、1997ａ）バッチ培養腐食実験バッチ培養腐食実験を、250mlの三角フラスコ中で、30℃で、振盪せずに、以前に記載されたように行った（Jayaramanら、1997a）。D．vulgarisに曝露した軟鋼クーポン（３連）を、0.01％クロム酸で表面を拭くことにより清掃して、その後、温水において繰り返し洗浄した；全ての他のクーポンは、以前に記載されたように清掃した（Jayaramanら、1997a）。特異的重量損失（クーポンの全表面積についてmg/cm²において、11.18cm²）を腐食の程度（均一であると仮定する）の指標として使用した。増殖培地を、7日おきに補充して、そしてフラスコの壁に沿って緩やかに添加することにより置換した（適切な抗生物質を用いる）。3% (容量/容量)SRB接種を、好気性バイオフィルムの発達の3日後フラスコに添加した。 EISを用いる連続培養腐食実験連続リアクターを使用して、以前に記載されたように（Jayaramanら、1997ｃ）、金属表面にバイオフィルムを発達させた。Machintoshコンピュータ（PowerM ac 7100/80，Apple Computers，Cupertino，CA）にインターフェースされ、EISI S電気化学的実験ソフトウェア（University of California，Irvine）(THALES，類似の市販のソフトウェアもまた使用され得る)を実行する、Solarton-Schlumbe rger電気化学的測定ユニット（SI 1280，Schlumberger Technical Instruments Division，San Jose，CA）を使用して、少なくとも２連の実験においてインピーダンスのデータを得るために、電気化学的インピーダンス分光法（EIS）を使用した。開回路ポテンシャル（OCP）を、金属標本と参照電極（Ag/AgCl）との間の電位として測定し、そして分極抵抗を、Mansfeldらによって開発されたANALEIS ソフトウェア（ASTM Special Technical Protocol 1154:186(1992)）を使用してインピーダンスのdc限界として決定した。連続培養腐食速度を、Stern-Gearyの式R_P=B/I_corrに基づく実験分極抵抗R_Pから推定した。ここで、BはTafelの傾きに依存するパラメータであり、そしてI_corrは、ファラデーの法則を使用して、腐食速度に変換され得る腐食電流密度である（Mansfeld，F.，The polarization r esistance technique for measuring corrosion current，Fontana，M.G.，Star hle,R.W.(編)、Advances in Corrosion Science ans Technology，Plenum Press ，New york(1976)）。 3％(容量／容量)SRB接種（培養齢24〜48時間）を好気性バイオフィルムの発達の3〜5日後にリアクターに添加した。文献（Salehら、1964）において利用可能である最小の阻害濃度に基づき、そしてまた、種々の無機物および抗菌剤に対する懸濁培養中のSRBの感受性についての本研究室において作成されたデータに基づき、アンピシリン（200μg/ml）、クロラムフェニコール（200μg/ml）、アンピシリン（200μg/ml）とクロラムフェニコール（100μg/ml）の両方、ならびにアンピシリン（200μg/ml）とモリブデン酸アンモニウム（200μg/ml）の両方を、SRBを阻害する意図で、リアクター（SRBが金属をコロニー形成する前および後）に添加した。全ての抗菌剤を、栄養給餌物およびリアクターに、適切の濃度で同時に添加した。バイオフィルムにおいて生存可能なSRBの列挙好気性バイオフィルムを304ステンレス鋼クーポン上（25.5mmの直径、1.2mmの厚さ）で250mlの三角フラスコ中で、改変Baa培地を用いて、2日間30℃で、発達させた。1.0％（容量／容量）のD．vulgarisの接種物（O.D.₆₀₀=0.16〜0.18）を添加して、そしてさらに４日間、バイオフィルムをコロニー形成させた。金属クーポンをフラスコから注意深く取り除き、そして２度、蒸留水中に浸漬することによりリンスして、緩やかに付着した細胞を除去した。次に、バイオフィルムを滅菌スパーテルで剥がし、500μlの改変Baa培地において再懸濁した。好気性細菌を、プレートカウントによって決定して、生存可能なSRBを３つのチューブのM PNアッセイによって、列挙した（Greenberg，1992，前出）。結果 SAE 1018軟鋼上での、非抗菌剤産生性P．fragi KおよびD．