CN105695390B - 一种菌渣培养促中国被毛孢产分生孢子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种菌渣培养促中国被毛孢产分生孢子的方法，该方法包括菌种选择、菌渣获得、菌渣生长和分生孢子诱导四个步骤。本发明所述方法中选用稳定性好、活力强、发酵出来的菌丝体量多的冬虫夏草单子囊孢子作为菌种，通过对菌丝多级扩培，并在分生孢子诱导阶段选用不同的光源进行光周期刺激培养，在短周期内便可获得高产量的中国被毛孢分生孢子(1011～1012)，对人工培植冬虫夏草的产业化发展有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种菌渣培养促中国被毛孢产分生孢子的方法。
技术背景
冬虫夏草是冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis)感染并寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上长出的子座(子实体)及幼虫虫体的复合体，属于可食用的真菌，是我国一种传统的名贵滋补中药材，有调节免疫系统功能、抗肿瘤、抗疲劳等多种功效。
野生的冬虫夏草仅生长在青藏高原海拔3000-5000米的高山草甸、高原草甸等高寒植被中，由于近年来过度采挖，使得虫草资源已经濒临灭绝。而另一方面随着人们生活水平的提高，对冬虫夏草的需求却越来越高，冬虫夏草人工培育成为解决这一问题的有效途径之一。因此，我国科研人员一直在进行利用冬虫夏草菌侵染蝙蝠蛾幼虫人工培植冬虫夏草来替代野生冬虫夏草的产业化研究。冬虫夏草要完成产业化，首先必须找到它正确的菌种，然后利用冬虫夏草菌来侵染蝙蝠蛾幼虫，进而培植出冬虫夏草。经过多年的研究，冬虫夏草菌被鉴定为中国被毛孢，又称为蝙蝠蛾被毛孢。
人工培植冬虫夏草主要是采用中国被毛孢的菌丝体来侵染蝙蝠蛾幼虫，但是这种常规侵染方法的侵染率不高，使得培植冬虫夏草的成功率受到影响，阻碍了冬虫夏草的产业化发展。随着对人工培植冬虫夏草技术领域的不断探索，有研究表明采用中国被毛孢的分生孢子来侵染蝙蝠蛾幼虫能够明显提高侵染率。因此，人工制备中国被毛孢菌分生孢子的过程就成为影响人工培植冬虫夏草成功率的重要环节。
目前，有关中国被毛孢产生分生孢子的报道较少，且分生孢子的数量不高。如文献“不同因子对冬虫夏草真菌产生分生孢子的研究”(李玉玲，《食用菌》2002年第5期)，其论述了中国被毛孢在不同培养基、不同光照以及不同温度下产生分生孢子的研究；又如文献“不同微量元素和生长因子对冬虫夏草分生孢子产量的影响”(李玲玲，罗合春，胡敏，《重庆工贸职业技术学院学报》2014年第2期)，其通过在基础培养及配方中添加微量元素和氨基酸生长因子，研究了不同微量元素和生长因子对中国被毛孢孢子产量的影响，但是利用上述文献中的方法所得到的分生孢子数量不高于105数量级。因此，如何通过培养获得大量分生孢子，已逐渐成为人工培植冬虫夏草产业化发展过程中的瓶颈。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供一种菌渣培养促中国被毛孢产分生孢子的方法，在分生孢子诱导阶段选用一定种类的光源进行光周期刺激培养，该方法获得分生孢子的周期短且产量高。
本发明的技术方案提供了一种菌渣培养促中国被毛孢产分生孢子的方法，包括以下制备步骤：
(1)菌种选择：收集冬虫夏草子囊孢子，挑取单子囊孢子进行培养，得到中国被毛孢单子囊孢子菌落；
(2)菌渣获得：在菌落中挑取3-5块菌块接种于培养基中，将菌块打碎，于恒温摇床中培养10天，记为一级摇瓶；将一级摇瓶进行扩培，在相同培养条件下培养5天，记为二级摇瓶；将二级摇瓶进行扩培，在相同培养条件下培养5天，记为三级摇瓶；将获得的三级摇瓶进行菌液分离，获得的菌丝体即为菌渣；
(3)菌渣生长：将菌渣分装于无菌广口瓶中，底部垫上吸水棉，封好瓶盖，放置于恒温培养箱中培养生长；
(4)分生孢子诱导：待菌渣表面布满气生菌丝后，在一定温湿度下光周期刺激培养进行分生孢子诱导，诱导一定时间后得到大量散落的分生孢子；
所述光周期刺激培养为光照培养12小时，黑暗培养12小时；其中，光照的光源选自蓝光、红光、或蓝光与红光的组合。