vulgarisを用いた、バッチおよび連続腐食。 P．fragi KおよびD．vulgarisの存在下における改変Baa培地中の軟鋼SAE1018 クーポンからの質量損失を、定常バッチ培養において、28日間、30℃で試験した。D．vulgarisがバイオフィルム中に存在する場合はいつでも、クーポンは厚い、黒色の沈着物で覆われ、そして清浄するのが困難であった。P．fragi Kおよび D．vulgarisの２重の培養は、P．fragi Kのモノカルチャーと比較して、曝露の2 1日後における腐食速度が、1.8倍増加した；しかし、両方の場合において観察された腐食速度は、滅菌改変Baa培地において観察されたものよりも、常に低かった（表V）。SAE 1018鋼上でのD．vulgarisのモノカルチャーを用いて観察された腐食速度は、１４日後（１．４倍）および２１日後（２．５倍、表Vからの推定）の滅菌培地においてよりも高かった。アンピシリン（100μg/ml）が、D．vulg arisが金属クーポン上でコロニー形成する前にフラスコに添加した場合、観察された質量損失は、ＳＲＢの後にアンピシリンが添加された場合に見られるものよりも、４０％（１週目）〜１４％（３週目）少なかった（表Ｖ）。D．vulgaris に曝露された金属クーポンのマクロ的試験は、全ての実験について、多数のくぼみ(pit)の存在を明らかにした。黒色の硫化鉄の沈殿の発達およびリアクターの出口からの硫化水素の匂いによって示されるように、好気性D．vulgarisは、上部空間への200μｌ/分の通気速度を用いて、モノカルチャーとして連続リアクターにおいて増殖した。連続リアクターにおけるD．vulgarisの増殖は、滅菌コントロールと比較した場合、72時間後に、R_Pを90倍増加した。ＳＲＢ増殖の240時間後の200μｇ/mlのアンピシリンの添加は、R_Pを変化させず、そしてリアクターは、排気から異なる匂いをともない、黒いままであった（表Ｖ）。320時間後の、200μｇ/mlのアンピシリンおよび200μｇ/mlのモリブデン酸アンモニウムの組合せは、リアクター上清を明澄にした；しかし、硫化物の匂いは、以前として検出された。このことは、腐食速度は減少せず、そしてＳＲＢの増殖は、阻害されないことを示す。連続P．fragi Kリアクターに対するD．vulgarisの添加は、３６時間後に、軟鋼のR_Pを３倍増加させ、そして位相角に依存する振動数を変化させ；リアクターは、黒色になり、硫化物の匂いはリアクターの出口から検出された（表ＩＶおよび図６）。D．vulgarisの添加の前に、インピーダンスは、低い振動数で、定常の漸近値に達した（４．５２×１０⁴オーム・ｃｍ²）；しかし、SRB添加後２４時間以内に、ＳＲＢのリアクターへの添加は黒色となり、硫化物の匂いが検出され、そしてインピーダンスは、最低の振動数（１．４×１０^-3Ｈｚで、もはや漸近値に達しなかった。ＳＲＢの増殖（データ示さず）の１２０時間後および１５０時間後の２００μｇ／ｍｌのアンピシリンの添加（表ＩＶ）ならびに１００μ ｇ/ｍｌのアンピシリンと２５μｇ/ｍｌのクロラムフェニコールとの組合せの添加はまた、Ｒ_PをＳＲＢ添加前のその値までシフトさせなかった。このことは、ＳＲＢの阻害が存在しないことを示す。Ｓ．Ｓ．３０４ステンレス鋼上での非抗菌剤産生Ｐ．ｆｒａｇｉＫおよびＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓでの連続的腐食速度約９００時間の曝露後、３０４ステンレス鋼上での、滅菌Ｂａａｒ培地についてと、Ｐ．ｆｒａｇｉＫと共にとの間でインピーダンススペクトルの差異は観察されなかった。Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓは、３０４ステンレス鋼上で単一培養物（ｍｏｎｏｃｕｌｔｕｒｅ）として増殖せず、そしてＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓのＰ．ｆｒａｇｉＫリアクターへの添加は、４８時間以内により低い振動数でのインピーダンスの振動数依存性を変化させた（図７）。位相角は、ＳＲＢの添加の際に最小値を示した。これは、非常に低い振動数での新たな時定数の出現を示し（図７）、そして位相角の最大値は８１°から６９°に減少した。インピーダンススペクトルの変化は、リアクターの流出口からの硫化物の匂いの検出を伴い、そしてリアクターはまた灰色に変わった。２００μｇ／ｍＬアンピシリン（図７）、２００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１００μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールの両方（表ＶＩＩ、第２欄）、または２００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび２００μｇ／ｍＬのモリブデン酸アンモニウムの両方（データ示さず）の二重培養物リアクターへの添加により、インピーダンススペクトルは、Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓの添加の前に観察された単純な一時定数行動へと変化しないか（図７）、または硫化水素および硫化鉄の産生を止めなかった。これは、ＳＲＢが、死滅していなかったことを示す。Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓを添加する前に精製ＳＲＢ阻害抗菌剤に曝露されたバイオフィルムでの連続的腐食速度ＳＲＢコロニー形成の前に添加された場合に、抗菌剤がＳＲＢを阻害するのに有効であるか否かを決定するために、ＳＡＥ１０１８軟鋼および３０４ステンレス鋼上の非抗菌剤産生Ｐ．ｆｒａｇｉＫバイオフィルムを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンまたはグラミシジンＳにＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓが添加される前に２４時間曝露した。Ｐ．ｆｒａｇｉＫは、１００μｇ／ｍＬの両方の抗菌剤に曝露した終夜懸濁培養において飽和まで増殖した；従って、これは、これらの抗菌剤を添加することによっては影響を受けなかった。アンピシリンの添加後に、Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓを軟鋼およびステンレス鋼のリアクターに添加した場合、インピーダンススペクトルに変化はなく、そしてＲ_p が１００時間まで観察された（図６および７、表ＶＩおよびＶＩＩ）。リアクタ一流出口で硫化物の匂いは検出されなかった；従って、Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓは、リアクター中でこの抗菌剤によって完全に阻害された。１００μｇ／ｍＬの環状デカペプチド抗菌剤グラミシジンＳの外部からの添加はまた、インピーダンススペクトルの容量性性質によって証明されるように３０４ステンレス鋼実験におけるＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓの増殖を阻害することにおいて完全に有効であった（図７および表ＶＩ）；しかし、軟鋼を使用して、リアクターは灰色に変わったが、ＳＲＢへの曝露の８０時間後にＲ_pの増加はなかった（図８および表ＶＩＩ）。従って、軟鋼のＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓにより誘導された腐食の開始は、グラミシジンＳが全く存在せずに、Ｐ．ｆｒａｇｉＫおよびＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓに比較して遅延した。ＳＡＥ１０１８軟鋼および３０４ステンレス鋼上での抗菌産生ＢａｃｉｌｌｉおよびＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓでのバッチ腐食速度および連続的腐食速度ＳＡＥ１０１８ステンレス鋼クーポンのＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓおよび抗菌生物産生Ｂａｃｉｌｌｕｓバイオフィルムでのバッチ腐食研究（抗菌剤ペプチドのそれらの報告された産生に基づく、表Ｖ）は、全てのＢａｃｉｌｌｉが、Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓのコロニー形成を１週間まで制限することができることを実証した（腐食速度における、改変Ｂａａｒ培地でのＰ．ｆｒａｇｉＫについてのより大きい１．８倍の増加に比較して、より小さい１．２〜１．４倍の増加（表Ｖ）、および黒色および硫化物の匂いの発生の欠如によって証明される）。しかし、培地が７日後に再補充された場合、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ１８のフラスコを除く全てのフラスコが、黒色に変化し、そして硫化鉄が２４時間以内に検出された。Ｂａｃｉｌｌｉの存在下でのＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓでの腐食速度の増加（１．２〜１．