分生孢子是微生物对于特定条件下的一种应急反应，可以理解为不利环境下，微生物为了不使自身的种属被灭绝而产生的一种更为稳定、耐受性更强的无性繁殖体，因此特定的培养基以及培养条件相互协调才能制备得到大量的分生孢子。申请人在对中国被毛孢生长发育特点深入研究的基础上，经过创造性的劳动，提供了一种菌渣培养促中国被毛孢产分生孢子的方法，本发明所述方法分为菌种选择、菌渣获得、菌渣生长和分生孢子诱导四个阶段。
本发明中选用冬虫夏草单子囊孢子作为菌种，相对于其他组织分离的菌种具有稳定性好、活力强、特别是发酵出来的菌丝体量多的优点，通过对菌丝多级扩培，能够极大的提高分生孢子的数量。
本发明中所述菌渣获得阶段，在一些实施方式中，所述摇瓶培养基的配方，由以下质量百分比的组分组成：蚕蛹粉0.5％，蛋白胨0.5-1.5％，酵母粉1-2％；葡萄糖2-4％，无水硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，七水硫酸锌0.0013％，天门冬氨酸0.1％，维生素C0.1％，纯牛奶8％。
本发明中所述菌渣获得阶段，在一些实施方式中，菌块打碎后在摇床中的培养条件为：在120rpm下，20℃恒温培养。
本发明中所述菌渣生长阶段的温度控制在15-20℃；在一些实施方式中，所述菌渣生长阶段的温度为15℃；在另一些实施方式中，所述菌渣生长阶段的温度为18℃；在又一些实施方式中，所述菌渣生长阶段的温度为20℃。同时，所述菌渣生长阶段的湿度控制在60-80％，所述菌渣的生长时间控制在15-25天，优选为20天。
在所述分生孢子诱导阶段，申请人重点对温度和光源的选择进行了研究。研究发现，低温有助于刺激分生孢子的产生，优选地，诱导分生孢子的温度控制在5-10℃；在一些实施方式中，所述诱导分生孢子的温度为5℃；在另一些实施方式中，所述诱导分生孢子的温度为8℃；在又一些实施方式中，所述诱导分生孢子的温度为10℃。同时，所述诱导分生孢子的湿度控制在70-90％。进行光照周期刺激培养时，光源种类的选择对分生孢子的诱导时间有重要影响。相同培养条件下，选择一定的光源，调整诱导时间，可获得最大数量的分生孢子。在一些实施方式中，所述光源为蓝光，诱导时间为20天；在另一些实施方式中，所述光源为红光，诱导时间为20天；在又一些实施方式中，所述光源为蓝光与红光的组合，诱导时间为15天；在又一些实施方式中，所述光源为蓝光与红光的组合，诱导时间为10天。
除非明确说明，否则，本发明引用的所有范围包括端值，例如，“温度为15-20℃”，表示温度范围为15℃≤T≤20℃。
本发明的优点和有益效果在于：
(1)本发明中选用从新鲜冬虫夏草中分离的单子囊孢子作为菌种，相对于其他组织分离的菌种具有稳定性好、活力强、特别是发酵出来的菌丝体量多的优点，通过对菌丝多级扩培，能够极大的提高分生孢子的数量。
(2)通过对光源进行选择，可以在提高分生孢子数量的基础上，缩短分生孢子的诱导时间，使中国被毛孢产分生孢子的周期更短。
(3)本发明提供的菌渣培养促中国被毛孢产分生孢子的方法，周期短，产量高，对人工培植冬虫夏草的产业化发展具有重要意义。
附图说明
图1为本发明中菌渣生长阶段布满气生菌丝的图片。
图2为实施例3制备的大量中国被毛孢肾形分生孢子的镜检图。
具体实施方式
以下所述的是本发明的具体实施方式，本发明所保护的不限于以下具体实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。实施例中所用的原料如无特殊说明，均可以通过商业途径获得。
实施例1
培养基配方(质量百分比)：蚕蛹粉0.5％，蛋白胨1％，酵母粉2％，葡萄糖2％，无水硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，七水硫酸锌0.0013％，天门冬氨酸0.1％，维生素C0.1％，纯牛奶8％。