５倍の増加）は、Ｐ．ｆｒａｇｉＫおよびＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓで観察された増加（１．６倍の増加）に匹敵した。Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ１８およびＳＲＢで観察された質量の損失は、Ｐ．ｆｒａｇｉ単独で観察されたものに匹敵し、そしてＰ．ｆｒａｇｉＫおよびＳＲＢで観察されたものよりもほぼ２倍良好であった（表Ｖ）。硫化物の匂いは実験を通じて検出されなかった。バッチ培養物中でのＳＲＢの増殖の阻害におけるグラミシジンＳの有効性はまた、非抗菌剤産生Ｐ．ｆｒａｇｉＫバイオフィルムに比較して、増殖の４日後の３０４ステンレス鋼上でのＢ．ｂｒｅｖｉｓ１８バイオフィルムにおいて検出された（３チューブＭＰＮアッセイによって）生存可能なＳＲＢにおける３桁の大きさの減少によって確認された（5.47×10²/mL対8.47×10⁵/mLを比較のこと）。Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ１８、グラミシジンＳ過剰産生株（Ａｚｕｍａら、１９９２）での連続的培養物腐食速度は、ＳＡＥ１０１８軟鋼上で、Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓの存在下で得られた（図９および表ＶＩ）；軟鋼上でのＰ．ｆｒａｇｉＫへのＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓの添加の際に観察されたＲ_pの増加は、２４時間遅延した。最終的に、ＳＲＢは、リアクター流出口からの硫化水素の匂いによって証明されるように、バイオフィルムにコロニー形成したようである；しかし、Ｒ_p は、ＳＲＢ添加の前の3.43×10⁴オーム・ｃｍ²に対して、5.78×10⁴オーム・ｃｍ²で一定のままであった。図８および表ＶＩＩは、３０４型ステンレス鋼上でのＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓのＢ．ｂｒｅｖｉｓ１８バイオフィルムへの添加が、硫化物の匂いがリアクターの流出口でＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓの添加後４８時間で検出されたにもかかわらず、１２０時間後にＲ_pを減少させなかったことを示す。従って、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ１８を産生するグラミシジンＳは、３０４ステンレス鋼上でＳＲＢのコロニー形成を阻害し得たのに対し、それはＳＡＥ１０１８軟鋼上でＳＲＢの増殖を遅延し得たにすぎなかった。考察Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓを、好気性生物による腐食を阻害することにおけるインサイチュで産生された抗菌剤の有効性を研究するための代表的な硫酸塩還元細菌として選択した。なぜなら、それは、腐食を促進し（Ｇａｙｌａｒｄｅ、１９９２）、そしてこの種の株は、酸素ストレスに耐える能力を有している（Ｈａｒｄｙ，Ｊ．Ａ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｗ．Ａ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：２５９−２６２（１９８１））ことが報告されているからである。Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓは、培地の黒色変色によって証明されるように、定常的なバッチ培養物中、および酸素飽和したヘッドスペースを有する連続的なリアクター中、および腐食している軟鋼クーポンにおいて単一培養物として増殖することにおいて顕著な弾性を示した（Ｇａｙｌａｒｄｅ，１９９２、前出）。Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓはまた、液体の上のヘッドスペースにおける酸素飽和の条件下での振盪フラスコ中の好気性バイオフィルム内で、およびリアクターヘッドスペースへの２００ｍＬ／分の気流速度での連続的リアクター中で、増殖し得た。この研究におけるＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓについての増殖条件は、Ｇａｙｌａｒｄｅ（１９９２、前出）ならびにＨａｍｉｌｔｏｎおよびＬｅｅ（１９９５）（Ｂｉｏｃｏｒｒｏｓｉｏｎ、２４３−２６４頁、Ｂａｒｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．（編）、Ｓｕｌｆａｔｅ −ｒｅｄｕｃｉｎｇＢａｃｔｅｒｉａ，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）によって使用されたものと非常に類似しており、そしてＳＲＢ培養物中に少量の酸素が存在する場合（最大腐食速度を導く）に最も攻撃的であると呼ばれている。Ｐ．ｆｒａｇｉＫおよびＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓを有するバッチ培養物に曝露された軟鋼クーポンは、Ｐ．ｆｒａｇｉＫの単一培養物への曝露と比較して、腐食速度の増大を示し、これは、Ｊａｃｋら（Ｃｏｒｒ．Ｓｃｉ．３３；１８４３−１８５３（１９９２））およびＧａｙｌａｒｄｅ（１９９２，前出）によって報告されたものと類似していた。Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓの増殖を阻害するための、抗生物質の種々の組み合わせのバッチ培養物への添加は、腐食を阻害することにおいて成功裏であることは証明されなかった（表Ｖ）。しかし、抗菌剤産生Ｂａｃｉｌｌｉのバッチ培養物は、単一培養物コントロールに比較して、７日まで、ＳＲＢによって誘導される腐食の開始を遅延することができた。このＳＲＢ阻害効果は、増殖培地が再補充された後のほとんどのＢａｃｉｌｌｕｓで顕著に低減した。ほとんどの抗菌剤が二次代謝産物であり（Ｂａｉｌｅｙ，Ｊ．Ｅ．，Ｏｌｌｉｓ、Ｄ．Ｆ．，ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ第二版、ＭｃＧｒａｗ−ＨｉｌｌＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８６））、そして増殖の定常期の間に産生される（Ｄｏｉ，Ｒ．Ｈ．，ＭｃＧｌｏｕｇｌｉｎ，Ｍ．１９９２．ＢｉｏｌｏｇｙｏｆＢａｃｉｌｌｉ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ（１９９２））ので、７日後に増殖培地を再補充することは、バイオフィルム中に存在する抗菌剤の大部分を除去し、そして阻害レベルの抗菌剤が再び産生される前に、Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓが金属表面にコロニー形成することを可能にした可能性がある。しかし、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ１８は、この株を作製するために使用された変異誘発の結果としてのグラミシジンＳの過剰産生に起因して、ＳＲＢの増殖を２８日まで完全に阻害した（Ａｚｕｍａら、１９９２）。この結果は、グラミシジンＳのＳＲＢを殺傷する能力を示し、そして抗菌剤がＳＲＢコロニー形成の前にバイオフィルム中の他の細菌を介して首尾良く導入され得ることばかりでなく、またこの様にして導入された抗菌性化合物が、ＳＲＢの増殖を首尾良く阻害することを実証した。軟鋼およびステンレス鋼のインピーダンススペクトルは、これらの金属を有する連続的培養物中で観察された腐食行動を特徴付けるために使用された。軟鋼リアクターにおけるＳＡＥ１０１８上でのＤ．ｖｕｌｇａｒｉｓのＰ．ｆｒａｇｉＫへの添加は、Ｒ_pを増大させ、これは、腐食速度が減少したことを示す。この矛盾するように見える観察は、金属表面での酸化物層の形成に起因して説明され得る；改変されたＢａａｒ培地がｐＨ７．５（中性）を有するので、形成された錆びた層は、より酸性の環境で予想されるようには溶解しない。この錆の蓄積は、Ｒ_pの増大、および腐食速度の見かけ上の減少を引き起こし得る。ＳＲＢの阻害に関するＥＩＳからの結論の妥当性は、軟鋼についての、バッチ培養物の質量損失実験から計算されたＲ_p値とＥＩＳで得た値との間の良好な相関によって確認され得る（表ＶＩＩ）。中性培地における均一腐食について代表的である単純な単回定数（ｏｎｅ−ｔｉｍｅ−ｃｏｎｓｔａｎｔ）（ＯＴＣ）（Ｍａｎｓｆｅｌｄ，Ｆ．，Ｌｏｒｅｎｔｓ，Ｗ．Ｊ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｍｐｅｄａｎｃｅｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＥＩＳ）：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｃｏｒｒｏｓｉｏｎｓｃｉｅｎｃｅａｎｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖａｒｍａ，Ｒ．