收集野生新鲜冬虫夏草子囊孢子，通过体视镜挑取单子囊孢子进行培养，经过纯化培养之后获得中国被毛孢单子囊孢子菌落试管斜面；选取长势良好的中国被毛孢单子囊孢子菌落试管斜面，并挑取数块0.5cm2左右大小的菌块接种于能获得大量菌丝体的培养基中，用无菌匀浆器将菌块均匀打碎，于120rpm，20℃恒温摇床中培养10天，记为一级摇瓶，将一级摇瓶进行扩培，在相同培养条件下培养5天，记为二级摇瓶，以此类推，将获得的三级摇瓶在洁净区进行菌液分离，获得的菌丝体即为菌渣；将菌渣分装于500ml无菌广口瓶中，底部垫上吸水棉，装量约为广口瓶体积的二分之一，用纱布以及封口膜封好瓶盖，放置于温度为15℃、湿度为60％的培养箱中生长；25天后，菌渣表面完全生长透彻，布满气生菌丝，再在温度为8℃、湿度为80％的条件下，红光培养12小时，黑暗培养12小时，诱导分生孢子，诱导20天后即可得到大量散落的中国被毛孢肾形分生孢子。
经无菌水冲洗培养基斜面得到悬浮液，用细胞计数法对悬浮液进行统计和镜检，镜检可明显看到大量散落的中国被毛孢菌种肾形分生孢子，统计结果中分生孢子总数为1011数量级。
实施例2
培养基配方(质量百分比)：蚕蛹粉0.5％，蛋白胨1.5％，酵母粉1％，葡萄糖3％，无水硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，七水硫酸锌0.0013％，天门冬氨酸0.1％，维生素C0.1％，纯牛奶8％。
收集野生新鲜冬虫夏草子囊孢子，通过体视镜挑取单子囊孢子进行培养，经过纯化培养之后获得中国被毛孢单子囊孢子菌落试管斜面；选取长势良好的中国被毛孢单子囊孢子菌落试管斜面，并挑取数块0.5cm2左右大小的菌块接种于能获得大量菌丝体的培养基中，用无菌匀浆器将菌块均匀打碎，于120rpm，20℃恒温摇床中培养10天，记为一级摇瓶，将一级摇瓶进行扩培，在相同培养条件下培养5天，记为二级摇瓶，以此类推，将获得的三级摇瓶在洁净区进行菌液分离，获得的菌丝体即为菌渣；将菌渣分装于500ml无菌广口瓶中，底部垫上吸水棉，装量约为广口瓶体积的二分之一，用纱布以及封口膜封好瓶盖，放置于温度为20℃、湿度为70％的培养箱中生长；15天后，菌渣表面完全生长透彻，布满气生菌丝，再在温度为10℃、湿度为90％的条件下，蓝光培养12小时，黑暗培养12小时，诱导分生孢子，诱导20天后即可得到大量散落的中国被毛孢肾形分生孢子。
经无菌水冲洗培养基斜面得到悬浮液，用细胞计数法对悬浮液进行统计和镜检，镜检可明显看到大量散落的中国被毛孢菌种肾形分生孢子，统计结果中分生孢子总数为1011数量级。
实施例3
培养基配方(质量百分比)：蚕蛹粉0.5％，蛋白胨1％，酵母粉2％，葡萄糖2％，无水硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，七水硫酸锌0.0013％，天门冬氨酸0.1％，维生素C0.1％，纯牛奶8％。
收集野生新鲜冬虫夏草子囊孢子，通过体视镜挑取单子囊孢子进行培养，经过纯化培养之后获得中国被毛孢单子囊孢子菌落试管斜面；选取长势良好的中国被毛孢单子囊孢子菌落试管斜面，并挑取数块0.5cm2左右大小的菌块接种于能获得大量菌丝体的培养基中，用无菌匀浆器将菌块均匀打碎，于120rpm，20℃恒温摇床中培养10天，记为一级摇瓶，将一级摇瓶进行扩培，在相同培养条件下培养5天，记为二级摇瓶，以此类推，将获得的三级摇瓶在洁净区进行菌液分离，获得的菌丝体即为菌渣；将菌渣分装于500ml无菌广口瓶中，底部垫上吸水棉，装量约为广口瓶体积的二分之一，用纱布以及封口膜封好瓶盖，放置于温度为18℃、湿度为70％的培养箱中生长；20天后，菌渣表面完全生长透彻，布满气生菌丝，再在温度为8℃、湿度为80％的条件下，蓝光和红光同时照射培养12小时，黑暗培养12小时，诱导分生孢子，诱导10天后即可得到大量散落的中国被毛孢肾形分生孢子。
经无菌水冲洗培养基斜面得到悬浮液，用细胞计数法对悬浮液进行统计和镜检，镜检可明显看到大量散落的中国被毛孢菌种肾形分生孢子(图2)，统计结果中分生孢子总数为1012数量级。
实施例4
培养基配方(质量百分比)：蚕蛹粉0.5％，蛋白胨1.5％，酵母粉1.5％，葡萄糖4％，无水硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，七水硫酸锌0.0013％，天门冬氨酸0.1％，维生素C0.1％，纯牛奶8％。