，Ｓｅｌｍａｎ，Ｊ．Ｒ．（編）、ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｆｏｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓａｎｄｅＩｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓｅｓ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９１））（本明細書中以下では、ＭａｎｓｆｅｌｄおよびＬｏｒｅｎｚ，１９９１）を、軟鋼上でのＰ．ｆｒａｇｉＫおよびＰ．ｆｒａｇｉＫ＋アンピシリン＋ＳＲＢ（図６）で観察し、そしてこれらの２つの実験について得られたＲ_p値およびキャパシタンス値（Ｃ）は、類似していた（表ＶＩＩ）。軟鋼上でのＰ．ｆｒａｇｉＫ＋ＳＲＢについて、最小振動数での位相角ψの振動数依存性は、ピッティングに起因し得る新たな時定数の出現を示唆するが、一方、Ｐ．ｆｒａｇｉＫ＋ＳＲＢ＋アンピシリンについてのψの対称的な振動数依存性、およびＰ．ｆｒａｇｉＫについての振動数依存性に比較した場合の全インピーダンス曲線のシフトは、より高いＲ_pに起因し得る（図６）。類似のキャパシタンス値が、軟鋼上でのＰ．ｆｒａｇｉＫ＋ＳＲＢおよびＰ．ｆｒａｇｉＫ＋ＳＲＢ＋アンピシリンについてのスペクトルにおいて示された；しかし、これらのスペクトルを単純な等価回路にフィットさせ、Ｒ_pおよびＣの定量的な値を得ることは可能ではなかった。軟鋼上でのＢ．ｂｒｅｖｉｓ１８、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ１８＋ＳＲＢ、およびＰ．ｆｒａｇｉＫ＋グラミシジンＳ＋ＳＲＢについてのインピーダンススペクトルは、均一腐食について通常観察される振動数依存性を示し、そしてＲ_pは、インピーダンス係数│Ｚ│のｄｃ限界（ψ）＝０°）として決定され得た（図９）。滅菌培地を有するリアクターに曝露されたステンレス鋼サンプルはまた、定常的低振動数インピーダンス値に到達しなかった。滅菌コントロールと、Ｐ．ｆｒａｇｉＫまたはＢ．ｂｒｅｖｉｓを有する３０４ステンレス鋼上のリアクターとの間のインピーダンススペクトルにおける差異の欠如は、腐食がこの期間の間にほとんど起こらなかったことを示す。この結果は、２０日間９つの塩溶液中で、軟鋼での定常的な低振動数インピーダンス値を観察せず、それを腐食の欠如に起因するとしたＨｅｒｎａｎｄｅｚら、１９９４の観察に類似している。Ｐ．ｆｒａｇｉＫおよびＰ．ｆｒａｇｉＫ＋アンピシリン＋ＳＲＢについての３０４ステンレス鋼スペクトルは、２×１０⁷オーム・ｃｍ２に近い高いＲ_p 値で容量性であり、そして１００と２００μＦ／ｃｍ²との間のキャパシタンス値であった；これは、中性培地におけるステンレス鋼に特徴的な均一な腐食を示す（ＭａｎｓｆｅｌｄおよびＬｏｒｅｎｔｚ、１９９１）。軟鋼についての行動と類似する純粋に容量性である行動からの偏差が、３０４ステンレス鋼上のＰ．ｆｒａｇｉＫ＋ＳＲＢおよびＰ．ｆｒａｇｉＫ＋ＳＲＢ＋アンピシリンで観察され（図７）、そしてこれらのインピーダンスデータを単純ＥＣにフィットすることはできなかった。新たな時定数が、約0.01Hzでのψの最小値によって示されるように、Ｐ．ｆｒａｇｉＫ＋ＳＲＢについて観察された（図７）。Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ１８、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ１８＋ＳＲＢ、およびＰ．ｆｒａｇｉＫ＋グラミシジンＳ＋ＳＲＢについてのインピーダンススペクトルは、全て容量性であり、そしてＢ．ｂｒｅｖｉｓ１８およびＢ．ｂｒｅｖｉｓ１８＋ＳＲＢで観察されたＲ_p値およびＣ値は、Ｐ．ｆｒａｇｉＫで観察されたものと類似していた（図８）。全ての曝露条件についての腐食速度における変化の程度は、実験データを適切な等価曲線にフィッティングさせることなしには正確に決定され得ないが、腐食速度は、ＳＲＢの添加の際の硫化水素の産生に起因して増大したと結論し得る。同様に、ＳＲＢの付加の際の３０４ステンレス鋼の位相角の変化（図７ｂ）は、さらなる電気化学的プロセスの発生を示し、そして局在化した腐食を示唆する（ＭａｎｓｆｅｌｄおよびＬｏｒｅｎｚ，１９９１）。従って、精製された抗菌剤がＳＲＢの添加前に存在した場合、またはグラミシジンＳがバイオフィルムによって生成された場合、のインピーダンススペクトルにおける変化の不在は、ステンレス鋼上でのＳＲＢの阻害を実証する（図８）。アンピシリンおよびクロラムフェニコールは、それぞれ１μｇ／ｍＬおよび３ μｇ／ｍＬで、Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓの懸濁培養物を阻害することが公知である（ＯｄｏｍおよびＳｉｎｇｌｅｔｏｎ、１９９３）。バイオフィルムは、殺生物剤に対して１０〜１０００倍より耐性であることが公知であるので（ＣｈｅｕｎｇおよびＢｅｅｃｈ、１９９６）、２００μｇ／ｍＬまでの両方の抗生物質を、この研究で使用した。しかし、ＳＲＢが金属表面でコロニー形成した後に添加された場合、これらの添加物は、硫化物のさらなる産生を止めもせず、またいずれの型の鋼の腐食速度を減少させもしなかった。これは、ＳＲＢがハロゲン殺生物剤への曝露を少なくとも２６時間残存し得ることを観察したＦｒａｎｋｌｉｎら（１９９１）（Ｃｏｒｒｏｓｉｏｎ４７：１２８−１３４）の観察、および殺生物剤を添加したバイオフィルム集団の３桁〜４桁の大きさの減少を報告したが、その集団が殺生物剤の投薬を止めてから２４時間以内にその前処置密度に到達したことに注目したＦｒａｎｋｌｉｎら（１９８９）（材料の選択および対策の有効性を試験するための特異的な細菌コンソーシアムを有するアナログＭＩＣ系、Ｃｏｒｒｏｓｉｏｎ８９、ＮｅｗＯｒｌｅａｎｓ、ＬＡ，ＮａｔｉｏｎａｌＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆＣｏｒｒｏｓｉｏｎＥｎｇｉｎｅｅｒｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸで発表）の観察と一致する。類似する観察が、この研究において軟鋼リアクターでなされた；アンピシリンを含有する培地が中断された場合、ＳＲＢに誘導された腐食の開始が、３６時間以内に明らかになった。実施例６：ＳＲＢ関連腐食に対して水冷却タワーに接種するための方法の使用この実施例は、水冷却タワーをＳＲＢ関連腐食に対して「接種する」ための本発明の使用を実証する。新たな水冷却タワーが、発電装置に設置される。タワーがサービスに入る準備ができると、約１〜１０μｇ／ｍＬの濃度のバクテニシン（ｂａｃｔｅｎｉｃｉｎ）を分泌するように組換え的に改変されたＢａｃｉｌｌｕｓｐｏｌｙｍｙｘａの培養物が、約１０³〜約１０⁶細胞／ｍＬの濃度で、好ましくは、希釈された高価でない複合体栄養素ブロス（例えば、ＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ）中で、水源に添加され、これは、次いで水タワーを通じて循環する。タワーを「接種する」ために使用される水が乾くまえに、タワーへの通常のサービス水供給源を連結し、そしてタワーの正常な作動が開始する。実施例７：現存の構造を保護するための方法の使用この実施例は、すでに使用されているパイプラインを処理するための方法の使用を実証する。パイプラインの濡れた部分の表面に引っ掻き傷をつけ、そしてパイプラインのバイオフィルム中の細菌を培養する。１つ以上の培養されたグラム陽性細菌種（このような細菌は、抗菌剤または抗腐食剤、またはその両方がそこを通して分泌する１つの細胞膜のみを有するので好ましい）が、遺伝子の形質転換および培養の容易さおよび信頼度のような基準に基づいて選択される。次いで、選択されたグラム陽性細菌は、ｐＣＮＢ５（バクテネシンの遺伝子をコードする）のような染色体挿入ベクターと複合体化することによって形質転換される。形質転換された細菌は、培養され、次いで抗ＳＲＢ剤の分泌を確認するために試験される。次いで、抗ＳＲＢ剤の分泌について試験で陽性とされた培養物は、多量に増殖され、そして得られる培養物のアリコートを、１０³〜約１０⁶細胞／ｍＬの得られる濃度で間隔をおいて、パイプライン中へ導入する。本明細書中で引用される全ての刊行物、および特許出願は、あたかも各々の個々の刊行物または特許出願が、特別にそして個々に参考として援用されていることを示されているかのように、本明細書中でその全体が参考として援用される。上記の発明は、いくらか詳細に例示および実施例によって理解を明瞭にする目的で記載されてきたが、本発明の教示に照らして、特定の変更および改変が、添付の請求項の精神または範囲から逸脱することなくなされ得ることは、当業者には容易に明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ジャヤラマン，アルルアメリカ合衆国マサチューセッツ 02062，ノーウッド，ランスドーンウェイ 650，アパートメントナンバーティー３ (72)発明者アースマン，ジェイムズシー. アメリカ合衆国カリフォルニア 92612, アーバイン，バージルコート６