收集野生新鲜冬虫夏草子囊孢子，通过体视镜挑取单子囊孢子进行培养，经过纯化培养之后获得中国被毛孢单子囊孢子菌落试管斜面；选取长势良好的中国被毛孢单子囊孢子菌落试管斜面，并挑取数块0.5cm2左右大小的菌块接种于能获得大量菌丝体的培养基中，用无菌匀浆器将菌块均匀打碎，于120rpm，20℃恒温摇床中培养10天，记为一级摇瓶，将一级摇瓶进行扩培，在相同培养条件下培养5天，记为二级摇瓶，以此类推，将获得的三级摇瓶在洁净区进行菌液分离，获得的菌丝体即为菌渣；将菌渣分装于500ml无菌广口瓶中，底部垫上吸水棉，装量约为广口瓶体积的二分之一，用纱布以及封口膜封好瓶盖，放置于温度为20℃、湿度为80％的培养箱中生长；15天后，菌渣表面完全生长透彻，布满气生菌丝，再在温度为5℃、湿度为70％的条件下，蓝光和红光同时照射培养12小时，黑暗培养12小时，诱导分生孢子，诱导15天后即可得到大量散落的中国被毛孢肾形分生孢子。
经无菌水冲洗培养基斜面得到悬浮液，用细胞计数法对悬浮液进行统计和镜检，镜检可明显看到大量散落的中国被毛孢菌种肾形分生孢子，统计结果中分生孢子总数为1012数量级。
实施例5
培养基配方(质量百分比)：蚕蛹粉0.5％，蛋白胨0.5％，酵母粉1.5％，葡萄糖2％，无水硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，七水硫酸锌0.0013％，天门冬氨酸0.1％，维生素C0.1％，纯牛奶8％。
收集野生新鲜冬虫夏草子囊孢子，通过体视镜挑取单子囊孢子进行培养，经过纯化培养之后获得中国被毛孢单子囊孢子菌落试管斜面；选取长势良好的中国被毛孢单子囊孢子菌落试管斜面，并挑取数块0.5cm2左右大小的菌块接种于能获得大量菌丝体的培养基中，用无菌匀浆器将菌块均匀打碎，于120rpm，18℃恒温摇床中培养15天，记为一级摇瓶，将一级摇瓶进行扩培，在相同培养条件下培养5天，记为二级摇瓶，以此类推，将获得的三级摇瓶在洁净区进行菌液分离，获得的菌丝体即为菌渣；将菌渣分装于500ml无菌广口瓶中，底部垫上吸水棉，装量约为广口瓶体积的二分之一，用纱布以及封口膜封好瓶盖，放置于温度为20℃、湿度为70％的培养箱中生长；15天后，菌渣表面完全生长透彻，布满气生菌丝，再在温度为10℃、湿度为90％的条件下，蓝光和红光同时照射培养12小时，黑暗培养12小时，诱导分生孢子，诱导10天后即可得到大量散落的中国被毛孢肾形分生孢子。
经无菌水冲洗培养基斜面得到悬浮液，用细胞计数法对悬浮液进行统计和镜检，镜检可明显看到大量散落的中国被毛孢菌种肾形分生孢子，统计结果中分生孢子总数为1012数量级。
Claims (2)
1.一种菌渣培养促中国被毛孢产分生孢子的方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
(1)菌种选择：收集冬虫夏草子囊孢子，挑取单子囊孢子进行培养，得到中国被毛孢单子囊孢子菌落；
(2)菌渣获得：在菌落中挑取3-5块菌块接种于培养基中，将菌块打碎，于恒温摇床中培养10天，记为一级摇瓶；将一级摇瓶进行扩培，在相同培养条件下培养5天，记为二级摇瓶；将二级摇瓶进行扩培，在相同培养条件下培养5天，记为三级摇瓶；将获得的三级摇瓶进行菌液分离，获得的菌丝体即为菌渣；
(3)菌渣生长：将菌渣分装于无菌广口瓶中，底部垫上吸水棉，封好瓶盖，放置于恒温培养箱中培养生长；所述菌渣生长阶段的温度为15-20℃；所述菌渣生长阶段的湿度为60-80％；所述菌渣的生长时间为15-25天；
(4)分生孢子诱导：待菌渣表面布满气生菌丝后，在一定温湿度下光周期刺激培养进行分生孢子诱导，诱导一定时间后得到大量散落的分生孢子；分生孢子诱导阶段的温度为5-10℃；分生孢子诱导阶段的湿度为70-90％；分生孢子的诱导时间为10-20天；
所述光周期刺激培养为光照培养12小时，黑暗培养12小时；其中，光照的光源选自蓝光、红光、或蓝光与红光的组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述菌块打碎后在摇床中的培养条件为：在120rpm下，20℃恒温培养。
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