Claims

【特許請求の範囲】１．腐食感受性材料および分解感受性材料の群から選択される材料上で硫酸塩還元細菌の増殖を阻害する方法であって、該方法は、該材料を、該材料上での硫酸塩還元細菌の該増殖を阻害するのに十分な量の化学組成物を分泌する細菌に適用する工程を包含する、方法。２．前記腐食感受性材料が、金属である、請求項１に記載の方法。３．前記材料が、鋼である、請求項２に記載の方法。４．前記鋼が、軟鋼である、請求項３に記載の方法。５．前記鋼が、ステンレス鋼である、請求項３に記載の方法。６．前記金属が、アルミニウムまたはアルミニウム合金である、請求項２に記載の方法。７．前記金属が、銅または銅合金である、請求項２に記載の方法。８．前記金属が、チタン、ニッケル、チタン合金、およびニッケル合金からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。９．前記分解感受性材料が、コンクリートである、請求項１に記載の方法。１０．前記分解感受性材料が、鉄筋コンクリートである、請求項１に記載の方法。１１．前記分解感受性材料が、セメントである、請求項１に記載の方法。１２．前記細菌が、好気性菌である、請求項１に記載の方法。１３．前記細菌が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属のものである、請求項１に記載の方法。１４．前記細菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属のものである、請求項１に記載の方法。１５．前記化学組成物が、前記材料に適用された前記細菌種の野生型メンバーによっては分泌されないものである、請求項１に記載の方法。１６．前記細菌が、その種の野生型メンバーが分泌するよりも高いレベルで前記化学組成物を分泌するように組換え的に改変されている、請求項１に記載の方法。１７．前記化学組成物が、抗生物質である、請求項１に記載の方法。１８．前記抗生物質が、グラミシジンＳ、インドリシジン、ポリミキシン、およびバクテネシンの群から選択される、請求項１６に記載の方法。１９．前記化学組成物が、ポリアスパルテートである、請求項１に記載の方法。２０．前記化学組成物が、ポリグルタメートである、請求項１に記載の方法。２１．前記化学組成物が、ポリグリシンである、請求項１に記載の方法。２２．前記化学組成物が、ジデロフォアである、請求項１に記載の方法。２３．腐食感受性材料および分解感受性材料の群から選択される材料の腐食を阻害するためのシステムであって、その表面にバイオフィルムを有する材料を含み、該バイオフィルムは、該材料上での硫酸塩還元細菌の増殖を阻害するのに十分な量の化学組成物を分泌する細菌を含む、システム。２４．前記腐食感受性材料が、金属である、請求項２３に記載のシステム。２５．前記金属が、鋼である、請求項２４に記載のシステム。２６．前記鋼が、軟鋼である、請求項２５に記載のシステム。２７．前記鋼が、ステンレス鋼である、請求項２５に記載のシステム。２８．前記金属が、アルミニウムまたはアルミニウム合金である、請求項２４に記載のシステム。２９．前記金属が、銅または銅合金である、請求項２４に記載のシステム。３０．前記金属が、チタン、ニッケル、チタン合金、およびニッケル合金からなる群から選択される、請求項２４に記載のシステム。３１．前記分解感受性材料が、コンクリートである、請求項２３に記載のシステム。３２．前記分解感受性材料が、鉄筋コンクリートである，請求項２３に記載のシステム。３３．前記分解感受性材料が、セメントである、請求項２３に記載のシステム。３４．前記細菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属のものである、請求項２３に記載のシステム。３５．前記細菌が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属のものである、請求項２３に記載のシステム。３６．前記化学組成物が、前記材料に適用される前記細菌種の野生型メンバーによっては分泌されないものである、請求項２３に記載のシステム。３７．前記細菌が、その種の野生型メンバーよりも高いレベルで前記化学組成物を分泌するように組換え的に改変されている、請求項２３に記載のシステム。３８．前記化学組成物が、抗生物質である、請求項２３に記載のシステム。３９．前記抗生物質が、グラミシジンＳ、インドリシジン、ポリミキシン、およびバクテネシンの群から選択される、請求項３８に記載のシステム。４０．前記化学組成物が、ポリアスパルテート、ポリグルタメート、ポリグリシン、およびジデロフォアの群から選択される、請求項２３に記載のシステム。